Resistance of Two Rice Cultivars to the Sheath Blight Agent Rhizoctonia solani AG1-1A

بررسی مقاومت دو رقم برنج در تعامل با قارچ عامل سوختگی غلاف،AG1-1A Rhizoctonia solani

محمد سیاری¹، ولی اله بابایی زاد*²، محمد علی تاجیک قنبری²، حشمت اله رحیمیان³

¹دانشجوی سابق کارشناسی ارشد بیماری شناسی گیاهی، گروه گیاهپزشکی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری

 ²دانشیاران گروه گیاهپزشکی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری

³استاد گروه گیاهپزشکی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری

تاریخ دریافت: 20/08/1393، تاریخ پذیرش: 07/04/1394

چکیده

برنج از مهم­ترین گیاهان زراعی دنیا می­باشد که سطح وسیعی از اراضی زراعی قابل کشت را به خود اختصاص داده است. Rhizoctonia solani یکی از قارچ های بیماریزا است که خسارت عمده ای به محصولات مختلف زراعی وارد می سازد. زیرگروه آناستوموزی  AG1-1Aاین قارچ، برنج را مورد حمله قرار داده و باعث ایجاد بیماری سوختگی غلاف برنج می شود. این بیماری به عنوان یکی از مهمترین بیماری های قارچی در مناطق برنجکاری دنیا شناخته شده است. به دلیل آلودگیهای زیست محیطی توسط مصرف بی رویه آفت کش ها جهت کنترل این بیماری از یک سو و مقاومت پاتوژن به این مواد شیمیایی از سویی دیگر، مطالعه مستمر برای ارایه روش و یا روش های جدید و متفاوت جهت مقابله با این بیماری  ضروری به نظر می رسد. ژن‌های مقاومت در گیاهان که منابع ژنتیکی با ارزشی هستند را می توان در این راستا استفاده کرد. بررسی های مولکولی جهت ردیابی میزان بیان ژن های فوق بسیار با ارزش است. این تحقیق با هدف آنالیز مولکولی دو رقم برنج بینام و خزر در مقابل با قارچ Rhizoctonia solani عامل سوختگی غلاف انجام شد. طول لکه های حاصل از تلقیح پاتوژن در رقم خزر به طور تقریبی دو برابر رقم بینام بود. در نتیجه رقم بینام به عنوان ژنوتیپ مقاوم و رقم خزر به عنوان ژنوتیپ حساس در مقابل بیماری سوختگی غلاف انتخاب شد. جهت تعیین نیم رخ ژنهای دخیل در مقاومت از برگ های گیاهچه های دو هفته ای  در ساعات مختلف پس از تلقیح نمونه برداری شد. پروفایل ژن های مورد آزمایش توسط تکنیک Real time Q-PCR بررسی شد. نتایج حاصل از این تحقیق نشان داد بیان ژن هایPR-5، Proxidase، PR-10، Defensin، Thionin وNH-1  در رقم مقاوم بینام نسبت به رقم حساس خزر پس از مایه زنی به شدت افزایش یافت. در نتیجه به نظر می رسد ژن های فوق در مکانیسم های مقاومت گیاه برنج در تعامل با R. solani نقش داشته باشند.

واژه های کلیدی: ژن های مرتبط با بیماری زایی،  بیان ژن، برنج، NH1، cDNA،Real-time Q-PCR .

مقدمه

برنج از مهم­ترین گیاهان زراعی دنیا می­باشد که سطح وسیعی از اراضی زراعی قابل کشت را به خود اختصاص داده است (Lin et al,  1995). گیاه برنج در طول دوره­ رشد به بیماری­های مختلفی مبتلا می­شود که اهمیت آنها در هر منطقه بستگی به نوع بیماری، ارقام برنج، محیط رشد، اعمال روش­های زراعی و دامنه میزبانی عامل بیماری دارد. سوختگی غلاف برگ برنج با عامل  Rhizoctonia solani Kühn از  جمله بیماری­های قارچی است که از نظر بیماری­زایی و زیان اقتصادی در شمال کشور اهمیت دارد (Balali et al., 2008). این بیماری به عنوان یک عامل بازدارنده در توسعه ارقام پرمحصول محسوب شده و خسارت بیماری در استان­های شمالی قابل توجه می­باشد.

آلودگی­های زیست محیطی ناشی از مصرف بی رویه سموم شیمیایی جهت کنترل بیماری ها از یک سو و ظهور نژاد های مقاوم به قارچ کش ها از سویی دیگر، سبب ارایه روش های جدید و متفاوت جهت مقابله با بیمارگر ها شده است.  مهمترین این روش ها، مبتنی بر مقاومت گیاهان می باشد. دفاع در گیاهان بر اساس سدهای دفاعی اولیه مختلف و پاسخ‌های القایی استوار است (Grover and Gowthaman, 2003). سدهای اولیه برای مثال شامل لایه کوتیکولی گیاه، دیواره سلولی میزبان و ترکیبات ضد میکروبی می‌باشند. اولین پاسخ‌های دفاعی گیاهان شامل باز شدن کانالهای یونی ویژه‌ای در غشاء پلاسمایی، تولید سریع گونه‌های اکسیژن فعال (AOS) مثلŌ₂ ، H₂O₂ و در نهایت فسفریلاسیون و د‌فسفریلاسیون پروتئین‌های خاص می‌باشد (Grover and Gowthaman, 2003). این واکنش‌های اولیه پیش نیاز آغاز شبکه‌های سیگنالی بوده که سبب ‌راه‌اندازی پاسخ‌های دفاعی کلی می‌شود. بنظر می‌رسد پاسخ‌های دفاعی وابسته به جاسمونیک اسید (JA) و اتیلن توسط نکروتروف‌ها و پاسخ‌های وابسته به سالیسیلیک اسید (SA) توسط بیوتروف‌ها فعال شود. به هرحال هم‌پوشانی بین مسیر های سیگنالی مختلف و گاهی اثرات هم افزایی بین این مسیرهای مختلف وابسته به SA، اتیلن و JA گزارش شده است (Thomma et al., 1998). هر سه مسیر دفاعی در ارتباط با افزایش نسخه‌های ژنهای دفاعی زیادی هستند. پروتئین های مرتبط با بیماری زایی⁴معمولاً به‌عنوان پروتئین‌های خاص میزبانی بوده که در اکثر گونه‌های گیاهی در مقابل حملات پاتوژن‌ها و شرایط مشابه برانگیخته می‌شوند (Van Loon et al., 2006). از زمان کشف اولین PRها در 1970 در گیاهان توتون آلوده به ویروس موزاتیک توتون (TMV)، تاکنون 18 خانواده از آنها بر اساس توالی آمینواسیدی، روابط سرولوژیکی و فعالیت‌های بیولوژیکی و آنزیمی‌شان شناخته شده اند (Van Loon et al., 1997 and 2006).  پروتئین‌های متعلق به خانواده PR-5 به دلیل  داشتن توالی مشابه پروتئین گیاهی تائوماتین به پروتئین‌های شبه تائوماتین معروف هستند (Velazhahan et al., 1999). این پروتئین ها گروهی از پروتئین‌های گیاهی هستند که در تنش های شوری نیز بیان می‌شوند (Velazhahan et al., 1998). چندین گروه از PR-5 فعالیت موثری علیه قارچها از طریق ممانعت از رشد هیف، جوانه‌زدن اسپور و یا جلوگیری از توسعه لوله تندش در صورت جوانه زدن اسپور دارند (Velazhahan et al., 1998). ژن PR-5 تاکنون از آرابیدوپیس، ذرت، سویا، برنج، گندم، جو، توتون، گوجه فرنگی و بسیاری گیاهان دیگر جدا شده است (Christensen et al., 2002  Datta et al., 1999 ; Abad et al., 1996 ;). ژن Peroxidase (POX) در ایزوفورم‌های مختلفی وجود داشته و در محدوده وسیعی از فرآیندهای فیزیولوژیکی نظیر متابولیسم اکسین، بیوسنتز اتیلن، تشکیل لیگنین، تنفس، پروسه‌های واسطه نوری، رشد و پیری نقش دارد (Barratt et al., 1991). گروه پروتئین های PR-9 از دسته پراکسیدازهای تشکیل دهنده لیگنین هستند. این پروتیین ها با کاتالیز فرایند تولید لیگنین سبب تقویت دیواره سلولی گیاه و در نتیجه مقاومت علیه بسیاری پاتوژن ها می شوند (Passardi et al., 2004). در برنج حداقل 42 ژن POX شناخته شده است. ژن POX عمل اکسیداسیون NADH را کاتالیز می کند. افزایش فعالیت این ژن در برابر پاتوژن ها در گیاهان مختلف به دفعات گزارش شده است (Farkas et al., 1966; Novacky et al., 1968; Gholamnezhad et al., 2015; Goudarzi et al., 2015). بدلیل هومولوژی توالی خانواده PR-10 با ریبونوکلئاز گیاه جینسینگ، PR10 ها تحت عنوان Ribonuclease-like-function نامگذاری شده‌اند (Midoh et al., 1996). در مطالعات (Kim et al., 2001) میزان رونوشت های PR-10 در گیاهان برنج تیمار شده با Magnaporthe grisea به شدت افزایش یافت. گروهی دیگر از فعالان ضد میکروبی Defensinها هستند که پروتئین‌هایی با وزن مولکولی پایین حدود پنج کیلو دالتون و با تکرارهای زیاد سیستئین می‌باشند. Defensin ها ممکن است توسط تغییر نفوذپذیری دیواره سلولی قارچها و یا ممانعت از بیوسنتز ماکرومولکولها فعالیت ضد قارچی داشته باشند. افزایش بیان Defensin در گیاهان تراریخت در تعامل با پاتوژن‌های بسیاری شامل Alternaria (Bohlmann et al., 1994)، Fusarium (Epple et al., 1997) ، به اثبات رسیده و ضمناً سبب افزایش مقاومت سیب‌زمینی به Verticillium تحت شرایط مزرعه می‌شوند (Lay et al., 2005). تیونین ها (Thionins) در حال حاضر در گونه‌های تک‌لپه و دو لپه بدلیل فعالیت ضد میکروبی‌شان در گیاهان مورد توجه قرار گرفته‌اند (Florack and stiekema 1994). این پروتئین‌ها در دیواره‌های سلولی، واکوئل‌ها و اجسام پروتئینی حضور دارند و حدود پنج کیلو دالتون وزن دارند. تیونین هایی از جو و آرابیدوپیس از دسته ژنی بسیار کوچکی به خوبی شناسایی شده و در دفاع نقش دارند. ضمناً این ژنها در مسیر JA فعالیت دارند. اخیراً ژن Thionin از یولاف به گیاه برنج منتقل و منجر به مقاومت نسبت به دو باکتری مهم برنج شد (Carmona et al., 1993; Florack et al., 1993). محققان در این تحقیق از ژن Thionin یولاف برای یافتن نقش این ژن در برنج استفاده کردند و به این نتیجه رسیدند که بیان ژنهای Thionin اندوژن به تنهایی برای ممانعت از آلودگی‌های باکتریهایی در گیاهچه‌های برنج کافی نیست.

ژن NH1 نسخه بیان نشده ژنهای مرتبط با بیماریزایی (1 Nonexpresser of Pathogenesis- Related gene) بوده که ضمناً تحت نام های NIMI (Non-inducible immunity) و insensitive) SAI1 SA-) هم شناخته شده است (Shah et al., 1999). این گروه جهت انتقال سیگنال SA برای فعال‌سازی ژنهای PR و در نتیجه تحریک SAR حیاتی می‌باشند و سبب مقاومت پایای گیاهان علیه طیف وسیعی از پاتوژن‌ها می‌گردند. ژن NPR1 اولین بار در آرابیدوپسیس شناسایی شد (Glazebrook et al., 2005). افزایش بیان NPR1 در آرابیدوپیس و بیانش در برنج، گوجه فرنگی، گندم و سیب سبب افزایش مقاومت گیاهان مذکور به پاتوژنها با افزایش میزان بیان PR ژنها شده است (Lin et al., 1995; Chern et al., 2005). ضمناً ثابت شده که القای مقاومت توسط بیان NPR1 می‌تواند بدلیل بیان بیشتر و سریع‌تر PR  ژنها باشد (Shah et al., 1999). این تحقیق با هدف بررسی میزان تظاهر ژن های PR-5 ،PR-9، PR-10، Defensin، Thionin و NH1 در مقاومت به بیماری سوختگی غلاف در ارقام برنج بینام و خزر انجام شد.

مواد و روش ها

ارقام برنج مورد مطالعه در این تحقیق رقم‌های بینام و خزر بوده که بذور خالص ارقام مذکور از معاونت موسسه تحقیقات برنج کشور واقع در آمل تهیه گردید. بر اساس بررسی های مزرعه ای، رقم بینام به عنوان ژنوتیپ مقاوم و رقم خزر به عنوان رقم حساس انتخاب شد (Bahrami et al., unpublished data).

بذرها به مدت 4 ساعت در محلول 5 در هزار کاربوکسین- تیرام ضدعفونی گردیدند. بذور پس از شستشو با آب مقطر استریل در پتری‌های حاوی کاغذ صافی مرطوب قرار داده شدند. پتری‌ها به مدت 4-3 روز تا زمان جوانه‌زنی بذور در انکوباتور و دمای 25 درجه سانتی گراد در شرایط تاریکی نگهداری شدند. بذور جوانه‌زده سپس به گلدانهای پلاستیکی حاوی خاک استریل (نسبت رس: هوموس 2:1) منتقل و گلدانها به اتاقک رشد (با تناوب نوری 16 ساعت نور با دمای 28 درجه سانتی گراد و رطوبت نسبی 85% و 8 ساعت تاریکی با دمای 25 درجه سانتی گراد و رطوبت نسبی 95%) انتقال یافتند.

نمونه­هایی شامل غلاف برگ و ساقه از ارقام مختلف برنج که علائم مشکوک سوختگی غلاف و برگ را نشان دادند، جمع­آوری و به آزمایشگاه منتقل گردید. قسمت­های آلوده به مدت 5 دقیقه با جریان ملایم آب شسته شدند و به قطعاتی به اندازه 1 – 5/0 سانتی­متر بریده شدند. این قطعات به مدت 5 دقیقه در محلول هیپوکلریت سدیم یک درصد ضدعفونی سطحی شده و سپس سه بار (هر بار 10 دقیقه) در آب مقطر استریل شستشو و در محیط کشت Water Agar  (آب + آگار) دو درصد و Potato Dextrose Agar (PDA) در انکوباتور با دمای 25 درجه سانتی­گراد ­نگه­داری شدند. پس از چند روز قطعات مورد بررسی قرار گرفت و در صورت مشاهده اندام­های قارچی، خالص­سازی انجام شد. نمونه­های جداشده در دمای 27 درجه سانتی­گراد به مدت  3 تا 5 روز نگه­داری و از قارچ­های رشد یافته، روی محیط کشت آب آگار کشت نوک ریسه به روش جانی پور و همکاران (1388) تهیه ­شد. پس از شناسایی‌مورفولوژیکی از یک نمونه به‌عنوان نماینده استخراج DNA صورت پذیرفت و بخشی از ناحیه ITS آن با استفاده از جفت آغازگر های ITS4 و ITS5 تکثیر شد. پس از تعیین توالی و مقایسه نمونه با توالی های ثبت شده در بانک جهانی ژن ((NCBI به ‌عنوان نمونه استاندارد و نشان دادن شباهت 99 درصدی با R.  solani AG 1-1 A در باقی مراحل آزمایش مورد استفاده قرار گرفت.

مایه‌زنی بر روی گیاهچه‌های 2 هفته‌ای برنج و با استفاده از قرار دادن قرص ‌های cm5/0 از حاشیه کشت‌های 5 روزه قارچ در محل غلاف و سپس ثابت کردن آنها در محل با چسب نواری انجام شد. گیاهان مایه‌زنی شده سپس توسط نایلون‌های مرطوب پوشانده شده و گلدان‌ها مجدداً به اتاقک رشد برگردانده شدند. کیسه‌ها پس از 3 روز برداشته شدند. نمونه‌برداری از برگ گیاهان آلوده در زمان‌های 0 (شاهد)، 12، 24، 48، 72 و 100 ساعت پس از آلودگی انجام شد و نمونه ها پس از پودر شدن با ازت مایع تا زمان استخراج RNA در فریزر با دمای C°80- نگهداری شدند.

برای بررسی توسعه بیماری از گیاهان 6 هفته‌ای استفاده شد. طول لکه‌های ایجاد شده در گیاهچه‌های دارای علائم از هر لاین اندازه‌گیری شد. نتایج حاصله توسط نرم‌افزار Excel و آزمون مقایسه‌ای T-student در سطح احتمال 5% آنالیز شد.

Total RNA از برگهای نمونه‌برداری شده در زمان‌های مختلف با استفاده از ماده RNX plus (شرکت سیناژن) طبق روش Triant and Whitehead   (2009) به دست آمد. به منظور زدودن DNA ژنومی از نمونه های RNA از کیت DNase I, RNase-free ساخت شرکت Fermentas طبق دستورالعمل شرکت سازنده استفاده گردید.

کیفیت  RNA استخراجی بر روی تعدادی از نمونه ها با استفاده از ژل آگارز 5/1 درصد در بافر TAE ( (40mM Tris acetate, 1 mM EDTA  و یا اسپکتروفتومتر ارزیابی شدند. میزان جذب در طول موج های 260 و 280 نانومتر قرائت گردید. 

ساخت اولین رشته cDNA هر نمونه RNA  استخراجی  با استفاده از پرایمرoligo(dT)₁₈  و آنزیم  SuperScript Reverse Transcriptase  توسط کیت Revert Aid first strand cDNA (شرکت  Fermentase) انجام گرفت. نمونه ها تا زمان استفاده در C°20- نگهداری شدند.

تکثیر قطعات cDNA  با استفاده از واکنش زنجیره پلی مراز و جفت آغازگر ابی کوایتین انجام شد . ارزیابی محصول واکنش PCR بر روی ژل آگارز 5/1 درصد در بافر TBA  (89 mM Tris base,  89 mM boric acid, 2 mM EDTA) صورت گرفت . ژل در اتیدیوم بروماید (0.5 µg/ml) به مدت 15 دقیقه رنگ آمیزی و بعد از شستشو با آب مقطر با UV دستگاه ژل خوان کداک (GELLOGIC 200) از آن عکسبرداری شد. آزمون QRT-PCR (Quantitative Real Time PCR  )  با استفاده از دستگاه 3000P thermal cycler×M (BioRad) و کیت Syber green انجام شد. به حجم 1 میکرولیتر از cDNA رقیق شده (شامل 50 نانوگرم در هر میکرولیتر) از هر نمونه به‌عنوان الگو در واکنش‌ها استفاده شد و به ترکیب یک میکرولیتر از هر پرایمر، 10 میکرولیتر سایبرگرین، و آب تا حجم 20 میکرولیتر افزوده شد. پارامترهای دمایی جهت تکثیر به‌صورت زیر بود:

مرحله واسرشت‌سازی اولیه به مدت 4 دقیقه در دمای C°94، به همراه 40 سیکل شامل واسرشت‌سازی به مدت 5 ثانیه در دمای 94 درجه سانتی گراد، 5 ثانیه در دمای 60 درجه سانتی گراد (Annealing/ Extension). لیست آغازگرهای مورد استفاده در این تحقیق در جدول 1 آمده است. در تمام آزمایشات از ژن ابی کوایتین به‌عنوان ژن خانه‌دار استفاده شد. تمام واکنش‌های PCR در 2 تکرار انجام گرفت.

نرخ بیان ژن با استفاده از روش delta-delta (Livak et al, 2003) اندازه‌گیری شد. در ابتدا میانگین دو تکرار سیکل آستانه برای هر ژن محاسبه شد. سپس میانگین CT ابی‌کوای‌تین (Ubiquitin) از میانگین CT ژن هدف کم شده و شاخص ∆CT بدست آمد. نرخ بیان هر ژن با استفاده از فرمول 2^∆CT محاسبه شد. انحراف معیار داده‌ها با استفاده از اعداد بدست آمده برای هر 2 تکرار محاسبه و نتایج توسط آزمون مقایسه‌ای T-student آنالیز شد. آنالیز آماری داده­ها  با استفاده از برنامه های آماری موجود در نرم افزار  Microsoft  Excel   از مجموعه نرم افزارهای Microsoft office  انجام گرفت.

نتایج

پس از چهار هفته از آلوده سازی گیاهچه ها به قارچ R. solani میزان پیشرفت بیماری با اندازه گیری طول لکه ها در هر دو رقم مورد بررسی، محاسبه شد. نتایج بیانگر توسعه دو برابری بیماری در رقم حساس خزر در مقایسه با ژنوتیپ مقاوم بینام بود (شکل 1). نتایج حاصل از بررسی میزان بیان ژن های دفاعی مختلف نشان داد میزان بیان تمامی ژن های مورد بررسی در رقم مقاوم بینام به طور معنی داری در مقایسه با ژنوتیپ حساس خزر بالاتر بود.

جدول 1- جفت آغازگرهای مورد استفاده در این تحقیق  به همراه توالی نوکلئوتیدی آن ها.

Table 1- Primer pairs used in this study and their nucleotide sequences.

پس از جدا و خالص سازی در بررسی های اولیه میکروسکوپی تمامی نمونه ها مشخصات عمومی رایزوکتونیا را داشتند. تمامی جدایه ها قادر به آناستوموز باAG1-1A    R. Solaniعامل سوختگی غلاف برنج بودند. تعیین توالی نوکلئوتیدی حاصل از تکثیر ناحیه ITS و مقایسه آن با توالی های مشابه موجود در بانک جهانی ژن (NCBI) نتایج آزمون های مورفولوژیکی را ثابت کرد.

رقم بینام به مراتب درجه بالاتری از مقاومت نسبت به رقم حساس خزر نشان داد. همانطور که در شکل 1 دیده می‌شود مجموع طول لکه‌ها برای رقم خزر 2 برابر رقم بینام بود. آنالیز داده‌ها با آزمون مقایسه‌ای T-test تفاوت معنی داری در سطح احتمال 5% بین ارقام مقاوم و رقم حساس نشان داد.

تمام ژن‌های مورد مطالعه در این آزمون در زمان اوج بیان در سطح احتمال 1 درصد در رقم بینام در مقایسه با ژنوتیپ خزر به طور معنی داری افزایش بیان داشتند. سطح پایه‌ای بیان این ژن‌ها در گیاهان شاهد هر 2 رقم مورد بررسی در این آزمایش بسیار پایین بود.

بیان ژن های PR-5 و Pox در هر دو رقم الگوی مشابهی داشته و در ساعت 24 پس از تلقیح افزایش معنی داری داشت، حال آنکه میزان بیان آن در زمان 48 ساعت پس از مایه‌زنی به اوج خود رسید (شکل a-2 و b-2). بیان این ژن سپس در هر دو رقم مورد بررسی تا زمان 100 ساعت پس از آلودگی سیر نزولی طی کرد. میزان رونوشت‌های ژن PR-5 در زمان بیشینه بیان در رقم بینام 13 برابر و در رقم خزر 4 برابر زمان صفر بود. ضمناً میزان بیان این ژن در رقم بینام به ترتیب 4/3 برابر در مقایسه با میزان بیان در ساعت 48 بعد از آلودگی در رقم خزر بالاتر بود. مقدار بیان ژن  POX در ساعت اوج (48 ساعت پس از مایه‌زنی) در رقم بینام و خزر به ترتیب 10 و 3 برابر زمان صفر (شاهد) بود.

شکل1-A- تفاوت دو رقم در شدت بیماری ناشی از R. solani در هر برگ، توسط روش اندازه گیری طول لکه.

Figure 1 –A - Differences among two cultivars in severity of R. solani in each leaf performed by determination of lesion length.

ضمناً نرخ بیان این ژن در رقم بینام 3 برابر رقم خزر در زمان اوج بیان بود. آزمون مقایسه­ای T student  نیز در ساعات 24 و 48 که ساعات اوج بیان این دو ژن در دو رقم مورد مطالعه می­باشند تفاوت معنی­داری ((P <0.001 بین نرخ بیان این ژن ها در رقم مقاوم در برابر رقم حساس نشان داد (شکل a-2 و b-2). میزان رونوشت‌های ژن PR-10 در رقم بینام در زمان 12 ساعت پس از مایه‌زنی به شدت افزایش یافت. حال آنکه در رقم خزر بیشینه بیان در زمان 48 ساعت پس از تلقیح مشاهده شد (شکل c-2). بیان این ژن در ساعات 24 و 48  پس از تلقیح رو به کاهش گذاشته تا اینکه در 100 ساعت پس از آلودگی افزایشی چشمگیر در بیان این ژن دیده شد. نرخ بیان ژن در ارقام بینام و خزر در زمان بیشینه بیان به ترتیب 13 و 2 برابر شاهد بود. ضمناً میزان بیان این ژن در 48 ساعت پس از آلودگی در رقم بینام 8 برابر بالاتر در مقایسه با رقم خزر بود. آزمون مقایسه­ای  T student  نیز تفاوت معنی­داری (P value <0.001) در زمان 12 ساعت پس از تلقیح  بین نرخ بیان این ژن در رقم مقاوم در برابر رقم حساس نشان داد .

رونوشت‌های ژن های PR12 و PR-13 در زمان  12 ساعت پس از آلودگی به شدت افزایش داشت و سپس تا زمان 100 ساعت پس از تلقیح کاهش یافت (شکل d-2 و e-2). تنها مورد استثنا در مورد بیان ژن Defensin در رقم خزر بوده که بر خلاف رقم مقاوم بینام با اندکی تاخیر در 24 ساعت پس از تلقیح مشاهده شد. بیشترین میزان بیان ژن Defensin در رقم بینام در 12 ساعت پس از مایه‌زنی (زمان اوج) 14 برابر زمان صفر بود، اما در رقم خزر بیشینه بیان این ژن در زمان اوج (ساعت 24 پس از مایه‌زنی) حدود 5 برابر زمان صفر بود (شکل d-2). نرخ بیان ژن PR-13 در رقم بینام و خزر در 12 ساعت پس از آلودگی به ترتیب 11 و 4 برابر شاهد بود، ضمناً این میزان در رقم بینام در مقایسه با خزر 8 برابر بالاتر بود. آزمون مقایسه­ای T student  نیز تنها در ساعت 12 که ساعت اوج بیان این ژن ها در دو ژنوتیپ مورد مطالعه می­باشد تفاوت معنی­داری (P <0.001)  را بین نرخ بیان این دو ژن در  رقم مقاوم در برابر رقم حساس نشان داد.

نرخ بیان NH1 در هر دو رقم مورد بررسی در زمان 24 ساعت پس از مایه‌زنی به‌طور چشمگیری افزایش یافت (شکل f-2) و در ارقام بینام و خزر به ترتیب 13 و 2 برابر بالاتر از شاهد بود. نرخ بیان این ژن در رقم بینام در زمان اوج بیان 9 برابر بالاتر از رقم خزر بود. آزمون مقایسه­ای T student در ساعت 24 که ساعت اوج بیان این ژن در دو رقم مورد مطالعه می­باشد تفاوت معنی­داری را بین نرخ بیان این ژن در رقم مقاوم در برابر رقم حساس نشان داد (P <0.01). در بازه های 48 و 72 ساعت بعد از آلودگی با وجود کاهش در سطح بیان این ژن در هر دو رقم  این نرخ در رقم مقاوم در مقایسه با رقم حساس اختلاف داشت که این اختلاف به ترتیب از نظر آماری در سطح احتمال (P <0.001) و (P <0.01) معنی دار بود.  تفاوت معنی داری در نرخ بیان ژن NH1 در بازه زمانی 100 ساعت بعد از آلودگی در بین دو رقم مورد مطالعه مشاهده نشد (شکل f-2).

بحث

مقاومت گیاهان به بیماری ها جهت استفاده موفق از گونه های گیاهی در کشاورزی مدرن بسیار مهم است. در سال های اخیر گیاهان مقاوم به طور موفقیت آمیزی تولید شده اند. ظهور بیولوژی مولکولی ما را قادر کرده ژن های دخیل در مقاومت گیاهان را در سطح مولکولی آنالیز و ضمنا دریچه ای به روی ما گشوده تا بتوانیم ذره ای از پیچیدگی های پاسخ های دفاعی گیاهان در تعامل با پاتوژن ها را درک کنیم.

در غلات شمار بسیار زیادی از ژن های مقاومت به بیماری ها (R genes) از گیاهان برنج (Oryze sativa) ، گندم (Triticum aestivum) و ذرت (Zea mays) جدا شده است. این سه گونه گیاهی بیش از 85 % غلات جهان را تولید می کنند. البته اخیرا پیشرفت های خوبی در فهم اساس مولکولی تعامل جو (Hordeum volgare) با پاتوژن ها حاصل آمده است. به هر حال این 4 گونه تنها غلاتی هستند که ژن های دخیل در مقاومت از آن ها جدا و تعیین هویت شده است.

شکل 2- نرخ بیان ژن های A :  PR-5 ، B : POX، C : PR-10، D : PR-12، E : PR-13 و F : NH-1 در رقم بینام در مقایسه با خزر در تعامل با R. solani در زمان های مختلف پس از تلقیح.

Figure 2 - The expression rate of A: PR-5, B: POX, C: PR-10, D: PR-12, E: PR-13 and F: NH-1 genes in Binam cv comparing with Khazar cv in challenge with R. solani at different time points after inoculation.

خط نشان خطا، میانگین انحراف معیار بیان ژن را در دو آزمایش جداگانه نشان می­دهد ،**  و ***    به ترتیب معنی دار بودن را در سطح احتمال (P < 0.01) و  (P < 0.001)  در آزمون مقایسه ای T student  نشان می دهد.

Error bars represent standard error of the mean in two different experiments. ** and ***:  indicates (P <0.01), (P < 0.001) using t test.

پروتئین های شبه تائوماتین[1] سبب تغییر نفوذپذیری غشاء پلاسمایی قارچ‌ها شده و در نهایت سبب مرگ سلول قارچی می‌گردد. موتوکریشنان و همکاران (Muthukrishnan et al., 2001)  نقش این ژن را در افزایش مقاومت نسبت به R. solani در گیاه برنج گزارش کردند (Muthukrishnan et al., 2001). در این بررسی بیان رونوشت های ژن PR-5 از  12 ساعت پس از آلودگی شروع، در 24 ساعت پس از آلودگی افزایشی شدید داشته و در زمان 48 ساعت پس از تلقیح به اوج خود رسید. به نظر می رسد شروع القای این ژن در ساعت 12 به دلیل نفوذ بخشی از هیف ها به داخل پارانشیم می باشد. به نظر میرسد در ساعت 48 پس از آلودگی که میزان بیان ژن PR-5 به اوج خود رسیده قارچ از دیواره سلولی گیاه رد شده و در بافت پارانشیمی بوده که این حداکثر تحریک گیاه توسط نفوذ پاتوژن سبب افزایش بیان ژن مذکور می شود (Zhao et al., 2008.) روند افزایش بیان این ژن در طی ساعات ذکر شده با نتایج بابایی زاد و همکاران (Babaeizad et al., 2009) مطابقت دارد. در مطالعه ما نسخه‌های PR-5 در ژنوتیپ مقاوم پس از آلوده‌سازی گیاهان با R. solani افزایش یافت که با یافته‌های قبلی (Muthukrishnan et al., 2001) مطابقت داشته و نشان دهنده نقش این ژن در بروز مقاومت در برنج در مقابل R. solani می باشد.

به دلیل نقش فعال POX در محکم‌تر شدن دیواره سلولی گیاه  با کاتالیز فرایند تولید لیگنین (Lignification)، که خود منجر به افزایش تحمل در برابر فعالیت آنزیمی نفوذ بیمارگر شده جایگاه این ژن را در مقاومت توجیه می کند (Passardi et al., 2004). در مطالعات ما سطح بیان این ژن در 12 ساعت اول افزایشی اندک داشت که به دلیل نفوذ هیف‌های اولیه در این زمان است. نسخه های این ژن در ساعت های 24و 48 پس از تلقیح روند افزایشی خود را ادامه داد که با نتایج بررسی های قبلی در مورد بیانPOX در گیاه برنج پس از تلقیح با .Magnaporthe grisea و Xanthomonas oryzae pv.oryzae مطابقت دارد (Jaishree et al., 1997). در این زمان اکثر هیف‌ها به بافت پارانیشم رخنه کرده و علائم بیماری در حال بروز است. نسخه های این ژن در رقم حساس (خزر) در مقایسه با رقم مقاوم بسیار کمتر بوده که نشان‌دهنده نقش فعال این ژن در بروز مقاومت رقم بینام می‌باشد.  نقش این ژن در مقاومت گیاه برنج علیه بیماری سوختگی باکتریایی ناشی از X. oryzae pv. oryzae و دخالت آن در تولید لیگنین در گیاه بعنوان یکی از مکانیسم های دفاع گیاه پس از حمله بیمارگر بخوبی مورد مطالعه قرار گرفته است (Hilaire et al., 2001).

با اینکه ژن PR-10 اثرات ریبونوکلئازی و RNase دارد و نقش فعال آن در بروز مقاومت گیاهان علیه پاتوژنهای ویروسی اثبات شده است (Jwa et al., 2001)، اما بیان این ژن در برابر پاتوژنهای قارچی نیز افزایش می‌یابد. نتایج این بررسی نشان داد که سطح بیان این ژن در همان ساعات اولیه نفوذ افزایش داشت که با نتایج کیم و همکاران مطابقت دارد (Kim et al., 2001). در ساعت 100 پس از آلودگی نیز سطح بیان این ژن مجدداً در رقم مقاوم افزایش یافت که به دلیل تحریک ثانویه گیاه توسط هیف‌های ثانویه قارچ عامل بیماری می باشد. علاوه بر آن سطح بیان این ژن در رقم بینام به مراتب از رقم حساس خزر بیشتر بوده که نشان‌دهنده نقش این ژن در بروز مقاومت برنج علیهR. solani  است. نتایج مشابهی در مورد نقش فعال PBZ1 هومولوگ PR10 در گیاه برنج در مقاومت علیه R. solani گزارش شده است (Midoh and Iwata, 1996). تخریب بخشی از سلولهای قارچی تحت تاثیر آنزیم های کیتیناز و بتا 1،3- گلوکاناز در داخل بافت گیاهی و به دنبال آن آزاد شدن مولکول های سیگنال دفاعی نظیر مونومر های کیتین و گلوکان دلیل احتمالی افزایش بیان این ژن است.

بیان ژن های Defensin و Thionin در رقم مقاوم بینام در 12 ساعت اولیه پس از مایه‌زنی به اوج خود رسید. در حالیکه افزایش چندانی در رقم حساس خزر به چشم نمی‌خورد. این مشاهدات دلالت بر نقش احتمالی این دو ژن در بروز مقاومت ارقام برنج در تعامل با سوختگی غلاف دارد. بیان ژن Defensin در رقم حساس خزر بر خلاف رقم مقاوم در 24 ساعت پس از آلودگی افزایش داشت که این نرخ در مقایسه با رقم مقاوم خیلی کمتر بود. تاخیر در بیان این ژن در رقم حساس می تواند دلیلی بر افزایش حساسیت این رقم در مقابل R. solani باشد. از نتایج فوق چنین بر می آید که افزایش بیان ژن های دخیل در مقاومت در زمان مناسب (نفوذ بیمارگر) سبب مقاومت موثر گیاه می گردد.  ادروا و همکاران (2005) یک ژن شبه Thionin که در برگها و غلاف بطور مداوم بیان نمی‌شود و در برابر اکثر مولکولهای سیگنالی دفاعی مثل SA و JA القا نمی‌شود را کشف کردند. مطالعات بعدی نشان داد تیونین برنج ((OsThi1 با JA در غلاف برنج القا و باعث مقاومت به بیماری باکتریایی ناشی از Burkholderia plantarii  و  B. glumae می‌گردد که با نتایج ما هم خوانی دارد(Iwai  et al., 2002). ثابت شده بیان ژنهای defensin در گیاهان از طریق مسیرهای وابسته به JA و اتیلن صورت می پذیرد و غیروابسته به SA می‌باشد (Thomma et al., 1998). از این رو مسیر های وابسته به JA نقش فعالی در مکانیسم های مقاومت گیاه برنج علیه R. solani ایفا می کنند.

بنظر می‌رسد پاسخ‌های دفاعی وابسته به اتیلن و JA علیه نکروتروف‌ها و پاسخ‌های دفاعی وابسته به SA علیه عوامل بیوتروف در گیاهان در معرض حمله القا می‌شود. افزایش شدید بیان ژن NH1 24 ساعت پس از آلودگی به قارچ R. solani  این گفته را تایید می کند. برخی پاسخ‌های دفاعی وابسته به SA بطور مستقل از NPR1 عمل می‌کنند. در نتیجه باید شاخه‌ای دیگر از مسیر سیگنال SA نیز وجود داشته باشد. ژن (Arabidopsis thaliana AtWhy1) توسط آلودگی Phythophthora parasitica و تیمار با SA بیان شده اما این افزایش بیان مستقل از NPR1 است ((Spoel et al., 2003) . نتایج این بررسی نشان می دهد که سطح بیان این ژن در رقم مقاوم در زمان اولیه نفوذ ) 12 ساعت پس از آلودگی) کاهش ولی در ساعت های بعدی افزایش معنی داری در مقایسه با رقم حساس یافته است که نشان‌دهنده نقش NH1 در مکانیسم­های مقاومت رقم مقاوم در تعامل با پاتوژن مذکور می باشد. در مورد تعامل با نکروتروف‌ها در برنج برعکس بیوتروف‌ها NH1 باعث تجمع بیشتر SA و در نتیجه SAR نمی‌شود (Greenberg et al., 1994). احتمالاً افزایش بیان این ژن در ساعت 24 پس از تلقیح به دلیل نقش دیگر آن پیرامون بسته‌بندی و انتقال پروتئین‌های سنتز شده گیاهی است که قبلا این نقش برای آن به اثبات رسید (Wang et al., 2005).

منابع

Abad L, Urzo D, Liu MP, Narasimhan D, Reuveni ML, Zhu M, Niu JK, Singh X, Hasegawa NK, Bressan  RA (1996). Antifungal activity of tobacco osmotin has specificity and involves plasma membrane permeabilization. Plant Science 118: 11-23.

Babaeizad V, Imani JG, Kogel KH, Eichmann R, Hückelhoven R (2009). Over-expression of the cell death regulator BAX Inhibitor-1 in barley confers reduced or enhanced susceptibility to distinct fungal pathogens. Theoretical Applied Genetics 118: 455–463.

Balali GR, Rahimian M, Kosari M (2008).  Study of genetic variation of Rhizoctonia solani AG 1-1A isolated from rice using pectic zymogram technique. Iranian Journal of Biology 21: 17-23.

Barratt DHP and Clark JA (1991). Proteins arising during the late stages of embryogenesis in Pisum sativum L. Planta. 184: 14–23.

Bohlmann, H. 1994. The role of thionins in plant protection. Critical Reviews in Plant Sciences 13:1–16.

Carmona MJ, Molina A, Fernandez JA, Lopez-Fando JJ, Garcia-Olmedo F (1993). Expression of the alpha-Thionin gene from barley in tobacco confers enhanced resistance to bacterial pathogens. Plant Journal 3: 457-462.

Chern MS, Fitzgerald HA, Canlas PE, Navarre DA, Ronald PC (2005). Overexpression of a rice NPR1 homolog leads to constitutive activation of defense response and hypersensitivity to light. Molecular Plant-Microbe Interactions 18: 511-520.

Christensen AB, Hocho B, Naesby M, Gregersen PL Brandt J (2002). The molecular characterization of two barley proteins establishes the novel PR-17 family of pathogenesis-related proteins. Molecular Plant-Microbe Interactions 3: 135–44.

Datta R, Velazhahan N, Oliva I, Ona T, Mew GS, Kush T, Muthukrishnan, SK, Datta S (1999).  Over-expression of the cloned rice thaumatin-like protein (PR-5) gene in transgenic rice plants enhances environmental friendly resistance to Rhizoctonia solani causing sheath blight disease, Theoretical Applied Genetics 98: 1138–1145.

Edreva, A. 2005. Pathogenesis- related proteins: Research progress in the last 15 years. Gen. Applied plant physiology 31: 105-124.

Epple P, Apel K, Bohlmann H (1997). Overexpression of an endogenous thionin enhances resistance of Arabidopsis against Fusarium oxysporum. Plant Cell. 9: 509–20.

Farkas GL and Stahmann MA (1966). On the nature of changes in peroxidase isozymes in bean leaves infected by Southern Bean Mosaic Virus. Phytopathology 56: 669-677.

Florack DEA, and Stiekema WJ (1994). Thionins: Properties, possible biological roles and     mechanisms of actions. Plant molecular biology 26: 25-37.

Florack DEA, Visser BDE, Vries PH, Van Vuurde JWL, and Stiekema WJ (1993). Analysis of the toxicity of purothionins and hordothionins for plant-pathogenic bacteria. European Journal of Plant Pathology 99: 259-268.

Gholamnezhad J, Sanjarian F, Mohammadi goltapeh E, Safaei N, Razavi KH (2015) Study of Wheat ESTs in its interaction with Mycosphaerella graminicola. Iranian         Journal of Agricultural Biotechnology 7: 87-106.

Glazebrook J (2005). Contrasting mechanisms of defense against biotrophic and      necrotrophic pathogens. Annual Review of Phytopathology 43:205-227.

Goudarzi A, Safaie N, Jafari M, Mahmoudi SB, Tohidfar M (2015) Transformation of sugar     beet with a bean chitinase gene and enhanced resistance to Alternaria alternate. Iranian Journal of Agricultural Biotechnology 7: 175-200.

Greenberg JT, Guo A, Klessig DF, Ausubel FM (1994). Programmed cell death in plants: a pathogen-triggered response activated with multiple defense functions. Cell. 77:551–63.

Grover A, Gowthaman R (2003). Strategies for development of fungus-resistant transgenic plants. Current Science 84: 330–40.

Hilaire E, Young SA, Willard LH, McGee JD, Sweat T, Chittoor, JM, Guikema JA, Leach JE (2001). Vascular defense responses in rice: Peroxidase accumulation in xylem parenchyma cells and xylem wall thickening. Molecular Plant-Microbe Interactions 14: 1411-1419.

Iwai T, Kaku H, Honkura R, Nakamura S, Ochiai H, Sasaki T, Ohashi Y (2002). Enhanced resistance to seed-transmitted bacterial disease in transgenic rice overproducing an oat cell -wall – bound thionin. Molecular Plant-Microbe Interactions 15: 515-521.

Jaishree M, Chittoor J, Leach E, Frank F (1997). Differential Induction of a Peroxidase Gene Family During Infection of Rice by Xanthomonas oryzae pv. oryzae. Molecular Plant-Microbe Interactions 10: 861–871.

Jwa NS, Agrawal GK, Rakwal R, Park CH, Agrawal VP (2001). Molecular cloning and characterization of a novel jasmonate inducible pathogenesis-related class 10 protein gene, JIOsPR10, from rice (Oryza sativa L.) seedling leaves. Biochemical and Biophysical Research Communications 286: 973–983.

Kim S, Ahn P, Lee YH (2001). Analysis of genes expressed during rice-Magnaporthe grisea interactions. Molecular Plant-Microbe Interactions 14: 1340–1346.

Lay FT and Anderson MA (2005). Defensins—components of the innate immune system in plants. Curr. Protein Pept. Sci 6: 85–101.

Lin W, Anuratha CS, Datta K, Potrykus I, Muthukrishnan S, and Datta SK (1995). Genetic engineering of rice for resistance to sheath blight. Nature Biotechnology 13: 686-691.

Livak KJ, Schmittgen TD (2001). Analysis of relative gene expression data using realtime quantitative PCR and the 2^-ΔΔCT Method. Methods 25: 402–408.

Midoh N and Iwata W (1996). Cloning and characterization of a probenazole-inducible gene for an intracellular pathogenesis-related protein in rice. Plant Cell Physiology 37: 9–18.

Muthukrishnan S, George H, Harold N, Bikram S (2001). Pathogenesis-related proteins and their genes in cereals. Plant Cell Tissue and Organ Culture 64: 93–114.

Novacky A and Hampton RE (1968). Peroxidase isozymes in virus-infected plants. Phytopathology 58: 301-305.

Passardi F, Penel C, Dunand C (2004). Performing the paradoxical: How plant peroxidases modify the cell wall. Trends in Plant Science 9: 534–40.

Shah J, Kachroo P, Klessig DF (1999). The Arabidopsis ssi1 mutation restores pathogenesis-related gene expression in npr1 plants and renders defensin gene expression salicylic acid dependent. Plant Cell 11: 191–206.

Spoel SH, Koornneef A, Claessens SMC, Korzelius JP, Van Pelt J.A (2003). NPR1 modulates cross-talk between salicylate- and jasmonate-dependent defense pathways through a novel function in the cytosol. Plant Cell 15: 760–70.

Thomma BPHJ, Eggermont K, Penninckx IAMA, Mauch-Mani B, Vogelsang R (1998). Separate jasmonate-dependent and salicylate-dependent defense-response pathways in Arabidopsis are essential for resistance to distinct microbial pathogens. Proceedings of the National Academy of Sciences 95: 15107–11.

Triant DA and Whitehead (2009). Simultaneous extraction of high-quality RNA and DNA from small tissue samples. Journal of Heredity 100:  246–250.

Van Loon LC (1997). Induced resistance in plants and the role of pathogenesis-related proteins. European Journal of Plant Pathology 103: 753–7.

Van Loon LC, Rep M, Pieterse CMJ (2006). Significance of inducible defense-related proteins in infected plants.  Annual Review of Phytopathology 44: 135–62.

Velazhahan R, Chen-Cole K, Anuratha CS, Muthukrishnan S (1998). Induction of thaumatin-like proteins (TLPs) in Rhizoctonia solani- infected rice and characterization of two new cDNA clones. Physiologia Plantarum 102: 21-28.

Zhao CG, Wang AR, Shi YJ, Wang LQ, Liu WD, Wang ZH, Lu GD (2008). Identification of defense-related genes in rice responding to challenge by Rhizoctonia solani. Theoretical Applied of Genetics 116: 501–516.