Document Type : Research Paper
Authors
1 MSc graduate of plant breeding and professor, Sari Agricultural Sciences and Natural Resources University, Iran.
2 Associate professor, Department of Plant Breeding and Biotechnology, Urmia University, Iran.
3 Associate professor, Dryland Agricultural Research Institute, Maragheh, Iran
Abstract
Keywords
اشباع نقشه ژنتیکی جو با استفاده از نشانگرهای رتروترنسپوزونی و جمعیت دابل هاپلوئیدی حاصل از تلاقی Clipper×Sahara
فریبا قادری1، بابک عبدالهی مندولکانی2*، نادعلی بابائیان جلودار1، بهزاد صادقزاده3
1 دانش آموخته کارشناسی ارشد اصلاح نباتات و استاد دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری
2 دانشیار گروه اصلاح و بیوتکنولوژی گیاهی دانشکده کشاورزی دانشگاه ارومیه
3 دانشیار موسسه تحقیقات کشاورزی دیم کشور، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، مراغه
تاریخ دریافت: 09/03/1395، تاریخ پذیرش: 23/07/1395
چکیده
نقشههای ژنتیکی با تراکم و پوشش بالای ژنومی نقش بسزایی در تحقیقات پایهای و کاربردی ژنتیک ایفا میکنند. در دهههای اخیر با پیدایش نشانگرهای DNA تحول عظیمی در تهیه و اشباع نقشههای ژنتیکی در گیاهان مختلف فراهم شده است. در این تحقیق از نشانگرهای رتروترنسپوزونی IRAP و REMAP و نشانگرهای ISSR جهت اشباع نقشه ژنتیکی جو در 149 فرد هاپلوئید مضاعف حاصل از تلاقی دو والد Clipper و Sahara استفاده شد. از چهارچوب نقشه ژنتیکی این جمعیت به عنوان نقشه پایه در تجزیه و تحلیلهای بعدی استفاده شد. از 120 آغازگر بهکار رفته، 6 آغازگر IRAP، 7 آغازگر REMAP و 3 آغازگر ISSR بین والدین چندشکلی نشان دادند که از این میان 11 باند چندشکل برای نشانگر IRAP، 8 باند چندشکل برای نشانگر REMAP و 4 باند چندشکل برای نشانگر ISSR بدست آمد. درکل 18 نشانگر چندشکل در جمعیت تفرق نشان دادند که از این تعداد 12 نشانگر به هفت گروه لینکاژی جو منتسب شدند. دو نشانگر از نسبت مندلی 1:1 انحراف نشان دادند. بیشترین تعداد نشانگرها به گروه لینکاژی دوم منتسب شدند. نشانگرهای رتروترنسپوزونی در این مطالعه به خوبی توانستند بخشی از نواحی خالی گروههای لینکاژی 1، 3، 5 و 6 را در نقشه ژنتیکی جو پر کنند. نتایج تحقیق نشان داد که نشانگرهای رتروترنسپوزونی میتواند بطور مؤثری جهت اشباع نقشه ژنتیکی جو مورد استفاده قرارگیرند.
کلمات کلیدی: جو، نشانگرهای IRAP، نقشه ژنتیکی، جمعیت دابلهاپلوئید.
مقدمه
جو با نام علمی Hordeum vulgare L. یکی از سازگارترین و سادهترین زراعتها در جهان، ازجمله ایران است. این گیاه منبع غذایی بسیار مهمی در برخی از کشورها از جمله خاورمیانه و شمال آفریقا بهشمار میرود. جو بیشتر برای خوراک دام و تهیه فرآوردههای تخمیری از جمله ماءالشعیر مورد استفاده قرار میگیرد. در ایران زراعت این گیاه مقام دوم را بعد از گندم داراست (Banisadr, 1995). افزایش عملکرد و کیفیت محصول از اهداف اصلی برنامههای به نژادی جو میباشد که نیل به این اهداف نیازمند وجود تنوع کافی و داشتن اطلاعات از نحوه کنترل ژنتیکی صفات و شناسایی نواحی ژنومی مرتبط با تغییرات آنها میباشد. تعیین نحوه توارث و محل ژنهای کنترل کننده این صفات از چالشهای اصلی برنامههای اصلاح جو میباشد (Li et al., 2005; Hassan et al., 2010). امروزه نقشههای ژنتیکی با پوشش بالای ژنومی نقش بسزایی در تحقیقات پایه و کاربردی ژنتیک ایفا میکنند. در جو نشانگرهای مولکولی بهطور گستردهای برای تهیه نقشههای پیوستگی با پوشش ژنومی بالا، مکان یابی ژنهای کنترل کننده صفات کمّی، گزینش به کمک نشانگر (Marker assisted selection) و همسانهسازی ژنها براساس نقشه استفاده میشوند (Marquez-Cedillo et al., 2000; Hearnden et al., 2007; Sadeghzadeh et al., 2010; Heydari et al., 2014). پس از تهیه چهارچوب نقشه، لازم است که با استفاده از نشانگرهای چندشکل نقشه ژنتیکی اشباع شود. نشانگرهای ISSR (Inter-simple sequence repeat) و نشانگرهای مبتنی بر رتروترنسپوزونها از جمله REMAP (Retrotransposon-microsatellite amplification polymorphism) و IRAP (Inter-retrotransposon amplification polymorphism) به دلیل پوشش ژنومی بالا، تکرار پذیری زیاد و چندشکلی بالا، نشانگرهای ایدهآلی برای تهیه نقشههای ژنتیکی و اشباع آنها، گزینش به کمک نشانگر، انگشت نگاری ژنتیکی، تجزیه و تحلیل شجرهها و تعیین میزان تنوع ژنتیکی در ژرم پلاسمهای گیاهی هستند (Collard et al., 2005; Basirnia et al., 2014). در پژوهشی Waugh et al. (1997) اولین نشانگرهای رتروترنسپوزونی را معرفی کردند و نشان دادند که این نشانگرها برای تهیه نقشههای ژنتیکی و درک بهتری از عملکرد ژن و تنظیم آن در گیاهان بسیار مفید هستند. رتروترنسپوزونها نواحی متحرک تکراری در ژنوم هستند که بر خلاف ترنسپوزونها کپیهای خود را از طریق ساختن cDNA در ژنوم درج میکنند و خودشان از محل اولیهشان در ژنوم بریده نمیشوند. این نشانگرها تکرارپذیر و ساده بوده و چندشکلی زیادی نشان میدهند. در برخی مطالعات نشانگرهای مبتنی بر رتروترنسپوزونها، 25 درصد چندشکلی بیشتری در مقایسه با AFLP نشان دادهاند (Yu & Wise, 2000). توزیع تصادفی و تعداد متغیر کپی رتروترنسپوزونها در ژنوم، استفاده از آنها را به عنوان نشانگرهای مولکولی کارا میسّر میسازد. همچنین بسیاری از مطالعات توالییابی ژنومی حاکی از توزیع و حضور وسیع رتروترنسپوزونها در نواحی یوکروماتینی و اطراف ژنها است، بنابراین شناسایی نشانگرهای بسیار نزدیک با ژنهای مهم زراعی با استفاده از این نشانگرها امکانپذیر است (Kumar & Bennetzen, 1999). با استفاده از نشانگرهای رتروترنسپوزونی IRAP و REMAP، نقشه ژنتیکی اطراف ژن Yr15 (دخیل در مقاومت به زنگ زرد) در گندم دوروم اشباع و نشانگرهایی با فاصله کمتر از 2 سانتی مورگان با این ژن شناسایی شد (Abdollahi Mandoulakani et al., 2008). در جو بیشتر مطالعات در مورد خانوادهی رتروترنسپوزونی Bare-1 انجام گرفته است (Suoniemi et al., 1997). نشانگرهای رتروترنسپوزونی IRAP و RAMAP مبتنی بر خانوادههای Bare1 و Sukkula (از جو) همراه با نشانگرهای ISSR و SSR برای تهیه نقشه ژنتیکی ژنوم گندم در Aegilops tauschii استفاده شد. با استفاده از 13 ترکیب آغازگری، 80 نشانگر رتروترنسپوزونی به این نقشه افزوده شد. در این مطالعه مشخص شد که Bare1 به وفور در نزدیکی SSRها دیده میشود (Boyko et al., 2001). در مکانیابی ژن DW6 در یولاف با استفاده از نشانگرهای IRAP، REMAP و RAPD، دو نشانگر REMAP و IRAP در فاصله 2/5 و 6/12 سانتی مورگان این ژن شناسایی و به نشانگرهای همبارز SNP تبدیل شدند Tanhuanpaa et al., 2006)). با توجه به شناسایی رتروترنسپوزونها در ژنوم جو و گیاهان نزدیک به آن و کارایی بالای نشانگرهای مبتنی بر این عناصر، تحقیقی با اهداف ذیل پایه گذاری و اجرا گردید: 1) بررسی الگوی توزیع رتروترنسپوزونهای LTR دار در ژنوم جو و 2) اشباع نقشه ژنتیکی جو با نشانگرهای IRAP و REMAP مبتنی بر این خانوادههای رتروترنسپوزونی.
مواد و روشها
مواد گیاهی شامل 149 لاین هاپلوئید مضاعف جو، حاصل از تلاقی ارقام Clipper (والد مادری) و Sahara3771 (والد پدری) میباشد. رقم Clipper دارای تیپ رشدی بهاری و ناکارآمد در جذب Zn و دو ردیفه میباشد که به عنوان یک رقم زراعی در استرالیا کشت میشود. Sahara3771 رقم بومی الجزایر دارای تیپ رشدی زمستانی، کارآمد در جذب Zn و شش ردیفه میباشد. این جمعیت به روش H. bolbosum (Islam & Shepherd, 1981) در دانشگاه ادلاید استرالیا تهیه شده و توسط دکتر صادقزاده از مؤسسه تحقیقات دیم کشور فراهم شد (Sadeghzadeh, 2008). بذور ارقام والدینی و افراد جمعیت به تعداد 4 بذر در گلدانهای پلاستیکی کشت شدند و در مرحله دو برگی از هرگلدان به میزان 2/0 گرم برگ جوان جدا و استخراج DNA به روش CTAB انجام شد (Ausubel et al., 1995). کمیت و کیفیت DNA ژنومی با روش اسپکتروفتومتری و الکتروفورز ژل 8/0 درصد آگارز تعیین شد و نمونهها به غلظت 20 نانوگرم در میکرولیتر رقیق و در واکنشهای زنجیرهای پلیمراز استفاده شدند.
واکنشهای PCR و چرخه دمایی آن، الکتروفورز و رنگآمیزی محصولات PCR مربوط به هر سه نشانگر طبق روش Abdollahi Mandoulakani et al., (2012) انجام گرفت. در این مطالعه در کل 120 آغازگر شامل 21 آغازگر ISSR، 65 آغازگر REMAP و 34 آغازگر IRAP استفاده شد. واکنش زنجیرهای پلیمراز در حجم 20 میکرولیتر در دستگاه ترموسایکلر Bio-RAD (شرکت BioRAD، آمریکا) انجامشد.
الگوی نواری نشانگرهای چند شکل در جمعیت به صورت A برای افراد مشابه والد Clipper و B برای افراد مشابه والد Sahara3771 امتیازدهی شدند. دادههای گمشده با علامت - مشخص گردید. بهمنظور بررسی تبعیت نشانگرها از نسبت 1:1 مندلی، آزمون 2χ با نرمافزار SPSS نسخه 20 انجام شد. نشانگرهایی که از نسبت 1:1 انحراف نشان دادند (2 نشانگر) در مرحله تهیه نقشه استفاده نشدند. تعیین گروههای لینکاژی با در نظر گفتن میزان LOD برابر 3 و لحاظ کردن حداکثر فاصله بین دو نشانگر مجاور برابر 50 سانتیمورگان، توسط نرمافزار JoinMapنسخه 3 انجام گرفت و با استفاده از نرم افزار MapChart نسخه 1/2 گروههای لینکاژی رسم شد.
نتایج و بحث
در این بررسی 34 آغازگر IRAP مورد استفاده قرار گرفت. از بین آغازگرهای IRAP، سه آغازگر ترکیبی و سه آغازگر منفرد باندهای چندشکل بین والدین نشان دادند. دامنه باندهای تولید شده از 200 تا 2000 جفت باز متغیر بود (شکل 1). آغازگر منفرد مبتنی بر رتروترنسپوزون Sukkula دو باند چند شکل نشان داد که نشانگر فعالیت ادغامی قابل توجه این خانواده رتروترنسپوزونی در ژنوم جو میباشد. تعداد زیاد کپی و فعالیت بالای این خانواده رتروترنسپوزونی در گندم و سایر غلات نیز گزارش شده است (Nasri et al., 2013).
در این مطالعه سه آغازگر ترکیبی 5LTR-Bare1، LTR725-LTR455 و 5LTR- LTR2106، هرکدام به ترتیب 4، 2 و 1 باند چندشکل تولید نمودند. تعداد زیاد باندهای چند شکل تولید شده توسط خانواده رتروترنسپوزونی Bare1 و خانوادهای LTR دار، بیانگر تعداد زیاد و فعالیت ادغامی قابل توجه این رتروترنسپوزونها در ژنوم جو میباشد. در این مطالعه آغازگرهای مبتنی بر رتروترنسپوزونهای LTR دار هم به صورت تکی و هم به صورت ترکیبی باند چند شکل تولید نمودند بنابراین میتوان بیان نمود که این عناصر رتروترنسپوزونی در ژنوم جو در نزدیکی هم و یا در داخل یکدیگر به صورت آشیانهای ادغام شدهاند.
شکل 1- الگوی باندی چندشکل بین والدین Clipper (c) و Sahara (s)، a: 5LTR-440، b: Sukkula-857، c: 825-440.
Figure 1- Polymorphic banding pattern between parents Clipper (c) and Sahara (s), a: 5LTR-440, b: Sukula-857, c: 825-440.
مطالعات قبلی نیز گزارش کردند که رتروترنسپوزونهای LTR دار چندشکلی ادغامی بالایی در گونههای مختلف گیاهی بویژه غلات نشان میدهند و میتوانند به آسانی در گونهها و جنسهای نزدیک و حتی گاهی بین خانوادههای گیاهی نزدیک به عنوان نشانگرهای کارا مورد استفاده قرارگیرند (Lou and Chen 2007; Kalendar et al., 2011; Nasri et al., 2013). همچنین حرکت و ادغام خانوادههای مختلف رتروترنسپوزونی از جمله Bare1 در ژنوم جو نیز گزارش شده است (Shirasu et al., 2000). بطور کلی درصد بالای چندشکلی شناسایی شده توسط آغازگرهای IRAP (75%) و REMAP (٪66/16)، در این مطالعه نشان دهنده فعالیت بالای خانوادههای رتروترنسپوزونی مورد استفاده در ژنوم جو میباشد. در این تحقیق اکثر خانوادههای رتروترنسپوزونی مورد استفاده در واکنشهای REMAP باندهای چندشکل تولید کردند که بیانگر حضور و ادغام خانوادههای رتروترنسپوزونی مورد مطالعه در نزدیکی ریزماهوارهها در ژنوم جو میباشد. درج خانوادههای رتروترنسپوزونی در نزدیکی توالیهای ریزماهوارهای در گیاهان مختلف مانند مرکبات (Biswas et al., 2010) و دیگر غلات مانند گندم گزارش شده است (Boyko et al., 2001). آغازگرهای مبتنی بر خانوادههای رتروترنسپوزونی 5LTR وBare1 هم در واکنشهای IRAP و هم در واکنشهای REMAP (در ترکیب با آغازگرهای ISSR 818، 440 و 808 )، باندهای چندشکل تولید کردند. بنابراین احتمالا این خانوادههای رتروترنسپوزونی و سایر رتروترنسپوزونهای LTR در سازماندهی و تکامل ژنوم جو نقش اساسی دارند (Manninen et al., 2000). بررسیهای سیتولوژی نشان داده که Bare1 به صورت همگن در سراسر بازوهای کروموزومی جو پراکنده است اما در مناطق سانترومرها، تلومرها و ناحیه سازماندهی هستکی وجود ندارد (Manninen et al., 2000). به طور کلی نتایج این تحقیق نشان داد که خانوادههای رتروترنسپوزونی LTR هم به حالت منفرد و هم به حالت آشیانهای در ژنوم جو ادغام شدهاند. همچنین این عناصر دارای فعالیت انتقالی و چندشکلی زیادی در ژنوم جو میباشند و میتوان از نشانگرهای IRAP و REMAP مبتنی بر این عناصر در مطالعات ژنتیکی مانند ارزیابی تنوع ژنتیکی، بررسی روابط تکاملی و تهیه نقشههای ژنتیکی و مکانیابی ژنها استفاده کرد.
کارایی نشانگرهای رتروترنسپوزونی در شناسایی چندشکلی
از بین آغازگرهای IRAP مورد استفاده، 3 آغازگر ترکیبی و 3 آغازگر منفرد به ترتیب 7 و 4 باند چندشکل تولید کردند که برای بررسی چندشکلی 149 فرد از جمعیت دابلهاپلوئیدی حاصل از تلاقی دو والد Clipper×Sahara مورد استفاده قرار گرفتند. در کل 75 درصد پوششدهی گروههای لینکاژی به آغازگرهای IRAP اختصاص یافت. بعد از گروه بندی دادهها از بین 11 نشانگرIRAP، 9 نشانگر به گروههای لینکاژی در جمعیت مورد بررسی منتسب شدند (جدول 1). از بین آغازگرهای منفرد IRAP، تنها آغازگر Sukkula دو باند چند شکل تولید کرد که بعد از امتیازدهی باندها و رسم گروههای لینکاژی فقط یک باند چند شکل حاصل روی گروه لینکاژی 3 جو قرار گرفت. در بین آغازگرهای ترکیبی IRAP، آغازگر Bare1-5LTR با تکثیر 4 باند چندشکل بیشترین میزان چندشکلی را ایجاد نمود (شکل 2). 69 ترکیب آغازگری REMAP روی دو والد مورد آزمون قرار گرفت که از این تعداد 60 آغازگر باند واضح ولی مونومورف و تنها 3 ترکیب آغازگری REMAP باند چندشکل در جمعیت ایجاد نمود (80/5 درصد)، (جدول 1، شکل 3). بعد از انجام آنالیزهای آماری 2 نشانگر REMAP روی گروههای لینکاژی قرار گرفتند و دو نشانگر دیگر به هیچ گروه لینکاژی منتسب نشدند. نشانگرهای REMAP، 66/16 درصد از فضای خالی نقشه RFLP را پوشش دادند (جدول 1)، از بین این نشانگرها یک نشانگر از نسبت مندلی 1:1 انحراف نشان داد که به سمت والد Sahara اریب بود. این تحقیق اولین گزارش در مورد اشباع نقشه ژنتیکی جو با نشانگرهای IRAP و REMAP میباشد. در این تحقیق خانوادههای مختلف رتروترنسپوزونی به عنوان نشانگر مولکولی کارایی بالایی نشان دادند. بر اساس گزارشات موجود میزان چندشکلی در غلات متفاوت است. این میزان در برنج 6/26، ذرت 48، گندم ماکارونی 8/23، گندم نان 8/12 و در جو 3/11 درصد گزارش شده است (Langridge et al., 2001).
شکل 2- الگوی باندی آغازگر SukulaL روی والدها و برخی افراد جمعیت هاپلوئید مضاعف حاصل از تلاقی Clipper×Sahara.
Figure 2- Banding pattern amplified by Sukkula primer on parents and some individuals from doubled haploid population derived from a cross of Clipper×Sahara.
شکل 3- الگوی باندی آغازگر 5LTR-440 روی والدها و برخی افراد جمعیت هاپلوئید مضاعف حاصل از تلاقی Clipper×Sahara.
Figure 3- Banding pattern amplified by 5LTR-440 primer on parents and some individual of doubled haploid population derived from a cross Clipper×Sahara.
این نتایج نشان میدهد که درصد چندشکلی در جو پایین است. میزان چندشکلی حاصل از این مطالعه (15%) کمی بالاتر از سایر گزارشات مربوط به بررسی چندشکلی جو میباشد که احتمالا دلیلی بر کارایی بالای نشانگرهای رتروترنسپوزونی برای شناسایی چندشکلی در این گیاه میباشد. در مطالعات قبلی نیز گزارش شده که استفاده از نشانگرهای رتروترنسپوزونی در اصلاح جو همانند برنج مفید بوده است (Castelo et al., 2007). در پژوهشی Kalendar et al. (2010) نشانگرهای IRAP مبتنی بر Bare1 را در گونههای مختلف جو، تریتیکوم و آژیلوپس استفاده نمودند و نشان دادند که این خانواده رتروترنسپوزونی در این گونهها چندشکل و فعال میباشند. همچنین Carvalho et al. (2010) با استفاده از نشانگرهای رتروترنسپوزونی مبتنی برBare1 ، چندشکلی بالایی را در گندم شناسایی نمودند. در آژیلوپس نیز با استفاده از نشانگرهای مبتنی بر همین رتروترنسپوزون نتیجه مشابهی بدست آمد (Saeidi et al., 2008). از کل آغازگرهای ISSR به کار رفته در این تحقیق، 2 آغازگر یعنی 76/11 درصد آغازگرها باند چندشکل در جمعیت تولید کردند. بقیه آغازگرها الگوی باندی مونومورف بین والدین تولید کردند. با ایجاد گروههای لینکاژی، از بین سه نشانگر ISSR یک نشانگر روی گروه لینکاژی 6 جو قرار گرفت. در نهایت در نقشه اشباع شده جمعیت مورد بررسی، 33/8 درصد فضای خالی پرشده نقشه به نشانگرهای ISSR اختصاص داشت. از بین نشانگرهای ISSR هم یک نشانگر از نسبت 1:1 مندلی انحراف نشان داد. در مجموع دو نشانگر از نسبت 1:1 مندلی تبعیت نکردند که یکی ازنشانگرها به سمت والد Clipper اریب بود (جدول 1). تجزیه و تحلیل دادهها نشان داد که از بین نشانگرهای مورد استفاده، یک نشانگر از هر کدام از نشانگرهای REMAP و ISSR، در مجموع دو نشانگر یعنی 11/11 درصد از نشانگرها از نسبت 1:1 مندلی انحراف معنی داری نشان دادند (P≤0.05). میزان انحراف بدست آمده در مقایسه با میزان انحراف از نسبت مندلی توسط نشانگرهای AFLP در جو (6% توسط Becker et al., 1995) و RFLP در جو (10% توسطHeun et al., 1991 ) بیشتر است اما در مقایسه با میزان انحراف بدست آمده از نشانگرهای RFLP در تحقیق Kleinhofs et al. (1993) در جمعیت مشابه این جمعیت دابل هاپلوئیدی (3% با P≤0.01 و 14% با P≤0.05) کمتر است. میزان انحراف از نسبت مندلی بدست آمده در این تحقیق با نتایج گزارش شده از غلات دیگر مانند برنج (22% و 33% توسطXu et al., 1997 ) و گندم نان (2/18% توسطRahimmalek et al., 2007 ) نیز نزدیک است.
در این مطالعه نشانگرهای IRAP در مقایسه با نشانگرهای REMAP و ISSR میزان چندشکلی بیشتری نشان دادند. در مقایسه میزان چندشکلی و توانایی تمایز نشانگرهای RAPD، ISSR، IRAP و REMAP در مرکبات، سطوح بالایی از چندشکلی برای هر چهار سیستم نشانگری گزارش شد. همچنین در تجزیه و تحلیل گروههای لینکاژی طبق نتایج، نشانگرهای IRAP و REMAP به عنوان نشانگرهای قابل اعتمادی برای شناسایی ژرمپلاسم مرکبات و صدور گواهینامههای گیاهی و تهیه نقشههای ژنتیکی معرفی شدند. در مقایسه میانگین ارزش چندشکلی حاصل از توزیع رتروترنسپوزونها و نشانگرهای ISSR و RAPD در ژنوم مرکبات، بیشترین و کمترین میانگین ارزش چندشکلی، به ترتیب مربوط به نشانگرهای REMAP (94/5) و RAPD (48/4) بود (Biswas et al., 2010). در مطالعهای که به منظور ارزیابی رتروترنسپوزونها به عنوان نشانگرهای ملکولی در گندم انجام شد این نشانگرها کارایی بالایی نشان دادند. بیش از 90 درصد آغازگرهای رتروترنسپوزونی، الگوی واضح و قابل امتیازدهی تولید کردند. اکثر آغازگرهای مورد استفاده در این تحقیق بر اساس نواحی محفوظ LTR طراحی شده بودند (Abdollahi Mandoulakani et al., 2009). در این مطالعه نیز بیشترین میزان چندشکلی به آغازگرهای رتروترنسپوزونی اختصاص داشت، ولی تعداد زیادی از آغازگرهای مورد استفاده باند چندشکل بین والدین نشان ندادند. میانگین چند شکلی بدست آمده در این تحقیق (15%) با 6 آغازگر ترکیبی کمی پایینتر از نتایج گزارش شده توسط Waugh et al. (1997) در جمعیت Blenhim × E224/3 جو (26%) بود. شاید دلیل تفاوت نتایج حاصل از دو مطالعه، سیستمهای نشانگری متفاوتی باشد که در دو پژوهش استفاده شده است.
توزیع نشانگرها در گروههای لینکاژی
از بین 120 آغازگر استفاده شده، 5 نشانگر ISSR، 12 نشانگر IRAP و 9 نشانگر REMAP در بین والدین چندشکل بودند که از این بین 18 نشانگر درجمعیت تفرق نشان دادند (شکل 3)، از بین 18 نشانگر چندشکل بدست آمده، 12 نشانگر IRAP، REMAP و ISSR به 393 نشانگر RFLP نقشهی پیوستگی این جمعیت اضافه شدند (جدول2 ).
جدول 1- تعداد و درصد چندشکلی سیستمهای نشانگری مورد استفاده.
Table 1- Number and polymorphism percentage of the used marker systems.
|
سیستم نشانگری Marker system |
تعداد آغازگر Number of primers |
تعداد مکانهای چندشکل بین والدین Polymorphic loci between parents |
تعداد نشانگر چندشکل Number of polymorphic markers |
تعداد آغازگر چندشکل در جمعیت Polymorphic primers in population |
نشانگرهای دارای انحراف از تفرق مندلی Markers showed segregation distortion |
درصدآغازگرهای چند شکل The percentage of polymorphic primers |
|
IRAP |
34 |
15 |
11 |
6 |
1 |
*32.35 (75) |
|
REMAP |
69 |
12 |
4 |
4 |
0 |
5.8 (16.66) |
|
ISSR |
17 |
9 |
3 |
2 |
1 |
17.64 (8.33) |
|
ISSR+IRAP+REMAP |
120 |
36 |
18 |
12 |
2 |
|
*: درصد اول، درصد چند شکلی آغازگرهای هر سیستم نشانگری از مجموع آغازگرهای به کار رفته همان سیستم میباشد. درصد داخل پرانتز، درصد پوشش گروههای لینکاژی توسط آغازگرهای هر سیستم میباشد.
نشانگرها در چهار گروه لینکاژی 1، 3، 5 و 6 توزیع شدند و بیشترین نشانگرهای چندشکل روی گروه لینکاژی 6 قرار گرفتند. در گروههای لینکاژی 2، 4 و 7 هیچ نشانگری قرار نگرفت. نشانگرهای IR-1B، IR-1C و IR-1D با اختلاف 1/0 سانتی مورگان در مجاورت یکدیگر روی گروه لینکاژی 6 قرار گرفتند ولی بقیه نشانگرها با فاصلههای بیشتری از هم در گروههای لینکاژی توزیع شدند. براساس نتایج، نشانگرهای حاصل از این مطالعه با قرار گرفتن در میان نشانگرهای نقشه پایه، فضاهای خالی روی گروههای لینکاژی را به خوبی پوشش دادند. در نقشه لینکاژی پایه حاصل از این جمعیت، در گروه لینکاژی 6 نشانگرهای IR-1B، IR-1C و IR-1D بین نشانگرهای Bmag0807 و Bmac0144، نشانگر IR-3 بین نشانگرهای psr627 و ksuA3b و نشانگرهایISSR-8 و RE-4 در ابتدای گروه لینکاژی 6 قرار گرفتند.
جدول 2- نام، کد و موقعیت آغازگرهای چندشکل مورد استفاده در جمعیت هاپلوئید مضاعف حاصل از تلاقی دو والد Clipper×Sahara.
Table 2- Name, code and position of the polymorphic markers used in doubled haploid population derived from a cross of Clipper×Sahara.
|
موقعیت نشانگر در گروه لینکاژی (cM) Marker position on linkage group |
گروه لینکاژی Linkage group |
کد آغازگر Primer code |
نام آغازگر Primer name |
ردیف Row |
|
- |
- |
IR-1A |
5LTR-Bare1a |
1 |
|
53.9 |
6 |
IR-1B |
5LTR-Bare1b |
2 |
|
53.8 |
6 |
IR-1C |
5LTR-Bare1c |
3 |
|
53.8 |
6 |
IR-1D |
5LTR-Bare1d |
4 |
|
73.7 |
6 |
IR-3 |
5LTR-LTR2106 |
5 |
|
17.2 |
5 |
IR-7A |
LTR725-LTR455a |
6 |
|
0 |
5 |
IR-7B |
LTR725-LTR455b |
7 |
|
- |
- |
IR-9A |
Sukula a |
8 |
|
49.6 |
3 |
IR-9B |
Sukula b |
9 |
|
31.9 |
3 |
IR-10 |
LTR725 |
10 |
|
65.4 |
3 |
IR-11 |
LTR2108 |
11 |
|
- |
- |
RE-2A |
5LTR-818a |
12 |
|
123.7 |
1 |
RE-2B |
5LTR-818b |
13 |
|
0 |
6 |
RE-4 |
5LTR-440 |
14 |
|
- |
- |
RE-5 |
Bare1-808 |
15 |
|
- |
- |
ISSR-6A |
857-425a |
16 |
|
- |
- |
ISSR-6B |
857-425b |
17 |
|
0 |
6 |
ISSR-8 |
825-440 |
18 |
در گروه لینکاژی 5 نشانگر IR-7A با قرارگیری بین نشانگرهای EBmac0854 و GBM1399 فاصله زیاد این دو نشانگر را پوشش داد. در گروه لینکاژی 3 نشانگر IR-10بین نشانگرهای Bmag0877 و wg110، نشانگر IR-9B بین Bmag0606و Bmag0363 و نشانگر IR-11 فضای خالی بین دو نشانگر GBM5047 و GV1 را پر کرد و در گروه لینکاژی یک نشانگر RE-2B فضای خالی بین نشانگرهای bcd402 و ksuD14 را پوشش داد (شکل 5).
یکی از مواردی که از اشباع نقشه ژنتیکی گندم با استفاده از نشاگرهای AFLP بدست آمد عدم توزیع یکنواخت نشانگرها در طول ژنوم بود که دلیل توزیع غیر یکنواخت این نشانگر به مکانیسمهای ایجاد چندشکلی در این نشانگر، نسبت داده میشود. تجمع نشانگرهای AFLP و RFLP در نواحی سانترومری شاید به دلیل کاهش یا ممانعت از نوترکیبی در این مناطق باشد (Rahimmalek et al., 2007) باتوجه به توزیع رتروترنسپوزنها در سرتاسر کروموزوم، قابلیت انتقال آنها در طول ژنوم و قرارگیری آنها در نواحی هتروکروماتین کروموزوم (Manninen et al., 2000) میتوان از این نشانگرها به طور جداگانه یا ترکیبی جهت نقشهیابی کامل ژنوم استفاده کرد (Castelo et al., 2007).
نشانگرهای نزدیک به QTLهای کنترل کننده صفات روی یک نقشه با تراکم نشانگری بالا، میتواند وسیله قدرتمندی برای گزینش به وسیله نشانگر مولکولی باشد. تهیه نقشههای ژنتیکی با تراکم بالای نشانگر و توزیع مناسب در مناطق با سطح نوترکیبی بالا به راحتی امکانپذیر است ولی در مناطقی که نوترکیبی کاهش مییابد، استفاده از جمعیت بزرگتر برای افزایش دقت نقشه ژنتیکی ضروری میباشد (Tanksley et al., 1989). بنابراین ضروری بهنظر میرسد که نواحی با تراکم کم نشانگر توسط نشانگرهای چندشکل تا حد امکان پوشش داده شود تا مکانیابی ژنها با سهولت و دقت بیشتری صورت پذیرد. با توجه به اینکه جو گیاهی خودگشن است و میزان دگرگشنی کمی دارد و نظر به اینکه جمعیت مورد استفاده در این تحقیق جمعیت هاپلوئید مضاعف با هموزیگوسیتی بالا میباشد، از اینرو امکان مطالعات تکراردار و بررسی اثر متقابل محیط و مکانهای کنترل کننده صفات کمی با این جمعیت امکانپذیر میباشد پس به منظور تعیین موقعیت ژنهای صفات کمی و سایر ژنهای مفید، اشباع هرچه بیشتر این نقشه لازم بهنظر میرسد.
شکل 5- تعیین گروههای لینکاژی جو در جمعیت دابل هاپلوئیدی حاصل از تلاقی Clipper×Sahara، نشانگرهایی که به نقشه اضافه شدند با خطوط قرمز در شکل مشخص شدند و گروههای لینکاژی 2، 3، 5 و 7 که نشانگرهای شناسایی شده در این تحقیق به آنها منتسب شدند در شکل نشان شده است.
Figure 5- Determination of barley linkage groups in doubled haploid population derived from a cross of Clipper×Sahara. New markers, highlighted with red color, assigned to the linkage groups 2, 3, 5 and 7.
منابع
Abdollahi Mandoulakani B, Bihamta MR, Zali AA, Yazdi Samadi B, Naghavi MR, Schulman A (2008). Fine mapping of stripe rust resistance gene Yr15 in durum wheat. Seed and Plant Improvement Journal 3: 371-387 (In Farsi).
Abdollahi Mandoulakani B, Bihamta MR, Schulman A, Zali AA, Naghavi MR (2009). Retrotransposons assessment as molecular markers in wheat. Modern Genetics Journal 1: 17- 25 (In Farsi).
Abdollahi Mandoulakani B, Piri Y, Darvishzadeh R, Bernoosi I, Jafari M (2012). Retroelement insertional polymorphism and genetic diversity in Medicago sativa populations revealed by IRAP and REMAP markers. Plant Molecular Biology Reporter 30: 286-296.
Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K, Albright LM, Coen DM, Varki A (1995). Current protocols in molecular biology. John Wiley and Sons, New York.
Banisadr N (1995). Study of heat and cold tolerance in some barley cultivar. Seed and Plant Improvement Journal 99: 43-46 (In Farsi).
Basirnia A, Darvishzadeh R, Abdollahi Mandoulakani B, Nabipur A (2014). Assessment of genetic diversity in Iranian confectionary sunflower (Helianthus annuus L.) populations using retrotransposon based IRAP markers. Journal of Agricultural Biotechnology 1: 19-35 (In Farsi).
Becker J, Vos P, Kuiper M, Salamini F, Heun M (1995). Combined mapping of AFLP and RFLP markers in barley. Molecular and General Genetics. 249: 65-73.
Biswas MK, Xu Q, Deng X (2010). Utility of RAPD, ISSR, IRAP and REMAP markers for the genetic analysis of Citrus spp. Scientia Horticulturae 124: 254-261.
Boyko E, Kalendar R, Korzun V, Gill B, Schulman AH (2002). Combined mapping of Aegilops tauschii by retrotransposon, microsatellite, and gene markers. Plant Molecular Biology 48: 767-790.
Carvalho A, Guedes-Pinto H, Martins-Lopes P, Lima-Brito J (2010). Genetic variability of old Portuguese bread wheat cultivars assayed by IRAP and REMAP markers. Annals of Applied Biology 156:337-345.
Castelo JSB, Eduardo AV, Malon G, Mauricio MK, Malone E, Bernarde A, Mistur CC, Carvalho FIF, Oliveira CA (2007). IRAP and REMAP assessments of genetic similarity in rice. Journal of Applied Genetics 48: 107-113.
Collard BCY, Jahufer MZZ, Brouwer JB, Pang ECK (2005). An introduction to markers, quantitative trait loci (QTL) mapping and marker-assisted selection for crop improvement: the basic concepts. Euphytica 142: 169-196.
Harushima Y, Yano M, Shomura A, Sato M, Shimano T, Kuboki Y, et al (1998). A high-density rice genetic linkage map with 2275 markers using a single F2 population. Genetics 148: 479-494.
Hassan M, Oldach K, Baumann U, Langridge P, Sutton T (2010). Genes mapping to boron tolerance QTL in barley identified by suppression subtractive hybridization. Plant Cell Physiology 33: 118-198.
Hearnden PR, Eckermann PJ, McMichael GL, Hayden MJ, Eglinton JK, Chalmer KJ (2007). A genetic map of 1000 SSR and DArT markers in a wide barley cross. Theoretical and Applied Genetics 115: 383-391.
Heun M, Kennedy AE, Anderson JA, Lapitan NLV, Sorrells ME, Tanksley SD (1991). Construction of a restriction fragment length polymorphism map for barley (Hordeum vulgare). Genome 35: 1019-1025.
Heydari R, Sabouri A, Sabouri H, Fallahi HA, Dadras AR (2014). Identification of AFLP markers related to tolerance to flooding stress in barley. Journal of Agricultural Biotechnology 2: 41-60 (In Farsi).
Hirochika H, Sugimoto K, Otsuki Y, Tsugawa H, Kanda M (1996). Retrotransposons of rice involved in mutations induced by tissue culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 93: 7783-7788.
Islam AKMR, Shepherd KW (1981). Wheat-barley addition lines: their use in genetic and evolutionary studies of barley. In: Asher MJC, Ellis RP, Hayter AM, Whitehouse RNH (eds) Barley genetics IV. (Proc 4th Int. Barley Genet Symp). Edinburgh University Press, Edinburgh, pp 729-739.
Kalendar R, Antonius K, Smykal P, Schulman AH (2010). iPBS: A universal method for DNA fingerprinting and retrotransposon isolation. Theoretical and Applied Genetics 121:1419-1430.
Kalendar R, Flavell AJ, Ellis THN, Sjakste T, Moisy C, Schulman AH (2011). Analysis of plant diversity with retrotransposon- based molecular markers. Heredity 106: 520- 530.
Kalendar R, Grob T, Regina M, Suoniemi A, Schulman AH (1999). IRAP and REMAP: two new retrotransposon-based DNA fingerprinting techniques. Theoretical and Applied Genetics 98: 704-711.
Kleinhofs A, Kilian A, Saghai-Maroof MA, Biyashev RM, Hayes P, Chen FQ, Lapitan N, Fenwick A, Blake TK, Kanazin V, Ananiev E, Dahleen L, Kudnra D, Bollinger J, Knapp SJ, Liu B, Sorrells M, Heun M, Franckowiak JD, Hoffman D, Skadsen R, Steffenson BJ (1993). A molecular, isozyme and morphological map of the barley (Hordeum vulgare) genome. Theoretical and Applied Genetics 86: 705-712.
Kumar A, Bennetzen J (1999). Plant retrotransposons. Annual Review Genetics 33:479-532.
Langridge P, Lagudah ES, Holton TA, Sharp PJ, Chalmers K (2001). Ttrends in genetic and genome analysis of wheat: a review. Australian Journal of Agricultural Research 2:1043-1077.
Li JZ, Huang XQ, Heinrichs F, Ganal M, Roder MS (2005). Analysis of QTLs for yield, yield components and malting quality in a BC3-DH population of spring barley. Theoretical and Applied Genetics 110: 356-363.
Lou Q, Chen J (2007). Ty 1-copia retrotransposon- based SSAP marker development and its potential in the genetic study of cucurbits. Genome 50: 802- 810.
Manninen O, Kalendar R, Robinson J, Schulman AH (2000). Application of BARE-1 retrotransposon markers to the mapping of a major resistance gene for net blotch in barley. Molecular and General Genetics 264: 325- 334.
Marquez-Cedillo LA, Hayes PM, Jones BL, Kleinhofs A, Legge G, Rossnagel BG, Sato K, Ullrich SE, Wesenberg DM (2000). QTL analysis of malting quality in barley based on the doubled haploid progeny of two elite North American varieties representing different germplasm groups. Theoretical and Applied Genetics 101: 173-184.
Mather K (1938). Crossing over heterochromatin in X chromosome of Drosphila melanogaster. Genetics 24:413-435.
Nasri S, Abdollahi Mandoulakani B, Darvishzadeh R, Bernousi I (2013). Retrotransposon insertional polymorphism in Iranian bread wheat cultivars and breeding lines revealed by IRAP and REMAP Markers. Biochemical Genetics 51: 927-943.
Rahimmalek M, Seyed Tabatabayi BE, Mohammadi SA (2007). Saturating microsatellite linkage map of wheat in Fukuho-Komugi×Oligo-Culm cross population using AFLP markers. Journal of Science and Technology of Agriculture and Natural Resources 43: 567-575.
Sadeghzadeh B (2008). Mapping of chromosome regions associated with seed Zn accumulation in barley, PhD thesis, The University of Western Australia, Perth.
Sadeghzadeh B, Rengel Z, Li C, Yang H (2010) Molecular marker linked to a chromosome region regulating seed Zn accumulation in barley. Molecular Breeding 25, 167-177.
Saeidi H, Rahiminejad MR, Heslop-Harrison JS (2008). Retroelement insertional polymorphisms, diversity and phylogeography within diploid, D-genome Aegilops tauschii (Triticeae, Poaceae) sub-taxa in Iran. Annals of Botany 101: 855-861.
Shirasu K, Schulman AH, Lahaye T, Schulze- Lefert P (2000). A contiguous 66 kb barley DNA sequence provides evidence for reversible genome expansion. Genome Resources 10: 908-915.
Suoniemi A, Schmidt D, Schulman AH (1997). BARE-1 insertion site preferences and evolutionary conservation of RNA and cDNA processing sites. Genetica 100: 219-230.
Tanhuanpaa P, Kalendar R, Laurila J, Schulman AH, Manninen O, Kiviharju E (2006). Generation of SNP markers for short straw in oat (Avene sativa L.). Genome 49: 282-287.
Tanksley SD, Ganal MW, Prince JP, Vicente MC, Bonierbale MW, Broun P, Fulton TM, Giovannoni J, Grandillo S, Martin GB, Messiguer R, miller JC, Miller L, Paterson AH, Pineda O, Roder MS, Wing RA, Young ND (1992). High density molecular linkage maps of the tomato and potato genomes. Genetics 132: 1141-1160.
Waugh R, McLean K, Flavell A.J, Pearce S, Kumar A, Thomas BBT, Powell W (1997). Genetic distribution of BARE-1-like retrotransposable elements in the barley genome revealed by sequence-specific amplification polymorphisms (S-SAP). Molecular and General Genetics 253:687-694.
Xu Y, Zhu L, Xiao J, Huang N, McCouch SR (1997). Chromosomal regions associated with segregation distortion of molecular markers in F2, backcross, doubled haploid, and recombinant inbred populations in rice (Oryza sativa L.). Molecular and General Genetics 253: 535-545.
Yu G-X, Wise RP (2000). An anchored AFLP- and retrotransposon-based map of diploid Avena. Genome 43: 736-749.
Saturation of barley genetic map using retrotransposon-based markers and doubled haploid population derived from a cross of Clipper×Sahara
Ghaderi F.1, Abdollahi Mandoulakani B.*2, Babaeian Jelodar N.A.1, Sadeghzadeh B.3
1 MSc graduate of plant breeding and professor, Sari Agricultural Sciences and Natural Resources University, Iran.
2Associate professor, Department of Plant Breeding and Biotechnology, Urmia University, Iran.
3Associate professor, Dryland Agricultural Research Institute, Maragheh, Iran.
Abstract
Genetic maps with high density and wide genome coverage play significant role in basic and applied genetic researches. In recent decades, with the advent of DNA markers, the huge development has been created in genetic map preparation and saturation in various plant species. In this study, IRAP, REMAP and ISSR markers were applied to saturate the genetic map of barley in a population with 149 double haploid individuals derived from a cross of Clipper and Sahara. The basic genetic map of this population was used as a frame for further analysis. In general, among the 120 primers used, 6 IRAP, 7 REMAP and 3 ISSR primers showed polymorphism between parents which generated 11 IRAP, 7 REMAP and 4 ISSR markers. Eighteen markers segregated in population, out of which 12 markers assigned to 7 barley linkage groups. Two markers deviated from the ratio of 1:1. The maximum number of markers was assigned to linkage group 2. In the current investigation, retrotransposon-based markers were able to saturate the gaps of barley genetic map on linkage groups 1, 3, 5 and 6. The results showed that retrotransposon markers can be effectively used for saturation of barley genetic maps.
Keywords: barley, IRAP markers, genetic map, doubled haploid population.
)
