Document Type : Research Paper
Authors
Abstract
Keywords
تراریختی گیاه کلزا با ساختار ترکیبی حاوی ژن جهش یافته epsps و ترادف نشانه کلروپلاستی به منظورافزایش تحمل به علف کش گلیفوسیت
مه لقا قوامی1، امیرموسوی*2، علی هاتف سلمانیان3، فرانک هادی 4
1کارشناسی ارشد زیست شناسی سلولی و مولکولی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه تربیت معلم آذربایجان.
2دانشیار گروه بیوتکنولوژی گیاهی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری.
3استاد گروه بیوتکنولوژی گیاهی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری.
4استادیار گروه زیست شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه لرستان.
تاریخ دریافت: 09/02/1393، تاریخ پذیرش: 20/03/1393
چکیده
گیاهان زراعی متحمل نسبت به علف کش گلیفوسیت یکی از کاراترین روش های موجود در کنترل علف های هرز مزارع محسوب می شود. گلیفوسیت با مهار آنزیم EPSPS (5-انول پیرویل شیکیمات-3-فسفات سنتاز) در مسیر شیکیمات مانع سنتز اسید های آمینه حلقوی و در نتیجه مرگ گیاه می شود. یکی از موثرترین راه های ایجاد گیاهان مقاوم به علف کش گلیفوسیت، دست ورزی ژن کد کننده آنزیم EPSPS به منظور کاهش تمایل گلیفوسیت به این آنزیم می باشد. در مطالعات گذشته از روش جهش زایی هدایت یافته برای ایجاد دو جهش نقطه ای در ژن epsps اشرشیا کولی جهت تبدیل اسید آمینه گلیسین 96 به آلانین و آلانین 183 به ترئونین استفاده شد. در این تحقیق، ژن epsps باکتری اشرشیاکولی(Ec-epsps) با دو جهش مذکور، به پپتید نشانه کلروپلاستی ژن epsps مربوط به گیاه کلزا متصل شد. سپس، سازه ژنی حاصله در ناقل بیانی گیاهی pBI121 همسانه سازی و با روش مبتنی بر Agrobacterium به گیاه کلزا رقم PF-704591منتقل شد. حضور و بیان ژن مورد نظر با آنالیز های مولکولی بررسی و نتایج حاصل از آزمون زیستی نشان داد که گیاهان تراریخت، علف کش گلیفوسیت را تا سطح 2 میلی مولار تحمل می نمایند. در حالی که گیاهان شاهد در غلظت 5/0 میلی مولار از علف کش از بین رفتند.
واژه های کلیدی: کلزا Brassica napus L. ))، مقاومت به علف کش, گلیفوسیت،epsps دستورزی شده، پپتید نشانه کلروپلاستی.
مقدمه
ﮐﻠﺰا (Brassica napus L.) با تامین 12% از کل روغن خوراکی جهان بعد از سویا و نخل روغنی مهم ترین گیاه روغنی به شمار می رود (Canola Council of Canada, 2008). ارزش غذایی روغن آن به دلیل وجود اسید های چرب بی نظیری است که آن را مطلوب تر از سایر روغن های گیاهی نموده است (Barzan et al. 2015; Kakaei et al. 2009) همچنین کنجاله کلزا بعد از روغن کشی به عنوان غذای دام مورد استفاده قرار می گیرد (Stringam et al. 2003). یکی از مهم ترین عوامل تهدید کننده کشت و گسترش کلزا، علاوه بر آفات و بیماری ها، وجود علف های هرز در مزارع می باشد (Bhalla et al., 2008). علف های هرز، کیفیت و کمیت روغن کلزا را کاهش می دهند (Kishore et al., 1988). علف کش با دامنه عملکرد وسیع و غیر انتخابی گلیفوسیت برای کنترل علف های هرز بسیار استفاده می شود. فعالیت اصلی گلیفوسیت در گیاهان، مهار رقابتی آنزیم EPSPS می باشد که ششمین و تخصصی ترین مرحله ساخت اسید های آمینه حلقوی در چرخه شیکیمات که در گیاهان در کلروپلاست قرار دارد، مهار می کند (Amrhein et al., 1983). این چرخه مسئول ساخت اسید های آمینه حلقوی در گیاهان، باکتری ها و برخی از قارچ ها می باشد. دو نوع آنزیم EPSPS تاکنون شناسایی شده است، نوع اول، به طور ذاتی به گلیفوسیت حساس است، درحالی که نوع دوم آن به گلیفوسیت مقاوم می باشد (Funke et al.,2006). پس از اینکه آنزیم EPSPS، هدف اولیه گلیفوسیت در دهه 1980 شناخته شد، این آنزیم اولین انتخاب برای تولید محصولات متحمل به گلیفوسیت قرار گرفت. مطالعات بسیاری در راستای ایجاد آنزیم EPSPS مقاوم به گلیفوسیت تاکنون انجام شده است. یکی از مهم ترین راه کارهای مقاوم سازی گیاهان زراعی به علف کش گلیفوسیت، تولید آنزیم EPSPS مقاوم به علف کش از طریق ایجاد جهش های نقطه ای می باشد (Devine et al., 2000). مطالعات ساختاری بر روی اسید های آمینه حفظ شده در این آنزیم، دو اسید آمینه را شناسایی کرد که در جایگاه فعال این آنزیم قرار ندارند ولی بر روی تمایل گلیفوسیت به EPSPS بسیار موثرند. گلیسین در موقعیت 96 با گلیفوسیت پیوند هیدروژنی برقرار می کند و آلانین در جایگاه183، اسید آمینه مهمی برای میان کنش گلیفوسیت با آنزیم EPSPS می باشد (Schonbrunn et al., 2011). تغییر هر کدام از این اسید آمینه ها به تنهایی تمایل آنزیم به اتصال با گلیفوسیت را به مقدار قابل توجهی کاهش می دهد (al., 2001 Eichholtz et). این تغییرات اگرچه تمایل آنزیم به گلیفوسیت را کاهش می دهد ولی تغییری در فعالیت آنزیم ایجاد نمی کند. در تحقیقات گذشته، در ژن epsps مربوط به باکتری اشرشیا کولی K12 ((Ec-epsps دو جهش جانشینی شامل گلیسین 96 به آلانین و آلانین 183به ترئونین به منظور کاهش تمایل گلیفوسیت به آنزیم EPSPS انجام شد (Kahrizi et al., 2007). در تحقیق حاضر، به منظور انتقال موثر آنزیم EPSPS به کلروپلاست، توالی پپتید نشانه کلروپلاستی (Chloroplast signal peptide) مربوط به ژن epsps گیاه کلزا به ابتدای ژن Ec-epsps اضافه شد و سپس با انتقال این سازه ژنیsp-epsps) ) به کلروپلاست گیاه کلزا، میزان مقاومت گیاه کلزا به علف کش گلیفوسیت مورد ارزیابی قرار گرفت.
مواد و روش ها
مواد مورد استفاده
تنظیم کننده های رشد گیاه و آنتی بیوتیک ها از شرکت Merk آلمان با بالاترین درجه خلوص خریداری شد. کیت های آزمایشگاهی جهت تخلیص محصول PCRو استخراج ناقل، آنزیم های محدودگر و دیگر آنزیم های موردنیاز برای ساخت سازه ژنی از شرکت های Roche و Fermentas تهیه شدند.
سویه های باکتری، ناقل ها و مواد گیاهی
باکتری E. coli سویه DH5α از شرکت Invitrogene خریداری گردید و باکتری آگروباکتری سویه LBA4404، برای تراریختی گیاه استفاده شد. از ناقل همسانه سازی pUC19 و ناقل بیانی گیاهی pBI121 به منظور همسانه سازی و تهیه ساختار های انتقال به گیاه، استفاده شد. بذور کلزا رقم PF-7045-91 از موسسه تحقیقات تهیه و اصلاح نهال و بذر کرج تهیه گردید و تا زمان استفاده در 4- درجه سانتی گراد نگهداری شدند. کلیه روشهای ساخت محیط های کشت و آنتیبیوتیکها، اندازه‌گیری غلظت DNA، تخلیص و هضم آنزیمی پلاسمید، تخلیص محصول هضم آنزیمی، الحاق قطعه هدف در ناقل، تهیه سلولهای مستعد و غربالگری کلونیها براساس کتب مرجع در روشهای آزمایشگاهی مولکولی انجام شد (Sambrook et al., 2001 ).
تهیه سازه ژنی sp-epsps
به منظور اتصال ژنEc-epsps دارای دو جهش مضاعف به پپتید نشانه کلروپلاستی گیاه کلزا، ابتدا ژن Ec-epsps 1300 نوکلئوتیدی توسط آغازگرهای اختصاصی (eps F و eps R) و سپس توالی پپتید نشانه کلروپلاستی ژن epsps گیاه کلزا با آغازگرهای beps F و beps R (200 نوکلئوتید) به طور جداگانه تکثیر شدند، برای ایجاد قطعات همپوشان، یک جفت آغازگر تحت عنوانepsbn F و epsbn R با کمک نرم افزارprimer 3 online (biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi) طراحی شد. بر اساس واکنش زنجیره ای پلیمراز Soeing،دو PCR جداگانه با آنزیم پلیمراز pfu انجام شد. واکنشPCR I و IIبه ترتیب با کمک 1 پیکومول از آغازگرهای epsbn F, eps R، دمای اتصال 57 درجه سانتی گراد و epsbn R ,beps F، دمای اتصال 55 درجه سانتی گراد انجام گردید و پس از الکتروفورز بر روی ژل آگارز 1%، قطعات توسط کیت از روی ژل استخراج گردید. بدین ترتیب در انتهای ´3 ترادف نشانه و ´5 ژن جهش epsps نقاط مشترک به وجود آمد. سپس این دو قطعه با اندازه های 1300 و 200 نوکلئوتیدی با کمک روش Soeing به نسبت 1 به 3 طی دو مرحله به هم متصل شدند. مرحله اول برای اتصال دو قطعه با چرخه های کم (حدود 6 تا 10) در حضور دو محصول PCR I و IIبه نسبت 1 به 3 انجام شد و سپس در مرحله دوم با استفاده از آنزیم Expand high fidelity و با آغازگرهای beps F وeps R قطعه ژنی 1500 نوکلئوتیدی حاصل گردید. سازه ژنی حاصلهsp-epsps نامیده شد (جدول 1).
جدول1- مشخصات آغازگرهای به کار رفته در این تحقیق.
Table 1- Characteristics of the primers used in this study.
|
اندازه محصول تکثیر یافته Product length |
توالی (5'à3') Sequence |
نام توالی Primer name |
Overlapping extension (SOEING) PCR |
|
bp 1300 |
epsbn F: 5'- ACAGCTTCTGTTTCTATGGAATCCCTGACCT-3‘ eps R: 5' –CGGGATCCTCAGGCTGCCTGGCTAATC -3' |
: Ec-epsps |
|
|
bp 200 |
beps F: 5'- AAATTTCTAGAATGGCGCAATCTAGCAGA-3' epsbn R: 5'- ACGTCAGGAATTCCATGGAAACAGAAGCTGT-3' |
peptide signal
|
|
|
1500 bp |
beps F: 5'- AAATTTCTAGAATGGCGCAATCTAGCAGA-3' eps R: 5' –CGGGATCCTCAGGCTGCCTGGCTAATC -3' |
sp-epsps |
ساخت ناقل بیانی sp-epsps-pBI
سازه ژنی sp-epsps پس از تکثیر، در ناقل 19pUC توسط آنزیم لیگازT4 همسانه سازی شد. سپس صحت ناقل sp-epsps pUC- بوسیله آنزیم های برشی، واکنش PCR و توالی یابی با استفاده از آغازگر های استاندارد 13M مورد تائید قرار گرفت. سازه ژنی sp-epsps با آنزیم های برشیXbaI/SacI از ناقل 19pUC برید شده و در ناقل بیانیpBI121 به جای ژن بتاگلوکورونیداز (gus) قرارگرفت. پس از انتقال ناقل sp-epsps-pBI به E. coli، صحت آن توسط برش با آنزیم هایXbaI/SacI و PCR با آغازگر های اختصاصی ژن مربوطه اثبات گردید. ناقل sp-epsps-pBI به روش استاندارد انجماد و ذوب با استفاده از CaCl2 20 میلی مولار و ازت مایع به باکتری آگروباکتری سویه ی LBA4404 منتقل شد و کلونی های رشد یافته بر روی محیط انتخابی کانامایسین/ریفامپیسین توسط واکنش کلونی PCR با آغازگر های اختصاصی مورد تایید قرار گرفتندSambrook et al., 2001) ).
انتقال ژن به گیاه و باززایی آن
به منظور انتقال سازه ژنی مورد نظر به گیاه کلزا، بذور این گیاه پس از ضد عفونی شدن سطحی، در محیط MS کشت داده شدند. سپس با قطع کردن دمبرگ های لپه ای، ریزنمونه ها تهیه گردیدند. ریزنمونه ها بر روی محیط پیش کشت حاویmg/l 5/3 هورمون BAP کشت داده شدند. پس از مجاورت با آگروباکتری، ریزنمونه ها به مدت 48 ساعت در دمای 25 درجه سانتی گراد در محیط کشت هم کشتی با اگروباکتری قرار گرفتند. پس از باززایی بیشتر ریزنمونه ها و به منظور حذف نمونه های غیر تراریخت، این شاخه ها به محیط انتخابی با mg/l15 کانامایسین منتقل شدند. گیاهچه های بدست آمده که از نظر اندازه و ریشه دهی آمادگی لازم را دارا بودند، به خاک انتقال داده شدند.
تایید تراریختی گیاهان کلزا از طریق واکنش PCR
جهت بررسی گیاهان تراریخت و اثبات حضور ساختارهای مورد نظر در ژنوم گیاه، روش PCR با آغازگرهای اختصاصی ژن sp-epsps برای ژنوم گیاه کلزا با دمای اتصال 58 درجه سانتی گراد انجام شد.
تأیید بیان ژن در سطح رونویسی در گیاه تراریخت
به منظور تأئید بیان تراژن در گیاهان تراریخت شده از روش RT-PCR استفاده شد. بدین منظور، RNA از گیاه تراریخت با استفاده از کیتRNX (PLUS) استخراج شد و پس از ساخت cDNA تک رشته‌ای و تعیین رقت مناسب، از آن به عنوان الگو برای ساخت cDNA دو رشته‌ای و تکثیر آنها توسط PCR و دمای اتصال 58 جهت تایید بیان ژن مصنوعی در گیاه تراریخت استفاده شد.
آزمون زیستی گیاهان تراریخت نسل T0
جهت ارزیابی مقاومت به گلیفوسیت، گیاهان تراریخته با سازه ژنی و گیاهان شاهد (غیر تراریخته) با غلظت های مختلف گلیفوسیت (5/0، 1، 2/1، 5/1 و 2 میلی مولار (محلول پاشی شدند. یک هفته پس از اولین تیمار، دوباره این محلول پاشی تکرار شد. پس از گذشت 2 هفته وضعیت گیاهان و میزان سبز بودن برگ های آن ها مورد بررسی قرار گرفت.
نتایج و بحث
آنزیم EPSPS توسط ژنوم هسته ای کد شده و پس ازساخته شدن بر روی ریبوزوم های سیتوپلاسمی به درون کلروپلاست هدایت می شود (Read and Cobb, 2002). اطلاعات لازم برای هدفمند شدن پروتئین به سمت اندامک مورد نظر توسط بخشی از توالی پپتیدی که معمولاً در انتهای آمینی پروتئین قرار گرفته و پپتید نشانه نام دارد، مهیا می‌گردد. امروزه، استفاده از این توالی ها در تحقیقات زیست فناوری به منظور هدایت پروتئین نوترکیب به اندامک های خاص رو به افزایش است. این ترادف ها به گونه ای عمل می‌کنند که کارآیی انتقال یک پروتئین ساخته شده در سیتوپلاسم به داخل اندامک را چندین بار افزایش می‌دهد. با توجه به جایگاه مسیر شیکیمات در کلروپلاست گیاهان، باید ژن epspsدارای دوجهش مضاعف را به روشی کارا به درون کلروپلاست گیاه کلزا هدایت کرد. به این منظور در این پروژه ژن epspsباکتری اشرشیا کولی و پپتید نشانه کلروپلاستی گیاه کلزا، از طریق واکنش PCR به طور مجزا با کمک آغازگرهای هم پوشان توسط آنزیم pfu تکثیر و دو قطعه ی 1300 و 200 نوکلئوتیدی حاصل شد (شکل1 الف و ب). سپس این 2 قطعه تکثیر شده، با استفاده از آغازگر beps F و eps R وآنزیم Expand high fidelityبه یکدیگر متصل شده و سازه ی ژنی sp-epsps با اندازه 1500 جفت بازی حاصل گردید ( شکل 1 ج).
شکل 1- الگوی الکتروفورز محصولPCR برای تکثیر قطعات هم پوشان در توالی های Ec-epsps و پپتید نشانه و اتصال آنها توسط روش توسعه نقاط هم پوشان الف) چاهک 1: نشانگر وزن مولکولی Kb 1 (Fermentas) چاهک2: تکثیر قطعه حد واسط پپتید نشانه کلروپلاستی (bp200) با آغازگر epsbn R و beps F. ب) چاهک 1: تکثیر قطعه حد واسط epsps (bp1300 ( با آغازگر eps R و epsbn F چاهک 2: نشانگر وزن مولکولی Kb 1 (Fermentas). ج) اتصال ژن Ec-epsps به پپتید نشانه کلروپلاستی با به کارگیری آغازگرهای اختصاصی(beps F و eps R) چاهک 1: سازه ژنی sp-epsps (bp 1500( چاهک 2: نشانگر وزن مولکولی Kb 1(Fermentas).
Figure 1- Electrophoretic pattern of PCR products for amplification of overlapping fragments in Ec-epsps and signal peptide sequences and fusion of them by overlapping extension technique. A: Lane 1, 1 Kb ladder; Lane2, amplification of signal peptide intermediate fragment (200 bp) using beps F and epsbn R primers; B: Lane 1, amplification of epsps intermediate fragment (1300 bp) using eps R and epsbn F primers, Lane 2, 1 Kb ladder (Fermentas); C: Fusion of Ec-epsps to chloroplast signal peptide using specific primers (beps F و and eps R); Lane 1, sp-epsps (1500 bp), Lane 2, 1 Kb ladder (Fermentas).
قطعه نهایی در ناقل 19pUC همسانه سازی شد و در مرحله بعد پس از برش ناقل 19pUC با استفاده از آنزیم هایXbaI و SacI، سازه ژنی sp-epspsدر ناقل pBI121 توسط یک واکنش اتصال قرار می گیرد و سپس ناقل sp-epsps-pBI برروی محیط جامد حاوی آنتی بیوتیک کانامایسین غربالگری شد. پس از تایید همسانه سازی سازه ژنی در ناقل pBI121 با کمک هضم آنزیمی و PCR با آغازگرهای اختصاصی، جهت انتقال ژن به گیاه، این ناقل به اگروباکتری منتقل شد (به روش انجماد و ذوب) ( شکل 2).
شکل 2- تایید سازه ژنی sp-epsps-pBI از طریق واکنش زنجیره ای پلی مراز، چاهک های 1-5: تایید حضور ناقل حاوی قطعه sp-epsps در باکتری های نوترکیب از طریق PCR با آغازگر های اختصاصی چاهک6: ناقل pBI121بدون سازه ژنی به عنوان کنترل منفی، چاهک 7: نشانگر وزن مولکولی Kb 1 (Fermentas).
Figure 2- Confirmation of pBI-epsps gene construct by polymerase chain reaction, Lanes 1-5, confirmation the presence of vector contains sp-epsps fragment in recombinant bacteria by PCR with specific primers; Lane 6, pBI121 without gene construct as a negative control; Lane 7, 1Kb ladder (Fermentas).
کشت بافت و تراریختی گیاه
برای انتقال ژن به گیاه کلزا از باکتری اگروباکتری سویه LBA4404 استفاده شد و با توجه به وجود ژن مقاومت به کانامایسین در قطعه ی انتقال یافته، تولید نوساقه در بعضی از برگ های لپه ای بر روی محیط کشت گیاهی حاوی کانامایسین مشاهده شد(شکل 3). شاخه های سبز باززایی شده به محیط طویل شدن نوساقه و القای ریشه زایی انتقال داده شدند.
آزمون PCR به منظور اثبات حضور سازه ژنی در گیاهان تراریخت
به منظور بررسی مولکولی گیاهان تراریخت، DNA ژنومی با استفاده از کیت تخلیص DNA ،از برگ های جوان و سبز گیاه کلزای تراریخت و شاهد غیر تراریخت استخـراج گــردید. نتیجه PCR با استفاده ازآغازگرهای اختصاصی ابتدای ترادف نشانه و انتهای ژن جهش یافته epsps در شکل 4 آمده است.
شکل 3- گیاهچه های سبز[U1] تراریخت در محیط طویل شدن نوساقه حاوی mg/l 15 کانامایسین پس از1 ماه.
Figure 3- Green transformed plant in shoot elangation medium containing 15 mg/l kanamycin after one month.
آزمون RT-PCR به منظور اثبات حضور رونوشت در گیاهان تراریخت
پس از تائید حضور ژن sp-epsps در گیاهان تراریخت با استفاده از PCR، اقدام به بررسی نسخه‌برداری و بیان این ژن ها با کمک روش RT-PCR شد. پس از استخراج RNA کل و ساخت cDNA، با به کارگیری آغازگر های اختصاصی سازه ژنی، واکنش PCR انجام شد. همان طور که انتظار می رفت، در محصول RT-PCR گیاه تراریخت باند حدود bp1500 مشاهده گردید(شکل 5).
ارزیابی مقاومت به گلیفوسیت در گیاهان تراریخته
جهت ارزیابی مقاومت به گلیفوسیت، گیاهان تراریخته و گیاهان شاهد (غیر تراریخت) در غلظت های مختلف گلیفوسیت محلول پاشی شدند. گیاهان شاهد در غلظت 5/0 میلی مولار گلیفوسیت در مرحله اول از بین رفتند اما گیاهان تراریخت تا غلظت 2 میلی مولار، پس از 2 مرحله محلول پاشی با فاصله یک هفته، تحمل نشان دادند که نشان دهنده تحمل نسبی گیاهان تراریخت به علف کش گلیفوسیت می باشد (شکل 6).
شکل 4- الگوی الکتروفورز محصول آزمون PCR برای اثبات حضور سازه ژنی sp-epsps (bp 1500) در گیاه کلزا با بکارگیری آغازگرهای اختصاصی eps R و beps F، چاهک های 1 تا 3: محصول PCR گیاه تراریخت حاوی سازه ژنی sp-epsps (bp1500)، چاهک4: گیاه کلزای غیر تراریخت (کنترل منفی)، چاهک 5: ناقل نوترکیب pBI121 (کنترل مثبت)، چاهک 6: نشانگر وزن ملکولی Mix (Fermentas).
Figure 4- Electrophoretic pattern of PCR assay products to confirm the presence of sp-epsps construct (1500 bp) in canola plant using specific primers beps F and eps R. Lanes 1-3, PCR products of transformed plant containing sp-epsps (1500 bp); Lane 4, untransformed canola plant (negative control); Lane 5, recombinant pBI121 vector (positive control); Lane 6, Mix ladder (Fermentas).
شکل 5- الگوی الکتروفورز محصول RT-PCR گیاهان کلزای تراریخت حاوی سازه ژنی sp-epsps (bp 1500) با بکارگیری آغازگرهای اختصاصی eps R و beps F، چاهک 1-2: محصول RT-PCR گیاه تراریخت حاوی سازه sp-epsps (bp1500)، چاهک 3: ناقل نوترکیب pBI121 (کنترل مثبت)، چاهک 4 : گیاه کلزای غیر تراریخت (کنترل منفی)، چاهک 5: نشانگر وزن ملکولی Kb1 Fermentas)).
Figure 5- Electrophoretic pattern of RT-PCR products in transformed canola plants containing sp-epsps construct (1500 bp) using specific primers beps F and eps R. Lanes 1-2, RT-PCR products of transformed plants containing sp-epsps construct(1500 bp); Lane 3, recombinant pBI121 vector (positive control); Lane 4, untransformed canola (negative control); Lane 5, 1 Kb ladder (Fermentas).
|
ب (B) |
الف (A) |
شکل 6- مقایسه گیاهچه های تراریخت (الف) و غیر تراریخت (ب) پس از محلول پاشی با 2 میلی مولار گلیفوسیت بعد از گذشت سه هفته.
Figure 6- Comparison of the transformed plant (A) and an untransformed plant (B) after spraying with 2 mM glyphosate after three weeks.
گیاهان تراریخت در غلظت 5/0 میلی مولار از گلیفوسیت که برای گیاهان غیر تراریخت کشنده است قادر به تحمل علف کش هستند، هر چند که با افزایش میزان دز علف کش تحمل گیاهان کاهش می یابد ولی در بالاترین غلظت اعمال شده، غلظت 2 میلی مولار، گیاهان تراریخت همچنان عملکرد بهتری نسبت به گیاه غیر تراریخت در غلظت کشنده دارند.
مطالعات متعدد نشان داده است که برخی اسید های آمینه حفظ شده در آنزیم EPSPS نقش اساسی در اتصال گلیفوسیت به این آنزیم دارند و بنابراین ایجاد تغییرات در این اسیدهای آمینه از اصلی ترین روش ها برای جلوگیری از بازدارندگی و عدم اتصال گلیفوسیت به آنزیم EPSPS شده است. برای اولین بارpadgette و همکارانش آنزیم EPSPS با تحمل بالا به گلیفوسیت را گزارش کردند که دارای جهش جانشینی Gly96 Ala بود (Padgette et al., 1991 ). در این پروژه از ژن epsps Ec- باکتریایی که توسط روش جهش زایی نقطه ای، جهش یافته (Ala183Thr وGly96Ala ) و متحمل به گلیفوسیت شده بود استفاده گردید (Kahrizi et al., 2007). اسیدهای آمینه Gly96 و Ala183 دو جایگاه اساسی برای میان کنش علف کش گلیفوسیت با آنزیم می باشند و تغییر هر کدام به تنهایی تمایل آنزیم به اتصال با گلیفوسیت را به مقدار قابل توجهی کاهش می دهد(al., 2001 Eichholtz et). این تغییرات اگرچه تمایل آنزیم به گلیفوسیت را کاهش می دهد ولی تغییری در فعالیت آنزیم ایجاد نمی کند. مطالعات همچنین نشان داده است که می توان تمایل آنزیم به گلیفوسیت را توسط ایجاد تغییرات در آمینواسیدهای دیگر ی نیز کاهش داد ( Baerson et al., 2002).
مقایسه نتایج حاصل از تراریختی گیاه کلزا توسط آنزیم epsps بدون پپتید نشانه حاکی از آن است که میزان مقاومت ایجاده شده در گیاه کلزا نسبت به علف کش گلیفوسیت، یک مقاوت نسبی بوده است(Kahrizi et al., 2008). تصادفی بودن سیستم انتقال ژن از طریق اگروباکتری در درون ژنوم میزبان و تعداد نسخه های وارد شده تراژن و پدیده خاموشی ژن می تواند دلیل مقاومت نسبی به علف کش گلیفوسیت باشد (Bhalla and Smith, 1998 ). با توجه به این که جایگاه آنزیم EPSPS در کلروپلاست گیاه قرار دارد(Della-Cioppa et al., 2006) برای هدایت آن به سمت کلروپلاست یک پپتید نشانه کلروپلاستی با منشا گیاه کلزا ابتدای این آنزیم اضافه شد. نتایج حاصل از تراریختی گیاه کلزا با آنزیم EPSPS همراه با ترادف نشانه کلروپلاستی نشان داد که میزان مقاومت حاصله در مقایسه با مطالعات پیشین که بدون توالی نشانه انجام شده بودند، افزایش چشمگیری نداشت. به نظر می رسد بررسی ساختار فعال و عملکردی آنزیم EPSPS پس از افزایش پپتید نشانه کلروپلاستی و مقایسه آن با آنزیم EPSPS بدون پپتید نشانه کلروپلاستی ضروری می باشد. لذا تراریختی ژنوم کلروپلاست با ژن epsps در ژنوم کلروپلاست می تواند یکی دیگر از راه کارهای مناسب برای ایجاد کلزای مقاوم به علف کش باشد (Ye et al., 2001).
تشکر وقدردانی
نگارندگان از همکاری پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری در تامین اعتبار پروژه (طرح 407-م)و امکانات لازم، کمال تشکر و قدردانی را دارند.
منابع
Baerson SR, Rodriguez DJ, Tran M, Feng Y, Biest NA, Dill M (2002). Glyphosate- resistant goosegrass. Identification of a mutation in the target enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase. Plant Physiology 129: 1265-1275.
Barzan Z, Dehdari M, Amiri Fallahi R. (2015). Study of genetic diversity in rapeseed (Brassica napus L.) genotypes using microsatellite markers. Journal of Agricultural Biotechnology 7(1): 29-42.
Bhalla PL, Smith N (1998). Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of cauliflower, Brassica oleracea var. botrytis. Molecular Breeding 4:531–541
Bhalla L prem, Singh M (2008). Agrobacterium-mediated transformation of Brassica napus and Brassica oleracea. Nature protocol 3:181-9
Canola Council of Canada., (2008). Available from: http://www.canola-council.org/canola_resources/product45.aspx
Della-Cioppa G, Bauer SC, Taylor ML, Rochester DE, Klein BK (1987). Targeting a herbicide resistant enzyme from Escherichia coli to chloroplasts of higher plants. Nature Biotechnology 5: 579.584
Devine M D, Shukla A (2000). Altered target sites as a mechanism of herbicide resistance. Crop protection 19: 881-889
Eichholtz DA, Alan D, Gasser CS, Scott C, Kishore GM, Murthy G (2001). U.S. Patent 225: 114.
Eschenburg S, Healy M, Priestman M, Lushington,G, Scho¨ nbrunn E (2002). How the mutation glycine96 to alanine confers glyphosate insensitivity to 5- enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase from Escherichia coli. Planta 216: 129–135
Funke T, Han Huijong, Healy-Fried Martha L, Fischer Markus, Scho¨nbrunn Ernst (2006). Molecular basis for the herbicide resistance of Roundup Ready crops. Proceedings of the National Academy of Sciences 103: 13010–13015
Healy-Fried M, Funke T, Priestman M, Han H, Schonbrunn E (2007). Structural basis of glyphosate tolerance resulting from mutations of pro101 in Escherichia coli 5- Enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase. The journal of biological chemistry 282:32949–32955
Kahrizi D, Salmanian A.H, Afshari A, Mousavi A, Moeini A, (2008). Substitution of Amino Acid Ala-183 to Thr in 5-enolpyruvylshikimate 3-phoshpate Synthase of E. coli (k12) and the Effect of This Altered Gene in Glyphosate Tolerance in Rapeseed Plant (Brassica napus L.). Pajoohesh va Sazandeghi 79: 151-159
Kahrizi D, Salmanian A, Afshari A, Moeinie M, Mousavi A (2007). Simultaneous substitution of Gly96 to Ala and Ala183 to Thr in 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase gene of E. coli (k12) and transformation of rapeseed (Brassica napus L.) in order to make tolerance to glyphosate. plant cell Reports 26: 95-104
Kahrizi D, Salmanian A.H, Afshari A, Mousavi A, Moeini A, Karimzadeh GH (2004). Isolation, Molecular Characterization and Site Directed Mutagenesis in Bacterial EPSPS gene in order to confer tolerance to glyphosate herbicide in canola plant. Pajoohesh va Sazandeghi 64: 94-103
Kakaei M., Zabarjadi A.R., Mostafaie A. (2009). Comparison of genetic and morpho-physiological distance via SDS-PAGE marker in some rapeseed genotypes. Journal of Agricultural Biotechnology, 1(2): 79-93.
Kishore G M, Shah D (1988). Amino acid biosynthesis inhibitors as herbicides. Annual Reviews of Biochemistry 57: 627-663
Padgette S, Biest D, Gasser C S, Eichholtz D, Frazier R, Hironaka C,Levine E, Shah D, Fraley R, Kishore G (1991). Site-directed mutagenesis of conserved region of the 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatse synthase active site. The journal of biological. Chemistry 266: 22361-22369.
Reade JPH, Cobb AH (2002). Herbicides: modes of action and metabolism. Management handbook. Blackwell Science Oxford pp 134–170.
Sambrook J, Russell D W (2001). Molecular Cloning. A Laboratory manual. Cold Spring Harhor Press. New York
Schonbrunn E, Eschenburg S, Shuttleworth WA, Schloss JV, Amrhein N, Evans JN, Kabsch W (2001). Interaction of the herbicide glyphosate with its target enzyme 5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase in atomic detail. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 98: 1376-1380.
Stringam G R, Ripley V L, Love H K, Mitchell A (2003). Transgenic Herbicide Tolerant Canola. The Canadian Experience Crop Science 43:1590 1593.
Ye GN, Hajdukiewicz PT, Broyles D, Rodriguez D, Xu CW (2001). Plastid-expressed 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase genes provide high level glyphosate tolerance in tobacco. The Plant Journal 25: 261.270
Transformation of rapeseed by mutated epsps gene fused to chloroplast signal peptide towards enhancing tolerance to glyphosate
Ghavami M. 1, Mousavi1 A.* 2, Salmanian A.H.3, Hadi F.4
1M.Sc student, Department of Bbiology, Faculty of Science, Tarbiat Moallem University of Azarbaijan.
2Associate Professor, Department of Plant Biotechnology, National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology (NIGEB), Tehran, Iran.
3Professor, Department of Plant Biotechnology, National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology (NIGEB), Tehran, Iran.
4Assistant Professor, Department of Biology, Faculty of Science, Lorestan University, Khoramabad, Iran.
Abstract
One of the most effective approaches for weed control is production of glyphosate herbicide tolerant crops. Glyphosate blocks plant growth by inhibiting EPSPS (5- enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase) enzyme which in shikimate pathway for the biosynthesis of aromatic amino acids in plants and cause plant death. Manipulation of epsps gene in order to reduce its affinity for glyphosate is one of the best methods for production of glyphosate-tolerant plants. In the previous studies, site-directed mutagenesis was used to confer two point mutations in E. coli epsps gene in order to convert Glycine96 to Alanine (Gly96Ala) and Alanine 183 to Threonine, (Ala183Thr). In this study, mutated epsps gene was fused to the chloroplast signal peptide from B. napus L. epsps gene. Then, the manipulated Ec-epsps gene was cloned in pBI121 as a plant expression vector; Agrobacterium–mediated transformation was used to deliver the recombinant pBI121 in rapeseed cultivar PF-704591. Molecular analyses were used to confirm the presence and expression of the transgene. Bioassay analysis showed that the amount of glyphosate tolerance in transgenic plants was 2 mM, whereas the non-transformed ones were unable to survive in 0.5 mM glyphosate.
Key words: Rapeseed, tolerance to herbicide, Manipulated epsps, Glyphosate, Chloroplast Signal Peptide.
)
