Assessment of artificial operon in Bacillus subtilis to control transcription

بررسی اپرون  مصنوعی در باکتری باسیلوس سوبتیلیس (Bacillus subtilis) به منظور کنترل رونویسی

پرستو مجیدیان¹*، حمید نجفی زرینی²، کن یوشیدا³، غلامعلی رنجبر⁴، قربانعلی نعمت زاده⁵

¹دانشجوی دکتری، گروه اصلاح نباتات و بیوتکنولوژی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری، ایران.

² استادیار، گروه اصلاح نباتات و بیوتکنولوژی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری، ایران.

³استاد، گروه اگروبایوساینس، دانشگاه کوبه، ژاپن.

⁴ دانشیار، گروه اصلاح نباتات و بیوتکنولوژی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری، ساری، ایران.

⁵ استاد، گروه اصلاح نباتات و بیوتکنولوژی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری، ایران.

تاریخ دریافت: 03/12/1394، تاریخ پذیرش: 29/03/1395

چکیده

در این مطالعه، اپرون مصنوعی gnt با قابلیت تنظیم رونویسی برگشت‌پذیر در باکتری باسیلوس سوبتیلیس با استفاده از القاء‌کننده گلوکونات ایجاد شد. ابتدا، جهت عدم تاثیر پدیده بازدارندگی کاتابولیتی کربن بر روی میزان رونویسی، در ناحیه اتصالی پروتئین کاتابولیتی A در توالی‌های  cre_up و cre_down جهش ایجاد شد. سپس، ژن‌های ساختاری اپرون گلوکونات تحت کنترل یک پروموتر مداوم قوی (P_rpsO) به منظور تجزیه پذیری مداوم القاء‌کننده گلوکونات قرار گرفتند. از ژن گزارشگر lacZ نیز در پائین دست پروموتر‌های gnt جهت ارزیابی کارکرد اپرون مصنوعی استفاده شد. نتایج حاصل از القاء ضربه‌ای نشان داد که آنزیم بتاگالاکتوزیداز در هر یک از سویه‌های جهش‌یافته، در زمان صفر یا عدم حضور القاء‌کننده فعالیتی نشان نداد. با اضافه کردن 1 میلی‌مولار القاء‌کننده، حداکثر فعالیت آنزیم و تجمع متابولیت در 1 ساعت بعد از اضافه شدن القاء‌کننده دیده شد و به دنبال آن با تجزیه القاء‌کننده فعالیت آنزیم متوقف شد. با افزودن 5/2 و 5 میلی‌مولار گلوکونات به محیط کشت، حداکثر فعالیت آنزیم بتاگالاکتوزیداز به ترتیب در زمانهای 2h و 4h مشاهده شد. داده‌های ما بیانگرصرف زمان طولانی‌تری برای تجزیه القاء‌کننده و به تبع آن روشن ماندن اپرون در مدت زمان بیشتر و توقف رشد سلولی در حضور غلظت‌های بیشتری از القاء‌کننده بود. به طور کلی، می‌توان استفاده از سیستم القاء ضربه‌ای و اپرون‌های مصنوعی برگشت‌پذیر را جهت تولید وسیع متابولیت‌های خاص در بازه زمانی کوتاهی از رشد باکتری‌ها در مطالعات بعدی پیشنهاد کرد.

واژه‌های کلیدی: باسیلوس سوبتیلیس، اپرون مصنوعی، گلوکونات.

مقدمه

باکتری‌ها در معرض محیط‌های فیزیکی و شیمیایی مختلفی قرار دارند و با تنظیم بیان ژن‌های تولید کننده پروتئین­های ساختاری، انتقالی، آنزیم‌ها و ... به تغییرات شرایط محیطی واکنش نشان داده و به یک شرایط اکولوژیکی خاص سازگار می‌شوندTohidfar and Khosravi, 2014)). بنابراین، باکتری‌ها بسته به دسترسی به مواد غذایی مورد نیاز خود، بیان آنزیم­های دخیل در مسیرهای بیوشیمیائی مختلف را کنترل می­کنند (Balleza et al., 2009). پیشرف‌‌های اخیر در زمینه مهندسی متابولیک توجه محققین را به تولید سیستم­های تنظیمی رونویسی مصنوعی با هدف کنترل ژن‌های درون موجود زنده، ژن‌های ناهمگن، حذف یا افزایش مسیرهای متابولیکی ویژه و تولید و تجمع متابولیت‌های خاص معطوف کرده است
(Lee et al., 2012; Na et al., 2013). در زمینه مهندسی متابولیک، تعداد زیادی سیستم‌های بازدارندگی و القائی وجود دارد که جهت کنترل مصنوعی رونویسی استفاده می‌شوند. اما، اکثر این سیستم‌ها برگشت ناپذیر هستند، به این معنی که، زمانی که یک سیستم القائی روشن می‌شود به علت حضور مداوم القاء‌کننده نمی‌تواند خاموش شود و به طور مشابه، زمانی که یک سیستم بازدارندگی خاموش می‌شود، قابلیت روشن شدن مجدد را ندارد. در نتیجه، موضوع برگشت ناپذیری سیستم‌های تنظیمی رونویسی مصنوعی موجود، توجه انتقادی دانشمندان را در زمینه مهندسی متابولیک به خود جلب کرده است.

در ارتباط با تغییر بیان ژن، هیچ سیستم رونویسی برگشت‌پذیر فعال شونده با القاء‌کننده‌های شیمیایی وجود ندارد. اما، سیستم‌های دیگری نظیر سیستم‌های بیانی تغییر پذیر[1] به واسطه نور و دما وجود دارند که سبب القاء و بازدارندگی سریع و برگشت‌پذیر ژن‌های هدف در زمان‌های خاص می‌شوند (Rinas, 1996; Lee and Keasling, 2006; Lee et al., 2013). در طی دهه‌های اخیر، از باکتری باسیلوس سوبتیلیس به عنوان یک باکتری الگو جهت مطالعه اپرون‌های القائی و بازدارندگی مصنوعی، تنظیم بیان ژن و متابولیسم ژن‌ها استفاده شده است (Freyre-González et al., 2013). اپرون گلوکونات یکی از اپرون‌های معروف این باکتری است که مسئولیت کاتابولیسم گلوکونات را با استفاده از فسفریلاسیون گلوکونات به 6 فسفو گلوکونات طی مسیر پنتوز فسفات به عهده دارد (Reizer et al., 1991). به­علاوه، بازدارندگی کاتابولیتی کربن در باکتری باسیلوس سوبتیلیس تحت کنترل عناصر اساسی نظیر پروتئین کاتابولیتی A[2]، سرین فسفریله شده[3] و عنضر پاسخ دهنده کاتابولیتی[4] می باشد. تنظیم پدیده CCR در اپرون گلوکونات تحت کنترل دو توالی cre، یکی در اولین ژن اپرون گلوکونات، ژن تنظیم کننده gntR با نام (cre_down) و دیگری در ناحیه پروموتر با نام (cre_up) می‌باشد
(Miwa et al., 1997; Marciniak et al., 2012) و به دو صورت کنترل می‌شوند: الف) اتصال کمپلکس CcpA/P-ser-HPr به ناحیه cre در پروموتر اپرون گلوکونات سبب جلوگیری از رونویسی می‌شود. ب) اتصال کمپلکس CcpA/P-ser-HPr به ناحیه دیگری از cre درون ژن gntR از پیشرفت یا ادامه رونویسی ممانعت می‌کند (Miwa et al., 1997). در سال‌های اخیر، مطالعات متعددی بر روی بررسی عملکرد اپرون گلوکونات جهت ارزیابی و تنظیم سیستم‌های تنظیمی رونویسی مصنوعی انجام شده است. در سال 1986، فوجیتا و همکارانش، توالی نوکلئوتیدی اپرون گلوکونات را در باکتری باسیلوس سوبتیلیس گزارش کردند
(Fujita et al., 1986). روش‌های آنالیز حذفی و غیر فعال سازی الحاقی نشان داد که اپرون گلوکونات شامل سه ژن ساختاری به نام‌های گلوکونات کیناز (gntK)، گلوکونات پرمئاز (gntP)، یک ژن با عملکرد نامشخص (gntZ) و یک ژن تنظیمی (gntR) تولید‌کننده پروتئین بازدارنده رونویسی می‌باشد
(Miwa and Fujita, 1988).

در مطالعه دیگری، تنظیم منفی اپرون گلوکونات در اثر تعامل بین پروتئین بازدارنده گلوکونات و توالی اپراتور کشف شد
(Fujita and Fujita, 1987). در تحقیق مشابه دیگر، فوجیتا و میوا (1989)  دریافتند که پروتئین GntR در تعامل با گلوکونات یا S-گلوکونو لاکتون غیر فعال شده و توسط اولین ژن اپرون گلوکونات (gntR) رمز می‌شود
(Fujita and Miwa, 1989). در پژوهش ایشان مشخص شد که اپراتور gnt در بین موقعیت‌های 10- و 15+ قرار گرفته و دارای ساختار پالیندرومی نیمه متقارن ATACTTGTA می‌باشد. بر این اساس، هدف از مطالعه حاضر، 1) غیر فعال سازی پدیده CCR جهت از بین بردن تاثیر آن بر روی میزان رونویسی اپرون 2) بررسی عملکرد اپرون مصنوعی گلوکونات با هدف روشن و خاموش شدن برگشت‌پذیر سیستم بیانی در زمان های دلخواه و غلظت‌های متفاوت از القاء‌کننده در طول رشد باکتری بوده است.

مواد و روش‌ها

سویه‌های باکتریائی

در این مطالعه، از سویه باسیلوس سوبتیلیس 168 (trpC2) به عنوان یک سویه استاندارد استفاده شد. سویه‌های مشتق شده از سویه 168 عبارتند از: (trpC2, ∆gntR::P_rpsO (Em^R))، (trpC2, ∆gntR::P_rpsO (Em^R) amyE:: P_gnt-lacZgntRm)، (trpC2, ∆gntR::P_rpsO (Em^R) amyE::P_gntm1-lacZgntRm)، (trpC2, ∆gntR::P_rpsO (Em^R) amyE::P_gntm2-lacZgntRm).

محیط کشت و شرایط رشد باکتری‌ها

بعد از ترانسفورماسیون، جهش یافته­های باسیلوس سوبتیلیس بر روی محیط کشتagar  LB [5] انتخابی (شامل 10 گرم تریپتون، 5/0 گرم عصاره مخمر و 10 گرم سدیم کلراید) با آنتی بیوتیک‌های اریترومایسین و کلرامفنیکل به ترتیب به میزان 5/0 و 5 میکروگرم بر میلی لیتر در در دمای 37 درجه سانتی‌گراد به مدت 10 ساعت کشت داده شدند. جهت آزمون آنزیمی، سلول‌های باکتری در فاز تأخیری رشد (01/0 = ₆₀₀ OD) در فلاسک‌های زاویه دار حاوی محیط کشت مایع حداقل S6، تلقیح شدند.

از بین بردن پدیده CCR با ایجاد جهش در P_gnt و ناحیه رمز کننده پروتئین بازدارنده (gntRm)

جهت جلوگیری از اثر CCR بر روی میزان رونویسی، دو جهش در توالی cre  در بالادست (P_gnt) و پائین دست (gntR) اپرون gnt ایجاد شد. ابتدا، از ناحیه پروموتری ysiAB-etfBA شامل ناحیه 10- (TATCA)، یک توالی رابط 17 جفت بازی بین نواحی 10- و 35- و ناحیه 35- (TTGCAT) بدست آمده از پایگاه داده‌ای DBTBS مشابه با توالی پروموتر P_gnt استفاده شد (Ishii et al., 2001). به منظور ایجاد P_gntm1، ناحیه 35- پروموتر gnt با ناحیه پروموتری ysiAB-etfBA جایگزین شد و در مورد P_gntm2، توالی مورد توافق TTGACA در ناحیه 35- پروموتر gnt قرار گرفت. جهت تکثیر و کلونینگ قطعات P_gnt، P_gntm1 و P_gntm2، پلاسمید pCRE-test با آنزیم‌های برشی EcoRI و BamHI هضم شد و به ترتیب از جفت آغازگرهای (a067 و a070)، (a068 و a070) و (a069 و a070) برای ساخت pCRE-P_gnt، pCRE-P_gntm1 و pCRE-P_gntm2 استفاده شد. بعلاوه، توالی cre_down در 40 امین کدون (ACC) توسط جهش خاموش به کدون دیگری از اسید آمینه ترئونین (ACT) تبدیل شد.

ساخت سویه جهش‌یافته ∆gntR::P_rpsO (Em^R) به عنوان باکتری میزبان و ترانسفورماسیون

به منظور سهولت در تجزیه مداوم گلوکونات، ژن‌های ساختاری اپرون گلوکونات تحت کنترل مداوم پروموتر قوی[6] (P_rpsO) قرار گرفتند (Nicolas et al., 2012). کاست ژنی شامل پروموتر قوی و ژن مقاومت به اریترومایسین با استفاده از پی سی آر نوترکیب[7] تکثیر و به باکتری ترانسفورم شد (Farbet et al., 2002) (شکل 1).  با توجه به ماهیت طبیعی مستعد بودن[8] باکتری باسیلوس سوبتیلیس و عدم نیاز به ناقل پلاسمیدی برای ترانسفورماسیون
(de Vries and Wackernagel, 2002)، سلول‌های مستعد میزبان باکتریائی با استفاده از DNA استخراج شده از هر کدام از سلول‌های جهش‌یافته ترانسفورم شدند و کاست‌های ژنی از طریق نوترکیبی هومولوگی[9] در نواحی A و B در کروموزوم میزبان جای گرفتند.

شکل 1- الگوی ساخت سویه‌های جهش‌یافته. شکل بالا، حذف ژن تنظیم کننده gntR در اپرون gnt و جایگزینی با پروموتر مداوم قوی (P_rpsO) را نشان می‌دهد. شکل پائین نشاندهنده الحاق قطعه gntRm در پائین دست ژن گزارشگر و ساخت سویه‌های amyE:: P_gnt-lacZgntRm، amyE::P_gntm1-lacZgntRm و amyE::P_gntm2-lacZgntRm می‌باشد.

Figure 1- Construction of new strains. The upper figure shows deletion of gntR gene in the gnt operon and replacement with constitutive strong promoter (P_rpsO), the lower figure indicates the insertion of gntRm under lacZ reporter and construction of amyE::P_gntR-lacZgntRm, amyE::P_gntRm1-lacZgntRm and amyE::P_gntRm2-lacZgntRm strains.

تأئید سویه‌های جهش‌یافته با پی سی آر[10] و توالی‌یابی[11]

جهت استخراج تک کلونی‌ها[12]، کلونی‌های بدست آمده از هر محیط کشت بر روی محیط کشت جدید با استفاده از یک لوپ کشت شدند. DNA ژنومی از تک کلونی‌های هر پتری دیش، با استفاده از روشی مطابق مقاله ژانگ و همکاران با کمی تغییرات استخراج گردید (Zhang et al., 2011). تغییرات کروموزومی بدست آمده با استفاده از روش‌های PCR و توالی‌یابی با دستگاه توالی یاب ABI تأئید شدند. در نهایت، داده‌های بدست آمده از توالی‌یابی بوسیله نرم افزار‌های Sequence scanner version 1.0 وversion 10.1  GENETYX مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند.

اضافه کردن مقادیر متفاوتی از القاء‌کننده (گلوکونات) به محیط کشت باکتریائی جهت القاء ضربه‌ای[13]

سویه‌های باکتریائی بعد از پیش کشت[14]، در 100 میلی‌لیتر محیط کشت مایع S6 انتقال یافته و در شیکر انکوباتور دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه شد. کشت سلول‌های باکتری در فاز تأخیری رشد (01/0= ₆₀₀OD) آغاز شد و پس از رسیدن فاز لگاریتمی رشد (3/0=₆₀₀OD )، نمونه گیری از سلول‌های باکتریائی (1 میلی لیتر) انجام شد. به محض رسیدن فاز لگاریتمی رشد به 3/0، سلول‌ها به مدت 3 دقیقه با دور rpm 15000 در دمای 4 درجه سانتی‌گراد سانتریفیوژ شدند. سپس، به میزان 1 میلی‌مولار القاء‌کننده (گلوکونات) به محیط کشت اضافه شد و سلول‌ها با فاصله زمانی 1، 2، 4 و 8 ساعت بعد از اضافه کردن القاء‌کننده به میزان 500 میکرولیتر جمع‌آوری شدند.

آزمون آنزیمی

آزمون آنزیمی به دو صورت کمی و کیفی انجام شد. در حالت فنوتیپی، آزمون غربالگری کلونی‌های آبی – سفید[15]، میزان بیان ژن گزارشگر lacZ را نشان داد. بر این اساس، سلول‌های باکتریائی به مدت 40 ساعت بر روی محیط کشت LB agar حاوی سوبسترا X-gal (120 میکروگرم بر میلی‌لیتر) و آنتی‌بیوتیک کلرامفنیکل (5/0 میکروگرم بر میلی لیتر) کشت داده شدند. در آزمون کمی، میزان فعالیت آنزیم بتاگالاکتوزیداز بر اساس اندازه‌گیری ماده زرد رنگ او نیتروفنل بتا دی گالاکتوزید[16] و با استفاده از دستگاه اسپکتروفوتومتر BioRad powrwave XS انجام شد (Griffith and Wolf, 2002).

نتایج

نتایج حاصل از القاء ضربه‌ای در باکتری‌های جهش‌یافته

بر اساس نتایج بدست آمده، سلول‌های باکتری در محیط کشت بدون القاء‌کننده (0h) منحنی رشد نرمال را نشان دادند. یک ساعت بعد از اضافه کردن 1 میلی‌مولار گلوکونات (القاء‌کننده) به محیط کشت نیز تغییر محسوسی در میزان رشد سلول های باکتری ایجاد نشد. اما با افزایش مقادیر 5/2 و 5 میلی‌مولار از گلوکونات به محیط کشت، غلظت سلول‌های باکتریائی در فاز سکون[17]  کاهش یافته و سبب توقف رشد سلولی شد. به عنوان مثال، افزودن 5 میلی‌مولار گلوکونات نسبت به 1 میلی‌مولار به محیط کشت، رشد کندتری در فاز سکون را سبب شد
(شکل 2). از این رو، غلظت 1 میلی‌مولار از القاء‌کننده، رشد مناسب تر باکتری را نشان داد.

شکل 2- سیستم القائی ضربه‌ای در سویه‌های جهش‌یافته باکتری باسیلوس سوبتیلیس در عدم حضور القاء‌کننده (0 میلی‌مولار) و در حضور غلظت‌های متفاوتی از گلوکونات (1، 5/2 و 5 میلی‌مولار) به همراه 5 میلی‌مولار گلوکز

Figure 2- Pulse induction system in synthetic bacillus subtilis strains without any inducer and addition of 1 mM, 2.5 mM and 5 mM gluconate as well as 5 mM glucose.

بیان ژن گزارشگر lacZ با استفاده از آنالیز فنوتیپی

میزان بیان ژن گزارشگر lacZ تحت کنترل پروموتر های P_gnt، P_gntm1 و P_gntm2 در سه حالت بدون القاء‌کننده و با القاء‌کننده (1 و 5 میلی‌مولار) با استفاده از روش غربالگری کلونی‌های آبی – سفید انجام شد (شکل 3 بالا). کلونی‌های آبی رنگ مشاهده شده در محیط‌های کشت هر سه سویه باکتری فعالیت آنزیم بتاگالاکتوزیداز در حضور القاء‌کننده مشاهده شد. در حالی که وجود کلونی‌های سفید رنگ، عدم القاء پروموتر در اثر عدم حضور القاء‌کننده در محیط کشت را تأیید کرد.

نتایج بدست آمده از آزمون آنزیمی کمی نشان داد که هیچ گونه فعالیت آنزیمی در زمان (0h) به علت عدم حضور القاء‌کننده وجود ندارد
(شکل 3 پائین). با اضافه کردن 1 میلی‌مولار گلوکونات به محیط کشت، بالاترین سطح فعالیت آنزیم در زمان (1h) در هر سه سویه باکتریائی دیده شد و با تجزیه القاء‌کننده بعد از یک ساعت  فعالیت متوقف شد. با اضافه کردن 5/2 میلی‌مولار القاء‌کننده، بیشترین میزان فعالیت آنزیم در زمان (1h) در سویه ΔgntR::P_rpsO (Em^R) amyE::P_gnt lacZgntRm (Cm^R) ، در زمان (2h) در سویه ΔgntR::P_rpsO (Em^R) amyE::P_gntm1-lacZgntRm (Cm^R) و در زمان‌های (1h-2h) در سویهΔgntR::P_rpsO (Em^R) amyE::P_gntm2-lacZgntRm (Cm^R) مشاهده شد. با اضافه کردن 5 میلی‌مولار القاء‌کننده به محیط کشت، بیشترین سطح فعالیت آنزیم در زمان (4h) در همه سویه‌ها دیده شد. با توجه به مقایسات انجام شده می‌توان گفت که با اضافه کردن غلظت 5 میلی‌مولار از گلوکونات به محیط کشت، سلول باکتری قادر به تجزیه تمام آن نمی‌باشد و ژن هدف (lacZ) دیرتر فعال شده و اپرون به طور مداوم روشن می‌ماند. در حالی که، در غلظت پایین‌تر القاء‌کننده (1 میلی‌مولار)، گلوکونات در طول بازه زمانی کوتاهتری کاملا تجزیه شده سبب بازدارندگی مجدد از فعالیت آنزیم می‌گردد. در نتیجه، پروموتر در یک زمان مشخص در حضور القاء‌کننده تجزیه پذیر روشن و با تولید میزان کافی از محصول ژن گزارشگر (آنزیم بتا‌گالاکتوزیداز) خاموش می‌شود.

بحث

سیستم‌های بیان ژن تغییرپذیر به دلیل القاء و بازدارندگی برگشت‌پذیر ژن‌های هدف در هر زمان و کاهش اثرات پلیوتروپی ناشی از بیش‌بیان ژن‌ها، مورد توجه زیادی قرار گرفته‌اند. از سوی دیگر، سیستم­های در دسترس موجود تنها سیستم‌های القاء شونده با دما، pH و نور می‌باشند و سیستم‌های القائی با مواد شیمیائی  جهت استفاده در تولید انبوه متابولیت‌های خاص در صنعت وجود ندارد
(Jana and Deb, 2005; Valdez-Cruz et al., 2010). در این میان، تولید حداکثر متابولیت‌های خاص با کنترل کارآمد سیستم‌های بیولوژیکی و مسیرهای بیوشیمیائی ضروری است
(Drepper et al., 2011; Cho et al., 2012; Zhou et al., 2012). در نتیجه، دستیابی به یک ابزار مناسب جهت کنترل بیان ژن‌های باکتریائی به صورت دقیق و موقتی در پاسخ به محرک‌های خارجی به درک و دستکاری سیستم‌های بیولوژیکی پیچیده کمک می‌کند.

بر این اساس، از اپرون gnt در باکتری باسیلوس سوبتیلیس به دلیل ماهیت ذاتی برگشت پذیری‌اش و قابلیت تجزیه پذیری گلوکونات نه به عنوان منبع کربن بلکه به عنوان القاء‌کننده، جهت ایجاد اپرون مصنوعی برگشت پذیر استفاده شد. شواهد بدست آمده از مطالعه حاضر، به وضوح القاء ضربه‌ای در سیستم القائی مصنوعی در اثر اضافه کردن القاء‌کننده به محیط کشت نمونه‌های m1 و m2 را نشان داد. بعلاوه، عدم فعالیت آنزیم بتاگالاکتوزیداز در نمونه‌های جهش یافته در عدم حضور القاء‌کننده بیانگر کارآمد بودن جهش‌های ایجاد شده در پروموترهای مذکور و از بین رفتن پدیده CCR بود. تحقیقات مختلفی در زمینه پدیده بازدارندگی کربن در باکتری‌ها انجام گرفته است که با نتایج بدست آمده از پژوهش حاضر مطابقت دارد. در مطالعه‌ای مشابه، فسفریلاسیون مولکول‌های واسط Hpr و Crh جهت اتصال به پروتئین CcpA و تشکیل کمپلکس به منظور پدیده بازدارندگی کربن در اپرون xyn بررسی شد (Galinier et al., 1991).

شکل 3- بررسی کارکرد ژن گزارشگر lacZ با استفاده از آنالیزهای آنزیمی و فنوتیپی. شکل بالا، آزمون غربالگری کلونی‌های آبی –سفید را در غلظت‌های (0، 1 و 5 میلی‌مولار از گلوکونات به همراه گلوکز) در 3 سویه جهش یافته نشان می‌دهد. در شکل پائین، نتایج حاصل از آزمون آنزیمی بتاگالاکتوزیداز را در عدم حضور القاء‌کننده  و در حضور غلظت‌های متفاوتی از گلوکونات (1، 5/2 و 5 میلی‌مولار) بعلاوه 5 میلی‌مولار منبع کربن گلوکز مشاهده می‌شود. نمونه برداری از سلول‌های باکتریائی در زمان‌های 0h، 1h، 2h، 4h و 8h انجام شد. 

Figure 3- Check the functionality of lacZ reporter using phenotyping and enzymatic analysis. The upper part of the figure indicates the blue/white colonies in three mutant strains under different concentration of gluconate (0, 1 and 5 mM) with glucose as carbon source. The lower part shows the dendrograms of lacZ activity of each strain based on absence and presence of 0, 1, 2.5 and 5 mM gluconate in addition of 5 mM glucose. Time sampling was done in 0h, 1h, 2h, 4h and 8h after addition of gluconate.

نتایج نشان داد که مولکول واسط فروکتوز 1 و 6 بی فسفات سبب اتصال کمپلکس های P-ser-Hpr/CcpA و P-ser-Crh/CcpA  به توالی cre در اپرون xyn می گردد، اما هیچ اثری در اتصال CcpA به تنهائی به توالی cre  ندارد. در تحقیق دیگری، بیان اپرون dra–nupC–pdp تحت تأثیر پدیده بازدارندگی کاتابولیتی کربن مطالعه شد (Zeng et al., 2000). نتایج بدست آمده بیانگر وجود یک توالی پاسخ دهنده کاتابولیتی سیس اکتینگ واقع در 46 جفت باز در پائین دست نقطه شروع رونویسی بود. بعلاوه، در اثر ایجاد جهش نقطه‌ای در توالیcre  منجر به غیر فعال شدن پدیده بازدارندگی کاتابولیتی کربن در اپرون  dra–nupC–pdp شد.

در مطالعه دیگری، محققین بیان نمودند که علاوه بر پدیده CCR، فرآیندهای دفع القاء‌کننده  غیر وابسته به پروتئین CcpA و کنترل فعالیت تنظیم کننده‌ها توسط فسفریلاسیون منجر به غیر فعال سازی مسیرهای جایگزین در حضور سوبستراهای ترجیحی همچون گلوکز می‌گردند (Titgemeyer and Bruckner, 2002).

در پژوهشی، محققیقن ثابت کردند که بازدارندگی کاتابولیتی کربن در اپرون gnt تحت تأثیر پدیده دفع القاء کننده نمی‌باشد
(Fujita and Miwa, 1994). آنها بیان نمودند که پروتئین CcpA به عنوان عامل ضروری پدیده CCR  در اپرونgnt  نقش بازی می‌کند. بعلاوه، جهش ایجاد شده در آلل ژن  sigA بر روی پدیده  CCR تأثیر گذاشت.

در پژوهشی، بازدارندگی کاتابولیتی در اپرون gnt باکتری باسیلوس سوبتیلیس با استفاده از ایجاد جهش در مولکول His-15 مورد بررسی قرار گرفت (Rizer et a., 1998). آنها ثابت کردند که GntR، پروتئین بازدارنده اپرون gnt در باکتری باسیلوس سوبتیلیس، در بازدارندگی کاتابولیتی کربن اپرون gnt نقشی ندارد و فرآیند‌های دفع القاء‌کننده نیز موثر نمی‌باشند.

مطالعات متعددی در زمینه ساخت اپرون‌های مصنوعی با هدف افزایش و بهینه‌سازی یک متابولیت خاص انجام شده است. به عنوان مثال، در پژوهشی، ژن‌های دخیل در مسیر سنتز ریبوفلاوین (ribA, ribB, ribD, ribE, ribC) را در یک اپرون مصنوعی تحت کنترل پروموتر القائی trc جهت افزایش تولید این ماده قرار دادند. در نتیجه، بعد از مهندسی اپرون میزان تجمع ریبوفلاوین به میزان1/229 میلی‌گرم بر لیتر در باکتری E.coli افزایش یافت
(Lin et al., 2014).در مطالعه‌ای مشابه، میزان بیان ژن گزارشگر CAT تولید‌کننده آنزیم کلرامفنیکل استیل ترانسفراز در سویه 1A423 باکتری باسیلوس سوبتیلیس بررسی شد
(Fujita and Fujita, 1987). نتایج نشان داد که در 13 سلول نوترکیب مقاوم به آنتی‌بیوتیک کلرامفنیکل با اضافه کردن گلوکونات، میزان سنتز ژن CAT از 1/1 به 6/1 برابر افزایش یافت. در مطالعه دیگری، سه جهش‌یافته باکتری باسیلوس سوبتیلیس جهت ارزیابی توانائی اتصال گلوکونات به اپراتور توسط بررسی شدند
(Yoshida et al., 1995). در این پژوهش، پلاسمیدهای pGNT83D و pGNT177 جهش یافته مشتق شده از باکتری اشریشیا کولی، با اضافه کردن گلوکونات، سنتز ژن CAT را به میزان بالائی نشان دادند که دلالت بر نیاز مبرم به حضور آمینو اسیدهای 221 تا 243 جهت سنتز پروتئین GntR داشت. علاوه بر آن، فعالیت بالای آنزیم CAT می‌تواند دلالت بر حضور مداوم بازدانده در سلول حتی در عدم حضور القاء‌کننده را نیز داشته باشد. از خصوصیات بارز ژن گزارشگر lacZ نسبت به ژن  CAT، می‌توان به طول بیشتر ژن lacZ (استخراج شده از باکتری E.coli رمز کننده آنزیم بتاگالاکتوزیداز) حدود 3000 جفت باز نسبت به CAT اشاره کرد. ژن lacZ در مطالعات بیولوژیکی کاربرد فراوانی دارد و به سهولت قابل دستکاری ژنتیکی است. بعلاوه، آنزیم بتاگالاکتوزیداز نسبت به CAT، نیمه عمری پائین‌تری در حدود 15 دقیقه دارد
(Arvidson et al., 1991).

به طور کلی، در مهندسی متابولیک ممکن است نیاز به خاموش کردن یک مسیر متابولیکی ضروری به منظور تولید محصولات خاص با کارائی بالا باشد. اما این کار معمولا غیر ممکن است به این علت که مسیر بیوشیمیایی مورد نظر برای رشد سلول ضروری است
(Aristidou and Penttila, 2000). با استفاده از سیستم‌های القائی موقتی می‌توانیم یک مسیر بیوشیمیائی ضروری را جهت تجمع متابولیت مورد نظر به طور موقتی خاموش کنیم.

در واقع، با اضافه کردن القاء‌کننده به سیستم القائی، آنزیم مسئول واکنش مورد نظر بیان می‌شود و سبب رشد نرمال می‌گردد. اما زمانی که گلوکز به عنوان منبع کربن مصرف شود (بعد از تولید کافی از سلول ها)، واکنش مورد نظر به طور خودکار جهت تجمع متابولیت در بیشترین سطح، خاموش می‌گردد. اگر سلول‌ها نیاز به مسیر بیوشیمیایی مورد نظر جهت زنده ماندن داشته باشند، می‌توان با اضافه کردن القاء‌کننده، به طور موقتی واکنش را ادامه داد.

نتایج بدست آمده از آزمایشات ما به طور واضح نشان داد که سطح بیان ژن گزارشگر lacZ با تنظیم زمان و اضافه کردن غلظت‌های متفاوتی از گلوکونات تغییر می‌کند. این امر دلالت بر این دارد که مکانیسم القاء ضربه‌ای می‌تواند منجر به خلق یک سیستم القائی یا بازدارندگی مصنوعی در باکتری باسیلوس سوبتیلیس یا گونه‌های خویشاوند شود. امید است که در آینده‌ای نزدیک از این سیستم‌های تنظیمی برگشت پذیر به عنوان ابزار جدید و ارزشمندی در زمینه مهندسی متابولیک، تخمیر و تبدیل زیستی از جمله تولید سوخت‌های زیستی استفاده شود.