Study of population structure and stratification two ecotypes buffalo with dense single nucleotide polymorphism markers using Admixture, MDS, PCA and GC methods

بررسی ساختار و لایه بندی جمعیت گاومیش­های اکوتیپ آذری و شمالی  با نشانگرهای متراکم چند شکل تک نوکلئوتیدی  با استفاده از روش­های Admixture، GC، PCA و MDS

زهرا عزیزی¹، عباس رأفت²، جلیل شجاع³، حسین مرادی شهربابک*⁴، محمد مرادی شهربابک⁵

¹دانشجوی دکتری،گروه علوم دامی،دانشکده کشاورزی، دانشگاه تبریز

²دانشیار، گروه علوم دامی،دانشکده کشاورزی، دانشگاه تبریز

³استاد، گروه علوم دامی،دانشکده کشاورزی، دانشگاه تبریز

⁴استادیار، گروه علوم دامی،پردیس کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه تهران

⁵استاد،، گروه علوم دامی،پردیس کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه تهران

تاریخ دریافت: 30/09/1394، تاریخ پذیرش: 04/02/1395

چکیده

در کاربردهای ژنتیک جمعیت، اختصاص افراد به جمعیت­های مربوط به خود اهمیت دارد. با توسعه تکنولوژی تعیین ژنوتیپ در مقیاس وسیع بسیاری از نشانگرها از جمله اسنیپ ها برای این مطالعات قابل دسترس شده­اند که این اسنیپ­ها در مطالعه تنوع ژنتیکی دام­های اهلی و ساختار جمعیت سودمند هستند. هدف این تحقیق بررسی ساختار و لایه­بندی گاومیش­های مناطق مختلف دو اکوتیپ آذری و شمالی با استفاده از داده­های SNPChip 90 با روش­های معمول بررسی ساختار جمعیت بود که برای این منظور تعداد 258 گاومیش از استان­های آذربایجان شرقی، آذربایجان غربی و اردبیل مربوط به اکوتیپ آذری و از استان گیلان مربوط به اکوتیپ شمالی نمونه­گیری و تعیین ژنوتیپ شدند. نتایج حاصل از کنترل ژنومیک لایه بندی ضعیفی با =1.056λ نشان داد که حاکی از وجود اختلاط (ساختار ضعیفی) در بین دو اکوتیپ است. پلات­های حاصل از تجزیه مولفه­های اصلی و مقیاس بندی چند بعدی، تفکیک این دو اکوتیپ و استان­های مختلف دو اکوتیپ را براساس فواصل انجام داد. روش Admixture نیز نزدیکی فاصله ژنتیکی افراد استان­های مختلف دو اکوتیپ را نشان داد که البته افراد خالصی هم در این بین وجود داشتند و k=3 خطای اعتبارسنجی پایینی داشت. این روش­ها قادر به جداسازی کلی حیوانات به توده­های مربوطه بودند و نتایج این تحقیق گویای ارتباط ژنتیکی نزدیک افراد چهار استان مختلف از دو اکوتیپ آذری و شمالی بود.

واژه­های کلیدی: لایه بندی جمعیت، تراشه اسنیپ 90K، گاومیش، MDS، PCA.

مقدمه

حیوانــات و گیاهــان بومی به عنوان ســرمایه ملی و ذخایر اســتراتژیک هر کشور محســوب می شــوند و حفظ و تکثیرآنها از ارزش و اهمیــت بســیاری برخوردار اســت. ایــن موجودات پــس از هزاران ســال انتخاب طبیعی و مصنوعی و نیز گذر از موانع بســیار و با غلبه بر تمامی شــرایط نامساعد محیطی همچنان به حیات خویش ادامه داده و به تکثیر و ازدیاد نســل پرداخته­اند همچنین نســبت به بســیاری از محدودیت­های محیطی سازگاری پیدا کرده اند. این مسئله، بخصوص با افزایش تولید محصولات دامی و تولید محصولات پیش‌بینی‌نشده در آینده، لزوم حفظ تنوع ژنتیکی در دام­های بومی را الزامی ساخته است چرا که یک گونه بدون تنوع ژنتیکی کافی قادر به سازگاری با تغییرات محیطی و مبارزه با انگل­ها نیست (Askari et al., 2011). همچنین مطالعه تنوع ژنتیکی نژادهای بومی برای حفاظت از منابع ژنتیکی ذخایر بومی لازم و ضروری است (Mohammadi et al., 2009).

حفاظت باید بر اساس دانش عمیقی از منابع ژنتیکی نژادهای خاص باشد، لذا تلاش برای شناسایی و تعیین خصوصیات ژنتیکی نژادهای بومی و محلی بسیار اهمیت دارد (Shojaei et al., 2011 Zamani et al., 2013; ). استفاده از نشانگرهای مولکولی در سال­های اخیر جهت تعیین تنوع ژنتیکی بین جمعیت­ها و حیوانات حفاظت‌شده، کاربرد گسترده­ای یافته است. میزان چندشکلی به‌دست‌آمده از این نشانگرهای ژنتیکی، یکی از پارامترهای قابل ارزیابی برای مطالعه جمعیت­های مختلف و درک تفاوت­های ژنتیکی بین جمعیت­هاست. تکنیک­های ملکولی جدید، به همراه پیشرفت­های ژنتیک آماری افق جالب و جذابی را برای انجام تحقیقات در زمینه نقشه­یابی QTL و تنوع صفات مورد نظر گشوده­اند (Abadi et al., 2009). گاومیش­های ایران به دلیل سازگاری با محیط، مقاومت در برابر بیماری­ها، هزینه­های نگهداری پایین و استفاده از ضایعات کشاورزی و مواد خشبی کم ارزش، یکی از ذخایر ژنتیکی با ارزش محسوب می­شوند. گاومیش ایران براساس شرایط آب و هوایی به سه دسته اصلی تقسیم بندی می­شود: اکوتیپ آذری (آذربایجان غربی و شرقی)، اکوتیپ شمالی (گیلان و مازندران) و اکوتیپ خوزستانی (خوزستان). در حوزه ژنتیک و اصلاح نژاد دام، اطلاع از ساختار ژنتیکی جمعیت در راستای اجرای بهتر برنامه­های اصلاح نژادی و از همه مهم­تر، حفظ  ذخیره ژنتیکی بسیار ارزشمند است. از سویی دیگر ساختارهای زیر جمعیتی درون جمعیت های مورد مطالعه باعث ایجاد اریب در مطالعات GWAS می شود (Thomas and Witte, 2002 Wacholder et al., 2002; ) و لایه­بندی جمعیتی (مخلوطی از افراد از پس زمینه­های ژنتیکی متفاوت) به دلیل ایجاد اشتباه نوع اول، چالشی برای مطالعات  GWASاست، چرا که در مطالعات GWAS فرض بر همگنی جامعه است که این فرض می­تواند به آسانی نقض شود (Marchini et al., 2004). لایه بندی جمعیتی ناشی از تفاوت در فراوانی اللی زیر جمعیت ها به دلیل تفاوت ژنتیکی جد مشترک است بخصوص در مطالعات ارتباطی که باعث ایجاد نتایج اریب مرتبط با صفت مورد نظر می­گردد (Price et al., 2010). لایه بندی جمعیتی در این زمینه اشاره به ساختار جمعیت دارد. نسل­های جدید فن­آوری توالی یابی، باعث ایجاد مقادیر بی سابقه­ای از داده ها برای جوامع دامی در حوزه ژنتیک شده است و داده­های ژنومی فرصتی برای حل پیچیدگی تاریخچه تکاملی جمعیت­ها و بازسازی حتی وقایع تاریخی نادر، فراهم می­آورند. نتیجه منشا تاریخی پیچیده در ارتباط با انتخاب طبیعی و مصنوعی منجر به اختلاف متعدد نژادهای مختلف که تنوع فنوتیپی گسترده در طی یک دوره کوتاه زمانی نشان می­دهند، شده است (Epps et al., 2013). استنتاج ساختار جمعیت از نشانگرهای ژنتیکی، در شرایط گوناگون مثل مطالعات ارتباطی و تکاملی، دسته­بندی زیرگونه­ها و تعیین موانع ژنتیکی مفید می­باشد. روش­های متعددی برای تعیین ساختار ژنتیکی و لایه­بندی جمعیت وجود دارد. آنالیز مولفه­های اصلی (Patterson et al., 2006 Price et al., 2006; ) و مقیاس بندی چند بعدی (Purcell et al., 2007) روش­هایی هستند که قادر به تعیین ساختار جمعیت می­باشند. هدف از آنالیز MDS، کشف ساختار در داده­ها و ابعاد معنی دار مرتبط است که شمایی تصویری از عدم تشابه (تشابه) در بین عناصر را می­دهد. این روش ابعادی که فاصله ژنتیکی مشاهده شده را توضیح می­دهد براساس روش Identity by state  شناسایی می­نماید. تجزیه مؤلفه­های اصلی جزئی از تحلیل­های عاملی است که به عنوان یک روش بسیار مفید برای تصحیح لایه بندی جمعیتی در مطالعات GWAS کاربرد دارد (Liu et al., 2013).  این روش علاوه بر نشانگرهای تک نوکلئوتیدی و ریز ماهواره، بر فراوانی­های هاپلوتایپی نیز اعمال می­شود. آنالیز مولفه اصلی ابزار استانداری در ژنتیک جمعیت است که برای کشف ساختار جمعیت کاربرد دارد و می­تواند برای داده­های با حجم زیاد استفاده شود، برخلاف STRUCTURE که برای داده­های با حجم زیاد غیر عملی است. روش PCA آزمونی را برای وجود ساختار جمعیتی در داده های ژنتیکی فراهم می­آورد (Patterson et al., 2006) و در مطالعه­ی جمعیت­های اروپائی و هندی استفاده شده است (Lao et al., 2008). همچنین در کنترل کیفیت در مطالعات ژنتیکی استفاده می­شود. روش کنترل ژنومیک برای پیمایش ارتباطات نشانگرها تحت فرضیه صفر و برآورد لایه بندی جمعیتی با استفاده از آماره لامبدا و نمودار Q-Q plot  استفاده می­گردد. کنترل ژنومیک روش ناپارامتری برای کنترل لایه­بندی جمعیتی در مطالعات case-control می­باشد (Devlin and Roeder, 1999). این روش از نظر محاسباتی آسان و سریع است (Hinrichs et al., 2009). علاوه براین می­تواند برای تصحیح برای ساختار خانواده و ارتباطات نهان استفاده شود (Thornton and McPeek, 2010). در مطالعات ارتباطی کنترل ژنومیک نشانگرهای کل ژنوم را برای تصحیح هر گونه تورم در تست آماری به دلیل وجود زیر ساختار، استفاده می­کند (Bacanu et al., 2002). روش­های مبتنی بر مدل نیز برای استباط ساختار جمعیت و انتساب افراد به جمعیت­ها به کار برده شده است (Pritchard et al., 2000). از انواع الگوریتم­های مبتنی بر مدل، مدل Admixture برای دستیابی به ساختار جمعیت با استفاده از کل ژنوم ارائه شده است که این به لحاظ محاسباتی کارآمد بوده و برای داده های بزرگ کاربرد دارد و نیازمند توزیع پیشین برای پارامترهای مدل و متکی به اطلاعات انساب می­باشد (Alexander et al., 2009). الگوهای اختلاط و ساختار جمعیتی در جمعیت­های شمال آمریکای شمالی با روشAdmixture  بررسی شده است (Verdu et al., 2014). لذا، در این مطالعه روش­های [1]GC (کنترل ژنومیک)،PCA [2] (آنالیز مولفه اصلی)، MDS[3] (مقیاس بندی چند بعدی) و Admixture برای بررسی ساختار جمعیتی گاومیش­های اکوتیپ آذری و شمالی اجرا شد.

مواد و روش ها

نمونه­های حیوانی و تعیین ژنوتیپ

نمونه­ها از گله­های مردمی و گله­های تحت سیستم ثبت شجره و رکوردهای مرکز بهبود تولیدات دامی و اصلاح نژاد جمع آوری شد. فاکتورهای مورد توجه در گزینش حیوانات، انتخاب حیوانات غیر خویشاوند و حیواناتی بودند که تا حد ممکن پراکنش متفاوتی داشته و بیانگر تنوع موجود در جمعیت ها بودند. نمونه برداری از استان های آذربایجان غربی (از سه شهر خوی، ارومیه و مهاباد)، آذربایجان شرقی (از 5 شهر شامل تبریز، سراب، بستان آباد، اسکو و ایلخچی )، اردبیل (از دو شهر نمین و مشکین شهر) و گیلان (از 7 شهر ماسال، تالش، صومعه سرا، بندر انزلی، طاهر گوراب، رضوانشهر و اسالم) انجام گرفت. در کل 262 نمونه به ترتیب 68، 65،56 و 73 نمونه از استان­های آذربایجان غربی، اردبیل، آذربایجان شرقی و گیلان جمع­آوری شد. استخراج DNA ژنومیک از ریشه مو و خون با روش بهینه نمکی انجام شد. نمونه­ها جهت انجام مراحل بعدی توالی­یابی به آزمایشگاه ژنومیک مرکز تحقیقات پادانو (Parco Tecnologico Padano) کشور ایتالیا منتقل شدند سپس نمونه­ها با استفاده از تراشه­های Array Axiom® Buffalo Genotyping 90K مربوط به شرکت افی­متریکس کشور ایتالیا تعیین ژنوتیپ شدند. این آرایه­ها امکان تعیین ژنوتیپ بیش از85 هزار جایگاه نشانگریا اسنیپ را فراهم می­آورند.

مراحل فیلتراسیون داده های حاصل از تعیین

ژنوتیپ جهت انجام آنالیزهای نهایی

برای اطمینان از کیفیت داده­های حاصل از تعیین ژنوتیپ، در آنالیزهای نهایی مراحل مختلف فیلتراسیون بر روی داده های اولیه با استفاده از نرم افزار Plink، اعمال شد بدین ترتیب که در ابتدا حیوانات دارای بیش از 5% ژنوتیپ از دست رفته از آنالیزهای بعدی کنار گذاشته شد چون نمونه­های با کیفیت پایین با احتمال بیشتری با داده های گمشده همراه هستند و منجر به افزایش خطای ژنوتایپ می­شود (Barendse et al., 2009). دو فاکتور حداقل فراوانی آللی(MAF) و درصد نمونه­هایی که برای آن نشانگر ژنوتایپ شده­اند (Call rate) برای هر اسنیپ محاسبه شدند واسنیپ­هایی که در مجموع دارای  Call rate و MAF به ترتیب کمتر از 95% و 1 % بودند، حذف شدند. برای اسنیپ­های باقی مانده در صورت عدم تعادل هاردی–وینبرگ به عنوان معیاری از خطای ژنوتایپینگ کنار گذاشته شدند (Teo et al., 2007). برای  تعیین سطح معنی داری مطلوب در این آزمون از تصحیح بنفرونی(β=α/n) استفاده شد. به عبارتی پس از تعیین ژنوتیپ، با عمل غربالگری  توضیح داده شده، اسنیپ­های منتخب وارد مرحله دیگر آنالیز شدند. در این مطالعه کنترل کیفیت اولیه روی داده­ها توسط شرکت پادانو انجام گرفت که بعد از کنترل کیفیت اولیه، 4 نمونه در جریان تعیین ژنوتیپ(دو نمونه از استان اردبیل و دو نمونه از استان گیلان) با بیش از 5 درصد ژنوتیپ گم شده حذف شدند. در مجموع تعداد 8855 اسنیپ به دلیل MAF کمتر از 1% ، 336 اسنیپ به دلیل انحراف از تعادل هاردی-وینبرگ در سطح 5% و 19 اسنیپ بخاطر موقعیت ناشناخته حذف شدند. در نهایت258 حیوان با 64750 اسنیپ ، مراحل کنترل کیفیت را با MAF>0.01 و call rate>0.99 گذراندند و همه اسنیپ­های باقی مانده در سطح 5%  در تعادل هاردی وینبرگ بودند.

آنالیزهای آماری

مقیاس چند بعدی یا MDS[4]

این روش برای بررسی ساختار جمعیت و ارتباط میان افراد، براساس ماتریس همبستگی IBS بین دو فرد، عمل می کند که برای این کار از نرم افزار PLINK (Purcell et al., 2007) استفاده شد. سپس MDS در این ماتریس با تابع cmdscale در نرم افزار R اجرا شد.

کنترل ژنومیک یا  GC

روش کنترل ژنومیک برای برآورد لایه بندی جمعیتی با استفاده از  آماره لامبدا و نمودار Q-Q plot استفاده می­گردد. آماره لامبدا که از تقسیم میانه مقادیر کای مربع مشاهده شده بر میانه مورد انتظار (456/0) حاصل می شود، فاکتور inflation  می باشد. اگر مقدار آماره لامبدا کمتر یا مساوی یک باشد، نشان دهنده عدم وجود اثر لایه بندی می باشد. در این مطالعه روش کنترل ژنومیک و ترسیم Q-Q plot در نرم افزار R و با پکیج SNPassoc اجرا شد.

آنالیز به مولفه های اصلی یا  PCA

هدف از تجزیه به مؤلفه­های اصلی آن است که واریانس موجود در داده­های چندمتغیره را به مؤلفه­هایی تجزیه کند که اولین مؤلفه تا آنجا که ممکن است علت بیشترین واریانس موجود در داده­ها باشد. دومین مؤلفه علت بیشترین واریانس ممکن بعد از مؤلفه اول و الی آخر باشد. بعلاوه، در این روش هر مؤلفه مستقل از مؤلفه­های دیگر است، یعنی بین هر مؤلفه و مؤلفه­های دیگر همبستگی وجود ندارد. یعنی در فضا هر مؤلفه از نظر جهت در زاویه طرف راست مؤلفه­های دیگر قرار دارد. آنالیز PCA با تابع prcomp در نرم افزار R انجام شد.

بررسی آمیختگی بین جمعیت­ها  

برای بررسی آمیختگی بین جمعیت­ها، آنالیز اختلاط نژادی با استفاده از نرم افزار Admixture 1.23 در محیط لینوکس صورت گرفت و میزان اشتراک ژنتیکی این نژادها به­صورت گراف بدست آمد (Alexander et al., 2009). از فرمت داده­های استاندارد و باینری PLINK  به­عنوان داده­های ورودی این نرم افزار استفاده شد و فایل خروجی آن یک فایل متنی بود و گراف مربوط به این فایل خروجی در محیط R رسم شد. فاکتور K که عدد آن در این نرم­افزار در تشخیص تعداد جمعیت­ها نقش دارد و مبنای تفکیک جمعیت­ها مقدار عددی این فاکتور می­باشد. با توجه به خطای اعتبارسنجی متقابل پایین انتخاب می­شود.

نتایج و بحث

نتایج کنترل کیفیت

کنترل کیفیت روی 64750 اسنیپ بدست آمده از کنترل کیفیت اولیه اجرا شد که در ابتدا 19 اسنیپ به دلیل موقعیت ناشناخته حذف شدند و در مراحل مختلف کنترل کیفیت روی اسنیپ های باقیمانده 7 اسنیپ با MAF کمتر از 1 درصد حذف شدند و 5 اسنیپ هم به دلیل انحراف از تعادل هاردی –وینبرگ از آنالیزهای نهایی حذف شدند و در مجموع 258 حیوان از 4 استان مختلف از دو اکوتیپ با 64719 اسنیپ  وارد مرحله آنالیز نهایی شدند.

آنالیز آماری

کنترل ژنومیک

چندین روش برای تخمین کنترل تورم ژنومیکی وجود دارد که در این تحقیق روش تخمین­گر میانه اجرا شد. پارامتر تورم ژنتیکی تخمین زده شده حدود 0569/1 (λ_GC=1.0569) بود که لایه بندی جمعیتی ضعیفی را نشان می­دهد. به عبارتی انحراف از یک نشان دهنده این موضوع است که حیوانات 4 استان کاملا خالص نیستند و اختلاط و ارتباط ژنتیکی بین این حیوانات وجود دارد. گراف مربوط به Q-Q (شکل 1) ارائه شده است. هر گونه انحراف از خط نشان دهنده وجود اثر لایه بندی جمعیتی می باشد.

شکل 1- Q-Q plot برای ارزیابی لایه بندی.

Figure 1- Plot Q-Q for evaluation of stratification.

مقیاس بندی چند بعدی

آنالیز مقیاس بندی چند بعدی که برای مشاهده شباهت یا تفاوت در فضای با ابعاد کم است توزیع افراد استان­های مختلف را نشان می­دهد (شکل 2) که نتایج حاکی از این است که افرادی که دورترند خلوص بیشتری نسبت به افرادی که در میانه قرار گرفته اند دارند و افرادی که در میانه هستند اختلاط داشته و هیبرید هستند. در این شکل رنگ های سبز، قرمز، آبی و سیاه به ترتیب استان­های اردبیل، گیلان، تبریز و ارومیه می­باشد که بیشترین فاصله را حیوانات استان اردبیل با استان گیلان دارند ولی با توجه به اختلاطی که در میانه شکل رخ داده است تفکیک کامل امکان پذیر نیست و نمی­توان گفت که حیوانات دو استان از هم جدا هستند.

آنالیز مولفه های اصلی

روش PCA، مولفه­های اصلی را که ساختار جمعیت را براساس همبستگی ژنتیکی میان افراد بیان می­کند، شناسایی می­کند. برای ارزیابی اختلاف ژنتیکی میان جمعیت­ها (4 استان) در دو اکوتیپ شکل PCA(شکل 3) ترسیم شد که نشان دهنده نزدیکی ژنتیکی افراد استان های مختلف دو اکوتیپ است که مثل نتایج MDS، در این شکل رنگ های قرمز، سبز، آبی و سیاه به ترتیب استان های اردبیل، گیلان، تبریز و ارومیه  می­باشد که بیشترین فاصله را حیوانات استان اردبیل با استان گیلان دارند ولی با توجه به اختلاطی که در میانه شکل رخ داده است ارتباط ژنتیکی بین این استان ها وجود دارد. نتایج آنالیز PCA بر اساس PC1 و PC2 نشان داد که این 4 استان در میانه هم پوشانی دارند. این دو PCA در 4/2  درصد واریانس را توجیه می کنند. 26PCA اول 20 درصد واریانس را در این جمعیت توجیه می کنند که پایین بودن مقدار واریانس توجیهی نشان دهنده این است که این جمعیت ها تمایز کمتری دارند.

 شکل 2– MDS و دسته بندی افراد استان های مختلف (رنگ های سبز، قرمز، سیاه و آبی به ترتیب متعلق به استان های اردبیل، گیلان، آذربایجان غربی و آذربایجان شرقی می باشد).

Figure 2- MDS and categorization of the different provinces (green, red, blue and black color shows Ardebil, Guilan, West Azerbaijan and East Azerbaijan, respectively).

شکل 3- آنالیز PCA مربوط به گاومیش های استان های مختلف دو اکوتیپ (رنگ­های قرمز، سبز، سیاه و آبی به ترتیب استان های اردبیل، گیلان، آذربایجان غربی  و آذربایجان شرقی را نشان می­دهد).

Figure 3- PCA analysis of the buffalo from the provinces of two ecotypes (red, yellow, green and blue color shows Ardebil, Guilan, West Azerbaijan and East Azerbaijan, respectively).

آمیختگی بین جمعیت­ها  یا Admixture

فاکتور k که تعداد جمعیت ها را نشان می­دهد از 2 تا 7 در نظر گرفته شد و k=3 با 10 بار اعتبار سنجی متقابل کمترین خطا را نشان داد (شکل 4). گراف­های مربوط به k از 2 تا 4 برای مثال ارائه شده است (شکل 5). طبق شکل­های بالا که درصد اختلاط در سمت چپ قابل مشاهده است افرادی که تا بالای نمودار با یک رنگ مشخص ادامه دارند خالص هستند و افرادی که رنگ­های مختلف را با درصدهای مختلف دارند مخلوط بوده و هیبرید هستند. نتایج حاکی از این است که اختلاط و ارتباط ژنتیکی افراد استان­های مختلف دو اکوتیپ بالاست و طبق نتایج بدست آمده، این حیوانات متعلق به یک جمعیت می­باشند.

روش MDS انعطاف پذیرتر از روش PCA بود. PCA نیازمند پیش فرض توزیع نرمال چند جمله­ای داده­ها است در حای که MDS این محدودیت را نداشته و می­تواند برای هر نوع از تشابهات و فواصل نیز به کار رود. در حالتی نیز که MDS می­تواند از ماتریس کواریانس بدست آید در این صورت نتایج دو روش در تصحیح لایه­بندی جمعیتی یکسان می­شود (Li and Yu, 2008).

شکل 4- اعتبارسنجی متقابل برای داده های گاومیش برای تعیینK .

Figure 4- Cross validation for buffalo data to determine K.

شکل 5- ساختارAdmixture. در هر شکل، هر خوشه یا کلاس با رنگ ها مختلف بیان می شود و هر فرد توسط خطوط عمودی  به k بخش رنگی با ارتفاع متناسب با سهم ژنوتیپ در خوشه ها تقسیم شده است.

Figure 5- Structure Admixture. In each plot, each cluster classes with different colors and each one is represented by vertical lines to k-color section height divided according to the proportion of genotype in clusters.

محدودیت دیگرPCA، به تصویر کشیدن تعداد زیادی PC به طور همزمان برای نمایان کردن ساختار جامعه ممکن نیست (Gao and Starmer, 2007). در آنالیز ساختار جمعیت نژادهای گاومیش با روش خوشه بندی بیزی و PCA، با استفاده از 935 اسنیپ پلی مورفیسم ازBovine SNP50K Bead Chip، نژادها از نظر ساختاری به هم نزدیک بودند و این درحالی بود که این نژادها پیش زمینه تفاوت ژنتیکی معنی داری هم نداشتند (Wu et al., 2013). در مطالعه­ای روی جمعیت های گوسفند دنیا، 20 تا PC اول در مجموع فقط 16 درصد واریانس را توجیه کردند که بزرگ ترین مقدار مربوط به PC1  به مقدار 98/1 درصد بود (Kijas et al., 2012). در مطالعه­ای روی هفت نژاد بز ایرانی با 14 نشانگر ریزماهواره PC اول 39/25 درصد واریانس و PC دوم 70/19 درصد واریانس را توجیه کرد، آماره F_ST نیز محاسبه گردید و آنالیزSTRUCTURE که جزو روش­های مبتنی بر مدل است، نژادهای بز ایرانی را به سه خوشه تقسیم کرد و اختلاطی بین خوشه­های مرکزی و شمالی مشهود بود در حالی که خوشه غربی استخر ژنی کاملاً مجزایی تشکیل داد (Vahidi et al., 2014). در بررسی ساختار ژنتیکی گاوهای بومی ایران براساس نشانگرهای چند شکل تک نوکلئوتیدی، روش مبتنی بر مدل به کار گرفته شد و نتایج تعداد سه خوشه را توجیه کرد (Karimi et al, 2015). ساختار ژنتیکی و تنوع ژنتیکی گاوهای وحشی و اهلی بنگلادش با اسنیپ چیپ 80k بررسی شد. نتایج ساختار جمعیت و آنالیز مولفه اصلی پیشنهاد کرد که گایال جدا از بوس ایندیکوس بوده و دو جمعیت زبو ساختار ضعیفی داشتند (Uzzaman et al., 2014). این روش­هایی که ذکر شد جزء روش های بدون نظارت هستند که اطلاعات اولیه در آنالیزها وارد نمی­شود همچنین این روش­ها توانایی اجرای سریع داده­های با حجم زیاد (صدها هزار نشانگر و هزاران نمونه)را دارند. در مقایسه­ی دو روش PCA و MDS برای بررسی ساختار جمعیتی، در حالی که هر دو روش ساختار جمعیتی مشابهی را شناسایی کردند، PCA کمی بهتر از MDS در تصحیح لایه بندی جمعیتی عمل کرد (Wang et al., 2009). در بررسی الگوهای اختلاطی و ساختار جمعیتی جمعیت شمال غرب آمریکای شمالی با روش Admixture نتایج برخی از شباهت ها را نشان داد ولی اختلاف در بین الگوهای اختلاط در شمال غرب اقیانوس آرام و آمریکای لاتین جود داشت (Verdu et al., 2014). روش­های GC برای تست آماری GWAS با مدل­های متنوع توارثی می­تواند اعمال شود (Tsepilov et al., 2013). در مطالعه­ای برای بررسی لایه بندی جمعیتی روش­های مختلفی مقایسه شدند که در این بین روش­های مبتنی بر مدل و PCA عملکرد مشابهی داشتند و این در حالی بود که روش کنترل ژنومیک در جمعیت­هایی که لایه­بندی جمعیتی معنی داری وجود داشت، عملکرد خوبی نداشت (Zhang et al., 2008). روش Admixture می­تواند برای تخمین تعداد جمعیت­های پایه از طریق اعتبارسنجی متقابل استفاده شود و افراد از انساب شناخته شده می­توانند در یادگیری با نظارت برای تولید دقت بیشتر تخمین اجداد بکار برده شوند (Alexander and Lange, 2011). در این مطالعه با توجه به اینکه روش­های مختلف برای بررسی ساختار جمعیت به کار برده شد، و همه روش­های ذکر شده توانستند ساختار جمعیت­های دو اکوتیپ را نشان دهند و نتایج بدست آمده حاکی از این بود که با وجود افراد خالص در این جمعیت ها، این افراد از دو اکوتیپ مختلف متعلق به یک نژاد هستند و اشتراک ژنتیکی زیادی دارند. نتایج این تحقیق می­تواند در صورت وجود صفات فنوتیپی اجرا شود و نتایج حاصل از آنالیز GWAS با استفاده از اطلاعات نژادهای دیگر و با در نظر گرفتن زیر جمعیت ها و مقایسه آن با نتایج حاصل از بدون درنظر گرفتن زیر جمعیت ها منجر به فهم بهتر اهمیت بررسی ساختار و لایه بندی جمعیت شود.