Cloning and gene expression of alkane hydroxylase gene from Pseudomonas putida

همسانه‌سازی و بیان ژن آلکان هیدروکسیلاز از باکتری Pseudomonas putida

مهدی حسن شاهیان*¹، هادی روان²

¹ دانشیار میکروبیولوژی، گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، انشگاه شهید باهنر کرمان، ایران

² استادیار بیوشیمی، گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه شهید باهنر کرمان، ایران

تاریخ دریافت: 12/09/1392، تاریخ پذیرش: 04/02/1396

چکیده

Pseudomonas putida یک باکتری هتروتروف بوده که قابلیت رشد روی طیف وسیعی از سوبستراها که عمده آن ها آلکان­ها هستند، دارا می باشد. توانایی تجزیه طیف وسیعی از هیدروکربن‌ها، نشان‌دهنده برتری این ارگانیسم نسبت به اعضای دیگر جامعه میکروبی تجزیه کننده نفت می باشد. باکتری P. putida دارای سیستم آلکان هیدروکسیلاز (ژن alk-B) برای تجزیه آلکان‌ها می‌باشد. هدف از اجرای تحقیق حاضر جداسازی و بیان ژن آلکان هیدروکسیلاز باکتریP. putida  می باشد. برای این منظور ابتدا همسانه‌سازی در پلاسمید pBluescript انجام شد و سپس ناحیه کدکننده ژن مذکور در پلاسمید pET-26a  وارد  شد. بیان ژن خارجی  در سویه  BL-21 از باکتری E. coli  صورت پذیرفت. فعالیت آنزیم نوترکیب حاصله با تفاوت جذب اسپکتروسکپی در اثر اکسید کردن NADPH تعیین شد. نتایج حاصل از این تحقیق نشان داد که ژن آلکان هیدروکسیلاز در پلاسمید pBluescript به‌خوبی جایگزین گردید، کلنی PCR نیز این امر را تایید کرد. ژن مربوطه به‌خوبی در وکتور pET-26a کلون شد. با افزایش زمان پس از القاء با IPTG  ، بیان پروتئین آلکان هیدروکسیلاز افزایش یافت. پروتئین نوترکیب حاصله دارای فعالیت آنزیمی مناسب می باشد. انتقال این ژن به باکتری سریع الرشد و سوبسترای غذایی وسیع می تواند نوید بخش تولید  بیوکاتالیزوری با کارایی  برتر باشد.

واژه های کلیدی: آلکان‌ها، بیوکاتالیز، بیان پروتئین، تجزیه زیستی، کلونینگ.

.

 مقدمه

نفت خام یکی از مهمترین منابع طبیعی است که سوخت فسیلی عمده منابع صنعتی و ماده مورد نیاز در صنایع پتروشیمی است. آلودگی مزمن محیط با نفت موجب بهم ریختگی اکولوژیکی می­شود و مانع استفاده پایدار آن توسط بشر است. روش­های احیای زیستی امروزه به­عنوان بهترین، کم خطرترین و مقرون به صرفه­ترین روش­ها برای حذف آلودگی­های نفتی و هیدروکربنی می­باشند. تاکنون باکتری‌های گوناگونی برای این هدف استفاده شده­اند، ولی باکتری P. putida نه تنها هیدروکربن‌های نفتی را در شرایط آزمایشگاهی تجزیه می کند، بلکه به نظر می­رسد در خارج کردن نفت از اکوسیستم‌های خشکی اهمیت بسیاری دارد. بنابراین، بدیهی است که پتانسیل تجزیه زیستی سیستم­های آلوده به نفت را داشته باشد (Hassanshahian et al., 2010; Elcia et al., 2005). این باکتری قادر به رشد بر روی طیف محدودی از سویستراها است، که عمدتا سوبسترای آن آلکان‌ها می­باشند (Yateem et al., 2002). باکتری P. putida دارای سیستم آلکان هیدروکسیلاز (alk-B) برای تجزیه آلکان‌ها می­باشد (Vanbeilen et al., 2006). اغلب باکتری‌های تجزیه کننده هیدروکربن­های آلیفاتیک دارای سیستم آلکان هیدروکسیلاز وابسته به غشاء می‌باشند. آلکان هیدروکسیلاز متصل به غشاء ابتدا در سودوموناس فلورسنت تجزیه کننده هگزان شناسایی شد که بعداً P. oleovirans نامیده شد و کمی بعدتر به عنوان P. putida تشخیص داده شد. مطالعات بیوشیمی نشان داده که سیستم آلکان هیدروکسیلاز P. putida دارای یک مونواکسیژناز غشاءگذر، 1 تا 2 روبرودوکسین و یک روبرودوکسین رودوکتاز می‌باشد. روبرودوکسین رودوکتاز الکترون‌ها را از NADH (نیکوتین‌آمید آدنین دی‌نوکلئوتید) از طریق کوفاکتور FAD به روبرودوکسین منتقل می‌کند که آن نیز الکترون‌ها را به آلکان هیدروکسیلاز منتقل می‌نماید (Sei et al., 2003).

استفاده از باکتریP. putida   جهت تجزیه زیستی دارای محدودیت‌هایی است که شامل کند رشد بودن آن و عدم استفاده از کربوهیدرات‌ها جهت رشد می­باشند. یکی از راه حل‌ها برای این محدودیت‌ها انتقال ژن‌های تجزیه کننده آلکان‌ها از این باکتری به باکتری های سریع الرشد است (Hassanshahian et al., 2012a; Hassanshahian el al., 2012b).

آلکان هیدروکسیلاز بزرگترین بالا خانواده آنزیم­های حاوی هم است و توالی ژنی آن در ارگانیسم­های متعددی، از قبیل پستانداران، گیاهان آلی، جلبک ها، قارچ ها و باکتری ها شناسایی شده است. در پژوهشی Vanbeilen et al. (2006) با طراحی یک وکتور پلی سیسترونی ژن alk-B را با ژن فرودوکسین و فرودوکسین روداکتاز به P. putida انتقال دادند، که سویه های نوترکیب قادر به رشد روی آلکان بودند (Vanbeilen et al., 2006). در پژوهشی دیگر Vanbeilen et al. (2004) 16 ژن alk-B را از محیط­های مختلف از قبیل خاک آلوده به نفت، آب­های زیر زمینی و همچنین P. putida جداسازی کردند. یکی از فرضیات این تحقیق این است که ژن آلکان هیدروکسیلاز از این باکتری قابلیت بیان در میزبان E. coli را دارد. هدف از انجام این تحقیق همسانه سازی و بیان یکی از ژن های مهم باکتریP. Putida در تجزیه زیستی آلکان­ها می­باشد. هدف دیگر این تحقیق کاربرد ژن و پروتئین آلکان هیدروکسیلاز همسانه شده از  این باکتری به­عنوان کاتالیزور زیستی جهت هیدروکسیله کردن آلکان‌ها بود.

مواد و روش ها

میزبان های باکتریایی، پلاسمیدها و پرایمرها

در این تحقیق از سویه  P. putidaبه­عنوان تولید کننده پروتیئن آلکان هیدروکسیلاز (alk-B) برای کلیه مطالعات به کار گرفته شد. سویه  باکتری E. coli به عنوان میزبان در مراحل همسانه سازی سازی و جهت تکثیر DNA پلاسمیدی مورد استفاده قرار گرفت و  سویه BL21(DE3) به عنوان میزبان بیان کننده مورد استفاده قرار گرفت. در این تحقیق ناقل پلاسمیدی pBluescript برای کلون سازی ژن رمز کننده alk-B بکار رفت. همچنین از پلاسمید pET-26a نیز برای بیان ژن alk-B استفاده گردید. در این تحقیق از پرایمرهای   alk-F 5'-GAG ACA AAT CGT CTA AAA CGT AA-3ʹ و alk-R: TTG TTA TTA TTC CAA CTA TGC TC-3 5'- جهت تکثیر ژن alk-B استفاده شد.

 تکثیر ژن alk-B

با استفاده از پرایمرهای طراحی شده، ژن alk-B با PCR تکثیر یافت. این ژن به طول  330 جفت باز می­باشد. مواد مورد استفاده در واکنش تکثیر با حجم 25 μl  عبارت بود از: dNTP  (10 µM)، Buffer pfu DNA poly  (20 mM)، MgCl₂ (5 mM)، Primer alk-F  (10 PMol)، Primer alk-R  (10 PMol)، pfu polymerase (1 unit)، Template- DNA  (20 ng) و H₂O . برنامه PCR با 30 سیکل بصورت زیر بود: دناتوراسیون در دمای 94 درجه به مدت یک دقیقه، دمای اتصال پرایمرها 54 درجه به مدت یک دقیقه و دمای تکثیر 72 درجه به مدت یک دقیقه بود. محصول حاصله از PCR روی ژل آگارز یک درصد قرار گرفت و برای استخراج DNA (قطعه­ی 330 جفت بازی) از ژل آگارز، کیت استخراج DNA (شرکت فرمنتاس، کره جنوبی K0513) طبق دستورالعمل همراه باکیت بکار رفت Sambrook & Russel, 2001)).

همسانه سازی ژن alk-B داخل پلاسمید pBluescript

پلاسمیدpBluescript با استفاده از کیت Metabion طبق دستورالعمل کیت از میزبان باکتریایی () استخراج شد. واکنش هضم تک آنزیمی توسط آنزیم  EcoRV برای خطی کردن پلاسمید  pBluescriptبه­کار رفت. واکنش اتصال[1] جهت وارد نمودن ژن alk-B درون پلاسمید pBluescript انجام شد. روش کار بدین صورت بود که در حجم واکنش 25 μl میزان 0.4µg از ژن alk-B با0.2µg از پلاسمید همراه با 1Unit از آنزیم   T4 DNA ligase و بافر آن به مدت یک شب در دمای 16 درجه گرم‌خانه گذاری[2] گردید. سلول‌های مستعد جهت پذیرش DNA پلاسمیدی خارجی طبق دستورالعمل Sambrook and Russel, 2001))  تهیه شد. با استفاده از روش شوک حرارتی پلاسمید به سلول های مستعد منتقل گردید و واکنش تبدیل[3] صورت گرفت. به منظور غربالگری، میزان lµ 50 از باکتری­های E. coli ترانسفورم شده (مخلوط باکتری‌های نوترکیب و باکتری های حاوی پلاسمیدpBluescript  ) در محیط کشت LB حاوی X-gal، IPTG و آنتی بیوتیک Amp پخش شد و پلیت‌ها به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سلسیوس گرماگذاری شدند. برای اطمینان از این­که کلنی‌های سفید حاصل واجد پلاسمید نوترکیب می­باشند، کلنی PCR با پرایمرهای اختصاصی ژن alk-B انجام شد.

انتقال ژن alk-B به پلاسمید pET-26a

ابتدا پلاسمید pET-26a از درون میزبان باکتریایی آن (BL-21 E.Coli) با استفاده از کیت Metabion استخراج شد. همچنین پلاسمید pBluscript که دارای ژن alk-B بود نیز از باکتری E.coli استخراج گردید. یک واکنش هضم دو آنزیمی برای هر دو پلاسمید گذاشته شد. در واکنش هضم دو آنزیمی از آنزیم­های محدودالاثر NdeI و XhoI  استفاده گردید. زیرا آنزیم NdeI دارای جایگاه اثر در پرایمر F ژن alk-B و آنزیم  XhoIدارای جایگاه اثر تنها در پلاسمید pBluscript است. بنابراین، با این واکنش آنزیمی ژن alk-B از درون پلاسمید pBluscript بصورت چسبنده خارج می­گردد. بطور همزمان با همین دو آنزیم پلاسمید pET-26a نیز برش داده شد. محصول حاصل از هضم آنزیمی پلاسمید pET-26a و پلاسمید pBluescript در ژل آگارز یک درصد قرار گرفت. سپس با کیت استخراج DNA از ژل پلاسمید خطی شده pET-26a و ژن alk-B خالص سازی گردید. واکنش اتصال دو قطعه طبق روش شرح داده شده در قسمت 2-3  انجام شد.

بیان ژن alk-B

باکتریBL-21   E.coli  بعنوان میزبان بیان کننده پروتئین نوترکیب بکار رفت. سلول­های مستعد باکتری E.coli سویه BL-21  ابتدا طبق روش شرح داده شده در بالا تهیه گردید. سپس میزان 2 میکرولیتر از محصول اتصال[4] جهت تبدیل کردن باکتری BL-21 و انتقال پلاسمید pET-26 نوترکیب بکار رفت. انتخاب کلنی­های نوترکیب BL-21 در محیط حاوی آنتی بیوتیک کانامایسین انجام شد. پس از ظاهر شدن کلنی ها روی محیط انتخابی، کلنی PCR جهت تائید صحت همسانه سازی با پرایمرهای اختصاصی ژن alk-B صورت گرفت  Sambrook &Russel, 2001)).

10 میلی لیتر محیط LB مایع همراه با آنتی بیوتیک کانامایسین به داخل ارلن 50 میلی لیتری ریخته شد. یک کلنی از کشت تازه برداشته و به داخل آن تلقیح گردید و سپس در دمای 37 در انکوباتور شیکردار بطور شبانه گرماگذاری گردید. برای القاء جهت بیان پروتئین، IPTG[5] به غلظت نهایی 0.5-1 میلی مولار به آن اضافه شد. رشد باکتری­ها به مدت 5-4 ساعت ادامه یافت. هر یک ساعت 500 میکرولیتر از نمونه رسوب داده شد و در 100 میکرولیتر بافر نمونه SDS-PAGE به حالت سوسپانسیون درآورده شد و تا زمان انجام SDS-PAGE در فریزر°C 20- قرار گرفت.  برای تفکیک و تعیین جرم مولکولی پروتئین­ها از الکتروفورز عمودی و  ژل ^[6] SDS- PAGEاستفاده شد Sambrook & Russel, 2001)).

سنجش فعالیت آنزیم نوترکیب Alk-B

کشت باکتری و القای تولید آنزیم

باکتریBL-21   E.coli که دارای پلاسمید pET-26  نوترکیب بود را در 250 میلی لیتر از محیط LB حاوی آنتی بیوتیک کانامایسین در دمای 37 درجه سلسیوس و 150 دور در دقیقه کشت داده شد. زمانی­که جذب نوری آن در طول موج 600 نانومتر به 3/0 رسید، به محیط IPTG با غلظت نهایی 1 میلی مولار افزوده شد و در دمای Cْ37 به مدت 8 ساعت انکوبه گردید. علاوه بر این، از کلون‌ها با شرایط مشابه فوق کشت‌هایی تهیه شد با این تفاوت که به آنها IPTG  افزوده نشد. پس از اتمام دوره انکوباسیون باکتری‌ها در دور 4000 دور در دقیقه و دمای 4 درجه سلسیوس به مدت 20 دقیقه رسوب یافتند. بیوماس باکتری حاصله به مدت 4 ساعت در معرض هگزادکان قرار گرفت تا فعالیت آنزیم Alk-B  تحریک گردد. سپس سلول­های  باکتریایی با اولتراسونیک شکسته شدند. لاشه باکتری­ها و همچنین باکتری‌های شکسته نشده با سانتریفوژ در 4000 دور در دقیقه  و دمای 4 درجه سلسیوس به مدت 20 دقیقه رسوب یافتند. عصاره سلولی حاصله از هر دو کشت باکتریایی (القاء شده با IPTG و غیر القاء) جهت سنجش فعالیت آنزیم Alk-B  استفاده شد   (Vanbeilen et al., 2006)

روش سنجش آنزیم الکان هیدروکسیلاز (Alk-B)

برای سنجش فعالیت آنزیم الکان هیدروکسیلاز مخلوط واکنش آنزیمی بدین صورت تهیه گردید. مخلوط واکنشگر با حجم نهایی 1 میلی لیتر  شامل محلول اکتان (lµ 10) ، محلول NADPH (lµ 300) ، عصاره سلولی (lµ 100)، تریس 50 میلی مولار (lµ 590). مخلوط شاهد حاوی همه مواد ذکر شده بود فقط عصاره سلولی به آن اضافه نگردید. جذب مخلوط واکنش را در 340 نانومتر دو دقیقه قبل از اضافه کردن اکتان و 3 دقیقه بعد از اضافه کردن اکتان در مقابل شاهد اندازگیری می­شود. کاهش جذب در 340 نانومتر نشانگر فعالیت آنزیمی است. یک واحد آنزیمی از فعالیت آلکان هیدروکسیلاز مطابقت با مقدار آنزیمی است که یک میکرو مولار NADPH را به ازای یک دقیقه اکسیده می­کند Vanbeilen et al., 2006)).

نتایج

تکثیر ژن alk-B

با استفاده از پرایمرهای طراحی شده (alk- F وalk- R ) و آنزیم Pfu پلیمراز واکنش PCR انجام و محصول آن بر روی ژل آگارز مشاهده گردید (شکل 1). قطعه تکثیر شده به طول تقریبی  330 جفت باز می­باشد که اندازه آن در مقایسه با ژن alk-B باکتری P. putida موجود در بانک ژن مطابقت دارد.

همسانه سازی ژن alk-B در پلاسمید pBluescript

انتقال ژن alk-B درون پلاسمید pBluescript موفقیت آمیز بود. نتایج حاصله در شکل 2 نشان داده شده است. با توجه به این شکل، همسانه سازی ژن alk-B  تایید می­شود. زیرا کلنی سفید که واجد پلاسمید هستند پس از استخراج و بارگذاری در ژل از نظر اندازه مولکولی بالاتر از کلنی آبی که فاقد پلاسمید هستند قرار گرفته است.

بررسی کلنی های نوترکیب توسط PCR

برای تایید وجود ژن alk-B در کلونی­های نوترکیب (کلنی سفید) از روشPCR  با پرایمرهای اختصاصی استفاده شد. DNA  پلاسمیدی استخراج شده از تعدادی از کلونی های نوترکیب به همراه یک کلنی آبی بعنوان کنترل منفی با پرایمرهای ویژه ژن alk-B مورد واکنش PCR قرار گرفتند. نتایج نشان داد که کلیه کلنی­های سفید دارای ژن alk-B هستند، در حالی­که کلنی آبی فاقد این ژن است (شکل 3).

شکل 1- الکتروفورز محصول PCR  ژن alk-B  با استفاده از پرایمرهای  alk-F و alk-R  بر روی ژل آگارز یک درصد، چاهک (1) مارکر  (100 bp)، چاهک (7-2) محصول  PCR  و چاهک (8): کنترل منفی

Figure 1- Gel electrophoresis   of PCR product of alk-B gene with alk-F and alk-R primers on 1 % agarose gel. Lane (1): 100bp marker ladder, lane (2-7): PCR product and lane (8): Negative control.

انتقال ژن alk-B به پلاسمید pET-26a

با توجه به این­که در این تحقیق هدف بیان ژن همسانی شده نیز بود، لذا انتقال ژن به یک وکتور بیانی صورت گرفت. نتیجه حاصله از این انتقال در شکل 4 نشان داده شده است.

شکل 2- تصویر ژل الکتروفورز استخراج پلاسمید نوترکیب، چاهک (1): مارکر 1kb،چاهک (2): کلنی سفید که واجد پلاسمید نوترکیب  pBlu-alk-B است چاهک (3): کلنی آبی که تنها پلاسمید pBluescript را دارد .

Figure 2- Gel electrophoresis of extracted recombinant plasmid: Lane (1) 1kb ladder, lane (2): white colony contain recombinant pBlu-alk-B plasmid, lane (3): Blue colony contain only pBluscript plasmid.

شکل 3- تایید وجود ژن alk-B  در کلنی های نوترکیب. چاهک (M): مارکر 100 bp چاهک (5-1): کلنی ها سفید و چاهک (6): کلنی آبی.

Figure 3- Confirmation the presence of alk-B gene in recombinant colonies, lane (M): 100bp ladder, lane (1-5): White colonies and lane (6): Blue colony.

شکل 4- الکتروفورزDNA پلاسمیدی: چاهک (1):  پلاسمید pET-26a بعنوان  کنترل منفی، چاهک
(2): pET-26-alk-B استخراج شده ، چاهک (3): مارکر 1Kb

Figure 4- Electrophoresis of plasmid DNA: lane (1): pET-26a as negative control, lane (2): pET-26-alk-B, lane (3) a Kb ladder.

همانطور که در شکل 4 مشاهده می­شود این انتقال موفقیت آمیز بوده است، بطوری­که پلاسمیدی که حاوی کلنی نوترکیب بوده  واجد ژن alk-B است و وزن مولکولی بالاتری نسبت به کلنی که تنها حاوی پلاسمید pET-26a است، دارد. برای تایید نهایی حضور ژن از کلنی های غربال شده PCR با پرایمرهای اختصاصی ژن alk-B صورت گرفت و مشخص شد که کلنی های فوق حاوی این ژن هستند. نتایج حاصل نشان داد که با افزایش زمان پس از القاء با IPTG  بیان پروتئین آلکان هیدروکسیلاز افزایش یافته است و عدم حضور آن در پلاسمید pET-26a (غیر نوترکیب) نشان دهنده بیان این پروتئین تنها در پلاسمید نوترکیب می­باشد (شکل 5).

سنجش فعالیت آنزیمی پروتئین نوترکیب  آلکان هیدروکسیلاز

اصول بررسی تعیین فعالیت آنزیم آلکان هیدروکسیلاز  بر پایه کاهش جذب در 340 نانومتر بود. نتایج حاصله از سنجش فعالیت آنزیمی الکان هیدروکسیلاز در شکل 6 آمده است. این نتایج نشان دهنده این می باشد که آنزیم نوترکیب حاصله دارای فعالیت مناسب آنزیمی است.  پیک 340 نانومتر مربوط به اتصال سوبسترا به آنزیم فعال است، که آنزیم نوترکیب در مقایسه با شاهد کاهش قابل ملاحظه ای در این ناحیه دارد.

شکل 5- الکتروفورز عصاره باکتری حاوی پلاسمید نوترکیب pET-26-alk-B  و پلاسمید pET-26a توسط ژل SDS-PAGE 15 درصد. چاهک ( 1): مارکر وزن مولکولی پروتئین. چاهک ( 2):  عصاره باکتری حاوی پلاسمید pET-26a چاهک (3) باکتری های حاوی پلاسمید نوترکیب  pET-26-alk-B بعد از القا با  IPTG

Figure 5- Protein electrophoresis of bacterial extract contain pET-26-alk-B with SDS-PAGE 15%: lane (1): Protein marker, lane (2): bacterial extract contain pET-26a, lane (3): bacteria contain recombinant pET-26-alk-B after induction by IPTG  

بحث و نتیجه گیری

ویژگی مشخصه باکتری P. putida توانایی رشد بر روی آلکان‌ها است. این موضوع، باعث برتری این ارگانیسم نسبت به اعضای دیگر جامعه میکروبی تجزیه کننده نفت شده است (Cepeda et al., 2006). این باکتری دارای سیستم‌های چندتایی جهت کاتابولیسم هیدروکربن­ها است. یکی از مهمترین این  سیستم ها آلکان هیدروکسیلاز است. پروفایل پروتئولیتیک پیشنهاد کرده است که سیستم‌ Alk-B نقش مهمی در کاتابولیسم هیدروکربن‌های اشباع دارد (Vanbeilen et al., 2003). در پژوهشی Sei et al. (2003) توالی ژنوم باکتری P. putida را به­طور کامل گزارش کردند. آنها به این نتیجه رسیدند که این باکتری دارای ژن‌های متعددی برای تجزیه آلکان‌ها می­باشد و همچنین سیستم ژنتیکی آن دارای ژن‌هایی برای تشکیل بیوفیلم در فاز آبی-نفتی، تولید بیوسورفکتانت، پاسخ به استرس‌ها و جذب عناصر کمیاب است. تا کنون دو گزارش از همسانه سازی ژن‌های تجزیه کننده هیدروکربن ها وجود دارد. در پژوهشی ژن alk-B1 ازP. putida در E. coli همسانه سازی شد (Smits et al., 2002). آنها با تعیین توالی ژن کلون شده و مقایسه توالی با ژن‌های alk-B موجود از سایر باکتری‌ها به این نتیجه رسیدند که ژن alk-B1 باکتریP. putida مشابه ژن alk-B باکتری P. oleovorans GPO1 می­باشد.

شکل 6- کاهش جذب در 340 نانومتر توسط آنزیم الکان هیدروکسیلاز نوترکیب   (A)  شاهد فاقد عصاره سلولی (B) آنزیم نوترکیب

Figure 6- Reduction of absorbance in 340 nm with recombinant alkane hydroxylase enzyme (A): Blank without cell extract and (B): Recombinant Enzyme.

پژوهشگران ژن­های alk-B1 و alk-B2 باکتری P. putida  را در E. coli همسانه سازی نمودند و متعاقبا این دو ژن را در سویه اصلی تخریب کردند و خصوصیات رشدی موتانت های بهم ریخته را مورد تحقیق قرار دادند (Hara et al., 2004). نتایج آنها نشان داد که ژن alk-B1 مسئولی برای تجزیه هگزادکان می باشد و موتانت‌هایی که هر دو ژن آنها تخریب شده بودند هنوز قادر به رشد بر روی آلکانهای با زنجیره متوسط بودند که دلالت بر این دارد که آلکان های با زنجیره متوسط در این باکتری عمدتا بوسیله سیستم های آنزیمی به­جز Alk-B1 و Alk-B2 هیدروکسیله می­شوند. آنها آلکان هیدروکسیلاز را مسئول تجزیه آلکان‌ها در موتانت‌ها دانستند (Hara et al., 2004). در پژوهش حاضر، ژن alk-B از باکتری P. putida جداسازی گردیده و با استفاده از ناقل بیانی در میزبان باکتریایی به صورت نوترکیب بیان گردید. با مراجعه به منابع تاکنون هیچ گزارشی از همسانه سازی ژن alk-B  باکتریP. putida دیده نشد و تنها گزارش مربوط به Vanbeilen et al. (2006) می باشد. این محققین نیز ژن alk-B  این باکتری را به تنهایی همسانه سازی ننموده اند، بلکه از آن برای ساخت پروتئین چایمریک همراه با ژن‌های بدست آمده از منابع محیطی استفاده کردند. در این تحقیق سنجش فعالیت آنزیمی پروتئین نوترکیبAlk-B   بر اساس کاهش جذب در 340 نانومتر سنجش گردید. در پژوهشی Vomberg et al. (2000) برای سنجش فعالیت آنزیمی میزان تبدیل اکتان به اکتانول را با GC-MS اندازه گیری نمودند. همچنین Vanbeilen et al. (2007) با همسانه سازی و بیان ژن alk-B از منبع مخمری به این نتیجه رسیدند که اندازه گیری سنجش فعالیت کاهش جذب در 340 نانومتر بهترین روش می­باشد. زیرا به سنجش مستقیم و سریع الکان هیدروکسیلاز فعال امکان داده و از طرفی نیازمند خالص سازی آنزیم نمی­باشد و تنها محدودیت این روش در این است که نیازمند مقادیر بالایی از الکان هیدروکسیلاز جهت اندازه گیری دقیق می­باشد. پژوهشگران دیگر ژن alk-B از C. albicans را در E. coli کلون، بیان و خالص سازی نمودند و از کاهش جذب در 340 نانومتر جهت سنجش فعالیت آنزیمی استفاده کردند (Vanbeilen and Klinner, 2003). میزان فعالیت و تفاوت جذب به­دست آمده در این تحقیق در مقایسه با محققین دیگر پایین است که می تواند به دو علت باشد: (1) با توجه به این که کلونینگ در میزبان دیگری صورت گرفته است این احتمال وجود دارد که فولدینگ پروتئین آلکان هیدروکسیلاز تغییر کرده باشد. (2) ممکن است سلول ها بخوبی شکسته نشده باشند. در پایان پیشنهاد می­شود که از این باکتری نوترکیب جهت طراحی ساخت بیوکاتالیزور جهت هیدروکسیله کردن آلکان‌ها و تبدیل آنها به الکل استفاده گردد.