Phylogenetic analysis of new Iranian Fig badnavirus-1 isolates based on their movement protein gene sequence

بررسی فیلوژنتیکی جدایه­های جدید ایرانی ویروس بادنای یک انجیر بر اساس ترادف ژن پروتئین حرکتی

اطهر علی شیری[1]، فرشاد رخشنده رو^*2، غلامرضا صالحی جوزانی³، مسعود شمس بخش⁴

¹دانشجوی دکتری بیماری شناسی گیاهی، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، داﻧﺸﮕﺎه آزاد اﺳﻼﻣﻲ واﺣﺪ ﻋﻠﻮم و ﺗﺤﻘﻴﻘﺎت ﺗﻬﺮان.

 ²اﺳﺘﺎدﻳﺎر ﮔﺮوه ﺑﻴﻤﺎری ﺷﻨﺎﺳﻲ ﮔﻴﺎﻫﻲ، داﻧﺸﻜﺪه ﻛﺸﺎورزی و ﻣﻨﺎﺑﻊ ﻃﺒﻴﻌﻲ، داﻧﺸﮕﺎه آزاد اﺳﻼﻣﻲ واﺣﺪ ﻋﻠﻮم و ﺗﺤﻘﻴﻘﺎت ﺗﻬﺮان.

 ³استاد بخش تحقیقات بیوتکنولوژی میکروبی، پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی ایران (ABRII)، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی (AREEO)، کرج.

 ⁴ﺩﺍﻧﺸﻴﺎﺭ ﮔﺮﻭﻩ ﺑﻴﻤﺎﺭﻱ ﺷﻨﺎﺳﻲ ﮔﻴﺎﻫﻲ، ﺩﺍﻧﺸﻜﺪﻩ ﻛﺸﺎﻭﺭﺯﻱ، ﺩﺍﻧﺸﮕﺎﻩ ﺗﺮﺑﻴﺖ ﻣﺪﺭﺱ.

تاریخ دریافت: 09/03/1395، تاریخ پذیرش: 09/02/1396

چکیده

بیماری موزائیک انجیر گسترش جهانی دارد و به عنوان شایع­ترین بیماری ویروسی در انجیر شناخته می­شود. یکی از مهمترین ویروس­هایی که در این بیماری نقش دارد، ویروس بادنای یک انجیر (FBV-1) می­باشد. در تحقیق حاضر، روابط فیلوژنتیکی بین جدایه­های ایرانی و سایر جدایه­های گزارش شده از این ویروس مورد بررسی قرار گرفت. با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن رمز کننده پروتئین حرکتی ویروس، قطعه­ی مورد انتظار به اندازه تقریبی 1090 جفت باز از ژنوم ویروس تکثیر شد. قطعه ژنی 12 جدایه در پلاسمید pTZ57R/T همسانه و تعیین توالی شد. ترادف­های به دست آمده با ترادف­های موجود در بانک ژن مقایسه و پس از همردیف­سازی چندگانه، درخت فیلوژنتیکی بر اساس ژن پروتئین حرکتی FBV-1 ترسیم شد. بر اساس آنالیز فیلوژنتیکی، جدایه­های FBV-1 در دو گروه متمایز دسته­بندی شدند و جدایه­های ایرانی در دو زیرگروه با 99% مشابهت نوکلئوتیدی در گروه اول قرار گرفتند. در بررسی تبارزایی بر مبنای توالی اسید­آمینه­ای، جدایه های مورد بررسی در سه گروه با 99-98 % مشابهت قرار گرفتند. جدایه­های ایرانی از تنوع ژنتیکی پایین­تری در مقایسه با جدایه­های آمریکایی برخوردار بودند و شرایط جغرافیایی در تنوع ژنتیکی جدایه­های موجود تاثیر داشت.

واژه­های کلیدی: ویروس بادنای یک انجیر، آنالیز فیلوژنتیکی، ژن پروتئین حرکتی.

مقدمه

انجیر (Ficus carica L.) گیاه متعلق به خانواده Moraceae می­باشد (Watson & Dallwitz, 2004). این درخت بومی آسیا و اروپا بوده و از دیرباز در بسیاری از فرهنگ­ها و کشورها مورد توجه بوده است. انجیر حدود 1000 سال است که کاشته می­شود و بر اساس آمارنامه FAO در سال 2013 ایران رتبه چهارم را از لحاظ میزان تولید انجیر در جهان به خود اختصاص داده است. به­رغم آنکه انجیر به تعداد کمی از بیمارگرها حساس می­باشد ولی قارچ­های بیمارگر عامل پوسیدگی ریشه شامل Phytophthora cryptogea، Armillaria mellea و Rosellinia necatrix و بیماری موزائیک انجیر (Fig Mosaic Diseases) از مهمترین بیماری­های تهدید کننده محصول انجیر محسوب می­شوند. بیماری موزائیک انجیر سال­هاست که در جهان با نام FMD شناخته شده و از زمانی که علائم آن به عنوان یک بیماری در انجیر توسط Condit et al. (1993) گزارش شده، تاکنون از هر جایی از جهان که گونه انجیر خوراکی Ficus carica کشت می­شود گزارش شده است (Blodgett & Gomec, 1967). اما مهمترین عامل فرض شده برای این بیماری، ویروس موزائیک انجیر (Fig mosaic virus) می­باشد که ویژگی­های آن به طور کامل تعیین شده است. علاوه بر FMV، چندین ویروس دیگر از جنس­ها و خانواده­های دیگر ویروسی نیز در طی سال­های اخیر از انجیر گزارش شده­اند که شامل حداقل پنج گونه از خانواده Closteroviridae و یک گونه از هر کدام از جنس­های Trichovirus، Umbravirus، Luteovirus، Carlavirus، Potyvirus و Alphacryptovirus می­باشد (Elbeaino et al., 2011a, 2011b; Gattoni et al., 2009; Walia et al., 2009). اما همچنان محققین مجموعه­ای از این ویروس­ها را در بروز علایم و سبب شناسی این بیماری دخیل می­دانند (Castellano et al., 2007). در سال 2008 و در فرایند تعیین ویژگی FMV، چندین ویروس جدید از درختان دارای علایم FMD گزارش شد. یکی از این ویروس­ها که از شیوع بالایی برخوردار است، FBV-1 می­باشد. این ویروس برای اولین بار توسط Tzanetakis et al. (2010) از ایالت متحده گزارش شده است. بعد از این گزارش، حضور ویروس در کشورهای مختلف اروپایی، حوزه مدیترانه و کشورهای آفریقایی نیز گزارش شد (Elbeaino et al., 2012; Minafra et al., 2012). در ایران نیز این ویروس توسط Alimoradian et al. (2014) برای اولین بار گزارش شد. همچنین روابط فیلوژنتیکی بین برخی جدایه­های ایرانی و سایر جدایه­های موجود مورد بررسی قرار گرفته است (Alimoradian et al., 2016). ژنوم این ویروس از جنس dsDNA بوده و به خانواده Caulimoviridae و جنس Badnavirus تعلق دارد. بادناویروس­ها یک نوع پارارتروویروس هستند و علاوه بر اینکه می­توانند در ژنوم میزبان وارد شوند (Huang & Madan, 1999)، می­توانند به صورت خارج کروموزومی نیز نسخه­برداری فعال داشته باشند و ایجاد آلودگی کنند (Laney et al., 2012). بادناویروس­ها ژنوم­های حلقوی به اندازه 8-7 کیلوجفت باز دارند و در پیکره­های باسیلی شکل بدون غشاء کپسیدپوشی می­شوند. این ویروس از چهار چارچوب خوانش باز (ORF) تشکیل شده است که چهار پروتئین (P1-P4) را به ترتیب با توده مولکولی 3/15، 5/16، 3/212 و 17 کیلودالتون تولید می­کند. موتیف­های کلیدی بادناویروس در ORF3 و به صورت یک پلی­پروتئین وجود دارند. موتیف­های مذکور شامل پروتئین حرکتی، پروتئین پوششی، پروتئاز آسپارتات، نسخه­بردار معکوس و دامنه RNase H بوده و با توجه به گزارش نهم ICTV (King et al., 2011)، FBV-1 عضو جدیدی از جنس بادناویروس بوده و به خانواده کالیموویریدا (Geering & Hull, 2012) تعلق دارد.

از آنجایی که تاکنون تحقیقات بسیار محدودی بر روی این ویروس انجام گرفته، لذا هدف از انجام تحقیق حاضر بررسی خصوصیات فیلوژنتیکی جدایه­های بومی جداسازی شده و مقایسه آنها با سایر جدایه­های ایرانی و خارجی و همچنین ارتباط احتمالی موجود بین تنوع ژنتیکی و مناطق جغرافیایی در جهت ارایه راه­کارهای مناسب مدیریتی توسط محققین مربوط بوده است.

مواد و روش­ها

نمونه­برداری از استان های قم، گیلان، گلستان، مازندران، کرمانشاه، تهران، یزد، خراسان­رضوی، لرستان، فارس و کرمان و در طی فصول زراعی سال­های 1391 تا 1393 بصورت تصادفی انجام گرفت. برای این منظور تعداد 392 نمونه برگی از درختان علایم­دار و بدون علایم از انجیرکاری­های دیم و آبی کشور از درختان انجیر جوان و با ارقام مختلف جمع­آوری و در یخ به آزمایشگاه جهت ردیابی مولکولی انتقال داده شد (Alishiri et al., 2016).

ابتدا DNA کل از نمونه­های جمع­آوری شده با استفاده از روش CTAB (Dellaporta et al., 1983) استخراج و غلظت  DNA به­دست آمده توسط دستگاه نانودراپ (Thermo scientific) تعیین شد. برای انجام PCR از جفت آغازگرهای اختصاصی جهت تکثیر منطقه ژن پروتئین حرکتی ویروس و در محدوده ژنومی 560 تا 1650 نوکلئوتید استفاده شد (Laney et al., 2012). این منطقه که در انتهای ′5 ژنوم قرار دارد، انتهای ′3 قاب خواندنی باز I و تمام طول قاب خواندنی باز II را شامل می­شود. توالی آغازگرهای رفت و برگشتی استفاده شده در این تحقیق به صورت  F: 5′- AGGCTCTAAGGTTAACTGAAG- 3′ و R: 5′- ATCATCATCGTGTCAGGTATC- 3′ می­باشد. برای انجام PCR، از یک میکرولیتر از DNA استخراج شده با غلظت 200 نانوگرم بر میکرولیتر استفاده شد. مواد این آزمون برای یک واکنش شامل 5/2 میکرولیتر از 10X PCR buffer، 5/0 میکرولیتر از dNTP mix (از غلظت 10 میلی­مولار)، یک میکرولیتر MgCl₂ (از غلظت 50 میلی­مولار)، یک میکرولیتر از هر کدام از آغازگرهای رفت و برگشت (از غلظت 10 پیکو­مول)، 2/0 میکرولیتر آنزیم  Taq DNA polymerase(5 U/mL) شرکت فرمنتاس بود و واکنش در حجم نهایی 25 میکرولیتر انجام شد. برای انجام PCR از واکنش دمایی به شرح زیر استفاده شد: یک چرخه 94 درجه سلسیوس به مدت 2 دقیقه، 35 چرخه شامل 94 درجه سلسیوس به مدت 45 ثانیه، 57 درجه سلسیوس به مدت 30 ثانیه، 72 درجه سلسیوس به مدت 30 ثانیه و در آخر یک چرخه دمایی بسط نهایی در 72 درجه سلسیوس به مدت 5 دقیقه انجام شد. محصولات PCR بر روی ژل آگاروز 2/1 درصد الکتروفورز و در زیر نور UV عکسبرداری شدند.

برای همسانه­سازی محصول PCR، ابتدا قطعه ژنتیکی مورد نظر توسط کیت استخراج DNA از ژل شرکت کیاژن (QIAquick Gel Extraction Kit, QIAGEN)، از ژل استخراج شد. سپس قطعه مربوطه در ناقل پلاسمیدی pTZ57R/T وارد شد. پس از انتقال، پلاسمید نوترکیب با استفاده از شوک حرارتی به درون سلول­های باکتری E. coli سویه DH5α منتقل شد (Sambrook & Russell, 2001). در ادامه با استفاده از محیط­کشت انتخابی حاوی آمپی­سیلین و همچنین معرف­های IPTG و X-gal، باکتری­ها بر روی این محیط رشد داده شدند و با استفاده از غربالگری، کلونی باکتری­های نوترکیب حاوی پلاسمید نوترکیب که به رنگ سفید بودند انتخاب شدند و سپس با استفاده از کیت استخراج پلاسمید فرمنتاز، پلاسمیدهای مورد نظر استخراج شدند. در مرحله بعد با آنزیم­های برشی، حضور قطعه مورد انتظار در پلاسمیدهای نوترکیب تایید شد. پلاسمیدهای نوترکیب حاوی قطعات 12 جدایه ایرانی مربوط به مناطق جغرافیایی مختلف برای تعیین توالی مستقیم به شرکت ماکروژن کشور کره جنوبی ارسال شدند. خوانش­ها به تعداد دو بار و با استفاده از آغازگر عمومی M13 انجام شد.

نتایج حاصل از تعیین ترادف با استفاده از نرم­افزار Editseq مورد بررسی قرار گرفتند و پس از حذف فضاهای پوچ از درون توالی و گرفتن توالی نهایی، توالی­ها با برنامه Blast در پایگاه اطلاعاتی NCBI بررسی شدند (جدول 1). آنالیز فیلوژنتیکی بر اساس ژن پروتئین حرکتی 12 جدایه، پس از همردیف­سازی توالی­های بدست آمده با توالی­های ایرانی و آمریکایی نظیر موجود در بانک ژن با استفاده از نرم­افزارهای CLUSTALX 1.8 (Pearson & Lipman, 1988) و MEGA6 (Tamura et al., 2013) به روش Neighbor joining (Saitou & Nei, 1987) با مدل p-distance method (Nei & Kumar, 2000) با 1000 تکرار در ارزیابی Bootstrap انجام شد. درصد شباهت در سطح نوکلئوتیدی و آمینواسیدی بین جدایه­ها توسط موتور جستجوگر Blast تعیین شد. همچنین از ویروس Sweetpotato badnavirus B با شماره دسترسی FJ560944 به عنوان گروه خارجی استفاده شد.

نتایج و بحث

نمونه­های جمع­آوری شده از استان­های مختلف علائم متفاوتی داشتند. اما شاخص­ترین آنها حالت موزائیکی با حاشیه نکروز بود که در برگ­ها وجود داشت، این علائم در اکثر گزارشات به Fig mosaic virus (FMV) نسبت داده شده است (Caglayan et al., 2009; Shahmirzaie et al., 2012). به جز این، تغییر شکل برگ بود که این علائم نیز در بین نمونه­های جمع­آوری شده به شدت به چشم می­خورد و شاید بتوان گفت شایع­ترین علائم همراه با FBV-1 در ارقام ایرانی می­باشد (شکل 1).

شکل 1- علائم بیماری موزائیک انجیر در درختان آلوده. A و B: لکه­های موزائیکی کلروز که اطراف آنها نکروز شده است. C و D:  تغییر شکل و زوایای برگ از حالت اصلی خودش و همچنین رنگ پریدگی عمومی و روشن شدن رگبرگ­ها.

Figure 1- Mosaic diseases symptoms in infected fig tree. A, B: chlorotic mosaic lesion restricted with the marginal necrosis. C, D: angle and leaf deformation, general lightness and vein clearing.

آغازگر اختصاصی که برای این ویروس استفاده شد یک منطقه اختصاصی از ژنوم بادناویروس­ها را تکثیر می­کند که در انتهای ′5 ژنوم قرار دارد. این منطقه شامل طول کامل قاب خواندنی باز II (ORF II) است که در این منطقه ژن مربوط به پروتئین حرکتی ویروس قرار دارد و همچنین بخشی از انتهای ′3 قاب خواندنی باز I (ORF I) را نیز پوشش می­دهد. این دو منطقه ژنی اندازه­ای در حدود 1090 جفت باز را شامل می­شوند. با توجه به اینکه این ناحیه در ابتدای ′5 ژنوم قرار گرفته انتظار می­رود که تنوع زیادی نداشته باشد و حفاظت­شدگی بالایی را شامل شود. برای اثبات این ادعا نیاز به تعیین توالی طول کامل ژنوم می­باشد و بیشترین توالی ژنومی ویروس در قاب خواندنی باز III قرار گرفته که هنوز توالی­یابی نشده است. برای بررسی میزان تنوع ژنتیکی جدایه­های مورد بررسی، پس از همسانه­سازی و تعیین توالی، 12 توالی به عنوان توالی­های نماینده انتخاب شدند. توالی­های نماینده بر­اساس مناطق جغرافیایی مختلف انتخاب شدند. این توالی­ها که مربوط به بخشی از ژن پروتئین حرکتی ویروس و به اندازه 1090 جفت باز بودند با شماره­های دسترسی KU821715 تا KU821726 در پایگاه اطلاعاتی NCBI ثبت شدند.

جدول 1 اطلاعات مربوط به جدایه­های ایرانی موجود در این تحقیق و سایر جدایه­های بررسی شده با این جدایه­ها که هم جدایه­های ایرانی و هم جدایه­های آمریکایی است را نشان می­دهد. همردیف­سازی توالی­ها با استفاده از برنامه ClustalX 1.8 برای توالی­های نوکلئوتیدی 12 جدایه­ این تحقیق با تمام جدایه­های موجود در NCBI که شامل 10 جدایه داخلی و 25 جدایه خارجی بود انجام گرفت. مقایسه­ها نشان داد که جدایه­های ایرانی FBV-1 با سایر جدایه­های ثبت شده در بانک ژن به میزان 99 درصد در سطح توالی نوکلئوتیدی با یکدیگر شباهت دارند. علاوه بر مقایسه توالی نوکلئوتیدی بین جدایه­های مختلف FBV-1 با دیگر بادناویروس­های انجیر، مقایسه در سطح توالی­های آمینواسیدی هم انجام گرفت. در این مقایسه درصد شباهت بین جدایه­های جداسازی شده در این تحقیق با سایر جدایه­های موجود در بانک ژن بین 98 تا 99 درصد بود. همچنین میزان مشابهت نوکلئوتیدی بین جدایه­های جدید بررسی شده در این تحقق با جدایه­های قدیمی گزارش شده از ایران، به میزان 99 درصد بود و میزان مشابهت در سطح اسید­آمینه بین جدایه­های قدیم و جدید ایرانی بین 99-98 درصد بود.

شکل 2- محصول PCR بدست آمده بر روی ژل الکتروفورز 2/1 درصد با استفاده از جفت آغازگرهای اختصاصی تکثیر کننده ژن پروتئین حرکتی ویروس. چاهک­های 1 تا 12: قطعه تکثیر شده در نمونه­های انجیر آلوده به ترتیب از استان­های مازندران، گلستان، کرمانشاه، لرستان، گیلان، تهران، فارس، خراسان­رضوی، لرستان، قم، یزد و کرمان می­باشد. H: شاهد منفی (گیاه سالم). M: مارکر 100 جفت بازی شرکت فرمنتاز. (Gene Ruler^TM 100 bp DNA Ladder, Fermentase) .

Figure 2- Electrophoresis pattern of amplified movement protein gene of FBV-1 by PCR using specific primers in 1.2 ٪ agarose gel. Lanes 1-12: Cloned DNA fragment for infected fig samples from Mazandaran, Golestan, Kermanshah, Lorestan, Gilan, Tehran, Fars, Khorasan Razavi, Lorestan, Ghom, Yazd and Kerman provinces, respectively. H: negative control (Healthy plant). M: 100 bp DNA ladder (Fermentas, Germany).

درخت ترسیم شده بر اساس توالی نوکلئوتیدی ژن پروتئین حرکتی نشان داد که جدایه­های ایرانی در کنار سایر جدایه­های موجود در بانک ژن که از کشور آمریکا گزارش شده­اند، قرار می­گیرند. جدایه­ها در مجموع در دو گروه اصلی قرار گرفتند که گروه اول نیز به دو زیرگروه تقسیم شد. جدایه­های آمریکایی ویروس در هر دو گروه تقسیم شدند که نشان می­دهد تنوع در بین جدایه­های آمریکایی ویروس بیشتر از جدایه­های ایرانی است (شکل a3). از طرفی جدایه­های ایرانی هم متنوع هستند ولی با تنوع کمتر از جدایه­های آمریکایی ویروس و در دو زیر گروه از گروه اول قرار گرفتند. نتایج فیلوژنی نشان داد که تنوع جغرافیایی در تنوع جدایه­ها برای این ناحیه مورد بررسی از ژنوم ویروس تاثیر داشته است و به نظر می­رسد که جدایه­های بررسی شده در این تحقیق در گروه جدا از جدایه­های ایرانی که قبلا بررسی شده قرار گرفته است.

.

جدول 1- کدهای دسترسی ثبت شده در NCBI به همراه میزان درصد شباهت­های نوکلئوتیدی و اسید­آمینه­ای جدایه­های FBV-1، مناطق جغرافیایی و نام جدایه­های مربوطه استفاده شده در این تحقیق.

Table 1- Accession numbers submitted in NCBI along with the amino acid and nucleotide identities of FBV-1 isolates, geographic origins and isolate names used in this study.

* جدایه آمریکایی Arkansas 1 (JF411989) که به عنوان جدایه رفرنس در این مطالعه استفاده شد.

^aعضوی از جنس بادناویروس به اسم Sweetpotato badnavirus B (SPBV-B) که به عنوان گروه خارجی استفاده شد.

* American isolate Arkansas 1 (JF411989) was used as a reference isolates for FBV-1.

^aSweetpotato badnavirus B (SPBV-B) members of the genus Badnavirus used as an out-group species.

اما آنالیز فیلوژنتیکی جدایه­ها بر مبنای توالی اسید­آمینه دسته­بندی متفاوتی را در مقایسه با توالی نوکلئوتیدی نشان داد (شکل 3b). درخت فیلوژنتیکی ترسیم شده بر مبنای توالی اسید­آمینه­ای پروتئین حرکتی، سه گروه متمایز فیلوژنتیکی را تشکیل داد. در گروه اول جدایه­های مربوط به استان­های یزد (N11)، کرمان (N12)، گیلان (N9)، قم (N8)، لرستان (N7) و مازندران (N1) به همراه تعداد زیادی از جدایه­های آمریکایی قرار گرفتند. در انتهای این گروه و با فاصله خیلی زیاد، جدایه­هایی از کرمانشاه (N5) و تهران (N10) قرار گرفتند. در گروه دوم نیز جدایه­هایی از فارس (N3)، خراسان­رضوی (N4) و لرستان (N6) به همراه چند جدایه از کشور آمریکا در کنار یکدیگر قرار گرفتند. البته دو جدایه فارس و لرستان که در این گروه قرار گرفتند، در درخت فیلوژنتیکی ترسیم شده بر اساس توالی نوکلئوتیدی در زیر گروه یک از گروه اول و با فاصله خیلی زیادی نسبت به سایر جدایه­های ایرانی بررسی شده در این تحقیق قرار گرفتند. در گروه سوم نیز جدایه N2 از استان گلستان به همراه چهار جدایه آمریکایی به صورت جدا دسته­بندی شدند. بر اساس فیلوگرام ترسیم شده بر مبنای توالی اسید­آمینه، سویه­های جداسازی شده از لرستان (N6 و N7) در دو گروه جدا قرار گرفتند که این امر گویای این است که سویه­های لرستان در جمعیت­های متفاوتی وجود دارند. همچنین تمامی جدایه­های ایرانی FBV-1 که قبلا مورد بررسی قرار گرفتند در گروه اول فیلوژنتیکی بر مبنای اسید­آمینه قرار گرفتند. اما جدایه­های بومی جداسازی شده در این تحقیق، در هر سه گروه وجود داشتند و با توجه به اینکه سویه­های بررسی شده در این تحقیق از استان­های مختلف کشور جمع­آوری شده که عمده مناطق تولید انجیر را به خود اختصاص می­دهند، می­تواند نشانگر حضور و پراکنده بودن جمعیت­های ژنتیکی متفاوتی از این ویروس در کشور باشد. جدایه­های ایرانی که در گروه دوم قرار گرفتند در مقایسه با جدایه مرجع (JF411989) میزان شباهت آنها 98 % بود (جدول 1) که این امر نشان دهنده این است که احتمالا تنوع در جدایه­های این گروه بیشتر بوده و تغییرات در سطح نوکلئوتید، به اسید­آمینه انتقال پیدا کرده و احتمالا جمعیت­های متنوع­تری را تشکیل داده است. شاید این امر به این دلیل باشد که در طول زمان جدایه­های ویروس از همگرایی برخوردار نبوده و جمعیت­های متنوع ویروس احتمالا به دلیل انتقال ژن و یا فرار ژن بین جمعیت­ها تشکیل شده است. اما، با توجه به دسته­بندی جدایه­ها در فیلوگرام بر مبنای توالی اسید­آمینه، نشان داد که تنوع جغرافیایی در تنوع جدایه­ها بر مبنای ناحیه پروتئین حرکتی ویروس تاثیر داشت و توانست آنها را از هم تفکیک کند. به این صورت که جدایه­هایی که در گروه دوم از درخت فیلوژنی ترسیم شده با اسید­آمینه قرار داشتند از مناطق گرم و خشک کشور بودند. جایی که انجیر در آن مناطق بیشتر به صورت دیم کشت می شود و انجیرها، بومی آن مناطق هستند. مثل استان فارس که بیشترین میزان تولید انجیر دیم کشور را به خود اختصاص داده است. همچنین در گروه سوم از این طبقه­بندی، جدایه جداشده از استان گلستان قرار داشت. این استان نیز از مناطقی است که به علت شرایط آب و هوایی، میزان آلودگی بالاست و انجیر کشت شده در این استان به صورت آبی است و اکثرا قلمه­هایی است که از مناطق دیگر آورده می­شود و بومی خود این استان نیست. در گروه یک از این طبقه­بندی نیز سایر جدایه­های جدید جدا شده از کشور به همراه جدایه­های قدیمی ایرانی قرار گرفتند. نتایج این تحقیق؛ نتایج محققین گذشته (Alimoradian et al., 2016) را، که بر روی این قطعه ژنومی از ویروس کار کرده بودند، تایید کرد. از راهکارهایی که می­توان در این خصوص ارائه داد این است که آزمون دامنه میزبانی را برای جدایه­های بومی انجام داد و از آنجایی که این ویروس قابلیت انتقال به گیاهان علفی را دارد و با توجه به اینکه سایر ویروس­های همراه با این ویروس که در بیماری موزائیک انجیر دخیل هستند قابلیت انتقال به میزبان­های علفی را ندارند (Alimoradian et al., 2016)، لذا می­توان رابطه بین تنوع جغرافیایی و تنوع علائم را بررسی کرد تا بر این اساس بتوان بخشی از ژنوم ویروس که مسئول بیماریزایی است و از تنوع شرایط جغرافیایی متاثر شده است را پیدا کرد که البته برای اثبات این فرضیه نیاز هست تا طول کامل ژنوم ویروس تعیین توالی شده و آنالیز فیلوژنتیکی به صورت جداگانه برای بخش­های مختلف از ژنوم ویروس انجام گیرد.

تحقیق حاضر که به منظور شناسایی ناحیه­ای از ژنوم ویروس انجام شد که از حفاظت­شدگی نسبی برخوردار است، دومین تحقیق مولکولی می­باشد که در سطح کشور و بر روی این ناحیه از ژنوم FBV-1 انجام شده است. اولین گزارش از این ویروس در ایران مربوط به Alimoradian et al. (2014) می­باشد که این ناحیه از ژنوم را بررسی کرده و حضور این ویروس را از استان­های همدان، البرز و مازندران گزارش کرده بودند. نتایج این تحقیق و نیز پژوهش­های گذشته در مورد پراکندگی و وقوع عوامل ویروسی ایجاد کننده موزائیک در انجیر حاکی از پراکندگی غیریکنواخت این عوامل در انجیر­کاری­های مختلف جهان و همچنین ایران دارد. پراکندگی غیریکنواخت می­تواند به دلیل تغییرات ژنتیکی نژادهای متفاوت در جمعیت­های ویروس در مناطق مختلف باشد (Raybould et al., 1999).

شکل 3- درخت فیلوژنتیکی حاصل از آنالیز توالی­های نوکلئوتیدی (a) و اسید­آمینه ای (b) 12 جدایه ایرانی FBV-1  به همراه ژن­های همولوگ آن از ایران و آمریکا (جدول 1) با استفاده از الگوریتم Neighbor-joining و مدل p-distance و bootstrap با 1000 تکرار انجام شد. فقط ارزش­های bootstrap بیشتر از 60 ٪ نشان داده شده است. از توالی نوکلئوتیدی Sweetpotato badnavirus B به عنوان گروه خارجی در فیلوگرام استفاده شد (جدول 1).

Figure 3- Phylogram generated from the alignment of nucleotide (a) and amino acid (b) sequences of 12 Iranian FBV-1 and other GenBank isolates from USA and IRAN (Table 1) using neighbor-joining algorithm, p-distance method and bootstrap consisting of 1,000 pseudoreplicates. Only bootstrap values greater than 60 % are shown. Nucleotide sequences of Sweetpotato badnavirus B was used as an outgroup to root the tree (Table 1).

اثبات این امر نیز نیازمند تحقیقات بیشتر در زمینه بررسی روابط فیلوژنتیکی و تغییرات ژنتیکی جمعیت نژادهای مختلف ویروس­های دخیل در ایجاد بیماری موزائیک انجیر در کشورهای حوزه دریای مدیترانه می­باشد که بیشترین تولید انجیر را دارند. این دلیل یکی از دلایلی بود که این پروژه را به سمت بررسی تنوع ژنتیکی این ویروس که بسیار نیز گسترده است سوق داد. با توجه به تحقیقات انجام گرفته در ایران و جهان، ویروس موزائیک انجیر (Fig mosaic virus) که گفته می­شود عامل اصلی بیماری موزائیک انجیر می­باشد با درصد بسیار پایین­تری در مقایسه با FBV-1 گزارش شده است (Shahmirzaie et al., 2012; Danesh-Amuz et al., 2014; Alimoradian et al., 2016). شاید بتوان گفت که احتمالا FMV تنها عامل اصلی بیماری موزائیک انجیر نبوده و FBV-1 در ایجاد این بیماری و شدت آن نقش موثرتری را دارا می­باشد. البته این امر را نیز نمی­توان انکار کرد که آلودگی مشترک هم بین عوامل ویروسی مختلف در انجیر وجود دارد که شاید اثر تشدید کنندگی روی هم دارند و در ایجاد علائم و بروز بیماری، چندین ویروس با هم نقش داشته باشند. از جمله مطالعاتی که در آینده در ادامه تحقیق حاضر می­توان انجام داد، می­توان به تعیین مقاومت ارقام تجاری (هم دیم و هم آبی) انجیر نسبت به ویروس­های آلوده کننده این گیاه و همچنین تکثیر ژنوم کامل جدایه­های ایرانی این ویروس و همچنین در ادامه تعیین عملکرد ناشناخته برخی نواحی حفاظت شده بر روی ژنوم این ویروس اشاره نمود.