Document Type : Research Paper
Authors
1 Ph. D. Candidate in Plant Breeding & Biotechnology Department, Gorgan University of Agricultural Sciences & Natural Resources, Iran,
2 Associate Professor in Plant Breeding & Biotechnology Department, Gorgan University of Agricultural Sciences & Natural Resources, Iran,
3 Assistant Professor in Plant Breeding & Biotechnology Department, Gorgan University of Agricultural Sciences & Natural Resources, Iran,
4 Professor in Medical Biology Research Center, Kermanshah University of Medical Sciences, Iran,
Abstract
Highlights
Keywords
آنالیز مولکولی و فیزیولوژیکی پیری برگ پرچم و انتقال مجدد مواد فتوسنتزی در گندم نان تحت تنش خشکی انتهایی
سعید باقری‌کیا1، محمدهادی پهلوانی*2، احد یامچی3، خلیل زینلی نژاد3، علی مصطفایی4
1دانشجوی دکتری گروه اصلاح نباتات و بیوتکنولوژی دانشکده تولید گیاهی دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان
2دانشیار گروه اصلاح نباتات و بیوتکنولوژی دانشکده تولید گیاهی دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان
3استادیار گروه اصلاح نباتات و بیوتکنولوژی دانشکده تولید گیاهی دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان
4استاد مرکز تحقیقات بیولوژی پزشکی دانشگاه علوم پزشکی کرمانشاه
تاریخ دریافت: 05/07/1395، تاریخ پذیرش: 02/10/1395
چکیده
در مطالعه فیزیولوژیکی انتقال مجدد مواد فتوسنتزی از ساقه به دانه در طی پر شدن دانه‌ها مواد ژنتیکی جهش‌یافته ابزاری ارزشمند به شمار می‌آیند. دو لاین جهش‌یافته پیشرفته گندم نان (T-67-60 و T-65-7-1) به همراه رقم تیپ وحشی آن‌ها (رقم طبسی) در دو شرایط رطوبتی (مطلوب و 40-30 درصـد ظرفیت مزرعه) به صورت یک آزمایش فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی در سه تکرار کشت شدند. اعمال تنش در مرحله ظهور کامل سنبله (زادوکس 60) آغاز شد و نمونه‌برداری‌ها در 5 مرحله (0، 7، 14، 21 و 28 روز پس ازگرده‌افشانی) انجام شد. بر اساس نتایج انتقال مجدد ساقه و کارایی آن تحت تنش خشکی انتهایی در لاین‌های جهش‌یافته به طور معنی‌داری بیشتر از رقم تیپ وحشی بود. علت این امر قدرت مخزن بالاتر و بروز پیری زودرس در لاین‌های جهش‌یافته نسبت به رقم تیپ وحشی بود. با توجه به روند تغییرات محتوای کلروفیل و بیان نسبی ژن‌های کلیدی فتوسنتزی روبیسکو (زیرواحدهای کوچک و بزرگ روبیسکو و روبیسکو اکتیواز) در ژنوتیپ‌ها طی پر شدن دانه‌ها به نظر می‌رسد تجزیه کلروپلاست و سیستم فتوسنتزی در اثر پیری القاء شده توسط تنش خشکی در لاین‌های جهش‌یافته با شدت بیشتری نسبت به رقم تیپ وحشی اتفاق افتاده است. از آنجایی که پدیده پیری تحریک‌کننده انتقال مجدد مواد فتوسنتزی از ساقه به دانه است، انتقال مجدد ساقه و کارایی آن در لاین‌های جهش‌یافته بیشتر از رقم تیپ وحشی بود. رقم تیپ وحشی نیز بیشتر با تداوم فتوسنتز جاری برگ‌ها در جهت پر کردن دانه‌ها عمل کرده است.
واژه‌های کلیدی: بیان ژن، پیری، جهش‌یافته، روبیسکو، کلروفیل.
مقدمه
کاهش منابع آب سبب شده که توسعه ارقام زراعی با سازگاری بالاتر به خشکی هدف مهمی در بسیاری برنامه‌های اصلاحی گیاهان باشد (Sivamani et al., 2000). در مناطقی با شرایط آب و هوایی مدیترانه‌ای (مانند ایران) زراعت گندم نان در دوره پر شدن دانه با تنش خشکی و گرما مواجه است. در شرایط تنش انتهای فصل، انتقال مواد ذخیره‌ای ساقه یکی از مهم‌ترین و فرآیندهای مؤثر در تحمل به خشکی به شمار می‌آید (Blum, 1998). در غلات رشد و نمو دانـه تـا انـدازه‌ای توسـط انتقال مواد ذخیره‌ای گیاه حمایت می‌شود که این مـواد ذخیـره‌ای عمدتاً در سـاقه قبـل از مرحلـه گلدهی ذخیره شده و تحت عنوان انتقال مجدد مواد ذخیره‌ای سـاقه نامیـده می‌شود. تحـت تنش خشکی فتوسنتز جاری کاهش یافته و نقش انتقال مجدد ساقه در پر شدن دانه افزایش می‌یابد (Ehdaie et al., 2008). توانایی ژنوتیپ‌ها از نظر انتقال مجدد مواد فتوسنتزی از ساقه به دانه در طی پر شدن دانه با استفاده از پایش وزن خشک ساقه برآورد می‌شود (Blum et al., 1994; Ehdaie et al., 2006). بر اساس گزارشات متعدد فرآیند پیری ارتباط تنگاتنگی با فرآیند پر شدن دانه دارد (Yang et al., 2000; Mi et al., 2002; Bazargani et al., 2011). تأخیر در پیری امری نامطلوب به حساب می‌آید زیرا گیاه در عین رسیدگی سبز می‌ماند، در نتیجه نرخ پر شدن دانه‌ها کاهش می‌یابد (Yang & Zhang, 2006). تنش خشکی باعث القاء پیری زودرس می‌شود و انتقال مجدد آسیمیلات‌ها را به دانه افزایش می‌دهد (Plaut et al., 2004; Yang & Zhang, 2006). از جمله مهم‌ترین رخدادها در خلال پیری تخریب دستگاه فتوسنتزی، تجزیه کلروپلاست و کاهش چشمگیر کلروفیل است (Hörtensteiner & Feller, 2002). روبیسکو و روبیسکو اکتیواز از آنزیم‌های کلیدی فتوسنتز در کلروپلاست گیاهان C3 می‌باشد همچنین روبیسکو اولین آنزیم تخریب شده در چرخه کالوین طی پیری برگ است به همین علت کاهش میزان روبیسکو یکی از ویژگی‌های فیزیولوژیکی در طی پیری برگ پرچم می‌باشد (Weng et al., 2005). تنش خشکی در گیاهان گوجه فرنگی (Bartholomew et al., 1994) آرابیدوپسیس (Williams et al., 1994) و برنج (vu et al., 1998) باعث کاهش شدید رونوشت‌های زیر واحد روبیسکو شده است.
اصلاح موتاسیونی به القاء آگاهانه و توسعه لاین‌های جهش‌یافته به‌منظور بهبود گیاهان زراعی اشاره دارد. اصلاح موتاسیونی همچنین در مفهوم گسترده‌تری برای بهره‌برداری از جهش‌یافته‌های طبیعی و همچنین خودبخودی و توسعه هر واریته حامل یک جهش شناخته‌شده با هر منبعی، کاربرد دارد (Shu et al., 2012). پرتوتابی هسته‌ای با ایجاد ژرم‌پلاسم غنی از تنوع ژنتیکی می‌تواند نقش مهمی در اصلاح گیاهان ایفا کند زیرا اصلاح گیاهان زمانی می‌تواند صورت گیرد که تنوع کافی برای صفت مورد نظر در دسترس اصلاحگر باشد. صفاتی زراعی مهمی از قبیل کوتاه کردن طول دوره رشدی و افزایش تحمل و مقاومت به تنش‌های زنده و غیر‌زنده در گیاهانی همچون گندم از طریق اصلاح موتاسیونی بهبود یافته‌اند (Singh & Balyan, 2009). مطالعات فیزیولوژیکی گیاهی در واکنش به خشکی پیچیده است. یکی از مشکلات در معرفی رقم متحمل به تنش این است که این ارقام با ژنوتیپ های آستانه که فاصله ژنتیکی زیادی از هم دارند، مقایسه می شوند. استفاده از جهش‌یافته‌ها یا لاین‌های ایزوژنیک نزدیک ابزار بسیار مناسبی برای مطالعه ژنتیک گیاهی هستند و مطالعه آن‌ها می‌تواند جهت توسعه گیاهان متحمل به کم‌آبی امیدبخش باشد (Tuberosa & Salvi, 2006; Xu et al; 2010). هدف از این تحقیق ارزیابی روند بیان برخی ژن‌های فتوسنتزی وابسته به پیری و همچنین تغییرات محتوای کلروفیل در برگ پرچم و ارتباط آن با انتقال مجدد مواد فتوسنتزی در گندم نان طی پر شدن دانه‌ها تحت تنش خشکی انتهایی در لاین‌های جهش‌یافته و رقم تیپ وحشی گندم طبسی بود.
مواد و روش‌ها
این آزمایش در گلخانه تحقیقاتی دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان در سال 1393-1392 اجرا گردید. آزمایش با دو لاین جهش‌یافته نسل هفتم به نام‌های T-67-60 و T-65-7-1 حاصل از برنامه اصلاح موتاسیونی سازمان انرژی اتمی ایران با هدف اولیه مقاومت به ورس (با استفاده از پرتوتابی گاما با منشأ کبالت 60) به همراه رقم گندم طبسی به عنوان تیپ وحشی (رقم والدی) لاین‌های مذکور انجام شد. آزمایش به صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی (شرایط رطوبتی در دو سطح و ژنوتیپ در سه سطح) با سه تکرار در گلدان‌هایی حاوی 10 کیلوگرم خاک با ترکیب رس، ماسه بادی و کود حیوانی به نسبت 1: 2: 1 انجام شد. در هر واحد آزمایشی (گلدان) 10 بذر کشت گردید. اعمال تنش و قطع آبیاری در مرحله زادوکس 60 (ظهور کامل سنبله) انجام شد (Zadoks et al., 1974). ساقه اصلی بوته‌های موجود در هر گلدان با در نظر گرفتن نمایان شدن اولین سنبله از میان غلاف برگ پرچم در هر بوته نشان‌دار گردید. رطوبـت گلدان‌ها در شرایط شاهد از طریـق آبیـاری مـنظم در محدوده ظرفیت زراعی نگهداری می‌شـدند، در شرایط تنش خشکی نیز رطوبت گلدان‌ها به‌وسیله تـوزین مـنظم روزانـه در حـدود 40-30 درصـد ظرفیت زراعی نگهداری گردیدند. نمونه‌برداری به‌صورت تصادفی از برگ پرچم و ساقه‌های اصلی نشان‌دار شده با طول تقریباً یکـسان در 5 مرحله (هر واحد آزمایشی شامل 2 بوته)، از شروع گرده‌افشانی (زمان صفر گرده‌افشانی) در فاصله‌های زمانی 7 روزه (در زمان‌های 0، 7، 14، 21 و 28 روز پس از گرده‌افشانی) صورت گرفت. نمونه‌های مربوط به ساقه در آون 80 درجه سانتی‌گراد به مدت 48 ساعت خشک گردیدند و سپس توزین شدند. برگ‌های پرچم نیز پس از فریز شدن در ازت مایع در فریزر 80 – درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند.
اندازه‌گیری انتقال مجدد و کارایی انتقال مجدد
انتقال مجدد از تفاضل بین حداکثر و حداقل چگالی وزنی ساقه پس از گرده‌افشانی محاسبه شد. چگالی وزنی از تقسیم وزن ساقه به طول آن محاسبه شد. کارایی انتقال مجدد از نسبت انتقال مجدد به حداکثر چگالی وزنی به دست آمد (Ehdaie et al., 2006).
اندازه گیری محتوای کلروفیل
ابتدا مقدار 50 میلی‌گرم بافت برگ پرچم در 5 میلی‌لیتر استون خالص به‌خوبی سائیده شده و سپس مخلوط به دست آمده به مدت 15 دقیقه در g 13000 سانتریفیوژ گردید و در نهایت فاز فوقانی به لوله آزمایش جدید منتقل گردید و برای سنجش کلروفیل از آن استفاده شد. جذب عصاره‌ها با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر در دو طول موج 8/644، 6/661 قرائت گرید. مقدار کلروفیل‌های a، b و کل برحسب میکروگرم بر میلی‌لیتر از فرمول‌های زیر استفاده شد (Lichtenthaler, 1987).
Ca (µg/ml) =11.24 A661.6 - 2.04 A644.8
Cb (µg/ml) =20.13 A644.8 - 4.19 A661.6
Ca+b (µg/ml) = 7.05 A661.6 – 18.09 A644.8
بررسی الگوی بیان ژن‌ها
برای ارزیابی بیان ژن‌ها، استخراج RNA کل از g 1/0 نمونه‌های تهیه‌شده با استفاده از کیت P-Biozol (Bio Flux) انجام شد. پس از تیمار DNaseI کمیت و کیفیت RNA استخراج‌شده با اسپکتروفتومتری و الکتروفورز ژل آگارز تعیین گردید. به منظور ساخت cDNA، میزان 1 میکروگرم از هر نمونه RNA در واکنش RT-PCR به همراه آغازگر Oligo (dT)18، آب DEPC، بافر ساخت cDNA، مخلوط dNTP، آنزیم بازدارنده ریبونوکلئازو آنزیم رونوشت‌بردار معکوسبه روش پیشنهادی شرکت Fermentas استفاده شد. واکنش‌های زنجیره‌ای پلی‌مراز کمّی در زمان واقعی (q-RT-PCR) در حجم 20 میکرولیتر با استفاده از فناوری رنگ SYBR Green I (کیت سایبر بیوپارس دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان) تهیه شدند و در دستگاه iQ5 شرکت Bio Rad در شرایط بهینه اجرا گردیدند. آغازگرهای مورد نیاز به منظور ارزیابی الگوی بیان ژن‌های فتوسنتزی مرتبط با پدیده پیری شامل زیر واحدهای کوچک و بزرک روبیسکو و روبیسکو اکتیواز بر اساس اطلاعات موجود در پایگاه اطلاعاتی NCBI گردید. این طراحی با استفاده از نرمافزار AllelID7.0 و با در نظر گرفتن ویژگی‌های مطلوب برای استفاده در روش واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز کمّی در زمان واقعی (q-RT-PCR) انجام شد. از ژن خانه‌دار GAPDH که دارای بیان یکسانی در تمام مراحل نمونه‌برداری است استفاده شد (Goncalves et al., 2005). توالی و مشخصات آغازگرهای اختصاصی مورد استفاده و ژن خانه‌دار در جدول 1 ارائه شده است. ارزیابی میزان بیان نسبی ژن‌ها بر اساس روش ΔΔCT-2 نسبت به گیاهان کنترل در همان مرحله انجام شد (Pfaffl, 2001) و نمودارها توسط نرمافزار Excel رسم گردید. تجزیه‌وتحلیل آماری داده‌ها با استفاده از نرم‌افزارهای نرمافزار GenEx 6 و SAS 9.1.3 انجام شد. مقایسه میانگین‌ها نیز با روش LSD در سطح احتمال 5 درصد صورت گرفت.
جدول 1- آغازگرهای مورد استفاده در بررسی بیان ژن‌های مرتبط با پدیده پیری.
Table 1- The primer used in expression analysis of genes involved in senescence.
|
طول محصول |
دمای اتصال |
توالی |
نام آغازگر |
|
Product Length (bp) |
Annealing Temp (◦C) |
Sequence (5' → 3') |
Primer name |
|
187 |
60 |
F:GGTGGAGGAACTTTAGGACAT |
Rubisco Large Subunit |
|
R:TCGCCTTCCATACTTCACAA |
|||
|
84 |
60 |
F:ACTGGACAATGTGGAAGC |
Rubisco Small Subunit |
|
R:ACTCCTTCTTGACCTCCTC |
|||
|
164 |
62 |
F: TACGACATCTCCGATGACCA |
Rubisco Activase |
|
R: CTCGTAGGAGCTCAGGATGG |
|||
|
121 |
60 |
F:TCACCACCGACTACATGACC |
GAPDH |
|
R: ACAGCAACCTCCTTCTCACC |
نتایج و بحث
عملکرد دانه و انتقال مجدد ساقه و کارایی آن
نتایج تجزیه واریانس نشان داد ژنوتیپ‌ها از نظر عملکرد دانه در سنبله اصلی، انتقال مجدد ساقه و کارایی آن دارای اختلاف معنی‌دار آماری بودند، همچنین صفات مذکور در دو شرایط رطوبتی شاهد و تنش اختلاف معنی‌دار آماری داشتند (جدول 2).
جدول 2- تجزیه واریانس صفات در شرایط رطوبتی و ژنوتیپ‌های گندم نان.
Table 2- Analysis of variance for traits in moisture conditions and bread wheat genotypes.
|
مجموع مربعاتSum of Squares |
|
||||||
|
کلروفیل کل |
کلروفیل b |
کلروفیل a |
کارایی انتقال مجدد |
انتقال مجدد |
عملکرد در سنبله |
درجه آزادی |
منبع تغییر |
|
Total chlorophyll |
Chlorophyll b |
Chlorophyll a |
Remobilization efficiency |
Remobilization |
Yield per spike |
df |
SOV |
|
81.37** |
26.02** |
15.48** |
373.04** |
187.79** |
0.942** |
2 |
ژنوتیپ Genotype (G) |
|
104.23** |
13.73** |
42.30** |
82.51** |
17.91** |
0.135** |
1 |
شرایط رطوبتی moisture conditions (M) |
|
9.45 ns |
1.00 ns |
4.92 ns |
9.12 ns |
3.15 ns |
0.002 ns |
2 |
ژنوتیپ×شرایط رطوبتی G× M |
|
20.99 |
47.13 |
8.87 |
34.37 |
13.16 |
0.150 |
12 |
خطا Error |
|
4.70 |
7.54 |
4.46 |
8.07 |
9.28 |
11.64 |
|
ضریب تغییرات (%) CV (%) |
|
**وns به ترتیب معنی‌دار در سطح احتمال 1% و عدم معنی‌داری است. **, ns: Significant at 5% and 1% probability level and no significant respectively. |
|||||||
مقایسه میانگین عملکرد دانه در سنبله اصلی در هر سطح شرایط رطوبتی نشان داد که عملکرد لاین‌های جهش‌یافته بیشتر از رقم تیپ وحشی است به طوری که رقم تیپ وحشی و لاین جهش‌یافته T-65-7-1 به ترتیب دارای کمترین و بیشترین عملکرد دانه در سنبله بودند که از نظر آماری نیز معنی‌دار بود (جدول 3). تنش خشکی باعث کاهش عملکرد در همه ژنوتیپ‌ها شد که البته تنها در رقم تیپ وحشی معنی‌دار بود (جدول 3)
جدول 3- مقایسه میانگین صفات در ژنوتیپ‌های گندم نان در هر سطح شرایط رطوبتی.
Table 3- Mean comparison of traits in bread wheat genotypes at each level of moisture
|
ژنوتیپ Genotype |
عملکرد در سنبله (g) |
انتقال مجدد (mg cm-1) |
کارایی انتقال مجدد (%) |
|||
|
Yield per spike (g) |
Remobilization (mg cm-1) |
Remobilization efficiency (%) |
||||
|
|
شاهد |
تنش |
شاهد |
تنش |
شاهد |
تنش |
|
|
Control |
Stress |
Control |
Stress |
Control |
Stress |
|
تیپ وحشی Wild Type |
0.81b (a) |
0.61c (b) |
7.99b (a) |
8.93b (a) |
16.45b (a) |
18.88b (a) |
|
جهش‌یافته T-67-60 T-67-60 Mutant |
0.97b (a) |
0.82b (a) |
8.56b (b) |
10.62b (a) |
15.51b (b) |
20.05b (a) |
|
جهش‌یافتهT-65-7-1 T-65-7-1 Mutant |
1.35a (a) |
1.18a (a) |
14.31a (b) |
17.30a (a) |
24.44a (b) |
30.32a (a) |
|
ژنوتیپ Genotype |
کلروفیل a (µg ml-1) |
کلروفیل b (µg ml-1) |
کلروفیل کل (µg ml-1) |
|||
|
Chlorophyll a (µg ml-1) |
Chlorophyll b (µg ml-1) |
Total chlorophyll (µg ml-1) |
||||
|
|
شاهد |
تنش |
شاهد |
تنش |
شاهد |
تنش |
|
|
Control |
Stress |
Control |
Stress |
Control |
Stress |
|
تیپ وحشی Wild Type |
20.54a (a) |
18.83a (a) |
12.03a (a) |
10.61a (a) |
32.57a (a) |
29.44a (a) |
|
جهش‌یافته T-67-60 T-67-60 Mutant |
19.06b (a) |
15.84b (b) |
9.21b (a) |
7.80b (a) |
28.28b (a) |
23.65b (b) |
|
جهش‌یافتهT-65-7-1 T-65-7-1 Mutant |
20.32ab (a) |
16.06b (b) |
10.35b (a) |
7.94b (b) |
30.68a (a) |
24.01b (b) |
در هر ستون میانگین‌هایی که حرف (حروف) مشترک دارند با هم تفاوت معنی‌دار ندارند ( 5% LSD).
حرف مشترک داخل پرانتز بیانگر عدم تفاوت معنی‌دار آماری هر ژنوتیپ در شرایط شاهد و تنش در بخش مورد نظر می‌باشد ( 5% LSD).
Means in each column followed by same letter(s) are not significantly different (LSD 5%).
Same letter in parentheses indicates no significant difference between each genotype under control and stress conditions in that part (LSD 5%).
در هر دو شرایط رطوبتی شاهد و تنش، انتقال مجدد ساقه و کارایی آن در لاین جهش‌یافته T-65-7-1 به طور معنی‌داری بیشتر بود. کمترین میزان این صفات مربوط به رقم تیپ وحشی بود (جدول 3). تنش خشکی باعث افزایش انتقال مجدد در رقم تیپ وحشی (73/11 درصد) و لاین‌های جهش‌یافته T-67-60 (11/24 درصد) و T-65-7-1 (84/20 درصد) شد که این افزایش در لاین‌های جهش‌یافته معنی‌دار بود. همچنین افزایش معنی‌داری از نظر کارایی انتقال مجدد در لاین‌های جهش‌یافته تحت تنش خشکی مشاهده شد (جدول 3). تفاوت معنی‌دار ارقام تحت تنش خشکی از نظر میزان انتقال مجدد از اندام‌های ساقه به دانه‌ها گزارش شده است (Plaut et al., 2004; Ehdaie et al., 2006). در مطالعاتی دیگر در مرحله گرده‌افشانی گندم گزارش شده است که انتقال مجدد آسیمیلات‌ها و کارایی آن در شرایط تنش افزایش می‌یابد (Ehdaie et al., 2006; Mojtabaie Zamani et al., 2013; Sharbatkhari et al., 2014). در شرایط تنش خشکی ازآنجایی‌که فتوسنتز جاری برای پر شدن دانه کافی نیست گیاه با القای بیشتر مکانیسم انتقال مجدد درصدد پرکردن دانه برمی‌آید به نظر می‌رسد این مکانسیم در لاین‌های جهش‌یافته بیش از رقم تیپ وحشی تأثیرگذار بوده است. از یک سو تقاضای مخزن بیشتر (عملکرد بالاتر) برای دریافت آسیمیلات‌های ذخیره شده در ساقه و از سوی دیگر فعالیت آنزیم‌های مؤثر در انتقال مجدد و یا پیام‌های القاءکننده انتقال مجدد دلیل برتری لاین‌های جهش‌یافته نسبت به تیپ وحشی است.
محتوای کلروفیل
نظر به اینکه کلروفیل a، b و کل در پنج مرحله پس از گرده‌افشانی و در طی پر شدن دانه‌ها اندازه‌گیری شده بود برای آنالیز آماری از میانگین پنج مرحله استفاده شد. نتایج تجزیه واریانس نشان داد که اختلاف معنی‌داری بین ژنوتیپ‌ها و شرایط رطوبتی از نظر کلروفیل a، کلروفیل b و کلروفیل کل وجود دارد (جدول 2). مقایسه میانگین ژنوتیپ‌ها در شرایط شاهد بیانگر بیشترین مقدار کلروفیل a، کلروفیل b و کلروفیل کل در رقم تیپ وحشی بود اما اختلافی از لحاظ آماری با لاین جهش‌یافته T-65-7-1 نداشت (جدول 3). مقایسه میانگین ژنوتیپ‌ها در شرایط تنش نشان داد که تنش خشکی باعث کاهش کلروفیل a، کلروفیل b و کلروفیل کل می‌شود. این کاهش در لاین‌های جهش‌یافته بیشتر بود و رقم تیپ وحشی کمترین کاهش را نشان داد (جدول 3).
اساساً کاهش کلروفیل در فرآیند پیری یکی از مهم‌ترین شاخص‌های تشخیص پیری در سلول‌های گیاهی است (Hukmani & Tripath, 1994). استفاده آسیمیلات‌های ذخیره شده در بافت‌های رویشی برای پرشدن دانه گیاهان تک‌لپه مانند گندم نیازمند آغاز یا به عبارتی تحریک پدیده پیری در کل گیاه می‌باشد (Yang & Zhang, 2006). تـنش خشکی در مرحله پر شدن دانه منجر به تسریع پدیده پیری، کوتاه شـدن طـول دوره پر شدن دانه و انتقال و بازیافت مواد ذخیره‌ای در جهت پر شدن دانه است (Bazargani et al., 2011)، از نشانه‌های بارز پیری برگ روند تغییرات بسیار منظم و کنترل‌شده فعل‌وانفعالات فیزیولوژیک شامل توقف فتوسنتز، تجزیه کلروپلاست، کاهش چشمگیر کلروفیل و شکستن پروتئین‌ها و سایر مولکول‌های بزرگ است (Hörtensteiner & Feller, 2002). با توجه به روند تغییرات محتوای کلروفیل a، b و کل ژنوتیپ‌ها در طی پر شدن دانه‌ها به نظر می‌رسد تجزیه کلروپلاست و سیستم فتوسنتزی تحت تنش خشکی در لاین‌های جهش‌یافته با شدت بیشتری نسبت به رقم تیپ وحشی اتفاق افتاده است (شکل 1).
شکل 1- روند تغییرات کلروفیلa (الف)،کلروفیلb (ب) و کلروفیل کل (ج) برگ پرچم ژنوتیپ‌های گندم نان.
Figure 1- The changes of chlorophyll a (a), chlorophyll b (b) and total chlorophyll (c) in flag leaf of bread wheat genotypes.
با گذشت زمان تأثیر پیری القایی در اثر خشکی تأثیر خود را بیشتر نشان داده به طوری که مراحل انتهایی اختلاف بین محتوای کلروفیل در حالت شاهد و تنش بیشتر بود البته این اختلاف در لاین‌های جهش‌یافته بیشتر از رقم تیپ وحشی بود (شکل 1). به طور کلی تقاضای مخزن عاملی تعیین‌کننده در انتقال مجدد کربوهیدرات‌های ساقه است (Ehdaie et al., 2006). استفاده آسیمیلات‌های ذخیره شده در بافت‌های رویشی برای پرشدن دانه گیاهان تک لپه مانند گندم نیازمند آغاز یا به عبارتی تحریک پدیده پیری در کل گیاه می‌باشـد (Yang & Zhang, 2006)، بنابراین لاین‌های جهش‌یافته در انتقال مواد ذخیره‌ای ساقه بهتر عمل کردند. رقم تیپ وحشی نیز با تداوم فتوسنتز جاری برگ‌ها در جهت پر شدن دانه‌ها می‌کوشد. به طور کلی گزارش‌های متعددی در خصوص کاهش مقدار کلروفیل برگ در طی پیری وجود دارد (Nie et al., 1995; Weng et al., 2005; Rubia et al., 2014). کلروفیل در مراحل ابتدایی رشد گیاهان کم است و هرچه بذر به رسیدگی فیزیولوژیک نزدیک می‌شود، میزان آن افزایش می‌یابد که احتمالاً به سبب نیازهای شدید گیاه از نظر تأمین ذخایر بذری است، در نهایت با آغاز مرحله پیری میزان کلروفیل به طور قابل توجهی کاهش می‌یابد (Matile et al., 1996). میزان کاهش کلروفیل ناشی از پیری در اثر تنش در مراحل انتهایی به علت کاهش بیوسنتز کلروفیل و افزایش فرآیندهای اکسیداسیونی با شدت بیشتری اتفاق می افتد (Salehi et al., 2003; Navabpour et al., 2015)؛ بنابراین به نظر می‌رسد این رخدادها در لاین‌های جهش‌یافته با شدت بیشتری نسبت به رقم تیپ وحشی اتفاق افتاده باشد. در این تحقیق، الگوی بیان ژن‌های کد کننده پروتئین روبیسکو شامل ژن‌های زیرواحدهای کوچک و بزرگ روبیسکو و ژن روبیسکو اکتیواز در پنج مرحله پس از گرده‌افشانی و در طی پر شدن دانه‌ها مورد بررسی قرار گرفت. میزان بیان نسبی در هر ژنوتیپ در شرایط تنش نسبت به کنترل خود در همان مرحله محاسبه شد. با توجه به روند تغییرات بیان ژن‌های فتوسنتزی به نظر می‌رسد در شروع گرده‌افشانی (0 روز) که هنوز اثر تنش خشکی به خوبی توسط گیاه حس نشده است هیچ یک از ژنوتیپ‌ها تفاوت معنی‌داری از نظر کاهش بیان ژن‌های مورد مطالعه در اثر تنش نداشتند (شکل 2، الف تا ج). این عدم معنی‌داری در رقم تیپ وحشی در ژن‌های زیرواحد کوچک و بزرگ روبیسکو تا 14 روز پس از گرده‌افشانی و ژن روبیسکو اکتیواز تا 21 روز پس از گرده‌افشانی ادامه داشت که نشان‌دهنده تأثیر کمتر خشکی در تخریب سیستم فتوسنتزی در رقم تیپ وحشی نسبت به لاین‌های جهش‌یافته است (شکل 2).
شکل 2- روند تغییرات بیان ژن‌های زیر واحد کوچک روبیسکو (الف)، زیر واحد بزرگ روبیسکو (ب) و روبیسکو اکتیواز (ج) برگ پرچم ژنوتیپ‌های گندم نان.
اشکال توپر عدم اختلاف معنی‌دار آماری کاهش بیان ژن تحت تنش خشکی را نشان می‌دهد.
Figure 2- The changes of genes expression, Rubisco small subunit (a), Rubisco large subunit (b) and Rubisco Activase (c) in flag leaf of bread wheat genotypes.
Bold shapes indicates no significant difference in down-regulation under drought stress
به همین دلیل و با توجه به محتوای کلروفیل بالای رقم تیپ وحشی (شکل 1) به نظر می‌رسد رقم تیپ وحشی با تداوم فتوسنتز جاری برگ‌ها در جهت پر شدن دانه‌ها عمل می‌نماید. همچنین در هر سه ژن مورد مطالعه لاین جهش‌یافته T-67-60، در 7 روز پس از گرده‌افشانی و لاین جهش‌یافته T-65-7-1 در 14 روز پس از گرده‌افشانی کاهش معنی‌دار بیان نسبی ژن‌های فتوسنتزی در اثر تنش خشکی را نشان دادند که بیانگر تحت تأثیر قرار گرفتن سریع‌تر برگ پرچم لاین‌های جهش‌یافته در اثر پیری برگ زودرس ناشی از تنش خشکی است (شکل 2). روبیسکو یکی از پروتئین‌های مهم فتوسنتزی است که حدود 30-12 درصد کل پروتئین‌های برگ گیاهان C3 را شامل می‌شود (Evans, 1989). تنش‌های محیطی باعث کاهش سنتز روبیسکو و تخریب آن و در نتیجه کاهش فتوسنتز می‌شود (Ono et al., 2014). به همین دلیل روند کاهشی بیان ژن‌های فتوسنتزی در ژنوتیپ‌ها در طی پر شدن دانه‌ها دور از ذهن نبود.
مقایسه میانگین ژنوتیپ‌ها از نظر بیان ژن‌های فتوسنتزی مطالعه شده در هر مرحله به صورت جداگانه صورت گرفت. نتایج حاصل از مقایسه میانگین ژنوتیپ‌ها از نظر بیان ژن زیر واحد کوچک روبیسکو نشان داد که در شروع گرده‌افشانی کاهش بیان این ژن در لاین‌های جهش‌یافته T-67-60 (18/1) و T-65-7-1 (11/1) بیشتر از رقم تیپ وحشی (02/1) بود هرچند از لحاظ آماری معنی‌دار نبود (شکل 2، الف). در طی پر شدن دانه‌ها با گذشت زمان، اختلافِ کاهش بیان ژن زیر واحد کوچک روبیسکو بین ژنوتیپ‌ها بیشتر شده به طوری که در 28 روز پس از گرده‌افشانی میزان کاهش بیان در لاین‌های جهش‌یافته T-67-60 و T-65-7-1 و رقم تیپ وحشی به ترتیب 16/13، 05/6 و 09/3 برابر بود (شکل 2، الف). در ژن زیر واحد بزرگ روبیسکو به طور مشابهی بیشترین کاهش بیان در تمام مراحل به ترتیب در لاین‌های جهش‌یافته T-67-60 و T-65-7-1 و رقم تیپ وحشی مشاهد شد به طوری که بیشترین اختلاف بیان ژنوتیپ‌ها از نظر کاهش این ژن در اثر تنش خشکی مربوط به 28 روز پس از گرده‌افشانی (به ترتیب 31/18، 66/4 و 91/2 برابر) بود (شکل 2، ب). در ژن روبیسکو اکتیواز در شروع گرده‌افشانی اختلاف معنی‌داری بین ژنوتیپ‌ها از نظر کاهش بیان این ژن در اثر تنش خشکی وجود نداشت اما از مرحله 7 روز پس از گرده‌افشانی به بعد، اختلاف کاهش بیان این ژن در لاین‌های جهش‌یافته در اثر تنش، به طور معنی‌داری بیشتر از رقم تیپ وحشی بود و هرچه گیاهان به مراحل پایانی پر شدن دانه نزدیک می‌شدند این اختلاف، بیشتر خود را نشان داد به طوری در مرحله 28 روز پس از گرده‌افشانی کاهش بیان ژن روبیسکو اکتیواز در لاین‌های جهش‌یافته T-65-7-1 و T-67-60 و رقم تیپ وحشی به ترتیب 09/8، 81/4 و 39/2 برابر بود. (شکل 2، ج). روبیسکو در طی پیری تخریب شده و محصولات حاصل از آن می‌توانند به عنوان منبع نیتروژن و کربن در توسعه بافت‌ها و بذرهای در حال رشد مورد استفاده قرار گیرند (Suzuki et al., 2001) و البته هنوز علیرغم اهمیت و تأثیر فیزیولوژیکی آن در هموستازی و تولید در گیاهان مکانسیم کلی تخریب روبیسکو مشخص نیست (Masclaux-Daubresse et al., 2010). با توجه به نتایج این تحقیق می‌توان گفت لاین‌های جهش‌یافته نسبت به رقم تیپ وحشی در اثر خشکی با پیری زودرس مواجه می‌شوند و از آنجا که تحریک انتقال مجدد مواد فتوسنتزی از ساقه به دانه جهت استفاده آسیمیلات‌های ذخیره شده در بافت‌های رویشی توسط پدیده پیری انجام می‌شود؛ لاین‌های جهش‌یافته از انتقال مجدد و کارایی بیشتری نسبت به رقم تیپ وحشی برخوردار باشند. رقم تیپ وحشی نیز بیشتر با تداوم فتوسنتز جاری برگ‌ها در جهت پر شدن دانه‌ها عمل کرده است. در مناطق خشک و نیمه‌خشک پیری القایی بر اثر تنش، باعث افزایش انتقال مجدد مواد فتوسنتزی و بهبود عملکرد می‌شود و تأخیر در پیری نتیجه نامطلوبی در پی خواهد داشت (Yang & Zhang, 2006). با توجه به اینکه لاین‌های جهش‌یافته مورد مطالعه حاصل از برنامه اصلاح موتاسیونی با پرتوتابی گاما بوده‌اند به نظر می‌رسد پرتوگاما باعث تغییرات ژنتیکی مرتبط با پیری زودرس در لاین‌های جهش‌یافته و متعاقب آن افزایش انتقال مجدد ذخایر فتوسنتزی ساقه به دانه طی پر شدن دانه شده است و کاهش شدید عملکرد دانه در اثر تنش خشکی جلوگیری کرده است. نتایج پژوهش حاضر می‌تواند نقش مهمی در توجه به پتانسیل اصلاح موتاسیونی در متحمل کردن گیاهان به خشکی داشته باشد.
منابع
Bartholomew DM, Bartley GE, Scolnik PA (1991). Abscisic acid control of rbcS and cab transcription in tomato leaves. Plant Physiology 96: 291-296.
Bazargani MM, Sarhadi E, Bushehri A-AS, Matros A, Mock H-P, Naghavi M-R, Hajihoseini V, Mardi M, Hajirezaei M-R, Moradi F (2011). A proteomics view on the role of drought-induced senescence and oxidative stress defense in enhanced stem reserves remobilization in wheat. Journal of proteomics 74: 1959-1973.
Blum A (1998). Improving wheat grain filling under stress by stem reserve mobilisation. Euphytica 100:77-83.
Blum A, Sinmena B, Mayer J, Golan G, Shpiler L (1994). Stem reserve mobilisation supports wheat-grain filling under heat stress. Functional Plant Biology 21: 771-781.
Dubois M, Gilles KA, Hamilton JK, Rebers P, Smith F (1956). Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Analytical chemistry 28: 350-356.
Ehdaie B, Alloush G, Madore M, Waines J (2006). Genotypic variation for stem reserves and mobilization in wheat: I. P postanthesis changes in internode dry matter. Crop science 46: 735-747.
Ehdaie B, Alloush G, Waines J (2008). Genotypic variation in linear rate of grain growth and contribution of stem reserves to grain yield in wheat. Field Crops Research 106: 34-43.
Evans JR (1989). Photosynthesis and nitrogen relationships in leaves of C3 plants. Oecologia 78: 9-19.
Goncalves SJ, Cairney J, Maroco MM (2005). Evaluation of control transcripts in real-time RT-PCR expression analysis during maritime pine embryogenesis. Planta 222: 556-563.
Hörtensteiner S, Feller U (2002). Nitrogen metabolism and remobilization during senescence. Journal of Experimental Botany 53: 927-937.
Hukmani P, Tripathy BC (1994). Chlorophyll biosynthetic reactions during senescence of excised barley (Hordeum vulgare L. cv IB 65) leaves. Plant physiology 105: 1295-1300.
Lichtenthaler HK (1987). Chlorophyll fluorescence signatures of leaves during the autumnal chlorophyll breakdown. Journal of Plant Physiology 131: 101-110.
Masclaux-Daubresse C, Daniel-Vedele F, Dechorgnat J, Chardon F, Gaufichon L, Suzuki A (2010). Nitrogen uptake, assimilation and remobilization in plants: challenges for sustainable and productive agriculture. Annals of botany: mcq028.
Matile P, Hortensteiner S, Thomas H, Krautler B (1996). Chlorophyll breakdown in senescent leaves. Plant physiology 112: 1403.
Mi G, Tang L, Zhang F, Zhang J (2002). Carbohydrate storage and utilization during grain filling as regulated by nitrogen application in two wheat cultivars. Journal of plant nutrition 25: 213-229.
Mojtabaie Zamani M, Nabipour M, Meskarbashee M (2013). Evaluation of stem soluble carbohydrate accumulationand remobilization in spring bread wheat genotypes under terminal heat stress conditions in Ahwaz in Iran. Iranian Journalof Crop Sciences 15(3): 277-294 (In Farsi).
Navabpour S, Ramezanpour SS, Kazemi G (2015). Molecular analysis of hypersensitive reaction and senescence process in wheat leaves. Quarterly Modern Genetics Journal 10(1): 59-68 (In Farsi).
Nie G, Long S, Garcia R, Kimball B, Lamorte R, Pinter P, Wall G, Webber A (1995). Effects of free‐air CO2 enrichment on the development of the photosynthetic apparatus in wheat, as indicated by changes in leaf proteins. Plant, Cell & Environment 18: 855-864.
Ono Y, Wada S, Izumi M, Makino A, Ishida H (2013). Evidence for contribution of autophagy to Rubisco degradation during leaf senescence in Arabidopsis thaliana. Plant, cell & environment 36: 1147-1159.
Pfaffl MW (2001). A new mathematical model for relative quantification in real-time RT–PCR. Nucleic acids research 29: e45-e45.
Rubia L, Rangan L, Choudhury RR, Kamínek M, Dobrev P, Malbeck J, Fowler M, Slater A, Scott N, Bennett J (2014). Changes in the chlorophyll content and cytokinin levels in the top three leaves of new plant type rice during grain filling. Journal of plant growth regulation 33: 66-76.
Salehi M, Nassiri Mahallati M, Koocheki A (2003) Leafnitrogen and chlorophyll as indicators for salt stress. Iranian Journal Field Crops Research 1: 199-205 (In Farsi)
Sharbatkhari M, Galeshi S, Sadat Shobbar Z, Soltani A, Nakhoda B (2014). Expression analysis of the key genes of fructan remobilization and some physiological traits in wheat under terminal salinity. Journal of Agricultural Biotechnology 6: 75-90 (In Farsi).
Shu Q, Forster BP, Nakagawa H, Nakagawa H (2012). Plant mutation breeding and biotechnology: CABI. UK.
Sivamani E, Bahieldin A, Wraith JM, Al-Niemi T, Dyer WE, Ho T-HD, Qu R (2000). Improved biomass productivity and water use efficiency under water deficit conditions in transgenic wheat constitutively expressing the barley HVA1 gene. Plant Science 155: 1-9.
Suzuki Y, Makino A, Mae T (2001). Changes in the turnover of Rubisco and levels of mRNAs of rbcL and rbcS in rice leaves from emergence to senescence. Plant, Cell & Environment 24: 1353-1360.
Tuberosa R, Salvi S (2006). Genomics-based approaches to improve drought tolerance of crops. Trends in Plant Science 11: 405-412.
Vu JC, Baker JT, Pennanen AH, Allen Jr LH, Bowes G, Boote KJ (1998). Elevated CO2 and water deficit effects on photosynthesis, ribulose bisphosphate carboxylase‐oxygenase, and carbohydrate metabolism in rice. Physiologia Plantarum 103: 327-339.
Weng XY, Xu HX, Jiang DA (2005). Characteristics of gas exchange, chlorophyll fluorescence and expression of key enzymes in photosynthesis during leaf senescence in rice plants. Journal of Integrative Plant Biology 47: 560-566.
Williams J, Bulman M, Neill S (1994). Wilt‐induced ABA biosynthesis, gene expression and down‐regulation of rbcS mRNA levels in Arabidopsis thaliana. Physiologia Plantarum 91: 177-182.
Xu S, Chu C, Harris M, Williams C (2010). Comparative analysis of genetic background in eight near-isogenic wheat lines with different H genes conferring resistance to Hessian fly. Genome 54: 81-89.
Yang J, Zhang J (2006). Grain filling of cereals under soil drying. New phytologist 169: 223-236.
Yang J, Zhang J, Huang Z, Zhu Q, Wang L (2000). Remobilization of carbon reserves is improved by controlled soil-drying during grain filling of wheat. Crop Science 40: 1645-1655.
Zadoks JC, Chang TT, Konzak CF (1974). A decimal code for the growth stages of cereals. Weed research 14: 415-421.
Molecular and physiological analysis of flag leaf senescence and remobilization of assimilates in bread wheat under terminal drought stress
Bagherikia S.1, Pahlevani M H. *2, Yamchi A.3, Zenalinezhad K. 3, Mostafaie A. 4
1 Ph. D. Candidate in Plant Breeding & Biotechnology Department, Gorgan University of Agricultural Sciences & Natural Resources, Iran,
2 Associate Professor in Plant Breeding & Biotechnology Department, Gorgan University of Agricultural Sciences & Natural Resources, Iran,
3 Assistant Professor in Plant Breeding & Biotechnology Department, Gorgan University of Agricultural Sciences & Natural Resources, Iran,
4 Professor in Medical Biology Research Center, Kermanshah University of Medical Sciences, Iran,
Abstract
In the physiological study of stem remobilization of assimilates during grain filling, mutant genetic materials are a valuable tool. Two advanced mutant lines of bread wheat (T-67-60 and T-65-7-1) along with their wild type (Tabasi Cv.) were planted at two moisture conditions (normal and 30-40% of field capacity) as a factorial experiment based on a completely randomized design with three replications. Drought treatment initiated at full heading stage (Zadoks 60) and sampling done at 5 steps (0, 7, 14, 21 and 28 days after anthesis). Based on the results remobilization of stem and its efficiency in the mutant lines was significantly more than wild type, under terminal drought stress. The reasons for this were higher capability of the sink and early senescence in the mutant lines compared to the wild type. In consequence of changes in chlorophyll content and relative gene expression of key photosynthetic Rubisco (Rubisco large and small subunits and Rubisco activase), in the genotypes during grain filling seems degradation of chloroplasts and photosynthetic system occurred caused by senescence drought stress-induced in the mutant lines more strongly than in the wild type, and because of senescence is stimulating remobilization of assimilates from stem to grain, remobilization of stem and its efficiency in mutant lines were more than wild type. Also, wild type further with continuation of current photosynthesis in the leaves has acted for the grain filling.
Keywords: Gene expression, Senescence, Mutant, Rubisco, Chlorophyll.
*نویسنده مسئول:محمدهادی پهلوان تلفن: 01732437616 hpahlavani@yahoo.com Email:
* Corresponding Author: Pahlevani M H. Tel: +9801732437616 Email: hpahlavani@yahoo.com
)
