مهندسی ژنتیک پنبه: از گذشته تا امروز

مسعود توحیدفر*¹، سولماز خسروی ²

¹دانشیار، دانشکده علوم و زیست فنآوری، دانشگاه شهید بهشتی، تهران، ایران.

²مربی پژوهشی، پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی.

تاریخ دریافت: 14/12/1395، تاریخ پذیرش: 22/04/1396

خلاصه

پنبه یکی از گیاهان زراعی مهم و اقتصادی در دنیا و به عنوان چهارمین محصول مهم صنعتی در ایران به شمار می­رود. در گذشته، تلاش­های زیادی جهت اصلاح کیفیت پنبه توسط اصلاحگران سنتی صورت گرفته است که به علت محدودیت­های موجود در روش­های سنتی، استفاده از روش­های مهندسی ژنتیک رواج یافت. به دنبال رواج روش­های نوین، گیاهان تراریخته پنبه مقاوم به حشرات، بیماری­ها، علفکش، تنش­های غیر زیستی و همچنین الیاف با کیفیت بالاتر تولید شدند. امروزه، تعدادی از این ارقام تجاری­سازی شده و از پذیرش عمومی بالایی در سراسر جهان برخوردار هستند. اکنون نیز با ظهور روش­های توالی­یابی نسل جدید و تسهیل شناسایی ژن­های کاندید و مناسب جهت دست­ورزی و وجود روش­های ویرایش ژنوم (CRISPR/Cas9) با قابلیت ایجاد تغییرات هدفمند در ژن­ها، افق تازه­ای در حوزه اصلاح ژنتیکی پنبه ایجاد شده است.  این مقاله ضمن مروری بر تاریخچه اصلاح پنبه و بررسی موانع موجود، به تحقیقات صورت گرفته در زمینه تولید ارقام مقاوم به تنش­های زیستی و غیر زیستی و افزایش کیفیت پنبه با روش­های مهندسی ژنتیک و ویرایش ژنومی می­پردازد.

کلمات کلیدی: پنبه تراریخته، مقاومت به بیماری، مقاومت به حشرات، ویرایش ژنوم، CRISPR/Cas9.

مقدمه

زراعت پنبه نیز مانند سایر گیاهان تحت تاثیر تنش­های زیستی و غیرزیستی قرار می­گیرد. البته خسارت­های ناشی از تنش­های زیستی در این گیاه (76 تا 85 درصد) در مقایسه با سایر گیاهان بسیار بیشتر است. خسارت­های حاصل از حمله آفات و علف­های هرز به تنهایی شامل 8/36 و 9/35 درصد می­شود (Oerkem, 2006). بیش از 15 گونه مختلف از حشرات به پنبه خسارت می­زنند که از بین آنها کرم غوزه پنبه (Heliothis armigera) بیشترین خسارت را وارد می­کند. بیماری­های قارچی نیز باعث خسارت 8 تا 12 درصدی به زارعت پنبه می­شوند که مهمترین آنها قارچ­های ورتیسیلیوم و آلترناریا هستند (Tohidfar et al., 2005). پنبه همچنین به آلودگی­های ویروسی مانند جیمنی­ویروس­ها حساس است. این ویروس­ها باعث کاهش تعداد و اندازه غوزه و عملکرد دانه می­شوند (Mahmood-ur-Rahman et al., 2012). تنش­های غیرزیستی نیز مانند خشکی یا شوری به روش­های مختلف کشت و کار پنبه را تحت تاثیر قرار می­دهند. به عنوان مثال تنش خشکی در دوران زایشی گیاه پنبه اثرات بسیار نامطلوبی را بر عملکرد و کیفیت الیاف دارد (2009 Maqbool,). شوری نیز با توقف رشد رویشی گیاه، باعث کاهش عملکرد آن می­شود (Pic et al., 2002). با وجودی­که اصلاحگران سنتی پنبه تلاش­های زیادی را جهت بهبود افزایش تحمل به تنش­های زیستی و غیرزیستی انجام داده­اند  (Dutt et al., 2004; Lu & Zeiger, 1994)، اما به علت فقدان ژن­ها یا ژرم­پلاسم­های مطلوب و زمانبر بودن موفقیت­های چندانی حاصل نشده است (Juturu et al., 2015). بنابراین، استفاده از روش­های نوین مهندسی ژنتیک به عنوان ابزاری ارزشمند در جهت اصلاح  پنبه و ایجاد مقاومت در مقابل تنش­های زیستی و غیرزیستی توسعه یافته اند، بطوریکه میزان پذیرش جهانی پنبه تراریخته نسبت به نوع سنتی آن 70 درصد گزارش شده است (James, 2014). پنبه تراریخته بعد از ذرت و سویای تراریخته به میزان گسترده­ای کشت، خرید و فروش و پذیرفته شده است و بیش از 24 میلیون هکتار در سراسر دنیا سطح زیر کشت دارد. پنبه تراریخته سهم قابل توجهی را در افزایش میزان درآمد 5/16 میلیون کشاورز خرده پا در کشورهای در حال توسعه داشته است (James, 2014).

روش­های مهندسی ژنتیک امکان انتقال یک تا چند ژن را به گیاه فراهم کرده­اند. روش انتقال ژن به کمک آگروباکتریوم از بین روش­های موجود، بیشترین کاربرد را در تراریختی پنبه دارد. تولید اولین پنبه تراریخته در سال 1987 گزارش شد (Firozabady et al., 1987). این محققین ژن انتخابگر نئومایسین فسفوترانسفراز (npt II) را به ریزنمونه­های برگرفته از هیپوکوتیل منتقل کرده و به کمک آنالیزهای مولکولی تلفیق آن در داخل ژنوم را تایید کردند. این مطالعات باعث آغاز تحقیقات گسترده در زمینه مهندسی ژنتیک پنبه شد. کارایی انتقال ژن توسط آگروباکتریوم به پنبه تحت تاثیر عوامل مختلفی قرار دارد به عنوان مثال نژاد و غلظت باکتری، اضافه کردن مواد فنولی در محیط کشت، گونه گیاهی و ژنوتیپ، تنظیم­کننده­های رشدی، ریز نمونه، نور و دما، دمای همکشتی، آنتی­بیوتیک و  تیمار ایجاد زخم در بافت هدف (Tohidfar et al., 2010). از دیگر روش­های انتقال ژن به پنبه، استفاده از تفنگ ژنی است که اولین بار توسط Finer and McMullen (1990) با 7/0 درصد کارایی گزارش شد. در این گزارش از کالوس­های جنین­زا برای انتقال ژن استفاده شد. در مقابل این تحقیق، گزارش دیگری با کارایی انتقال 4 درصد نیز وجود دارد (Rajasekaran et al., 2000). به همین دلیل پلاستید، مریستم شاخه و محور جنینی نیز مورد استفاده قرار گرفته­اند (Rech et al., 2008; Liu et al., 2011; Kumar et al., 2004). از آنجا که روش­های یاد شده مستلزم بهینه­سازی رشد و باززایی گیاه در شرایط درون شیشه هستند، روش انتقال In planta نیز مورد استفاده قرار گرفت. این روش شامل معرفی ژن خارجی/هترولوگ به بذر/گیاه به کمک روش­های فیزیکی یا زیستی و به دنبال آن بازیابی گیاه بدون استفاده از روش­های کشت بافت است که مشتمل بر سه روش انتقال 1) بواسطه لوله گرده، 2) بواسطه گرده و 3) مریستم است (Juturu et al., 2015). میزان کارایی انتقال با روش In planta تحت تاثیر عوامل مختلفی قرار می­گیرد که از 05/0 درصد تا 5 درصد گزارش شده است (Chen et al., 2010).

با وجودی­که پیشرفت­های زیادی در زمینه انتقال ژن پنبه صورت گرفته است اما برخی از موانع هنوز بر سر راه انتقال ژن به پنبه وجود دارند که از مهمترین آنها می­توان به وابسته بودن کشت بافت گیاه پنبه به ژنوتیب اشاره کرد. کشت بافت پنبه از دو طریق جنین­زایی رویشی و اندام زایی انجام می­شود که البته روش اول بیشتر استفاده می­شود (Tohidfar et al., 2010). در جنین­زایی رویشی از بافت­هایی مانند ساقه، برگ، ریشه و گلبرگ­ها به عنوان اندام­های بالغ و کوتیلدون، هیپوکوتیل و مریستم ساقه به عنوان اندام­های نابالغ استفاده شده است. بطور کلی ریزنمونه­هایی که دارای محتوای اکسینی بیشتری هستند برای جنین­زایی رویشی مناسب­تر هستند (Jime´nez & Thomas, 2006). مهمترین عاملی که جنین­زایی رویشی در پنبه را تحت تاثیر قرار می­دهد، ژنوتیپ است. مطالعات انجام شده روی محتوای فنولیک کشت­های سوسپانسونی به منظور ایجاد جنین­های رویشی در دو کولتیوار کوکر 312 و R405-2000 نشان داد که کولتیوار R405-2000 در مقابل کوکر یک کولتیوار غیرجنین­زا است و القای جنین­زایی در کوکر به شدت به داشتن محتوای بیشتر از کافئیک، فرولیک اسید و اسید سالسیلیک وابسته است، ضمن اینکه ژن­هایی هم وجود دارند که در جنین­زایی نقش دارند (Kouakou et al., 2007). وابستگی به ژنوتیپ، داشتن تنوع سوماکلونال (Jin et al., 2008) و طولانی بودن زمان جنین­زایی رویشی، موانع موجود در کاربرد این روش در برنامه­های مهندسی ژنتیک پنبه هستند (Juturu et al., 2015). به همین دلیل تلاش­هایی به منظور ایجاد یک روش باززایی مستقیم صورت گرفت که در آن از ریزنمونه­هایی مانند نوک مریستم، گره کوتیلدون، هیپوکوتیل، محورهای جنینی، قطعاتی از اپیکوتیل و کوتیلدون استفاده می­شود. این مقاله ضمن مرور پیشرفت­ها و تلاش­های صورت گرفته در زمینه اصلاح پنبه با کمک روش­های مهندسی ژنتیک، به بحث در خصوص چشم انداز مورد انتظار در این حوزه می­پردازد.

پنبه مقاوم به حشرات

تلاش­های بسیاری جهت انتقال ژن مقاومت به حشرات از منابع مختلف به پنبه صورت گرفته است (Lycett & Grierson, 1990). انواع پروتئین­های Bt برگرفته از باکتری Bacillus thuringiensis که برای راسته­های لپیدوپترا (Cohen et al., 2000)، دیپترا (Andrews et al., 1987) و کلوئپترا (Krieg et al., 1983) کار گرفته می­شود، به پنبه منتقل شده­اند. در حال حاضر، 24 میلیون هکتار سطح زیر کشت پنبه در سراسر دنیا به پنبه تراریخته اختصاص دارد که معادل 78 درصد سطح کل زیر کشت پنبه است و انتظار می­رود در سال­های آینده میزان آن افزایش یابد (James, 2015).

موفقیت­های چشمگیر زمانی ایجاد شد که تغییراتی در ژن­های Bt جهت بیان بهتر در گیاه ایجاد شد (Perlak et al., 1991). انتقال ژن cry1Ac به پنبه باعث مقاومت بیشتر به حشرات راسته لپیدوپترا مثل کرم غوزه شد. آزمایشات مزرعه­ای این گیاهان نشان داد که آنها به کرم صورتی غوزه (Pectinophora  zea) نیز مقاومت بسیار خوبی دارند (Perlak et al., 1990). گزارش­های متعددی نیز از انتقال ژن cry1Ab به پنبه با روش آگروباکتریوم وجود دارد (Tohidfar et al., 2008; Khan et al., 2013). همکشتی کالوس جنین­زا با سویه آگروباکتریوم حاوی ژن cry1Ia5 نیز گزارش شده است (Leelavathi et al., 2004). گیاهان پنبه مقاوم بهH. armigera  نیز با انتقال ژن­های cry1Ac و API-B ایجاد شده­اند که در واکنش­های زیست­سنجی مقاومت بالایی به کرم غوزه نشان داد­ه­اند (Wu et al., 2005). یک کولتیوار پاکستانی نیز با انتقال ژن­های GNA و cry1Ac به آفات جونده و مکنده مقاوم شده است (Hussain et al., 2007). کارایی حشره­کشی پروتئین cry1F بوسیله آزمایش­های مزرعه­ای پنبه­های تراریخته حاوی ژن در کنترل آفت Spodoptera frugiperda نشان داده شده است (Siebert et al., 2008). به منظور ایجاد مقاومت طولانی مدت به آفات مورد هدف، ژن­های cry1C و cry2Aبطور همزمان به پنبه (رقم CIM-482) توسط روش آگروباکتریوم منتقل شدند (Rashid et al., 2008). لاین­های تراریخته باعث مرگ و میر آفت (شکل 1) از 75 تا 100 درصد در مقایسه با شاهد شدند. زمانیکه این گیاهان تحت آزمایش­های مزرعه­ای بیشتر قرار گرفتند، نتایج نشان داد که عملکرد بالایی در نقاط مختلف دارند (Bakhsh et al., 2009). مقایسه پنبه­های تراریخته دارای ژن مقاومت به حشره تحت کنترل پیشبرهای 35S CaMV و RbcS نشان داد که پنبه­های دارای پیشبر بافت اختصاصی، ژن مقاومت را به طور دایم در برگها بیان می­کنند (Bakhshet al., 2010). با وجودی­که پبشبر دایمی 35S یک پیشبر قوی برای بیان ژنهای مورد نظر در گیاه تراریخته محسوب می­شود، اما بیان همیشگی ژن مورد نظر در گیاه می­تواند باعث ایجاد اختلالاتی در رشد و نمو و یا توان متابولیکی گیاه شود (Hood et al., 2003). به همین منظور، کاربرد عوامل تنظیمی که بیان ژن را به طور اختصاصی در بافت­های مورد هدف یا مراحل رشدی خاص تضمین کنند، همواره مطلوب بوده است (Song et al., 2000). شناسایی پیشبر ژن Gh-1 (965 جفت باز بالادست محل شروع رونویسی) (John & Crow, 1992)، E6 (Dang et al., 1995)، FbL2A  (3/2 کیلوباز) ( Rinehart et al., 1996) و شش ژن مخصوص مراحل مختلف رشدی الیاف (Chen & Brucke, 2015) از جمله تلاش­هایی هستند که برای معرفی پیشبرهای مختص الیاف پنبه صورت گرفته است. جداسازی پیشبر مختص بذر FAD2-1 نشان داد که در این گونه پیشبرهای اختصاصی، حضور عناصر تنظیمی Cis مختص اندوسپرم یا بذر و یا نواحی 5ʹUTR بر کارایی پیشبر تاثیر دارند (Liu et al., 2015).

شکل 1- کارایی ژنهای مقاومت به حشره در پنبه تراربخته. الف) لارو زنده Helicoverpa حال تغذیه از برگ پنبه غیر تراریخته. ب) مرگ لارو پس از  تغذیه از پنبه تراریخته(Bakhsh et al., 2009). 

Figure 1- The efficiency of insect resistance genes in transgenic cotton. A) Alive Helicoverpa feeding from non-transgenic cotton, B) Dead Helicoverpa after feeding from transgenic cotton.

راهکارهای مختلفی جهت مقابله با توسعه مقاومت در حشرات پیشنهاد شده است از جمله بیان غلظت­های بالا از پروتئین­های مختلف Bt (Gryspeirt & Gre´goire, 2012 Tohidfar & Jafari, 2007;) و استفاده از پروتئین Bt متصل شده به لکتین جهت افزایش قابلیت اتصال پروتئین در قسمت میانی مجرای هاضمه حشره (Mehlo et al., 2005). محققان پیشنهاد می­دهند که استفاده از تک پروتئین Bt می­تواند باعث ایجاد مقاومت نسبی در حشرات مورد هدف شود. علاوه بر روش هرم­بندی ژن­ها و راهکار پناهگاه، انتقال ژن Cry1Ac-RB به کلروپلاست که برای بیان موضعی ژن­ها بکار می­رود، توانست مانع ایجاد مقاومت در حشرات شود (Kiani et al., 2013).

علاوه بر کرم غوزه پنبه، حشرات مکنده از خانواده همیپترا مانند زنجره ، مگس سفید و شته­ها نیز جزو آفات ثانویه پنبه محسوب شده و باعث ایجاد خسارت به آن می­شوند (Amudha et al., 2011). این حشرات در مقایسه با خانواده لپیدوپترا سریع تکثیر شده و عادات غذایی متفاوتی دارند، بنابراین سخت­تر بوسیله حشره­کش­های سنتی کنترل می­شوند. ژن­های Bt علیه این دسته از حشرات موثر نیستند. گیاهان بطور طبیعی با سنتز پروتئین­هایی مانند لکتین یا ممانعت­کننده­های پروتئازی با این آفات مقابله می­کنند (Yarasi et al., 2008). مکانسیم عملکرد لکتین و ممانعت کننده­های پروتئازی بخوبی مطالعه شده است (Vasconcelos & Oliveira, 2004). ژن­های لکتین گیاهی با موفقیت به پنبه منتقل شده  (Yarasi et al., 2008) و کارایی آنها به خوبی به اثبات رسیده است (Vajhalal et al., 2013).

علاوه بر روش­های رایج ایجاد مقاومت در گیاهان ، فناوری RNAi نیز در پنبه به خدمت گرفته شده است تا خصوصا در برابر آفات حشره­ای مقاومت ایجاد کند (Price and Gatehouse 2008). این تکنیک که اولین بار در elegans Caenorhabditis شناسایی شد، به خوبی برای خاموش سازی ژن­ها استفاده شده است (Fire et al., 1998). ژن­های حشرات مختلف بوسیله تغذیه از گیاهان حاوی dsRNA از حشرات همینوپترا (Lynch & Desplan, 2006)، کلوئپترا (Tomoyasu et al., 2008)، دیپترا ((Dzitoyeva et al., 2001) و لپیدوپترا (Terenius et al., 2011) خاموش شدند. تعداد زیادی از کولتیوارهای پنبه در اندامهای هوایی و ریشه گاسیپول تولید می­کنند که در نهایت تبدیل به ماده سمی آرسنال می­شود. بسیاری از حشرات قادر به  هضم اینگونه متابولیت­های سمی که گیاه برای دفع آفات در خود تولید می­کند، هستند.  ژن P450 (CYP6AE14)  نیز در Helicoverpa armigera بواسطه تولید گاسیپول در بدن حشره القا ­می­شود و با رشد حشره رابطه مستقیم دارد که در زمان تغذیه حشره به آن کمک می­کند تا سمیت گاسیپول را خنثی کند. فناوری siRNA جهت خاموش­سازی این ژن به منظور ایجاد مقاومت به Helicoverpa armigera در پنبه استفاده شده است (Mao et al., 2011). زمانیکه لاروهای این حشره از گیاهان تراریخته کهdsRNA  را علیه CYP6AE14  تولید می­کردند، تغذیه کردند؛ بیان ژن CYP6AE14 در حشرات کاهش یافت. این روش در مراحل ابتدایی خود بوده و در نقاط مختلف دنیا تحقیقات در این زمینه با هدف استفاده تجاری از آن در حال انجام است.

پنبه مقاوم به علفکش

خسارت ناشی از حمله علف­های هرز به مزارع پنبه می­تواند از 45 تا 85 درصد کاهش عملکرد را موجب شود (Nalini et al., 2015). مدیریت علف­های هرز با شروع تجاری­سازی محصولات تراریخته مقاوم به علفکش مانند پنبه، ذرت، سویا و کلزا بسیار آسان شده است. بهبود مدیریت علف­های هرز باعث افزایش عملکرد می­شود (Green 2012). ژن EPSPS جداشده از سویه CP4 آگروباکتریوم که مسئول مقاومت در برابر علفکش است با موفقیت به پنبه و چند گیاه دیگر منتقل شده است.  گلایفوسیت ماده موثره رانداپ است که از فعالیت EPSP سنتتاز جلوگیری می­کند. این آنزیم در مسیر شیکیمات و ساخت اسیدآمینه­های آروماتیک نقش دارد. سویه CP4 آگروباکتریوم آنزیم مقاومت به گلایفوسیت را کد می­کند (Pollegioni et al., 2011). اولین پنبه مقاوم به علفکش با انتقال این ژن با نام MON 1445/1698 توسط شرکت مونسانتو در سال 1997 ایجاد شد که به گلایفوسیت مقاومت دارد. بعد از آن، انتقال ژن به پنبه با سرعت بیشتری انجام شد (جدول 1).

یک رقم چینی پنبه (Zhongmian 35) با انتقال ژن کدکننده مقاومت به گلایفوسیت (aroA-M1) که به آن پپتید نشانه کلروپلاستی متصل شده بود، تحت پیشبر CamV 35S  تراریخته شد و کارآیی آن در نسل های T0 و T1 بررسی شد که نسبت به علفکش مقاومت بهتری از خود نشان دادند (Zhao et al., 2006). پنبه تراریخته تجاری با نام Roundup Ready Flex دارای ژن epsps پس از 8 سال تحقیقات مزرعه­ای با انتخاب رخداد MON 88913 توسط مونسانتو روانه بازار شد. اخیرا یک رقم محلی پنبه که دارای ژنهای cry1AC و cry2A بود با ژن epsps که ترجیح کدونی آن بهینه شده، تراریخته شد (Latif et al., 2015).

کارایی این ژن پس از اسپری گلایفوسیت بر لاین­های تراریخته 41 درصد و کارایی ژنهای مقاومت به حشره 100 درصد گزارش شد. میزان پذیرش گیاهان مقاوم به علفکش تا کنون رشد مثبتی  داشته است (10 درصد).

جدول 1- کولتیوارهای پنبه تراریخته مقاوم به علفکش که تجاری­سازی شده­اند و در حال کشت هستند.

Table 1- Commercialized herbicide resistant cotton cultivars which are under cultivation.

منتقدین این فناوری اظهار می­دارند که استفاده از گیاهان مقاوم به علفکش تنها برای زراعت­های در مقیاس انبوه مناسب است، درحالی­که استفاده این گیاهان توسط کشاورزان خرده پا نیز به علت افزایش عملکرد محصول و تسهیل عملیات مدیریت علف­های هرز  باعث سودآوری بالایی شده است (Green, 2012). علاوه براین، بسیاری از تحقیقات نشان داده است که محصولات تراریخته مقاوم به علفکش در کنترل علف­های هرز بسیار کارآمد بوده و ضمن ایمن بودن، برای محیط زیست تهدیدی به حساب نمی­آیند (Entine, 2006; Duke 2011).

پنبه مقاوم به پژمردگی

پنبه به تعداد کمی از بیماری­های قارچی حساس است که در بین آنها پژمردگی فوزاریومی و ورتیسیلیومی از همه مهمتر هستند. عامل بیماری پژمردگی فوزاریومی قارچ Fusarium oxysporum  است درحالی­که پژمردگی ورتیسیلیومی توسط قارچ Verticillium dahlia  ایجاد می­شود. بیشتر کولتیوارهای پنبه (آپلند) به V. dahlia حساس هستند و تلاش­های انجام شده برای اصلاح ارقام موجود موفق نبوده است. قارچ ورتیسیلیوم برای مدت طولانی در خاک به صورت میکرواسکلروتیا باقی می­ماند. علایم اندام هوایی به صورت کلروز یا نکروز سیستم آوندی است و زمانیکه بیماری پیشرفت می­کند گیاه دچار خزان می­شود و غوزه­های جوان نیز ممکن است ریزش پیدا کنند (Miao et al., 2010). این بیماری گاهی می­تواند باعث از بین رفتن 80 درصد از عملکرد الیاف پنبه شود (Wei et al., 2015). انتقال ژنهای مقاومت به ارقام پنبه از طریق روش­های سنتی بسیار زمانبر بوده و امکان تولید ارقام مقاوم به ورتیسیلیوم حاصل از تلاقی­های درون گونه­ای که قابلیت تجاری­سازی داشته باشند، مشکل است (Borole, 2000). علاوه بر این،  از نشانگر های مولکولی هم در راستای شناسایی ژن های مقاومت به بیماری قارچی  استفاده شده است (Najafzadeh et al., 2016). محققین تلاش­های زیادی را جهت انتقال ژن­های مقاومت به ورتیسیلیوم به پنبه انجام داده­اند (جدول 2). گیاهان تراریخته سطوح متغیری از مقاومت کم تا مقاومت کامل را در برابر رشد ورتیسیلیوم نشان داده­اند (شکل 2) (Tohidfar et al., 2005; Tohidfar et al., 2008; Tohidfar et al., 2009; Rajasekaran et al., 2005). برخی نیز در شرایط مزرعه­ای نسبت به این بیماری افزایش مقاومت داشتند (Miao et al., 2010). گزارشاتی نیز در مورد پنبه مقاوم به فوزاریوم و آلترناریا وجود دارد (Ganesan et al., 2009). انتقال ژنNaD1  از تنباکو به پنبه، به عنوان ژنی که پتانسیل ضد قارچی علیه  Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum (Fov)  و V. dahlia دارد؛ باعث شد پنبه­های تراریخته در مزرعه آلوده به این دو قارچ 2 تا 3 برابر درصد زنده­مانی بالاتر و 2 تا 4 برابر عملکرد الیاف بیشتر نسبت به کنترل داشته باشند (Gaspar et al., 2014).

از آنجا که مبارزه با V. dahlia سخت است، جهت کنترل این بیماری به ارقامی از پنبه نیاز است که مقاومت گسترده­ای نسبت به این بیماری نشان دهند. پروتئین­های GAFPs[1] که از گیاه دارویی Gastrodia elata جدا شده­اند مقاومت بالایی را به انواع V. dahlia نشان داده­اند (Wang et al., 2016). انتقال دو ژن متفاوت از این خانواده ژنی به ارقام پنبه منجر به تولید گیاهان تراریخته­ای شد که عملکرد تولید الیاف پنبه در آنها به 40 تا 50 درصد افزایش یافت (Wang et al., 2016).

پنبه مقاوم به ویروس

ویروس پیچیدگی برگ پنبه (CLCuD[2]) یکی از مهمترین مشکلات تولید پنبه محسوب می­شود. زمانیکه بیماری اوایل فصل رشد شایع شود و یا ارقام حساس را آلوده کند، می­تواند تا 20 درصد تولید را  کاهش دهد. این ویروس بوسیله مگس سفید منتقل می­شود و از اعضای خانواده Geminiviridae است. جیمنی­ویروس­ها بیشتر در مناطق گرمسیر باعث خسارت می­شوند. ژنوم جیمنی­ویروس­ها ممکن است یک یا دو قسمتی باشد که وجود DNA b از ژنوم تک قسمتی برای آلودگی ویروسی ضروری است (Mahmood-ur-Rahman et al., 2012). پنبه­هایی که با این ویروس آلوده شده­اند دارای DNA A و یک ماهواره تک­رشته­ای از مولکول DNA با نام DNA b (1350 نوکلئوتید) هستند که با هم علایم تیپیک بیماری CLCuD را سبب می­شوند (Briddon & Markham, 2000).

شکل 2- مقایسه مقاومت پنبه تراریخته دارای ژن کیتیناز لوبیا با شاهد نسبت به بیماری قارچی ورتیسیلیوم. الف) علایم بیماری در گیاه شاهد ایجاد شد، ب) برش افقی از ساقه گیاهان تراریخته و شاهد پنبه پس از تیمار با عامل بیماری a- ساقه پنبه غیرتراریخته تزریق شده با آب، b- ساقه پنبه تراریخته تزریق شده با کنیدی­های V. dahlia که سالم مانده، ساقه پنبه غیرتراریخته تزریق شده با کنیدی­های V. dahlia  که علایم بیماری به شکل قهوه­ای شدن آوندها در آن ظاهر شده است (Tohidfar et al., 2012)

Figure 2- Transgenic cotton harboring endochitinase Gene from Phaseolus vulgaris resistant to V. dahlia. A) Symptoms of disease are observed in non-transgenic cotton. B) Horizontal cut from transgenic and control cotton stem: a- non-transgenic cotton stem injected with water, b- transgenic cotton stem injected with V. dahlia conidia which remained natural, c- non-transgenic cotton stem injected with V. dahlia conidia which showed symptom of brown vascular discoloration.

تولید پنبه تراریخته مقاوم به CLCuD می­تواند راهکار مناسبی برای مدیریت این بیماری محسوب شود. پنبه تراریخته مقاوم به CLCuD از دو روش انجام شده است: انتقال ژن مقاومت به ویروس که از خود ویروس برگرفته باشد یا از منبع دیگر. در روش ایجاد مقاومت به  بیمارگر، تمام یا قسمتی از ژن بیماریزا به گیاه منتقل می­شود. بنابراین، چون این RNA­ها مکمل ژنوم ویروس هستند باعث اختلال در فعالیت آن و در نهایت خاموشی آن می­شوند. در مورد بگوموویروس­ها بیان ژن پروتئین پوششی (Neves-Borges et al., 2001)، رپلیکاز (Yang et al., 2004) و یا پروتئین حرکتی موفقیت­آمیز بوده است.

جدول 2- انتقال ژنهای مختلف به پنبه جهت تولید کولتیوارهای مقاوم به بیماری ورتیسیلیوم.

Table 2- Introduction of different genes to cotton against Verticillium.

استفاده از ژن پروتئین پوششی، اولین و گسترده­ترین ژنی است که در ایجاد مقاومت به ویروس استفاده می­شود (Prins, 2003).

پنبه مقاوم به CLCuD با استفاده از پروتئین آنتی­سنس پوششی (ACP[3]) ایجاد شده است (Amudha et al., 2011). در این روش یک ناقل دوگانه حامل ژن ACP و npt II برای تراریختی استفاده شد. گیاهان تراریخته به صورت مجزا در گلخانه کشت شدند و به کمک مگس سفید به ویروس CLCuD آلوده شدند و مقاومت آنها نسبت به این بیماری بررسی شد (شکل 3). نتایج نشان داد این گیاهان با وجودیکه آلوده شده بودند، علایمی از بیماری را نشان ندادند.

شکل 3- مقایسه مقاومت الف) گیاهان مقاوم به ClCuD و ب) شاهد پس از آلوده­سازی گیاهان با این ویروس توسط مگس سفید (Amudha et al., 2011).

Figure 3- Comparison of ClCuD transgenic and control plants’ resistance after being infected through white fly.

پنبه مقاوم به تنش­های غیرزیستی

تنش­های غیرزیستی مانند درجه حرارت­های بالا، کم آبی و شوری رشد و عملکرد گیاهان را تحت تاثیر قرار می­دهند. افزایش بیان ژن­های تکی مانند ژن­های کدکننده آنتی­اکسیدانت­ها، نگهدارنده فشار اسمزی، LEAs، HSPs و ناقلین غشایی و همچنین ژن­های چند عملکردی مانند عوامل رونویسی و پروتئین­کینازها باعث ایجاد گیاهان مقاوم به تنش­های غیرزیستی می­شوند (Allen, 2010). بیان ژن AtNHX1 کدکننده یک آنتی­پورتر آوندی Na⁺/H⁺ در پنبه باعث شد تحمل گیاهان در شرایط گلخانه و مزرعه به شوری افزایش یابد همچنین باعث افزایش در میزان زیست­توده و الیاف در آنها شد (He et al., 2005). بیش­بیان ژن SNAC1 از برنج در کولتیوار YZ-1 پنبه باعث افزایش توسعه ریشه و کاهش میزان رونویسی شد که نتیجه آن تولید گیاهان مقاوم به خشکی و شوری، افزایش زیست­توده و تعداد غوزه در شرایط شوری بود (Lie et al., 2014). بیش­بیان ژن AVP1 از آرابیدوپسیس در پنبه نیز ضمن افزایش مقاومت به خشکی و شوری باعث افزایش عملکرد الیاف تحت شرایط خشکی شد (Zhang et al., 2011). افزایش رشد ریشه و زیست­توده برگ­ها در پنبه به ترتیب به کمک بیش بیان ژن­های At RAV1/2 یا At AB15 از آرابیدوپسیس و Ta MnSOD از گیاه Tamarix albiflonum باعث شد گیاهان تراریخته حاصل به شرایط خشکی مقاومت بیشتری داشته باشند (Mittal et al., 2014; Zhang et al., 2014). گیاهان تراریخته دارای بیش­بیان ژن AtLOS5 از آرابیدوپسیس، 13 درصد وزن خشک بیشتری نسبت به گیاهان کنترل در شرایط خشکی داشتند (Yue et al., 2012). بیان ژن IPT از آگروباکتریوم تحت کنترل پیشبر PSARK نیز باعث افزایش مقاومت به خشکی شد (Kuppu et al., 2013). بیان ژن AnnBj1 از گیاه خردل نیز باعث افزایش مقاومت به پراکسید هیدروژن، سدیم کلراید شده و همچنین تعداد غوزه و محتوای سلولزی الیاف پنبه تحت تنش شوری زیاد شد (Divya et al., 2010). باوجود رهاسازی ذرت متحمل به خشکی هنوز هیچ رخدادی از پنبه که مقاوم به تنش غیرزیستی باشد، تجاری­سازی نشده است. انتظار می­رود تحقیقات در زمینه مهندسی ژنتیک پنبه نیز بر تولید رخدادهای مقاوم به تنش­های غیرزیستی متمرکز شود.

افزایش محتوای الیاف پنبه

ویژگی­ها و کیفیت الیاف پنبه که شامل طول، استقامت و رسیدگی الیاف هستند در صنعت نساجی بسیار مهم هستند (Chee & Campbell, 2009). مهندسی ژنتیک ژن­های مرتبط با الیاف در پنبه گزارش شده است که در آن طول، استحکام، کیفیت، رنگ و ویژگی­های مرتبط با الیاف بهبود یافته­اند (Richter, 1998; May & Wofford, 2000; Zhang et al., 2004; Li et al., 2004; Shangguan et al., 2007; Qin et al., 2007).

انتقال ژن­های مسئول سنتز سلولز (acsA و acsB) از باکتری گرم منفی Acetobacter xylinum به پنبه باعث بهبود کیفیت الیاف شد (Li et al., 2004). پروتئین فیبریون از کرم ابریشم نیز برای بهبود کیفیت الیاف استفاده شده است. ساختار کریستالین ویژه­ای که این پروتئین دارد باعث اعطای خاصیت کشسانی و نرمی به بافت پنبه می­شود (Chen et al., 2003). ژن این پروتئین به پنبه منتقل شد که باعث بهبود کیفیت خصوصیات الیاف شد (Li et al., 2009). انتقال یک ژن مرتبط با سنتز الیاف از منبع Calotropis procera به یک کولتیوار محلی از پنبه، باعث افزایش ظرافت و استحکام الیاف در مقایسه با رقم کنترل شد (Bajwa et al., 2013). 

بهبود کیفیت روغن پنبه

پنبه به طور طبیعی دارای تعدادی از سزکویی­ترپن­ها شامل گاسیپول در قسمت­های اندام هوایی و سلول­های اپیدرمی ریشه است (Bell, 1986). وجود این ماده در اندام­های هوایی به عنوان یک سد دفاعی در برابر حشرات است. اما حضور گاسیپول در بذور پنبه باعث می­شود تا از ارزش این بذر به عنوان یک محصول جانبی برای تغذیه دام کاسته شود. تلاش­های زیادی صورت گرفته است تا مسیرهای سنتز گاسیپول و سایر ترپن­ها شناخته شوند. اولین مرحله در سنتز سزکویی­ترپنها ساخت گاما-کادینین (δ-cadinene) است که حاصل فعالیت کاتالیکی بتاکادینین سیکلاز بر فارنسیل دی سولفید است. از آنجا که (+)-گاما-کادینین مهمترین ماده حدواسط در سنتز گاسیپول است، محققین تلاش کردند با کمک روش RNAi میزان این ماده را در بذر پنبه کاهش دهند، بدون اینکه میزان آن در سایر اندام­ها کاهش یابد. در ابتدا کاهش سنتز گاسیپول با کمک روش RNAi زیاد موفق نبود (Townsend et al., 2005)، اما بعدها با شناسایی یک پیشبر اختصاصی دانه (آلفا-گلوبولین) تعدادی لاین­های تراریخته پنبه ایجاد شدند که سطح گاسیپول به طور معنی­داری در آنها کاهش یافت (Sunilkumar et al., 2006). از آنجا که پیشبر اختصاصی دانه در این تحقیق استفاده شده بود، سطح گاسیپول در سایر اندام­های هوایی یا ریشه که در دفاع علیه بیماری­ها و حشرات نقش دارد، کاهش نیافت. بر اساس این نتایج، بعدها پنبه تراریخته­ای ایجاد شد که سطح گاسیپول بذور نه تنها نسبت به کنترل بسیار کاهش یافته بود بلکه سایر محتویات بذری هیچ تغییری نداشتند (Palle et al., 2013) که این نتایج توانایی روش RNAi را برای تولیدات تجاری نشان می­دهد.

استفاده از روش­های نوین اصلاح ژنوم

ویرایش ژنوم[4] با اندونوکلئازهای اختصاصی، امکان انجام ژنتیک معکوس، مهندسی ژنوم و انتقال ژن به صورت هدفمند را با کارایی بالا فراهم ساخته است. ویرایش ژنوم شامل ایجاد یک شکست در DNA دورشته­ای بواسطه یک نوکلئاز مهندسی شده است که در نتیجه آن واکنش­های سلولی ترمیم DNA فعال می­شوند.تغییراتی که در ژنوم ایجاد می­شوند بسته به مسیر ترمیمی که در سلول فعال شده است و حضور یا عدم حضور یک الگو برای ترمیم DNA متفاوت خواهند بود (Bortesi & Fischer, 2015). سه نوع آنزیمی که برای ایجاد شکست در DNA دورشته­ای بکار می­روند عبارتند از: انگشت روی (ZFNs[5])، TALENs[6] و مگانوکلئازها (Epinat et al., 2003). انگشت روی شامل یک ناحیه متصل­شونده به DNA و ناحیه کاتالیتیکی FokI است. ناحیه متصل­شونده به DNA دارای سه تا پنج انگشت روی است که هریک سه نوکلئوتید را شناسایی می­کنند.

شامل یک ناحیه متصل­شونده به DNA است که از دست­ورزی TALE بدست آمده و نیز دارای ناحیه کاتالیتیکی FokI است (Cermak et al., 2011). پروتئین­های[7]TAL در واقع فاکتورهای بیماریزا در باکتری زانتاموناس هستند که طی سیستم ترشحی نوع III وارد گیاه میزبان شده و رونویسی از ژنهای گیاهی را به نفع باکتری تغییر می­دهند. هر  TAL دارای یک ناحیه فعال و در پایانه C دارای سیگنال مکان­یابی هسته ([8]NLS) است. ناحیه فعال در قسمت میانی خود دارای تکرارهایی حفاظت شده از 34 اسیدآمینه است که البته اسیدآمینه­های 12 و 13 در آن متغیر بوده و به ناحیه RVD[9] معروف است. ناحیه RVD مسوول تشخیص و اتصال به DNA هستند. هر تکرار TALE به یک نوکلئوتید متصل می­شود و هر واحد حدود 17 بار تکرار می­شود. از آنجا که آنزیم FokI تنها زمانیکه به صورت دایمر باشد DNA را برش می­دهد این نکته در کاربرد TALENs و ZFNs لحاظ می­شود (شکل 4). سومین دسته از آنزیم­ها که در ایجاد شکست در DNA دورشته­ای به کار می­روند، مگاآنزیم­ها هستند. از آنجا که ناحیه متصل­شونده به DNA متصل به ناحیه کاتالیتیکی بوده و از آن جدا نمی­شود، مهندسی این دسته از آنزیم­ها در مقایسه با TALENs و ZFNs مشکل­تر است (Taylor et al., 2012). مگانوکلئازها تکرارهای بلند 20 تا 30 نوکلئوتیدی را شناسایی می­کنند. اخیرا از نوکلئازهای مهندسی­شده که بوسیله RNA هدایت می­شوند، استفاده می­شود که رایجترین آنها سیستم CRISPR/Cas9 برگرفته از Streptococcus pyogenes است. این سیستم بخشی از سیستم ایمنی باکتری و آرکی­هاست که آنها را با برشی که در قطعات نوکلئیک اسید ایجاد می­کند، در برابر ویروس­ها حفاظت می­کند. این سیستم با تلفیق قطعاتی از DNA مهاجم (ویروس) به درون ژنوم میزبان (باکتری/ آرکی) در مکان ژنی CRISPR ایجاد می­شود. زمانیکه باکتری با ویروس مهاجم روبرو می­شود؛ قطعات CRISPR رونویسی و پس از ویرایش به قطعات کوچکتری که CRISPR RNA (crRNAs) نامیده می­شوند، تبدیل می­شوند که طول آنها حدودا 40 نوکلئوتید است. این قطعات در نتیجه انجام نسخه­برداری از مکان ژنی CRISPR و ایجاد یک توالی RNA تک رشته‌ای به هم پیوسته از توالی‌های تکراری (حاوی نواحی پالیندرومیک) و توالی‌های spacer غیرتکراری ایجاد می‌شود. به طوری که نواحی پالیندرومیک ساختار ساقه-حلقه یا pre-crRNA یا CRISPR RNA اولیه را تشکیل می‌دهند. در نهایت پردازش crRNA اولیه (CRISPR RNA processing) توسط نوکلئازی پروتئین‌های Cas انجام گرفته و crRNAهای بالغ را ایجاد میکند. این قطعات در ترکیب با transactivating CRISPR RNA (tracrRNA) باعث فعالسازی و هدایت نوکلئاز Cas9 می­شوند. در نهایت، این مجموعه باعث شکست DNA می­شود. لازمه شکسته شدن DNA توسط  CRISPR حضور موتیف PAM[10] در پایین دست DNA هدف[11] در ژنوم میزبان است که معمولا یک توالی 5'-NGG-3' یا NAG است (Gasiunas et al., 2012). وجود یک هسته نوکلئوتیدی 12 جفت بازی در بالادست PAM باعث اتصال اختصاصی DNA هدف و RNA راهبر[12] می­شود (شکل 5). می­توان Cas9 را طوری طراحی کرد که DNA را تنها به کمک یک RNA راهبر بشکند. RNA راهبر از ترکیب انتهای 3ʹ crRNA و انتهای 5ʹ tracrRNA بدست می­آید. پس از ایجاد شکست، مکانیسم­های ترمیم سلولی فعال می­شوند که معمولا از نوع نوترکیبی غیرهمولوگ (NHR[13]) هستند. NHR معمولا دقیق نبوده و با حذف و اضافه کردن تصادفی نوکلئوتیدها همراه است و در نتیجه باعث غیرفعال شدن ژن شکسته­شده می­شود. چنانچه هنگام تعمیر؛ الگوی همولوگ با DNA شکسته شده وجود داشته باشد، مکانیسم تعمیر بر اساس نوترکیبی همولوگ (HR) خواهد بود که بسیار دقیق است. تلفیق دو ژن مقاومت به علفکش (epsps,[14] hppd) کنار مکان ژنی مقاومت به حشره (cry2Ae) در پنبه به کمک روش CRISPR انجام شده است (D’Halluin et al., 2013). به این منظور، ژنوم پنبه به طول 2/5 کیلوباز بالادست این مکان ژنی مورد بررسی قرار گرفت که بر اساس آن چهار سایت هدف احتمالی برای تولید آنزیم­های مگانوکلئاز انتخاب شدند. با وجودیکه هر چهار آنزیم در شرایط in vitro ژنوم را در جایگاه­های مورد نظر برش دادند، اما تنها یکی از آنها توانست عمل برش را در شرایط in planta انجام دهد. تلفیق این دو ژن بطور هدفمند به جایگاه مورد نظر به کمک مکانیسم HR انجام شد و وراثت­پذیری آنها به تایید رسید. تلفیق ژنهای مختلف در یک جایگاه کروموزومی داخل ژنوم پنبه که از جمله گیاهانی است که به سختی تراریخته می شود، کاری سخت و زمانبر است. با این وجود، استفاده از روش­هایی مانند ناقل­های چند ژنی یا انتقال چند ناقل به طور همزمان که هر یک دارای یک ژن هدف هستند، به منظور تولید پنبه تراریخته چند صفتی[15] رواج یافته است. در روش استفاده از ناقل­های حاوی دو ژن، آنالیز نتاج به منظور یافتن گیاهانی که دارای یک کپی از ژنهای انتقال یافته بوده و به خوبی هم بیان شوند، کاری بسیار زمانبر است. زمانیکه ژنها پشت سر هم منتقل می­شوند به علت تداخل­هایی که حین رونویسی با یکدیگر ممکن است پیدا کنند؛ بیان آنها تحت تاثیر یکدیگر قرار می­گیرد (Eszterhas et al., 2002). با کاربرد ناقل­هایی که دارای چند کاست ژنی هستند نیز احتمال انتخاب یک رخداد که دارای تمامی ژنها باشد، کاهش پیدا می­کند، چرا که با افزایش تعداد ترانسژن­ها، بیان هر ژن و کارایی هر صفت کمتر قابل پیش­بینی می­شود (Dietz-Pfeilstetter, 2010). درصورتیکه مزیت استفاده از روشCRISPR  نسبت به روش­های رایج این است که امکان معرفی همزمان ژنهای مختلف را به جایگاه­های کروموزومی مشخص دارد به گونه­ای که هر یک از این ژنها بر روی بیان یکدیگر تاثیری نداشته باشند (D’Halluin et al., 2013).

شکل 4- ساختار TALEN. الف) ساختار .TALE هر TAL دارای یک دومین فعال و در پایانه C دارای سیگنال مکان­یابی هسته است. دومین فعال در قسمت میانی خود دارای تکرارهایی حفاظت شده از 34 اسیدآمینه است که البته اسیدآمینه­های 12 و 13 در آن متغیر بوده و به ناحیه RVD معروف است. ناحیه RVD مسوول تشخیص و اتصال به اسیدهای نوکلئیک در DNA هستند. هر تکرار TALE به یک نوکلئوتید متصل می­شود و هر واحد 17 بار تکرار می­شود. ب) نحوه اتصال TALEN به توالی DNA. آنزیم FolkI تنها زمانیکه به صورت دایمر باشد DNA را برش می­دهد. درنتیجه هنگام کاربرد TALENs از دو واحد TALEN استفاده می­شود که هریک به یکی از رشته­های DNA متصل می­شوند.

Figure 4- TALEN structure. A) Each TALE have an active domain and NLS in its C-terminal. The active domain contains tandem repeats of 34 conserved amino acids in its center. However, amino acids of 12 and 13 are variant and called RVD. The RVD is responsible for detecting and attaching to nucleic acids in DNA. Each TALE recognizes one nucleotide. B) TALEN binds to DNA. FolkI enzyme can cleave DNA just in dimer form. Subsequently, two TALENS are used that each of them binds to one DNA strand.

شکل 5- ساختار CRISPR. پروتئین Cas9 (دایره آبی) به همراه crRNA که دارای یک توالی 20 نوکلئوتیدی است که ویژگی آن را تعیین می­کند و tracrRNA که باعث پایداری کل این ساختار و فعالسازی Cas9 برای ایجاد برش می­شود؛ با شناسایی موتیف PAM (NGG یا NAC)، توالی ژنوم بالادست آنرا برش می­دهد.

Figure 5- CRISPR structure. Cas9 protein (blue circle) is guided by crRNA which is a 20bp-long sequence determining target specificity, and tracrRNA which stabilizes the structure and activates Cas9 to cleave the target DNA upstream of PAM motif (NAC or NGG).

تاکنون تلاش­های زیادی در قالب روش­های اصلاح سنتی تا مولکولی صورت گرفته است تا با بیماری ویروسی پنبه  CLCuD مبارزه شود، با این وجود مقاومت یا تحمل به این بیماری در طول زمان بوسیله ویروس شکسته شده است. از طرفی، تمام روش­های بکار رفته جهت مبارزه با بگوموویروسها وابسته به خود ژنوم CLCuD بوده است که در آنها DNA های ماهواره­ای مورد هدف قرار نمی­گیرند. در واقع بیماری CLCuD بوسیله مجموعه­ای از بگوموویروس­ها و مولکول­های ماهواره­ای خاصی (آلفا و بتاماهواره­ها) ایجاد می­شود (Sattar et al., 2013). از بین این دو ماهواره، بتاماهواره تک پروتئین βC1 را کد می­کند که دارای نقش بازدارنگی بر سیستم دفاعی میزبان است (Saeed et al., 2005). به تازگی سیستم CRISPR/Cas9 برای کنترل تعدادی از بیماری­های ویروسی مانند BeYDV (Baltes et al., 2015)،BSCTV (Ji et al., 2015) و TYLCV (Ali et al., 2015) بکار رفته است. به همین جهت، از روش CRISPR به منظور افزایش کارآیی مقابله با بیماری CLCuD استفاده شد که در آن چندین gRNA طراحی شدند تا بطور همزمان امکان هدفگیری نه تنها تمام بگوموویروس­ها بلکه DNA­های ماهواره­ای مرتبط به هم نیز میسر شود (Iqbal et al., 2016). تا کنون سیستم CRISPR برای کنترل این بیماری بکار رفته است اما روش معرفی شده با طراحی چندین gRNA و معرفی آنها به گیاه امکان ایجاد مقاومت به بگوموویروس­های مختلف را بطور همزمان فراهم می­کند.

علاوه بر موارد اشاره شد، مهندسی کلروپلاست یا انتقال ژن به کلروپلاست هم در پنبه در راستای مقاومت به آفت مورد بهره برداری قرار گرفته است.  بطورکلی برای تولید پروتئین‌های نوترکیب در گیاه از روش هسته‌ای و ناقلین ویروسی استفاده می‌شود. استفاده از ناقلین ویروسی بیشتر به‌منظور بیان موقت پروتئین‌های نوترکیب استفاده می‌شود. از طرفی بیان ژن‌های بیگانه در هسته‌ نیز پایین است. اخیراً روش کلروپلاست به‌منظور بیان بیشتر و بالاتر، توسعه یافته است. کلروپلاست نسبت به هسته چندین مزیت منحصر به فرد دارد که شامل: بیان بالای ژن خارجی؛ بیان پلی‌سیسترونی، جلوگیری از فرار ژن به‌ دلیل وجود وراثت مادری (دانه گرده فاقد سیتوپلاسم است)، فقدان خاموشی ژن و اثرات مکانی است. بیان بالای سیستم کلروپلاست را می‌توان به تعداد ژنوم‌های کلروپلاست نسبت داد. به‌طوری‌ که کلروپلاست بالغ دارای تعداد نسخه‌های زیادی (بیشتر از 100 عدد) از ژنوم است. در یک سلول مزوفیل که دارای تقریبا 100 کلروپلاست است، حدود 10 هزار کپی کروموزوم پلاستیدی وجود دارد. در نتیجه مقدار پروتئین بیان شده در اثر وارد‌ کردن یک ژن خارجی در ژنوم کلروپلاستی می‌تواند بسیار بالا باشد. اخیرا دانشمندان با استفاده از مهندسی کلروپلاست توانستند پنبه­های تولید کنند که مقاومت بالایی به کرم غوزه داشته باشند (Amarjeet K S et al 2016). این فناوری در حال حاضر در اول راه است و تاکنون در پنبه تجاری نشده است.

بحث و نتیجه­گیری

محصولات تراریخته ظرفیت قابل توجهی در برطرف­سازی فقر و تامین غذا در دنیا دارند. بررسی اثرات استفاده از پنبه مقاوم به آفت نشان داده است که فواید اقتصادی زیادی را برای کشاورزان و مصرف­کنندگان به همراه داشته است. همچنین اثرات سودمندی را بر سلامت انسان و محیط زیست دارد (Qaim, 2009).  پنبه تراریخته در چین فواید اقتصادی به ارزش بیش از 15 میلیون دلار را بین سال­های 1996 و 2012 ایجاد کرده است. درآمد کشاورزان در هند نیز بین سال­های 2002 تا 2010 با کشت پنبه تراریخته 1/7 میلیون دلار افزایش داشته است (Kouser and Qaim 2012).

با توجه به نقش اقتصادی پنبه در جهان و همچنین دارا بودن رتبه سوم بین گیاهان صنعتی کشور (6/16 درصد از کل سطح زیر کشت گیاهان زراعی)، توسعه برنامه­های اصلاحی برای بهره­برداری بهینه و اقتصادی این محصول از اهمیت ویژه­ای برخوردار است. فرآیند تولید محصول در این گیاه با چالش­های متفاوتی مانند حمله آفات، بیماری­ها، علف­های هرز و تنش­های زیست­محیطی روبرو است. البته، با تلاش­های بیشمار اصلاح­گران سنتی پشرفت­های زیادی در زمینه بهبود عملکرد پنبه ایجاد شده است. با این وجود، تحقیقات در رابطه با اصلاح پنبه به علت عدم وجود منابع ژنتیکی کافی به سمت استفاده از روش­های جدید مهندسی ژنتیک سوق داده شده است. اگرچه، تولید پنبه تراریخته از طریق مهندسی ژنتیک مانند استفاده از آگروباکتریوم یا روش­های انتقال ژن مستقیم نیز دارای مشکلاتی مانند تاثیر ژنوتیپ و فرآیند طولانی مدت باززایی است؛ با این وجود، تولید رخدادهای مقاوم به علفکش و آفت در پنبه به خوبی تاثیر مثبت خود در افزایش تولید را نشان داده­اند. با این حال، استفاده از ژنهای جدید برای تولید پنبه مقاوم به آفت، ایجاد پنبه تراریخته با بیان ژن مختص یک بافت و انتقال ژن به ژنوم پلاستید در این حوزه ضروری به نظر می­رسد. علاوه ­بر این، تولید پنبه تراریخته مقاوم به تنش­های غیرزیستی و الیاف با کیفیت از پیشرفت­های بزرگ در این زمینه به شمار می­روند. در این رابطه، افزایش سطح زیر کشت پنبه­های تراریخته مقاوم به تنش زیستی از مقیاس آزمایشگاهی به طرح پایلوت به منظور ارزیابی ظرفیت آنها در مقابله با تنش­های زیستی بسیار مهم است. این محصولات می­توانند تاثیر بسزایی بر کشاورزی پایدار داشته باشند چراکه خسارت هدر رفت محصول ناشی از تنش­های زیستی بسیار شایع است.

اگر چه از  زمان ظهور این تکنولوژی تا به حال چالش ها و بحث های جنجال برانگیزی  در خصوص جنبه­های اخلاقی و ایمنی  بر علیه آن مطرح شده است ولی هر روز سطح زیر کشت محصولات  ناشی  این فنآوری  در حال افزایش است. بطوریکه سطح زیر کشت محصولات تراریخته از جمله پنبه Bt  نسبت به سال 1996میلادی بی سابقه بوده و موجب شد تا کشت پنبه تراریخته به عنوان سریع ترین فناوری مورد پذیرش در تاریخ اخیر کشاورزی باشد. این امر نشان دهنده اعتماد و اطمینان میلیون­ها کشاورز در سراسر جهان به این فناوری است که به دلیل فواید چندگانه محصولات تراریخته به طور مستمر و در هر سال کشت بیشتر این محصولات را ادامه می­دهند. برای اولین مرتبه، سطح زیر کشت  پنبه تراریخته تقریبا به  74 درصد از  مساحت 33 میلیون هکتاری این محصول در جهان رسید.  در هندوستان در سال 2012 بیش از  هشتاد و هفت  درصد کل محصول پنبه این کشور به پنبه Bt   اختصاص یافته است. جالب توجه این که 13 میلیون نفر از 14 میلیون کشاورزی که از این فناوری بهره­مند می­شوند، از کشاورزان خرده پا و فقیر هستند.  این کشاورزان در حال حاضر از کشت محصولات تراریخته­ای مانند پنبه Bt منتفع می­شوند.

زمانی استفاده از یک تکنولوژی اخلاقی خواهد بود  که بتواند مشکلی را حل نموده و از نظر ایمنی و سلامتی هم مشکلی را ایجاد ننماید. به نظر می رسد جامعه بایستی با نگرش منطقی و علمی نسبت به این فنآوری  قضاوت کند. اگر چه هیچ مدرکی دال بر مضر بودن  پنبه تراریخته Bt برای انسان، موجودات دیگر و محیط زیست تا به حال گزارش نشده است ولی همیشه  آزمایشات اکولوژیکی _ زراعی اساسی ودر سطح وسیع برای ارزیابی اثرات آنها صورت میگیرد تا ایمنی آنها تایید شود.

تاکنون فواید حاصل از تجاری­سازی پنبه­های تراریخته مقاوم به آفت و علفکش به خوبی به اثبات رسیده­اند؛ اکنون نیز انتظار می رود که تولید پنبه­هایی که از روش­های ویرایش ژنوم بدست آمده­اند بتوانند جهش فوق­العاده­ای را در تولید پنبه ایجاد کنند. اخیرا، استفاده از داده­های توالی­یابی نسل سوم به منظور کاندید ژنهای مناسب برای اصلاح صفات زراعی مهم و روشهای ویرایش ژنوم به منظور دست­ورزی اختصاصی ژنها امکانات گسترده­ای را برای اصلاح مولکولی گیاهان فراهم کرده است.