Effect of substitution of Cys11 by Ser on the activity and dimerization of one of rice thioredoxin isoforms (OsTrx23) using site-directed mutagenesis

جایگزینی سیستئین 11 با سرین ‎در یکی از ایزوفرم‌های تیوردوکسین برنج (OsTrx23)‏  ‎‏ با روش جهش‌زایی هدایت شده‎ و اثر ‏آن بر میزان دایمر ‌شدن و فعالیت احیایی

میترا رودگرنشتا¹، آذر شاه‌پیری*² ‏

‏¹ کارشناس ارشد گروه بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه صنعتی اصفهان.

‏² استادیار، گروه بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشکده کشاورزی ، دانشگاه صنعتی اصفهان.

‏ تاریخ دریافت: 23/04/1392، تاریخ پذیرش: 04/06/1393

چکیده

تیوردوکسین (Trx) ‌ها، پروتئین‌هایی کوچک هستند که با داشتن یک گروه تیول- دی‌سولفید در جایگاه فعالشان نقش مهمی در تنظیم اکسایش- احیای سلولی دارند. برخلاف جانوران و پروکاریوت‌ها، در گیاهان ایزوفرم های مختلفی Trx وجود دارد که بر اساس مجل آنها در سلول در هشت زیرگروه  f، m، x، y، z، o، s و h قرار می‌گیرند. ایزوفرم‌های مختلفی از Trx h‏ در سیتوپلاسم سلول های گیاهی وجود دارند. از جمله در برنج نه ایزوفرم Trx h وجود دارد که از این میان ایزوفرم‌های OsTrx20، OsTrx1، OsTrx23 و OsTrx18 علاوه بر دو اسید‌آمینه‌یCys  در جایگاه فعال، دارای یک یا دو  Cys اضافی در انتهای آمین توالی خود نیز می‌باشند. در پژوهش حاضر به منظور بررسی نقش Cys انتهای در توالی پروتئین OsTrx23، با روش جهش‌زایی هدایت‌شده  Cys11باُSer  جایگزین شد. پروتئین جهش‌یافته (C11S_OsTrx23) و طبیعی (Wt_OsTrx23) در باکتری اشریشیاکلی سویه روزتا به صورت دگرساخت بیان و خالص‌سازی شدند و فعالیت احیایی آنزیم‌‌های طبیعی و جهش‌یافته در واکنش با انسولین بررسی شد. همچنین دایمر و مونومر بودن این پروتئین ها از طریق ران کردن آنها در دو شرایط احیاء و عدم احیاء بر روی ژل SDS-PAGE‌ مورد بررسی قرار گرفت. بر اساس نتایج به دست آمده ‍سیستئین انتهایی درOsTrx23، با ایجاد پیوند دی‌سولفیدی نقش کلیدی در دایمر‌شدن پروتئین دارد اما تأثیری بر فعالیت احیایی ندارد.

کلمات کلیدی: تیوردوکسین، جهش زایی هدایت‌شده، سیستئین، دایمر‌شدن

مقدمه

تیوردوکسین (Trx) در گیاهان به عنوان منبع الکترون‌دهنده به طیف وسیعی از پروتئین‌ها که در متابولیسم‌های مختلف سلولی مانند فتوسنتز، تبادلات غشایی، ترجمه، تجمع و پیچش پروتئین‌ها دخالت دارند، عمل می‌کند (Gelhaye et al. 2004). با توجه به نقش Trx در احیای بسیاری از پروتئین‌های مهم در متابولیسم سلولی، شناخت سازوکار عمل این آنزیم و چگونگی برهم‌کنش آن با پروتئین‌های هدف و یا با تیوردوکسین‌ردوکتاز^[1] به عنوان پروتئین الکترون‌دهنده موضوع مورد مطالعه بسیاری از محققان می‌باشد (Gelhaye et al. 2004‎). پیوند دی‌سولفیدی موجود در یک پلی‌پپتید، بین دو پلی‌پپتید در یک پروتئین و یا بین دو سیستئین موجود در یک پروتئین، نقش مهمی در پایداری ساختمان پروتئین ایفا می‌کند. Trx ‌ها با احیای برگشت‌پذیر پیوند‌های دی‌سولفیدی در بسیاری از مولکول‌های هدف، باعث تنظیم فعالیت آن‌ها می‌شوند. بر خلاف پستانداران، باکتری‌ها و قارچ‎ها، گیاهان دارای ایزوفرم‌های مختلفی از  Trx می‎باشند، که بر اساس ساختمان اولیه و محل قرار‌گیری در سلول به هشت زیر‌خانواده تقسیم می‌شوند. Trx ‌‌های f، m ، x و y در کلروپلاست، Trx o در میتوکندری و ایزوفرم‌‎های Trx h در سیتوزول قرار ­دارند. با این حال Trx h در قسمت‌های دیگر سلولی چون هسته، شبکه آندوپلاسمی و میتوکندری شناسایی شده‎اند (Kang et al. 2004; Gelhaye et al. 1998). بر خلاف Trx ‌های کلروپلاستی که احیای آنها وابسته به نور و با حضور فردوکسین و فردوکسین‌‌ردوکتاز صورت می‌گیرد، احیای Trx h و Trx o وابسته به NADPH بوده و با واسطه آنزیم تیوردوکسین ردوکتاز وابسته به NADPH صورت می‌گیرد (Jacquot et al. 1997; Meyer (et al. 2005 . چندین ایزوفرم Trx h در گیاهان عالی وجود دارد (Meyer et al. 2002). به طوری‌که در گیاه آرابیدوپسیس^[2] هشت، در گندم پنج و درجو دو ایزوفرم از Trx h وجود دارد .تیوردوکسین h نقشی اساسی در رشد و نمو گیاه دارد. نقش Trx h در جوانه‌زنی بذر غلات به خوبی مستند شده است (Shahpiri et al. 2009‎). علاوه بر آن حضور Trx h در آوند آبکش برنج به نقش پیام‌رسانی این پروتئین در گیاه اشاره می‌کند (Florencio et al. 1988; Gelhaye et al. 2004‎). در ژنوم گیاه برنج 30 ژن کدکننده Trx وجود دارد که از این 30 ژن، نه ژن رمز‌گردان Trx h می‌باشند Nuruzzaman et al. 2008)‎). آنالیز توالی انجام‌شده روی این نه ایزوفرم نشان می‌دهد که در بین این ایزوفرم‌ها، ایزوفرم‌های OsTrx20، OsTrx23، OsTrx18 و OsTrx15 دارای سیستئین اضافی علاوه بر دو سیستئین جایگاه فعال در قسمت انتهایی پروتئین می‌باشند (Papzan et al. 2012). برای پی بردن به نقش این سیستئین سوم در انتهای آمینی پروتئین OsTrx23 ، سیستئین 11 در این پروتئین با سرین با روش جهش‌زایی هدایت شده جایگزین شد. پروتئین‌های جهش‌یافته و طبیعی به صورت دگرساخت در باکتری بیان شده و با استفاده از کروماتوگرافی جذبی خالص سازی شدند. دایمر شدن پروتئین‌ها با استفاده از آنالیز ژل SDS-PAGE تحت شرایط وجود و عدم وجود DTT به عنوان عامل احیا کننده بررسی شد به علاوه فعالیت احیایی پروتئین‌های طبیعی و جهش‌یافته نیز در واکنش احیایی با انسولین به عنوان سوبسترا اندازه گیری شد.

مواد و روش‌ها

آنالیز توالی

توالی آمینواسیدی ایزوفرم‌های Trx h برنج از پایگاه داده ژنوم برنج (http://rice.plantbiology.msu.edu) گرفته شد. همردیف‌سازی توالی کدکننده‌ی OsTrx23 با توالی آمینواسیدی ایزوفرم‌های تیوردوکسین h برنج با استفاده از برنامه Clustal W ‎‎‎‎(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/) انجام شد.

طراحی آغازگر و ایجاد جهش به روش جهش‌زایی هدایت‌شده

ژن رمزگردان OsTrx23 که قبلاً در ناقل بیانی pET-15b همسانه سازی شده بود به عنوان ماده اولیه ژنتیکی در این تحقیق مورد استفاده قرار گرفت (Papzan et al. 2012). جایگزینی اسید آمینه Cys با Ser با استفاده از جهش‌‌زایی هدایت شده انجام شد (Alam et al. 2011; Cazalis et al. 2006). جفت پرایمرهای ´3 – CGC CTCC CAC AAC AAG GAC GAA TTC GAC GC -'5 و´3 GCG TCG AAT TCG TCC TTG TTG TGGGAG GCG-  -´5 (اسیدآمینه‌ی تغییر یافته با قلم سیاه و زیر خط مشخص شده است)  با استفاده از نرم افزار Primer X (www.bioinformatics.org/primerx/‎) و با تغییر کدون‌های رمز‌کننده‌ی اسیدآمینه‌ی سیستئین طراحی شدند. به دلیل طویل بودن منطقه تکثیر (ژن به همراه پلاسید)، واکنش PCR بر روی pET15b - OsTrx23  با استفاده از آنزیم pfu (فرمنتاز) و پرایمرها انجام شد. واکنش PCR به مدت یک دقیقه در مرحله واسرشت سازی اولیه با دمای 95 درجه سلسیوس و یک چرخه دمایی; 18 چرخه دمایی و مدت یک دقیقه با دمای 95 درجه سلسیوس، یک دقیقه با دمای اتصال 60 درجه سلسیوس ، یک دقیقه با دمای گسترش 72 درجه سلسیوس و در نهایت یک چرخه دمایی به مدت 12 دقیقه در مرحله گسترش نهایی با دمای 72 درجه سلسیوس انجام شد. برای از بین بردن پلاسمید والدی در نواحی متیله (که دارای ژن غیر جهش‌یافته می باشد)، محصول PCR به مدت دو ساعت در دمای 37 درجه‌ی سانتیگراد با آنزیم  DpnIگرماگذاری شد. این آنزیم توانایی هضم رشته والدی را در نواحی متیله و همی متیله ‏داشته، در نتیجه باعث هضم پلاسمید حاوی ژن غیر جهش‌یافته و تک رشته ای شدن محصول PCR خواهد شد. در حالی که ‏DNA‏ جهش‌یافته‌ی تازه سنتز شده فاقد نواحی متیله بوده توسط این آنزیم برش نمی‌یابد. پس از انتقال پلاسمید تک رشته‌ای حاوی ژن جهش‌یافته به باکتری DH5α به روش شوک الکتریکی، پلاسمید حاوی ژن جهش یافته با استفاده از سیستم همانند‌سازی میزبان قادر به همانند سازی و تشکیل دو رشته می باشد. با توجه به اینکه آنزیم  DpnI پلاسمید مادری حاوی ژن طبیعی را در نواحی متیله کاملاً هضم می کند، کلونی های حاصل به احتمال زیادی دارای ژن جهش‌یافته می باشند. با این حال جهت تأیید از هضم آنزیمی استفاده شد. به منظور تأیید کلونی‌های دارای ژن جهش‌یافته، ‏برش آنزیمی پلاسمید ‏pET15b-OsTrx23‎‏ توسط آنزیم SalI‏ انجام شد. آنزیم SalI با شناسایی دو جایگاه برش در پلاسمید حاوی ژن جهش یافته تولید دو قطعه bp700 و bp5400 می کرد. در مقایسه پلاسمید حاوی ژن طبیعی تنها یک جایگاه شناسایی برای برش توسط این آنزیم داشت و بدین شکل کلونی‌های حاوی پلاسمیدهای دارای ژن جهش یافته کاملا مشخص بودند.  پلاسمید حاوی ژن جهش یافته بعد از تأیید آنزیمی برای تأیید توالی ارسال شد.

بیان وتولید پروتئین‌های نوترکیب جهش‌یافته و طبیعی

پلاسمید حاوی ژن جهش‌یافته پس از توالی‌یابی به منظور تولید پروتئین جهش‌یافته به روش شوک الکتریکی وارد سلول‌های مستعد باکتریایی اشریشیا کلای سویه روزتا (DE3) شد. به دلیل حضور ژن مقاومت به آنتی بیوتیک آمپی‌سیلین بر روی پلاسمید pET-15b و هم‌چنین مقاومت باکتری روزتا ‎(DE3‎) به آنتی بیوتیک کلرامفنیکل، سلول های باکتری ترانسفورم شده حاوی پلاسمید جهش‌یافته در محیط LB حاوی آنتی بیوتیک آمپی‌سیلین (100 میلی گرم بر لیتر) و کلرامفنیکل (5 میلی گرم بر لیتر) در دمای 37 درجه سانتیگراد بر روی انکوباتور شیکردار با 180 دور در دقیقه کشت شدند. میزان 5 میلی‌لیتر از کشت‌های باکتریایی به 400 میلی‌لیتر محیط کشت LB مایع حاوی آنتی‌بیوتیک مناسب اضافه و جذب نوری کشت باکتریایی (λ600nm) اندازه‌گیری شد. سپس نمونه‌ها در انکوباتور 37 درجه‌ی سلسیوس با 200 دور در دقیقه قرار داده شدند تا جذب نوری کشت باکتریایی به 6/0 رسید. کشت‌ها اضافه شد. ‏در این زمان القاکننده‌ی IPTG به غلظت نهایی 1/0 میلی مولار به کشت‌ها اضافه و کشت باکتریایی به مدت 4 ساعت دیگر ادامه یافت. پس از گذشت 4 ساعت، سوسپانسیون باکتری در لوله‌های 50 میلی لیتری به مدت 5 دقیقه در 12000 دور در دقیقه در دمای 4 درجه سلسیوس سانتریفوژ گردیدند و سپس محلول رویی لوله‎ها دور ریخته ‌و رسوب حاصل در 10 میلی لیتر ازبافر8pH= Tris-HCl mM10 سوسپانسیون شد. دیواره سلول‌های باکتری با استفاده از روش امواج صوتی با دامنه‌ی امواج^[3]100% و چرخه‌ی^[4] 60% تخریب ‌شد و پس از سانتریفیوژ به مدت 10 دقیقه در 12000 دور در دقیقه در دمای 4 درجه سلسیوس، فاز رویی برای بررسی میزان بیان پروتئین‌های محلول بر روی ژل آکریل‌آمید 12% بارگذاری گردیدند.

خالص سازی پروتئین و اندازه گیری فعالیت آنزیم جهش‌یافته و طبیعی

پروتئینهای نوترکیب تولید شده به دلیل داشتن منطقه رمزگردان پلی هیستیدین (‏His-tag‏) در بالادست ‏پلاسمید ‏pET-15b‏، دارای دنباله‌ی پلی هیستیدینی در انتهای آمین می‌باشند. پروتئین‌های نوترکیب جهش‏یافته و طبیعی تولید شده در فاز محلول توسط ستون‌های His-trap (GE Healthcare) حاوی رزین نیکل و به روش کروماتوگرافی جذبی^[5] خالص‌سازی شدند. برای این منظور ابتدا بافر بارگذاری A (ایمیدازول 10 میلی مولار، کلرید سدیم 500 میلی مولار و 30 میلی مولار تریس- اسید کلریدریک، =8 pH) از ستون عبور داده شد. سپس پروتئین استخراج شده از ستون عبور داده شده و برای  شستشوی پروتئین های غیر اختصاصی چسبیده به ستون از محلولی حاوی 10% بافر B (ایمیدازول 400 میلی مولار، کلرید سدیم 500 میلی مولار و 30 میلی مولار تریس- اسید کلریدریک ، pH=8) و 90% بافر A استفاده شد. سپس جهت جدا سازی پروتئین نوترکیب حاوی His-tag از ستون، شیب غلظتی از 10-50% بافر B مورد استفاده قرار گرفت. محلول حاوی پروتئین در لوله های اپندورف 5/1 میلی‌لیتری جمع‌آوری شدند. پروتئین‌های خالص شده برای آنالیز کیفیت و خلوص بر روی ژل SDS-PAGE بارگذاری شدند. غلظت پروتئین‌های نوترکیب و جهش‌یافته با استفاده از اندازه‌گیری میزان جذب پروتئین در طول موج 280 نانومتر و استفاده از قانون بیر- لمبرت تعیین شد. فعالیت پروتئین‌های خالص طی واکنش با انسولین به عنوان سوبسترا با غلظت 1 میلی گرم در میلی‌لیتر، بافر پتاسیم‌فسفات 100 میلی مولار با pH برابر با 5/6 ، ^[6]EDTA با غلظت 2/0 میلی مولار و DTT^[7] با غلظت 1 میلی‌مولار و غلظت های 5 میکرومولار از هر کدام از پروتئین‌های نوترکیب جهش‌یافته و طبیعی در طول موج 650 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفوتومتر(Beckman DU 530) اندازه‌گیری شد. لازم به ذکر است یک واکنش حاوی تمام ترکیبات ذکر شده در واکنش بدون حضور تیوردوکسین به عنوان واکنش کنترل در نظر گرفته شد.

نتایج و بحث

همردیف سازی و تجزیه و تحلیل توالی

مقایسه توالی آمینواسیدی بین هفت ایزوفرم OsTrxh نشان داد که از بین این ایزوفرم‌ها، OsTrx18، OsTrx23 و OsTrx15 غیر از دو سیستئین (Cys) موجود در جایگاه فعال، دارای یک سیستئین اضافی در انتهای آمین می باشند. در حالیکه ایزوفرم OsTrx20 دارای دو سیستئین اضافی در این انتهاست (شکل 1).

شکل 1- آنالیز توالی و همردیف سازی ‏OsTrx23‎‏ با Trx های ‏h‏ از گیاه برنج با استفاده از نرم افزار Clustal W. سیستئین‌های انتهای آمین با رنگ مشکی و منطقه جایگاه فعال با رنگ خاکستری نشان داده شده است.

Figure 1- Sequences analysis and multiple alignment between different rice Trxh isoforms using the Clustal W software (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/). The active site is shown with gray box and N- terminal Cys residues are shown black.

تایید بیان پروتئین جهش یافته و طبیعی در باکتری

پس از القای باکتری‌ها با IPTG، فاز محلول پروتئین از باکتری‌ها استخراج شد و آنالیز کل پروتئین محلول بر روی ژل SDS-PAGE صورت گرفت. با توجه به وجود منطقه کد کننده پلی هیستیدین ((His-tag در بالا دست جایگاه کلون سازی در پلاسمید pET15b پروتئین‌های نوترکیب حاصل دارای دنباله پلی هیستیدین در انتهای آمینو می باشند. وزن مولکولی پیش بینی شده برای هر دو مولکول پروتئین جهش یافته و طبیعی 31/15 کیلودالتون و نقطه ی ایزوالکتریک آن ها 29/6  می باشد. وجود باندهای پلی پپتیدی با وزن مولکولی مورد نظر بر روی ژل، تولید پروتئین‌های نوترکیب C11S_OsTrx23-His و  His-Wt_OsTrx23در مقایسه با سویه کنترل را تایید کرد (شکل 2). پروتئین‌های نوترکیب تولید شده، با استفاده از کروماتوگرافی جذبی و ستون‌های حاوی رزین نیکل (Ni²⁺ (، خالص شدند و کیفیت خالص سازی با استفاده از SDS-PAGE بررسی شد )شکل 2).

شکل 2- آنالیز SDS-PAGE جهت تایید بیان و خالص سازی. پروتئین استخراج شده از باکتری حاوی پلاسمید pET15b به عنوان کنترل منفی(ستون‌1)، pET15b-Wt_OsTrx20 (ستون2) و pET15b-C11S_OsTrx23  (ستون‌های 3) 4 ساعت پس از اضافه کردن .IPTG پروتئین‌های خالص سازی شده His-Wt_OsTrx20 و C11S _OsTrx20 His- (ستون‌های 4 و 5).

Figure 2- SDS-PAGE analysis for verification of ‎expression and ‎purification. Total soluble protein extracted from E. coli‎ harboring pET15b (lane 1), ‎pET15b-WtOsTrx23 (lanes 2), pET15b-C11SOsTrx23 (lane 3),‎ 4 ‎hours after addition of ‎IPTG. Purified His-Wt‎‎_OsTrx23 (lane 4), and His-‎C11S_OsTrx23 (lane 5). PM: Protein Marker.

بررسی میزان دایمر شدن پروتئین‌ها در شرایط احیا و غیر احیا با استفاده از DTT

بررسی میزان دایمر شدن پروتئین‌ها در نتیجه جایگزینی سیستئین انتهای آمین با سرین و تأثیر این سیستئین بر دایمر شدن پروتئین با آنالیز SDS-PAGE  پروتئین‌های جهش‌یافته و طبیعی انجام شد. در شرایط حضور DTT به عنوان واسرشت‌کننده پیوند‌های دی‌سولفیدی هر دو پروتئین طبیعی و جهش‌یافته تنها در فرم مونومر دیده شدند (شکل3-B). این در حالی است که آنالیز SDS-PAGE  بر پروتئین‌های جهش‌یافته و طبیعی در شرایط عدم وجود DTT به عنوان عامل احیا کننده پیوند‌های دی‌سولفیدی در پروتئین، پروتئین جهش‌یافته را تنها در فرم مونومر نشان داد. در حالیکه در این شرایط، پروتئین طبیعی به صورت مخلوطی از دو فرم مونومر و دایمر دیده شد. (شکل 3- A). بنابراین به نظر می رسد Cys₁₁نقش مهمی در دایمر شدن پروتئین دارد و در واقع دایمر بودن نسبی در پروتئین طبیعی نتیجه حاصل از پیوند دی سولفیدی بین دو رشته پلی پپتیدی از طریق Cys ₁₁ می‌باشد.

شکل3- آنالیز پروتئین‌های جهش‌یافته C11S_OsTrx23و طبیعی Wt_OsTrx20بر روی ژل  SDS-PAGE در شرایط (‏A‏) عدم حضور ‏DTT‏ به عنوان عامل احیا کننده. پروتئین طبیعی His-Wt‎‎_OsTrx23 ‎‏(ستون 1) و پروتئین جهش‌یافته ‏ His-‎C11S_OsTrx23‎‏ (ستون 2). (‏B‏) حضور ‏DTT‏ به عنوان عامل احیا کننده. پروتئین طبیعی ‏‏ His-Wt‎‎_OsTrx23‎‏(ستون 1) و پروتئین ‏جهش‌یافته ‏ His-‎C11S_OsTrx23‎‏(ستون 2). ‏PM، نشانگر پروتئینی (فرمنتاز).

Figure 3- (A) Effects of non reducing conditions on dimerization of WT_OsTrx23(lane 1) and C11S_OsTrx23(lane 2). (B) Effects of reducing condition on dimerization of WT_OsTrx23(lane 1) and C11S_OsTrx23(lane 2).‎ PM: Protein marker (fermentas).

اندازه‌گیری فعالیت تیوردوکسین‌های طبیعی و جهش‌یافته در واکنش با انسولین

در سیستم NTR/Trx الکترون از NADPH به NTR و از NTR به Trx h انتقال می‌یابد. تیوردوکسین احیا شده نیز متعاقباً به عنوان عامل احیا کننده‌ی بسیاری از پروتئین‌ها قادر به احیای پیوندهای دی‌سولفیدی در آن‌ها می باشد. تحقیقات هولمگرن و همکاران در سال 1979 نشان داد که DTT نیز به عنوان عامل احیا کننده در محیط in vitro  قادر به احیای باند‌های دی‌سولفیدی در انسولین می‌گردد (Holmgren 1979). انسولین پروتئینی است که دو زنجیره‌ی α و β در آن به وسیله پیوند دی سولفیدی به یکدیگر متصل شده‌اند. احیای باند‌های دی سولفیدی توسط تیوردوکسین احیا شده در این واکنش منجر به رسوب زنجیره‌ی β شده که تشکیل این رسوب سفید و اندازه‌گیری میزان جذب در طول موج 650 نانومتر نشان‌دهنده‌ی پیشرفت واکنش می باشد. در این مطالعه نتایج حاصل از مقایسه فعالیت احیایی پروتئین‌های جهش‌یافته و طبیعی در واکنش حاوی DTT و انسولین نشان داد که سرعت رسوب دهی انسولین حدود A₆₅₀/min 0.089 تخمین زده شد که در هر دو واکنش تقریباً یکسان بوده و تفاوتی بین فعالیت آنزیمی پروتئین جهش‌یافته با پروتئین طبیعی برای احیای انسولین وجود نداشت (شکل 4).

شکل 4- اندازه‌گیری فعالیت آنزیمی پروتئین‌ جهش‌یافته C11S_OsTrx23 در مقایسه با پروتئین طبیعی OsTrx23 در واکنش با انسولین.  واکنش شامل 5 میکرومولار از نمونه پروتئینی و 1 میلی‌گرم در میلی‌لیتر انسولین‏ می باشد. پیشرفت واکنش با اندازه گیری ‏میزان جذب در طول موج 650 نانومتر بررسی شد. ‏نمونه‌ی کنترل شامل واکنش فاقد Trxh می‌باشد.

Figure 4- DTT- dependent insulin reduction assay. Comparing the activity of Wt_OsTrx23 and ‎C11S_OsTrx23 proteins with insulin. 5 µM of each protein sample was reacted with 1mg/ml of ‎insulin and the absorbance was measured spectrophotometrically at 650 nm. Control shows the reaction containing insulin and DTT without addition Trx h.   

با جایگزینی هر اسیدآمینه‌ی سیستئین در جایگاه فعال Trx ها، فعالیت اکسیدوردوکتازی تیوردوکسین‌ها به مقدار قابل توجهی کاهش یافته یا یه طور کامل از بین خواهد رفت (Alam et al. 2011). پیش از این حضور یک سیستئین اضافی در انتهای آمین Trx ‌های نوع h علاوه بر دو سیستئین در جایگاه فعال، در تعداد کمی از گیاهان از قبیل صنوبر (Gelhaye et al. 2003)، جو (Maeda et al. 2003) و گندم (Cazalis et al. 2006) گزارش شده است. جایگزینی این سیستئین انتهایی با سرین در Trxh1 از گیاه گندم نشان داد که این اسیدآمینه تأثیر اندکی روی فعالیت احیایی پروتئین داشته اما نقش اساسی در دایمر شدن پروتئین دارد (Cazalis et al. 2006‎). دایمر شدن در پروتئین‌ها از طریق این سیستئین‌های غیر احیایی و تشکیل پیوندهای دی‌سولفیدی درون مولکولی در Trxh1 در انسان نیز مشاهده شده است (Watson et al. 2003). ایزوفرم OsTrx23 با یک سیستئین اضافی در انتهای آمین پروتئین، یکی از تیوردوکسین‌های نوع h در گیاه برنج است که تحت شرایط غیر احیا (بدون حضور DTT به عنوان عامل واسرشت کننده‌ی پروتئین) به صورت جزیی تشکیل دایمر می‌دهد. برای بررسی نقش این سیستئین انتهایی و تأثیر آن بر دایمر شدن پروتئین در سطوح ملکولی، سیستئین انتهای آمین به روش جهش‌زایی هدایت شده با سرین جایگزین شد. جهش‌یافته C11S_OsTrx23 همانند پروتئین طبیعی Wt_OsTrx23 به صورت دگرساخت بیان و خالص‌سازی شد. آنالیز ژل SDS-PAGE پروتئین‌ها برای بررسی باندهای پروتئینی نشان داد که این سیستئین نقشی حیاتی در دایمر شدن پروتئین داشته اما تأثیری بر فعالیت اکسیدور‌داکتازی پروتئین ندارد. فعالیت احیایی پروتئین‌ها نیز با استفاده از واکنش با انسولین اندازه‌گیری شد. فعالیت هر دو پروتئین جهش‌یافته و طبیعی با سرعت تقریباً مشابه در احیای انسولین تخمین زده شد که این برابری تقریبی در فعالیت احیایی پروتئین نشان دهنده‌ی این مسئله است که برخلاف سیستئین های موجود در جایگاه فعال Trx ‌ها، که نقشی اساسی در فعالیت احیایی پروتئین‌ها دارند، این سیستئین‌انتهایی تأثیری بر قدرت احیایی OsTrx23‌ ندارد.