Studying PR2 and PAL genes involvement in rice resistance against Acidovorax avenae subsp. Avenae

مطالعه نقش ژن‌هایPR2  وPAL  در مقاومت گیاه برنج به باکتری Acidovorax avenae subsp. Avenae

امیر مسعود حیدری نژاد*¹، ولی اله بابایی زاد²، حشمت اله رحیمیان³

¹دانشجوی کارشناسی ارشد، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری، گروه گیاهپزشکی

²استادیار، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری، گروه گیاهپزشکی

³استاد، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری، گروه گیاهپزشکی

تاریخ دریافت: 09/08/1393، تاریخ پذیرش: 26/05/1394

چکیده

بیماری‌های گیاهی یکی از محدودیت‌های بزرگ در تولید محصولات کشاورزی به شمار می‌روند. نواری قهوه‌ای باکتریایی برنج با عامل Acidovorax avenae subsp. avenae از جمله بیماری‌های برنج است که در خزانه روی برگ و غلاف گیاهچه‌ها نوارهای آبسوخته و قهوه‌ای ایجاد می‌کند. گیاهان همواره برای مقابله با آفات و بیمارگرها مکانیسم‌های دفاعی مختلفی کسب کرده‌اند. در این میان ژن‌های مقاومت گیاه برنج (R genes)، از جمله پروتئین‌های در ارتباط با بیماری‌زایی نقش مهمی در تعامل برنج با عوامل بیماری‌زا دارند. هدف از این مطالعه بررسی نقش ژن‌های‌ مرتبط با بیماری‎زایی PR2 و PAL در دو رقم برنج طارم محلی و ساحل در طی تیمار با جدایه بیماری‌زای باکتری عامل نواری قهوه‌ای با استفاده از تکنیک Quantitative Real-time PCR است. نمونه برداری از برگ‌های تلقیح شده با سوسپانسیون باکتری در بازه‌های زمانی مختلف صورت گرفت. از نمونه‌ها RNA کل استخراج و DNA مکمل ساخته شد. بیان ژن‌های هدف مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج آماری حاصل از این پژوهش نشان داد که بیان ژن‌های PR2 و PAL در رقم مقاوم ساحل نسبت به رقم حساس طارم محلی پس از مایه زنی به شکل معنی داری افزایش یافت. افزایش نرخ بیان دو ژن مورد بررسی، حاکی از نقش این دو ژن در مقاومت گیاه برنج به باکتری عامل بیماری نواری قهوه‌ای می‌باشد.

واژه های کلیدی: RNA، برنج، بیان ژن، مقاومت، Real-Time PCR.

مقدمه

برنج (Oryza sativa L.) از جنس Oryza متعلق به قبیله Oryzeae از خانواده Poaceae می باشد (Van Nguyen and Ferrero, 2004). از نظر مورفولوژیکی برنج گیاهی است علفی، یک ساله، ایستاده، دارای ریشه افشان، سطحی، قوی و به رنگ سفید می‌باشد. برنج غذای اصلی حدود 5/2 میلیارد نفر از جمعیت جهان می‌باشد  که حدود 20 درصد از انرژی مورد نیاز روزانه و پروتئین 15 درصد از مردم دنیا را تامین می کند(Ghamar et al., 2013) . بر اساس گزارش سازمان خوار و بار کشاورزی (FAO) میزان سطح زیرکشت برنج در جهان در سال 2012، 7/193 میلیون هکتار، یعنی 30 میلیون هکتار بیش از کل مساحت کشور ایران می‌باشد.

بیماری نواری قهوه‌ای باکتریایی[1] برنج که نواری شدن باکتریایی هم نامیده می‌شود، در خزانه‌های تالابی و زمین‌های مرتفع، همچنین در جعبه‌های نشاء نیز رخ می دهد. علائم نواری قهوه‌ای باکتریایی توسط باکتری Acidovorax avenae subsp. avenae ایجاد و توسط بذر منتقل می‌شود. علائم شامل نوار‌های آبسوخته روی برگ‌ها و غلاف‌های برگ است که در ادامه به رنگ قهوه‌ای در می‌آید. روی برگ‌ها نوارها در بین رگبرگ‌ها یا در طول رگبرگ اصلی یا در حاشیه برگ‌ها تشکیل می‌شوند(Sharifnabi, 2010). اندازه نوار‌ها یا لکه‌ها تا 1mm × 1cm  است، اما این ها ممکن است به هم متصل شوند و لکه‌های پهن‌تر و طویل‌تری تشکیل دهند. عامل بیماری همچنین می‌تواند به برگ‌های جوان و باز شده حمله کند و باعث پوسیدگی آن‌ها شود، که این ممکن است منجر به توقف رشد یا مرگ گیاهچه شود.

تمام گیاهان دارای سازوکارهای دفاعی هستند و مقاومت به بیماری استثنا نیست، بلکه یک قاعده است. بیمارگرهای باکتریایی در برخی از گیاهان، تحت شرایط خاص ایجاد بیماری می‌کنند. روش‌های جدید زیست شناسی مولکولی سعی در شناخت سازوکارهایی دارند که همکنش بیمارگر-گیاه را کنترل می‌کنند. بسیاری از همکنش‌های گیاه- باکتری اختصاصی عمل می‌کنند. این اختصاصی بودن به تشخیص مولکول های دو میکروارگانیسم در سطح سلولی بستگی دارد. شواهد زیادی وجود دارد که نشان می‌دهد همکنش باکتری-گیاه شامل فرایند‌های تشخیص مولکولی بین گیاه و بیمارگر باکتریایی   است. به عنوان مثال، ژن مقاومت Pto در گوجه فرنگی که باعث مقاومت گیاه در برابر باکتری Psudomonas syringae pv. Syringae می‌شود، یک پروتئین کیناز سیتوپلاسمی را رمزگذاری می‌کند که به نظر می‌رسد به طور مستقیم با پروتئین avr Pto که توسط باکتری مستقیما وارد سیتوپلاسم گیاه می‌گردد، واکنش می‌کند (Agrios, 2005). تبادل ممتد اطلاعات بین گیاه و باکتری مشحص می‌کند که آیا همکنش منجر به بیماری می‌شود یا در ایجاد مقاومت گیاه نقش دارد. گیاهان بیمارگر را تشخیص داده و ترکیبات شیمیایی دفاعی تولید می‌کنند. بیمارگرها نیز گیاهان میزبان را شناسایی کرده و سازوکارهایی را به کار می‌برند تا بر سازوکارهای دفاعی میزبان غلبه کنند. در طول همکنش مولوکول‌های مشتق شده از گیاه به عنوان سیگنال‌هایی عمل کرده که بیان ژن‌های باکتری را القا می‌کنند. محصولات این ژن‌ها نیز تغییراتی در بیان ژن‌های گیاهی ایجاد می‌کنند که در نهایت باعث تغییرات متابولیکی در گیاهان می‌شود. این نوع همکنش صرف نظر از سازگار یا ناسازگار بودن در اکثر همکنش‌های گیاه و باکتری مشاهده می‌شود (Vidhyasekaran, 2002). واکنش‌های گیاهان به حمله بیمارگرها پیچیده است و شامل تحریک ژن‌های بسیاری که پروتئین‌های متنوعی را کد می­کنند، می‌باشند (Jwa et al., 2006).

مقاومت القاء شده سرتاسری [2](SAR) و مقاومت سیستمیک القایی[3](ISR)  مکانیسم‌های دفاعی گیاه هستند که به دنبال تحریک گیاه با بیمارگر یا عوامل القایی دیگر، در گیاه القا می‌شوند. این پاسخ دفاعی به صورت موضعی در محلی که مورد حمله پاتوژن قرار گرفته است و همچنین به صورت سیستمیک در بخش‌های دورتر غیر آلوده گیاهی که مورد حمله پاتوژن قرار گرفته است القا می شود (Zhang and Klessig, 1997). فنیل آلانین آمونیالیاز (PAL)، ترانس سینامیک اسید[4] را ابتدا به 2-هیدروکسی سینامیک اسید[5] و یا بنزوئیک اسید[6] و در نهایت به سالیسیلیک اسید تبدیل می‌کند. سالیسیلیک اسید باعث فعال شدن مسیرSAR  می‌شود.(Wildermuth et al., 2001)  ژن‌های PR1 و PR2 به طور عمده از مسیر SAR فعال می‌شوند (Agrios, 2005). در کنار دفاع ساختمانی، SAR در مقاومت گیاهان شرکت می‌کند و یک امتیاز انتخابی را برای بقا تدارک می‌بیند .(Sticher et al., 1997) این پاسخ دفاعی القا شونده شامل تغییرات سیتولوژیکی و بیوشیمیایی می‌باشد و به تولید سیگنال که از قسمت‌های دیگر گیاه منتقل می‌شود بستگی دارد. زمان مورد نیاز برای ایجاد SAR  به گیاه و نوع ارگانیسم القا کننده بستگی دارد. میزان حفاظت نیز به ارگانیسم مورد استفاده برای آلودگی اولیه و به ویژه روی اندازه نکروز تولید شده بستگی دارد. فرایند SAR هم در تک لپه ای‌ها و هم دو لپه ای­ها القا می‌شود. شروع SAR اغلب به بیان پروتئین‌های  (PR)[7]  منتهی می‌شود.

مقاومت القای سراسری  (ISR) نوعی مقاومت است که در اثر سودوموناس ، رایزوباکترهای غیر بیماری زا، و همزیستی گیاهان با قارچ های همزیست نظیر Piriformospora indica   القا می‌شود و حفاظت سراسری علیه قارچ‌ها، باکتری‌ها و ویروس‌ها ایجاد می‌کند (Vleesschauwer et al., 2008). در اکثر موارد پدیده ISR مستقل از تولید و تجمع سالیسیلیک اسید و نیازمند پاسخ‌های دفاعی وابسته به جاسمونیک اسید و اتیلن است (Vleesschauwer et al., 2008). پروتئین لیپوکسی‌ژناز[8]، لینولئیک اسید[9] را به جاسمونیک اسید تبدیل می‌کند (Vick and Zimmerman, 1983)، و به نوعی در مسیر مقاومت سیستمیک القایی (ISR)  نقش دارد. مکانیسم دقیق ISR کاملا مشخص نیست.

کلمه (PR) Pathogenesis related proteins شامل مجموعه پروتئین‌های القا شده توسط میکروب‌هاست که عموما به طور ترکیبی در اغلب آلودگی‌ها افزایش می‌یابند. این پروتئین‌ها ابتدا در واکنش فوق حساسیت برگ‌های توتون به TMV به وسیله دو گروه مستقل شناسایی و در ابتدا b-protein  نامیده شدند (Gianinazzi et al, 1970; Vanloon, 1985). تصور می‌شد که این پروتیئن‌ها تنها در مقاومت گیاهان در واکنش فوق حساسیت به پاتوژن‌های ویروسی، باکتریایی و قارچی معمول بیان می‌شوند. اما بعدها مشخص شد که این پروتئین‌ها تنها در مقاومت القا نمی‌شوند و حتی در تعامل سازگار گیاه و پاتوژن و حتی در مقابل فاکتورهای غیر زنده نیز بیان می‌شوند (Van Loon, 1985). می‌توان گفت که در گیاهان مقاوم سریع‌تر و به میزان بیشتر تولید می‌شوند. از زمان کشف اولین PRها در سال 1970 در گیاهان توتون آلوده به  TMVتاکنون 17 خانواده از آنها بر اساس توالی آمینواسیدی، روابط سرولوژیکی و فعالیت های بیولوژیکی و آنزیمی شناخته شده است (Van Loon et al, 2006).

این مطالعه با هدف بررسی نقش ژن‌های‌ دخیل در القای مقاومت‌PR2[10]  و PAL[11] در تعامل دو رقم حساس (طارم محلی) و مقاوم (ساحل) گیاه برنج با باکتری A. Avenae subsp. Avenae انجام شد. نتایج حاصل از این پژوهش می‌تواند در تولید گیاهان برنج تراریخته مقاوم به عامل بیماری نوار قهوه‌ای برنج سودمند باشد. 

مواد و روش‌ها

باکتری عامل بیماری، جدا شده از گیاهچه‌های برنج مشکوک به علائم نواری قهوه ای از شالیزارهای شهرستان نکا، مورد مطالعه در آزمایشگاه باکتری شناسی دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری، دریافت شد.

بذور لاین­های برنج مورد نظر از معاونت تحقیقات برنج کشور (مازندران، آمل) جمع­آوری و جهت انجام پژوهش به آزمایشگاه منتقل شدند. جهت استریل نمودن بذور از محلول کربوکسین - تیرام به نسبت 2 در هزار استفاده شد (Hashemi et al, 2013). بذور درون پتری­دیش حاوی کاغذ صافی مرطوب پخش و به اتاقک کشت با رطوبت نسبی نود درصد و دمای بیست ­و هشت درجه سلسیوس منتقل شدند. پنج روز بعد بذرها به ­خوبی جوانه زده و برای کاشت آماده شدند. حداکثر بیست عدد بذر درون هر گلدان حاوی خاک استریل کاشته شد. گیاهچه‌ها در شرایط گلخانه با محدوده­ دمایی 35-30 درجه سلسیوس و دوره تناوبی 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی در شرایط غرقابی نگهداری شدند (Hashemi et al, 2013).

در این تحقیق پس از انجام آزمون غربالگری و بررسی سطوح مقاومت، دو رقم طارم محلی و ساحل به عنوان ارقام انتخابی برای بررسی‌های مولکولی استفاده شد. سوسپانسیونی از باکتری تازه کشت شده با غلظت 10⁷ سلول در هر میلی لیتر، محاسبه شده با دستگاه اسپکتوفتومتر (در طول موج 600 نانومتر)، تهیه و به گیاهچه ها تزریق شد. در هر گلدان 4 گیاهچه توسط سرنگ استریل حاوی سوسپانسیون باکتری تلقیح و روی گلدان‌ها با نایلون مرطوب پوشیده شد. گیاهان در شرایط گلخانه نگهداری شدند. نمونه برداری از گیاهان تیمار شده در زمان های صفر (شاهد)، 24، 48، 72 و 96 ساعت پس از انجام آلودگی شد.

استخراج RNA از نمونه­های نگهداری شده در فریزر 80- درجه سلسیوس با استفاده از بافر RNX-Plus  (شرکت سیناژن) طبق دستور العمل مربوطه انجام شد. به منظور زدودن DNA ژنومی از نمونه های RNA از کیت DNase I, RNase-free ساخت شرکت Fermentas طبق دستورالعمل شرکت سازنده استفاده شد.

نمونه­ها با استفاده از ژل آگارز 1 درصد در بافر TBE (40 mM Tris acetate 1 mM EDTA 1X) بررسی شدند. پنج میکرولیتر از RNA استخراج شده به همراه دو میکرولیتر رنگ (برم فنل بلو25 میلی گرم، زایلن سیانول اف اف 25 میلی گرم، گلیسرول 3.3 میلی لیتر و آب دوبار تقطیر 6.7 میلی لیتر) به چاهک ­های ژل انتقال داده و الکتروفورز در بافر TBE در ولتاژ 80 به مدت 5/1 ساعت انجام شد. ژل در اتیدیوم بروماید (µg /mL ./5)  به مدت پانزده دقیقه رنگ آمیزی و با نور UV دستگاه ژل خوان کداک (GEL LOGIC 200) از آن عکس­برداری شد.

سنتز cDNA با استفاده از AccuPowerR CycleScript RT PreMix (dN6) kit  و براساس دستورالعمل، از محتوی RNA کل استخراج شده ساخته شد. به منظور تایید صحت    عملکرد cDNA سنتز شده، تکثیر قطعه انتخابی با استفاده از آغازگرهای رفت و برگشت اکتین و واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) انجام شد. ارزیابی محصول واکنش PCR بر روی ژل آگارز 5/1 درصد در بافر TBE صورت گرفت.

بررسی سطح بیان ژن های مورد مطالعه شامل PR2 و PAL در گیاهان شاهد و مایه‌زنی شده در زمان‌های مختلف با استفاده از تکنیک QPCR و دستگاه  StepOnePlus Real-Time PCR شرکت Applied biosystems انجام شد. واکنش با استفاده از شناساگر SYBR green در حجم نهایی 15 مایکرولیتر (جدول 1) با آغازگرهای طراحی شده (جدول 2) صورت گرفت. از آغازگر Actin به عنوان ژن خانه داری به منظور مقایسه سطح بیان ژن‌های هدف استفاده شد. واکنش زنجیر پلیمراز شامل واسرشت سازی اولیه 10 دقیقه،  94 درجه سلسیوس، مرحله واسرشت سازی 15 ثانیه،  94 درجه سلسیوس و مرحله اتصال و گسترش 1 دقیقه، 60 درجه سلسیوس (طبق دستورالعمل شرکت سازنده) در40 مرتبه تکرار بود. تمام واکنش‌های PCR در 2 تکرار انجام گرفت.

جدول 1- غلظت و مقادیر حجمی مواد بکار رفته در واکنش Real time PCR.

Table 1-Concentration and the volume of materials used in the Real time PCR reaction

جدول 2- نام ژن­ها و توالی آغازگر­های استفاده شده در این مطالعه.

Table 2- Genes name and Primer pairs used in the present study.

آنالیز نتایج حاصل از واکنش Real Time- PCR با فرمول  ^(ΔΔCT)– 2 محاسبه شد (Yuan et al, 2006).  

Δ CT= Ct ژن هدف [12] – Ct  ژن مرجعà (برای زمان مورد ارزیابی و نمونه کنترل)

ΔΔ CT= Δ Ct زمان مورد ارزیابی  – Δ Ct نمونه کنترل  

ترسیم نمودارها با استفاده از نرم افزار Microsoft excel از مجموعه نرم افزارهای Microsoft office و تحلیل آماری داده‌ها به وسیله نرم افزار SPSS statistics 22 انجام شد.

نتایج

در این بررسی پس از انجام تست های اولیه سطوح حساسیت و بررسی توسعه باکتری در گیاه در بین ارقام موجود، دو رقم طارم محلی و ساحل به ترتیب به عنوان ارقام حساس و مقاوم برگزیده شدند (داده های منتشر نشده).  پس از استخراج RNA از نمونه ها و ساخت cDNA، بررسی سطح بیان ژن‌های PR2 و PR10 در 5 بازه زمانی مختلف، توسط تکنیک Quantitative Real Time-PCR با بهره گیری از فرمول  ^(ΔΔCT)– 2 محاسبه  شد.

نمونه های RNA به منظور بررسی کیفیت استخراج روی ژل آگارز 1 درصد بارگذاری شدند. باندهای مربوط به قطعات rRNA به دلیل وجود نسخه‌های متعدد، روی ژل به خوبی تشکیل شد. (شکل1).

پس از سنتز cDNA  نمونه ها به وسیله آغازگر ژن خانه‌داری[13] Actin به وسیله واکنش زنجیره پلیمراز تکثیر و بروی ژل آگارز 5/1 درصد مورد تایید قرار گرفت ( شکل 2).

الگوی بیان ژن PR2 در دو رقم مورد مطالعه در طی بازه های زمانی مورد بررسی روند متفاوتی را نشان داد. بطوری که در رقم مقاوم ساحل اوج بیان ژن هدف طی بازه‌های زمانی مورد ارزیابی، در ساعت 24 پس از تلقیح بیش از 6 برابر زمان صفر بود. آزمون تی نمونه‌های مستقل (Two Independent Samples t Test) نیز تفاوت معنی داری در سطح احتمال 1% بین نرخ بیان این ژن در دو رقم را در این بازه زمانی نشان دادP) value <0.01). در ادامه، در ساعت‌های بعدی پس از تلقیح بیان ژن مذکور روند نزولی را طی کرد. نرخ بیان این ژن در رقم ساحل در ساعات 48 تا 96 پس از تلقیح به ترتیب 2/3، 7/2 و 7/1 برابر نسبت به نمونه شاهد بود. در حالی که بیشنه بیان این ژن در رقم طارم محلی در ساعت 96 پس از تلقیح کمتر از 6 برابر زمان صفر بود. نرخ بیان این ژن در رقم طارم محلی در ساعت 24 تا 72 پس از تلقیح به ترتیب 2/1 ، 3/2، و 4/3 برابر نسبت به نمونه شاهد بود (شکل 3).

الگوی بیان ژن PAL در دو رقم طارم محلی و ساحل روند مشابه ای را دنبال کرد. به طوری که بیشینه بیان ژن PAL در هر دو رقم مورد مطالعه تا ساعت 96 پس از تلفیح باکتری A.avenae subsp. avenae به گیاهچه‌ها سیر صعودی را دنبال کرد. در این ساعت نرخ بیان ژن  PALدر رقم طارم محلی و ساحل به ترتیب 7/2 و 5/8 برابر نسبت به زمان صفر (قبل از تلقیح) بود. در تمام ساعت مورد ارزیابی نرخ بیان ژن PAL در رقم ساحل به طور معنی داری بیشتر از رقم طارم محلی بود(P value <0.05 , P value <0.01) . سطح بیان ژن PAL در رقم ساحل در ساعات 24 تا 72 پس از آلودگی به ترتیب 1/3، 6/4 و 7 برابر نسبت به نمونه شاهد بود. سطح بیان این ژن در رقم محلی طارم در همین بازه زمانی به ترتیب 4/1، 9/1 و 3/2 برابر نسبت به نمونه شاهد بود (شکل4).

بحث

نقش پروتئین‌های PR2 در مقاومت گیاهان

پروتئین‌های PR-2 (β-glucanases) فعالیت بتا-1و3-گلوکانازی نشان می‌دهند. بتا-1و3-گلوکاناز [14](گلوکان اندو-1و3 بتا-گلوکوزیداز) باعث شکستن واحد‌های 1و3-بتا –دی-گلوکوزیدی[15] در بتا-1و3-گلوکان‌ها می‌شود. این ترکیب در بافت‌های گیاهی وجود دارد و در تشکیل کالوز و در زوائد مویی ساقه و برگ، تارهای کشنده ریشه، دانه گرده، تخمک‌ها و سلول‌های پارانشیمی زخم نقش دارد (Vidhyasekaran, 2002). وزن مولکولی آن‌ها در حدود 33 تا 36 کیلو دالتون است (Van Loon et al, 2006). اولین نقشی که β-glucanases در تعامل باکتری-گیاه ایفا می‌کند مربوط به متلاشی و تجزیه نمودن دیواره سلولی بیمارگر می‌باشد که این خود به مرگ بیمارگر می‌انجامد. پخش شدن قطعات دیواره سلولی حاصل از متلاشی شدن باکتری به عنوان الیسیتور عمل نموده و سیستم دفاعی گیاه را فعال می‌نماید (Vidhyasekaran, 2002). در تحقیقات، خاصیت سینرژیستی پروتئین‌های این گروه به همراه گروه PR3 اثبات شده است (Stintzi, 1993). در تحقیقات تکمیلی نشان داده شد که در بعضی موارد این پروتئین در آزاد کردن مولکول‌های الیسیتور گیاهی از جمله ترکیبات فنولی، فیتوالکسین‌ها و سایر PR ‌ ها نقش دارد و افزایش مقاومت به علت عمل مستقیم این پروتئین نمی‌باشد (Vidhyasekaran, 2002). در مطالعه پیش رو، نرخ بیان ژن PR2 در رقم حساس طارم محلی مطابق با مطالعات پیشین در ساعت‌های پس از آلودگی به طور متناوب افزایش یافته است. اما الگوی بیان این ژن در رقم مقاوم ساحل متفاوت بوده و سطح بیان آن در ساعات اولیه پس از تلقیح با باکتری Aaa  به طور معنی داری بیشتر از رقم طارم محلی بوده است و در بازه‌های بعدی تجمع سطح رونوشت های این ژن کاهش یافت (شکل 3).

شکل 1- بررسی کیفیت نمونه­های RNA بر روی ژل آگارز 1 درصد. قطعات rRNA به خوبی از هم تفکیک شدند.

Figure 1- RNA analysis on 1% agarose gel.  Different fragments of rRNA bands separated in gel.

شکل 2- کیفیت cDNA حاصل از PCR با آغازگر Actin برای ده نمونه مورد بررسی در ژل آگارز 5/1 درصد. تشکیل باند مورد انتظار نشانه تکثیر قطعه هدف و کیفیت cDNA  ساخته شده می باشد.

Figure 2- quality of ten synthesized cDNA samples using by Actin primer on 1.5% agarose gel. Formations of expected bands show the quality of synthesized cDNA.

شکل3- نرخ بیان ژن PR2 در گیاهچه‌های برنج آلوده شده به باکتری Aaa درپنج بازه زمانی مختلف. ns و _** به ترتیب غیر معنی دار و معنی دار در سطح احتمال یک درصد.

Figure 3- Expression rate of PR2 gene in rice seedlings inoculated with Aaa at 5 different time course. (non-significant =ns, P<0.05=*).

شکل4- نرخ بیان ژن PAL در گیاهچه‌های برنج آلوده شده به باکتری Aaa درپنج بازه زمانی مختلف. _* و _** به ترتیب  معنی دار در سطح احتمال پنج و یک درصد.

Figure 4- Expressionn rate of PAL gene in rice seedlings inoculated with Aaa at 5 different time cous. (P<0.01=**, P<0.05=*).

به نظر می رسد این نتایج، اهمیت بیان ژن PR2 در ساعات ابتدایی پس از تلقیح و کارآیی آن را در مقاومت نشان می‌دهد. به خوبی روشن است القای به موقع  این ژن با متلاشی نمودن دیواره سلولی باکتری در مراحل اولیه استقرار و نفوذ،  در مقاومت رقم ساحل نقش بسزایی دارد. بیان بالای این ژن در برابر بیمارگرهای باکتریایی و قارچی در بررسی های گذشته نیز به اثبات رسیده است (Sharp et al., 1984).

اخیرا نیز افزایش بیان این ژن را در برابر باکتری عامل بلایت برگی برنجXanthomonas oryzae)) در برنج بررسی شده است (Nisha et al., 2012; Hou et al., 2012). در سال 2011 نیز در بررسی نقش این ژن در تعامل با شانکر مرکبات به افزایش این ژن در گیاه لیمو عمانی آلوده به شانکر پی برده شد. (Sharifi et al., 2011).

نقش پروتئین‌های PAL در مقاومت گیاهان

فنیل آلانین آمونیالیاز فرایند دی آمینی شدن و تبدیل ال-فینیل آلانین به ترانس –سینامیک اسید را کاتالیز می کند. این تبدیل ، اولین مرحله مسیر فنیل پروپانوئید می باشد که پیش سازهای مواد فنولی ، لیگنین و فیتوآلکسین ها را فراهم می کند(Vidhyasekaran, 2002). مشخص شده است که افزایش مقدار mRNA ژن PAL مبنای افزایش فعالیت آن می باشد. عدم فعالیت ژن فنیل آلانین آمونیالیاز که برای سنتز سالیسیلیک اسید مورد نیاز است منجر به کاهش SAR می شود. PAL در مسیر بیوسنتز سالیسلیک اسید و دیگر ترکیبات وابسته دفاعی دخیل است و یک ترکیب کلیدی سیگنال دهی برای فعال نمودن ژن‌های وابسته دفاعی، کاتالیزکننده‌ها، پروتئین‌های رسپتور مانند و فاکتور رونویسی است. گیاهان تراریخت توتون که فعالیت PAL در آن‌ها کم می‌باشد، لیگنین کمتری در دیواره داشته و در مقایسه با گیاهان دستکاری نشده توتون ، نسبت به تهاجم بیمارگر حساس‌تر می‌باشند. بنابراین PAL  نقش مهمی در مقاومت  گیاه به بیماری دارد (Stotzet al., 2009).

مطالعات گذشته حضور یک خانواده کوچک ژن­های کدکننده PAL را در برنج نشان دادند، امروزه 3 ژن PAL از برنج جداشده که GP-GP-1 ,GP-28 ,ZB8 نامیده می­شوند (Agrawal et al., 2001). بیان ژن OsPAL در اثر تلقیح ایزوله ناسازگار باکتری A.avenae subsp. avenae به گیاهچه‌های برنج تا 6 ساعت پس از آلودگی به صورت متناوب افزایش می‌یابد  در صوتی که سطح بیان این ژن در اثر تلقیح ایزوله سازگاری از این باکتری (برهمکنش سازگار) تا 6 ساعت پس از آلودگی روند تقریبا ثابتی را نشان می‌دهد. (Tanaka et al., 2003). طاهری و طریقی (2009)، سیاری و همکاران (2014) نقش مثبت PAL را در تعامل گیاه برنج به قارچ Rhizoctonia solani را بررسی و تایید کردند. همچنین در تحقیقات اخیر نیز به افزایش بیان ژنPAL  در پاسخ به قارچ  Phytophthora parasitica و زخم مکانیکی  در پونسیروس پی برده شد (Bova et al., 2011). نرخ بیان این ژن در آخرین بازه مورد ارزیابی در رقم مقاوم ساحل بیش از 8 برابر در نمونه شاهد بود (شکل 4).  نتایج حاصل از این پژوهش نیز نقش ژن‌های PAL را در مقاومت گیاه برنج به باکتری A.avenae subsp. avenae را نشان می دهد.

نتیجه گیری

بیان ژن‌های مورد بررسی در این پژوهش در رقم مقاوم ساحل نسبت به رقم طارم محلی در زمان پاسخ و همچنین سطح بیان سریع‌تر و به مقدار قابل توجهی بیشتر بود. اگرچه برخی از پروتئین‌های در ارتباط با بیماری‌زایی به طور طبیعی به مقدار اندکی در بافت‌های گیاه بیان می‌شوند، ولی افزایش بیان آن‌ها پس از عفونت با عامل بیماری‌زا و یا تنش‌های محیطی به میزان زیادی افزایش می‌یابد که خود دلیل محکمی بر نقش این پروتئین‌ها در پاسخ و مقاومت به آسیب‌هایی با منشاء زنده[16] و غیر زنده[17] می‌باشد. مهندسی ژنتیک همواره سعی بر دستیابی به گیاهانی دارد که حاوی ژن‌های مطلوب مقاومت به آفات و بیماری‌ها هستند. از آن‌جایی که استفاده از سموم شیمیایی محدودیت‌ها و خطرات خاص خود را دارد، استفاده از گیاهان تراریخت[18] کاهش هزینه، افزایش کیفیت و کمیت محصول، و کاهش صدمات وارده به منابع زیستی را به دنبال دارد. امید است نتایج حاصل این پژوهش و تحقیقات تکمیلی در شناسایی ژن‌های دخیل در مقاومت گیاهان برنج به باکتری عامل بیماری نوار قهوه‌ای، فوق بیان‌[19] آن‌ها در ارقام حساس و سایر گیاهان در تولید گیاهان مطلوب تراریخت موثر باشد.