تجزیه و تحلیل ژنتیکی و فیلوژنتیکی بخشی ازناحیه کنترلی ژنوم میتوکندری در گوسفند زندی

زانا پیرخضرانیان*¹، محمد رزم کبیر²، نرگس نظیفی¹

¹دانشجوی دکتری ژنتیک و اصلاح نژاد دام، گروه علوم دامی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه فردوسی مشهد، مشهد، ایران.

²استادیار گروه ژنتیک و اصلاح نژاد دام، گروه علوم دامی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه کردستان، سنندج، ایران.

تاریخ دریافت: 11/08/1395، تاریخ پذیرش: 22/05/1396

چکیده

حفظ دام­های بومی، به عنوان ذخایر ژنتیکی و سرمایه­های ملی برای برنامه­های اصلاح نژادی و  بازده تولید ضروری می­باشد. استفاده از نشانگرهای ژنتیکی توالی یابی ژنوم میتوکندری یکی از کاربردی ترین روش­ها برای تشخیص گونه­ها و تعیین رابطه فیلوژنی بین جمعیت­ها و گونه­های نزدیک به هم می­باشد. هدف از این مطالعه بررسی میزان تنوع ناحیهHVR-I  ژنوم میتوکندری گوسفند نژاد زندی بود. بدین منظور نمونه­های خون از تعداد 25 رأس گوسفند غیر خویشاوند نژاد زندی در ایستگاه خجیر تهران جمع­آوری شد؛ و پس از استخراج DNAوتکثیر قطعه 432 نوکلئوتیدی ناحیه HVR-I ژنوم میتوکندری با استفاده از واکنش زنجیره­ای پلیمراز، نمونه­ها توالی یابی شدند. نتایج آنالیز توالی­ها حاکی از وجود چهار هاپلوتایپ و چهار جایگاه چند شکل در ژن مذکور بود. بررسی همولوژی توالی مورد توافق انواع نژادهای گوسفند نشان داد که تثبیت چند شکلی موجود در موقعیت شماره 13 نمونه های بررسی شده به عنوان جامعه­ای کوچک از گوسفندان زندی ایران ممکن است فقط خاص گوسفند نژاد زندی ­باشد. بررسی تنوع نوکلئوتیدی نشان داد که گوسفند نژاد زندی دارای تنوع نوکلئوتیدی کمتری نسسبت به گوسفندان مغانی و بلوچی می­باشد. نتایج ترسیم درخت فیلوژنی نشان داد که گوسفند نژاد زندی متعلق به گروه هاپلوتایپی A می­باشد و کمترین فاصله ژنتیکی را با نژادهای گوسفند ایرانی بلوچی، مغانی و افشاری دارد، با این وجود فاصله ژنتیکی  قابل تاملی را با توالی مرجع گروه هاپلوتایپی A دارا می­باشد.

واژه های کلیدی: درخت فیلوژنی، ناحیه HVR-I، تنوع نوکلئوتیدی، گوسفندزندی.

مقدمه

استفاده از ژنتیک ملکولی و بیوتکنولوژی در علوم دامی به منظور مطالعه تنوع ژنتیکی، تعیین ژنوتایپ کاندیدهای انتخاب در برنامه های اصلاح نژادی، حفاظت ذخایز ژنتیکی دام و طیور و اخیرا پیش بینی ژنومیک فواید و کاربردهای زیاد و موثری پیدا کرده است. (Mousavizadeh et al., 2009). همچنین استفاده از نشانگرهای ژنتیکی در انتخاب و اصلاح نژاد به طور مهیجی پیشرفت ژنتیکی را تسریع می­کند (Javanmard et al., 2008). مطالعه تنوع ژنتیکی نژادهای بومی برای حفاظت از منابع ژنتیکی لازم و ضروری است (Mohammadi et al., 2009). بالغ بر27 نژاد گوسفند در ایران وجود دارد که با مناطق و اقلیم های مختلف آب و هوایی ایران سازگار شده­اند (Zamani et al., 2015; Khodabakhshzadeh et al., 2016b). در حال حاضر، تولید گوشت مهمترین دلیل پرورش گوسفند در ایران است و تولیدات دیگر مانند پشم، شیر و پوست در درجات بعدی اهمیت قرار دارند (Mohammadabadi and Sattayimokhtari, 2013). به طور کلی در بیشتر کشورهای جهان هدف از اصلاح نژاد گوسفند سودآوری از طریق بهبود یک یا چند صفت اقتصادی در جامعه است. این بهبود می­تواند از طریق انتخاب گوسفندان برتر به عنوان والدین نسل آینده بر اساس شایستگی ژنتیکی آنها برای صفات مورد نظر صورت گیرد (Khodabakhshzadeh et al., 2015a; Khodabakhshzadeh et al., 2016a).  همگام با افزایش پیشرفت­های ژنتیکی، حفظ تنوع ژنتیکی یک جمعیت برای اطمینان از پاسخ به انتخاب بلند مدت، یک ضرورت و وظیفه مهم برنامه­های اصلاح نژادی است  برنامه­های اصلاح نژادی بیشتر در جهت بهبود وضعیت تولیدی حیوانات اهلی عمل می­کنند که توفیق این برنامه­هابه مقدار تنوع ژنتیکی موجود درگله­­ها بستگی دارد (Khodabakhshzadeh et al., 2015a). گوسفند زندی یکی از نژاد‌‌های بومی ایران است. این نژاد همانند گوسفند قره گل یکی از سه نژاد تولید کننده پوست های زینتی در دنیا می باشد. ولی با توجه به کاهش تقاضا برای پوست هدف عمده پرورش این نژاد در حال حاضر تولید گوشت و بره است.   استان تهران یکی از مراکز مهم پرورش گوسفند زندی است. پراکنش این نژاد از این استان به مناطق مجاورگسترش یافته است. امروزه گله های اصیل زندی در قسمت هایی از شهرستان های ساوه، شهرری،  ورامین، پیشوا، شمیرانات و دماوند یافت می شوند. جمعیت این نژاد در حدود2 میلیون راس برآورد می شود. از جمله خصوصیات این گوسفندان می توان به توانایی تولید شیر مناسب، مقاوم بودن در برابر تغییرات آب و هوایی، خصوصیات خوب تولید مثلی، عدم وجود سخت زایی و مشکلات زایمان اشاره کرد. مجموعه مزایای شمرده شده باعث شده که این گوسفند در سیستم کوچرو موفق ‌ترین‌ دام باشد.  ایستگاه پرورش و اصلاح نژاد گوسفند زندی از سال 1370 با خرید 220 رأس دام مولد ماده  و 10 رأس مولد نر در منطقه میانبند خجیر از توابع شهرستان شمیرانات استان تهران شروع به کار کرد و فعالیت های ثبت مشخصات و رکوردبرداری گوسفند زندی در این ایستگاه انجام می شود.

استفاده از تعداد محدودی قوچ در ایستگاه و در مواردی تلاقی­های کنترل نشده در گله­ها می تواند سبب کاهش تنوع ژنتیکی حیوانات شود. بر این اساس  استفاده از تکنولوژی و دانش ژنتیک مولکولی برای کمک به برنامه های انتخاب و آمیزش حیوانات،  بیش از پیش ضرورت پیدا می­کندShafaqmotlagh et al., 2007) ) ژن­ها عمدتا در کروموزوم­های هسته سلول و مقدار کمی نیز در میتوکندری‌ها قرار دارند. در سال 1963 وجودDNA  میتوکندریایی با استفاده از میکروسکوپ الکترونی به اثبات رسید(Nass et al., 1963) . بیان ژن­های میتوکندری در مهره­داران برای تولید انرژی، سوخت و ساز بدن، تعادل و مرگ سلولی ضروری است (DiMauro et al., 2004). در هر سلول هزار الی 10 هزار میتوکندری و در درون هریک از آنها 5 تا 10 ژنوم وجود دارد. این ژن­ها در گونه­های جانوری 37 ژن را کد می کنند، که شامل 13 ژن کد کننده زنجیره تنفسی، 22 ژن کد کننده tRNA و دو ژن کد کننده rRNA می­باشد. در پژوهشی Mohammadipestebik et al. (2011) استفاده ازنشانگرهای ژنتیکی توالی یابی ژنوم میتوکندری را یکی از کاربردی ترین روش­ها برای تشخیص گونه­ها و تعیین رابطه فیلوژنی بین جمعیت­ها و گونه­های نزدیک به هم تشخیص دادند. از جمله مزایای DNA میتوکندری (mtDNA) در ترسیم روابط فیلوژنتیکی بین گونه­ها، تعداد زیاد  نسخه به ازای هر سلول، کوچک بودن اندازه آن نسبت به  DNA هسته­ای، وراثت پذیری مادری، هاپلوئید بودن و در نتیجه انجام نشدن فرایند میوز، عدم وجود نوترکیبی در آن­ها ، سرعت بالای تکامل و وجود نواحی حفاظت نشده مانند D-loop می­باشد (Zeder et al., 2006). در اولین مطالعات روی ژنوم میتوکندری گوسفند که توسط پژوهشگران انجام شد دو دسته هاپلوتایپی مختلف A و B برای گوسفند گزارش شد (Wood and Phu.,1996). سپس محققان در ضمن انجام مطالعات بیشتر در راستای بررسی­های فیلوژنتیکی، هاپلوتایپ دسته C را نیز شناسایی نمودند (Hiendleder et al., 2002) و در نهایت در سال 2006 پژوهشگران موفق به گزارش یک گروه هاپلوتایپی دیگری شدند که هاپلوتایپ D نام گذاری شدو اعلام کردند که تنوع نوکلئوتیدی در گروه هاپلوتیپی A: 9/0%، در گروه هاپلوتیپی B: 7/0% و در گروه هاپلوتیپی C: 4/0% می­باشد. بیشترین فراوانی مربوط به هاپلوتایپB  با 71% و کمترین فراوانی مربوط به گروه D می­باشد که تنها در یک مورد در شمال پاکستان یافت شده است (Tapio et al., 2006).

 ناحیه­ای به نام ناحیه کنترلی (D-Loop)در ژنوم میتوکندری وجود دارد که ژن کد کننده هیچ نوع پروتئینی را ندارد بنابراین جهش­ها می­توانند در آن­جا تجمع پیدا کنند. این بخش خود به دو ناحیه متغییر کاملاً مشخص(HVRI)[1] و^[2](HVRII) و یک ناحیه نسبتاً حفاظت شده در بین این دو ناحیه تقسیم می­شود. این نواحی دارای بالاترین میزان تغییرات نوکلئوتیدی در افراد مختلف بوده و جهش­های ایجاد شده در آن­ها بدون تغییر به نسل­های بعد منتقل می­شوند (Jazinet al., 1998). به علت وجود این ویژگی­ها و همچنین تکامل سریع، مطالعه توالی این نواحی از ژنوم میتوکندری، در بررسی تنوع ژنتیکی و ارزیابی روابط میان گونه­ها بسیار ارزشمند است. شناسایی توالی D-Loop میتوکندری به عنوان مشخصه ژنتیکی ثابت محسوب می­شود و می­تواند به تهیه شناسنامه ژنتیکی و نگهداری خلوص نژادهای بومی کمک فراوانی نماید. همچنین امکان مطالعات فیلوژنیکی، بررسی اشتقاق گونه­ها و محاسبه فاصله نسلی با استفاده از این توالی وجود دارد(  Mohammadhashemi et al., 2009؛Pirani et al., 2010). هدف انجام این پژوهش، بررسی میزان تنوع موجود در گوسفندان نژاد زندی وتجزیه و تحلیل فیلوژنتیکی ناحیه HVR-I ،  D- LooP میتوکندریایی بود.

مواد و روش­ها

به منظور انجام این تحقیق تعداد 25 نمونه بیولوژیکی (خون) به صورت تصادفی و با اطمینان از عدم وجود رابطه خویشاوندی بین نمونه­ها (از طریق بررسی رکورد­های ثبت شده­ی آمیزشی توسط متخصصان ایستگاه پرورش)، از ایستگاه پرورش و اصلاح نژاد گوسفند زندی (ایستگاه خجیر) استان تهران جمع آوری شد. نمونه­های خون تا زمان استخراج در لوله­های حاوی EDTA در دمای 20- درجه در آزمایشگاه بیوتکنولوژی حیوانی دانشگاه فردوسی مشهد نگهداری شد. استخراج DNA با استفاده از کیت DIAtom DNA Prep محصول Iso Gene کشور روسیه صورت گرفت. برای آگاهی‌ از میزان خلوص‌و کیفیت DNA از الکتروفورز ژل‌ آگارز 8/0 درصد و برای تعیین کمیت آن از دستگاه‌ اسپکتروفتومتر نانودراپ مدل ND-200 شرکت THERMO امریکا استفاده شد. جهت تکثیر اختصاصی ناحیه HVR1 یک جفت پرایمر با استفاده از نرم افزار Primer Premier 5 (Lalitha 2000) طراحی شد (جدول 1).

جدول 1- توالی پرایمرهای مورد استفاده و طول قطعه تکثیر شده.

Table 1- Sequences of primers and length of PCR product.

در مرحله بعد، با استفاده از رویه BLAST موجود در پایگاه بانک جهانی ژن (NCBI)، میزان همپوشانی آن­ها با توالی­های موجود، مقایسه گردید تا از اختصاصی بودن پرایمرهای رفت و برگشت اطمینان حاصل شود. واکنش زنجیره­ای پلیمراز برای تکثیر قطعه 432 جفت بازی ناحیه HVR-I، ازmtDNA توسط دستگاه ترموسایکلر Biometra مدل T-personal براساس روش استاندارد و در 35 چرخه انجام گرفت. اجزای واکنش PCR در حجم نهایی 25 میکرولیتر شامل mM Tris-HCL(PH 8.8)100، 1 واحد آنزیم Taq پلیمراز، mM2/0 dNtp، mM5/1 ازMgCl2، pmol 5 از آغازگر اختصاصی ژن و 100 نانوگرم از DNA هدف با استفاده از برنامه حرارتی واسرشت سازی در دمای 94 درجه سانتیگراد برای 30 ثانیه، اتصال در دمای 57 درجه برای 30 ثانیه، تکثیر در دمای 72 درجه برای 45 ثانیه، یک مرحله واسرشت سازی اولیه در دمای 94 درجه سانتیگراد برای 5 دقیقه و یک مرحله تکثیر نهایی در دمای 72 درجه برای 10 دقیقه در 35 سیکل تکثیر شد. الکتروفورز محصولات واکنش زنجیره­ای پلیمراز بر روی ژل آگارز 1 درصد و رنگ آمیزی با اتیدیوم بروماید در ولتاژ 100 ولت و به مدت 20 دقیقه انجام پذیرفت و برای تعیین حدود اندازه آن از DNA Ladder 100bp استفاده شد.

مقدار 100 میکرولیتر از محصولات PCR پس از برش از ژل، خالص سازی شد و به همراه 50 میکرولیتر از هر یک از آغازگرهای رفت و برگشت با غلظت 10 پیکومول به منظور تعیین توالی به شرکت بایونیر کره جنوبی ارسال گردیدند. نمونه­ها به روش اتوماتیک و با استفاده از دستگاه AB1 3130 توالی یابی گردیدند. لازم به ذکر است که برای بالا بردن دقت توالی یابی، هر نمونه با هر دو پرایمر مستقیم و معکوس توالی یابی شد. آنالیز قطعات توالی یابی شده با استفاده از نرم­افزارهای بیوانفورماتیکی (Knudsen,2007)CLC Main workebench 5.5،chromas Lite 2.01(Technelysium, 2007)،(Tamura et al., 2011) MEGA 5 و Bio Edit (Hall TA, 1999) برای 25 نمونه انجام گرفت. ابتدا توالی­های نوکلئوتیدی به دست آمده با استفاده از نرم­افزار Chromas Lite 2.01 ویرایش شدند، بعد از تبدیل کردن توالی­ها از فرمت ab1 به FASTA، از ابزار BLAST و رویه BLASTN در پایگاه NCBI و نرم­افزار CLC Main workebench5.5 جهت تعیین همولوژی توالی به­دست آمده با توالی­های ثبت شده از همین ژن در NCBI و همچنین خود توالی­ها با هم استفاده شد. تنوع نوکلئوتیدی و هاپلوتایپی توسط نرم افزار Arlequin 3.5(Excoffier et al., 2005) به دست آمد. همچنین جهت رسم درخت فیلوژنتیکی با 1000 تکرار، از رویه Neighbor-Joining نرم افزار MEGA5 و تعیین فاصله ژنتیکی از رویهCreate Pairwise Comparison نرم­افزار CLC Main workebench 5.5 استفاده شد.

نتایج و بحث

استخراج DNA از تمام نمونه­ها با موفقیت انجام شد. نتایج طیف سنجی نشان داد که DNA استخراج شده از کمیت و کیفیت مناسبی برخوردار است. با توجه به مکان قرارگیری آغازگرها، انتظار مشاهده باندی به طول 432 جفت­باز در اثر تکثیر واکنش PCR می­رفت. پس از انجام PCR، الکتروفورز محصول واکنش نشان داد که آغازگرهای طراحی شده به خوبی فعالیت نموده و قطعه اختصاصی بخش HVR-1، از ناحیه کنترلی (D-Loop) میتوکندری به درستی تکثیر شده است. وجود کنترل منفی عاری از هر نوع باند DNA تکثیر شده­ای و قطعات اختصاصی، نشان از دقت و صحت انجام واکنش داشت. همچنین وجود تنها یک باند در واکنش مشخص کرد که جایگاه نشست دیگری برای آغازگرهای طراحی شده در سایر نواحی ژنوم وجود ندارد (شکل 1).

شکل 1- الکتروفورز محصولات واکنش زنجیره­ای پلیمراز به طول 432 جفت­باز ناحیه HVR-I روی ژل آگارز 1 درصد با اندازه نشانگرM100.

Figure 1- Electrophoresis of polymerase chain reaction (PCR) products by 432bp length of HVR-I erea in 1% agaros gel.M: size marker.

بعد از تعیین توالی قطعه 432 جفت بازی ناحیه HVR-I برای همه­نمونه­ها، مشاهده شد که دو تا از نمونه­های توالی­ یابی شده فاقد کیفیت مناسب می باشند بنابراین، در ادامه آزمایشات آنالیز داده­ها مورد استفاده قرار نگرفتند و بقیه مراحل آنالیز با 23 توالی باقی مانده انجام شد. با تجزیه و تحلیل توالی­ها وجود 4 هاپلوتایپ در جمعیت مورد مطالعه ثابت شد.  بیشترین و کمترین فراوانی متعلق به هاپلوتایپ­های شماره یک و چهار ترتیب با فراوانی 35 و 13 درصد بود، همچنین هاپلوتایپ­های شماره 2و3 نیز به ترتیب 22 و 30 درصد فراوانی را به خود اختصاص داده بودند (شکل2).در مطالعات قبلی  پژوهشگران ایرانی روی 20 راس گوسفند نژاد مغانی، وجود پنج هاپلوتیپ گزارش شده است (Mohamadhashemi et al., 2009). تعیین توالی­های مورد توافق یکی از روش­های معمول جهت ثبت و شناسایی نژاد­های مختلف می­باشد (Valizade et al., 2012). در نتیجه با زیرهمچینی توالی­های مورد مطالعه یک توالی مورد توافق به عنوان توالی شاخص در نژادهای مورد مطالعه، تعیین گردید. ازآنجایی که توالی مورد توافق بر حسبIUPAC  برایNCBI تعریف نشده است، درنتیجه از توالی مورد توافق براساس معیار اکثریت استفاده شد. محتوای توالی مورد توافق به دست آمده از هاپلوتایپ­ها شامل 6/26% آدنین، 4/23% سیتوزین، 6/16% گوانوزین و 4/33% تیمیدین بود که همانطور که مشاهده می­شود نسبت فراوانی A+T  به C+G در این توالی، به ترتب به نسبت 60 به 40 می باشد. وزن مولکولی این ناحیه از D-loop 05/138 کیلو دالتون می­باشد. همچنین وزن مولکولی این ناحیه از ژنوم میتوکندری گوسفند بلوچی ایران نیز همین مقدار گزارش شده است ولی وزن مولکولی گوسفند مغانی ایران کمتر و 52/135 کیلو دالتون گزارش شده است (Mohamadhashemi et al., 2009; Shafaqmotlagh et al., 2007). توالی نهایی به دست آمده برای اولین بار برای گوسفند نژاد زندی ایران به طول 431 جفت باز، با استفاده از نرم افزار Sequin در بانک جهانی ژن (NCBI) با کد دسترسی KJ705406 ثبت شد. با تعیین موقعیت جهش­های نوکلئوتیدی مشخص شد که هاپلوتایپ­های به دست آمده دارای 4 جایگاه چندشکل می­باشند. این جایگاهای چند شکل در موقعیت­های شماره13، 29، 36 و 414 توالی­ها وجود داشتند (شکل2). همانطور که در شکل دیده می­شود چندشکلی حاصل در موقعیت شماره 13 از نوع اضافه شدن^[3] نوکلئوتید، در موقعیت شماره 29 از نوع جانشینی^[4] یا تغییرات درون بازهای پورینی و پیریمیدنی، در موقعیت شماره 36 از نوع جایگزینی^[5] یاتبدیل به هر نوکلئوتید دیگرو چند شکلی حاصل در موقعیت 414 نیز، هم ناشی از جانشینی و هم حذف^[6] نوکلئوتید می­باشد. در مطالعه محمدهاشمی و همکاران (2009) روی گوسفند نژاد مغانی ۹ جایگاه چند شکل گزارش شد که جهش­های گزارش شده در این مطالعه در موقعیت­های 29 و 414 را نیز شامل می­شود (Mohamadhashemi et al., 2009). شفق و همکاران (2007) نیز با مطالعه روی DNA میتوکندریایی گوسفندان نژاد بلوچی، هم چندشکلی­های مشاهده شده در این مطالعه، به غیر از چندشکلی موجود در موقعیت 13 را گزارش کردند (Shafaq et al., 2007). بررسی همولوژی توالی مورد توافق نوکلئوتیدی چندین نژاد گوسفند ایرانی و غیر ایرانی نشان داد که چند شکلی تثبیت شده موجود در موقعیت شماره 13 ناحیه HVR-I ناحیه کنترلی DNA احتمالا فقط مختص گوسفند نژاد زندی می­باشد، چون هیچ کدام از نژادهای دیگر این چند شکلی را در ساختار نوکلئوتیدی توالی مورد توافق خود نداشتند (شکل 3). البته، به منظور اطمینان بیشتر از نتیجه چندشکلی گزارش شده موجود در این موقعیت به تعداد توالی­های بیشتری نیاز است. لازم به ذکر است که این چندشکلی در چند مورد از هاپلوتایپ­های گوسفند نژاد افشاری نیز وجود دارد ولی به دلیل این که توالی مورد توافق براساس معیار اکثریت محاسبه می­شود این چندشکلی در توالی مورد توافق این نژاد دیده نمی­شود.

با توجه به این موضوع که تعداد جایگاه­های چند شکل وابسته به تعداد نمونه هستند و با افزایش یا کاهش میزان نمونه­ها تغییر می­کنند، در نتیجه از پارامتر دیگری تحت عنوان تنوع نوکلئوتیدی (π) یا هتروزیگوسیتی در سطح نوکلئوتید نیز استفاده گردید، که تحت تاثیر طول DNA و اندازه نمونه نیست (Parvari et al., 1988). تنوع نوکلئوتیدی در جمعیت حاضر 00357/0 به دست آمد که در محدوده متوسط تنوع نوکلئوتیدی در یوکاریوت­ها که بین 002/0 تا 019/0 می­باشد قرار گرفت. دامنه شاخص نئی (Nei., 1987) نوکلئوتیدی برای گوسفند نژاد بلوچی، مغانی، افشاری، شال و سنگسری ایران، توسط سایر پژوهشگران به ترتیب 01/0، 007/0، 00268/0، 0092/0، 0083/0گزارش شده است (Shafaq motlagh et al., 2007; Mohamadhashemiet al., 2009; Pirkhezranian et al., 2015;). میانگین تنوع نوکلئوتیدی گزارش شده برای گوسفندان بومی هند، پاکستان، تاجیکستان، ازبکستان، ترکیه و قزاقستان به ترتیب برابر با 0024/0،  0026/0،0823/0، 0018/0، 0029/0و 0722/0 می­باشد (Naghash et al., 2007; Pardeshi et al ., 2007).

شکل 2-توالی نوکلئوتیدی بخش  HVR-1از ناحیه کنترلی DNA میتوکندریایی، گوسفندان زندی و هاپلوتایپ­های مشاهده شده.

Figure 2- sequence of HVR-1 of control region in mitocondrial DNA of Zel sheep and related haplotypes.

شکل3- همولوژی قسمتی از توالی ناحیه کنترلی نژادهای مختلف گوسفند به منظور بررسی چندشکلی موقعیت شماره 1 (جهش موقعیت نوکلئوتید شماره 13).

Figure 3- The homology of part of control region from different sheep breeds to survey polymorphism in number 1 situation (mutation in number 13 nucleotide).

از آنجایی که این ناحیه دارای بالاترین میزان تغییرات نوکلئوتیدی در افراد مختلف می­باشد و بیشترین مقدار تجمع جهش در آن دیده می­شود (Tapio et al., 2006)، در نتیجه تنوع نوکلئوتیدی این ناحیه دامنه وسیعی (0018/0 تا 0823/0) را در بین گوسفندان مختلف دارد. به دلیل این­که نمونه­های جمع آوری شده برای این مطالعه همگی مربوط به یک مرکز تحقیقاتی می­باشد و غالبا، ایستگاه­های تحقیقاتی به منظور حفظ ذخیره ژنتیکی و جلوگیری از انقراض گونه­هایی که اندازه موثر جمعیت^[7] آنها پایین می­باشد مجبور به تلاقی گوسفندان خویشاوند با هم هستند به نظر می­رسد تنوع ژنتیکی در گوسفندان نژاد زندی در واقع بیشتر از مقداری باشد که در این مطالعه گزارش شده است.

در پژوهشی Wood and Phua (1996) دو گروه هاپلوتیپی اصلی A و B را گزارش کردند. سپس محققان  بعد از مقایسه توزیع این گروه­های هاپلوتایپی در چند نژاد آلمانی، روسیه و قزاقستان آنها را به ترتیب دو نژاد آسیایی و اروپایی معرفی کردند (Hiendleder et al., 1998). در مطالعه Guo و همکارن(2005) و همچنین Pedrosa و همکارن (2005) با بررسی نژاد­های گوسفند موجود در چین و ترکیه ­موفق به گزارش هاپلوتایپ جدیدی به نام هاپلوتایپ C شدند (Guo et al., 2005; Pedrosa et al., 2005). هر کدام از این گروه­های هاپلوتایپی دارای یک توالی مرجع می­باشد. شماره دسترسی توالی مرجع گروه هاپلوتایپیA: DQ097451، گروه هاپلوتایپی B: DQ097431، گروه هاپلوتایپیC:DQ097457 و گروه هاپلوتایپیD: DQ242212 می­باشد.

در شکل 4 تعیین گروه هاپلوتیپی به وسیله رسم درخت فیلوژنی با استفاده از ناحیه  HVR-1، ناحیه کنترلی (D-Loop) میتوکندری بین 33 گونه مختلف گوسفند قابل مشاهده است.  با استفاده از این درخت می­توان موقعیت گوسفند نژاد زندی را به طور کلی در بین گروه­های هاپلوتایپی و به طور اختصاصی بین نژادهای مختلف تعیین نمود و در نهایت برخی از تغییرات خصوصیات مورفولوژیکی این نژاد ­را توجیه نمود. همانطور که در شکل 4 مشاهده می­شود گروه­های هاپلوتایپی چهارگانه فوق به صورت کاملا تفکیک شده در خوشه­های مختلف قرار گرفته­اند و گوسفند نژاد زندی همراه با سایر گوسفندان ایرانی در گروه هاپلوتایپی A قرار گرفته ­است.

محققان ایرانی در پژوهش­هایی که بر روی گوسفندان نژاد مغانی (Mohamadhashemi et al., 2009)، گوسفندان نژاد بلوچی (Shafaq motlag et al., 2007)، همچنین گوسفندان نژاد سنگسری و شال (Mohamadhashemi et al., 2011) و گوسفندان نژاد افشاری (Pirkhazranian et al., 2015) انجام دادند به این نتیجه رسیدند که گوسفندان ایرانی ذکر شده همگی به گروه هاپلوتایپی A تعلق دارند. با توجه به مشترک بودن جد پدری گوسفندان آسیایی O. orientalis (Hiendlederet al al., 2002) و همچنین واقع شدن ایران در آسیا و به طور ویژه­ای در خاور میانه، قرار گرفتن گوسفندان ایرانی در هاپلوتایپ A منطقی به نظر می­رسد. همچنین در بررسی تنوع ژنوم میتوکندری گوسفندان اروپایی، کاسکازین و آسیا گزارش شده است که بیشتر گوسفندان آسیایی در هاپلوتیپ­های  A(۲۲ درصد) و B (۷۱ درصد) قرار می­گیرند (Tapio et al., 2006) که این گزارش نیز می­تواند قرار گرفتن گوسفند زندی در گروه هاپلوتایپی A را توجیه کند. اعداد بالایی قطر جدول، فواصل ژنتیکی و اعداد مربوط به پایینی قطر جدول، درصد تشابه ژنتیکی را نشان می‌دهند.

Up the diagonal: Genetic distances & Uner the diagonal: similarity percentage

به منظور بررسی دقیق تر گروه هاپلوتایپی A، ماتریس فاصله ژنتیکی (میزان اختلاف نوکلئوتیدی) و درصد تشابه ژنتیکی  این گروه هاپلوتایپی تعیین شد (جدول 2). همانطور که در جدول 4 مشاهده می‌شود گوسفند نژاد زندی در بین گونه‌هایی که در گروه هاپلوتایپی A قرار گرفته‌اند دارای کمترین فاصله ژنتیکی با گوسفندان ایرانی می‌باشد. فاصله ژنتیکی زیاد و در پی آن درصد شباهت ژنتیکی کم بین توالی مرجع گروه هاپلوتایپی A (DQ097451.1) که در ردیف 1 قرار گرفته است و گوسفندان ایرانی نسبت به سایر گوسفندان گروه هاپلوتایپی A قابل تامل می‌باشد که علت آن ممکن است به دلیل تغییرات اقلیم بین مناطقی که نمونه‌ها در آنها جمع آوری شده است باشد.

نتیجه گیری

نتایج این پژوهش نشان دهنده پایین بودن نسبی تنوع ژنتیکی در گوسفند زندی می­باشد. پایین بودن تنوع در این جمعیت می­تواند مبین نیاز به برنامه­ریزی اصلاح نژادی در این جمعیت  از طریق تلاقی­های برنامه ریزی شده و اصطلاحا طراحی سیستم آمیزشی مناسب برای کنترل همخونی و خویشاوندی است. این مساله کمک می کند تنوع و پتانسیل ژنتیکی گوسفند زندی برای فعالیت های اصلاح نژادی در آینده حفظ شود. برای تسریع این مساله حتی می توان از قوچ های برتر گله های مردمی در ایستگاه خجیر استفاده نمود تا سازگاری محیطی و مقاومت گوسفند زندی در حد مطلوبی حفظ شود. با توجه به این که داده­های جمع­آوری شده برای این مطالعه مربوط به یک ایستگاه تحقیقاتی پرورش گوسفند می­باشد، ممکن است که در واقع، تنوع ژنتیکی بدست آمده از نمونه­ها، اندکی کمتر از  از تنوع حقیقی موجود در جمعیت گوسفند زندی باشد. به منظور تایید نتایج حاصل از این تحقیق، بهره گیری از تعداد نمونه بیشتر به ویژه  نمونه گیری از گله­های مختلف و گله­های مردمی پیشنهاد می­گردد.

شکل 4 - درخت فیلوژنی ناحیه HVR-I بین نژادهای مختلف گوسفند. شماره دسترسی­های مربوط به گروه­های هاپلوتایپی در شکل مشخص شده است (●: گروه هاپلوتایپیB، مثلث▲: گروه هاپلوتایپیD، ♦ : گروه هاپلوتایپی A و ■: گروه هاپلوتایپی C)

Figure 4- Phylogenetic tree of HVR-I region among different sheep breeds. Accession number of each haplotype is given (●: B haplotype, ▲: D haplotype, ♦: A haplotype and ■: C haplotype).

جدول 2- فواصل ژنتیکی و درصد تشابه بین گروه­ هاپلوتایپی .A

Table 2- Genetic distances and similarity percentage among A haptotype grope

سپاسگزاری

از ایستگاه پرورش و اصلاح نژاد گوسفند زندی (ایستگاه خجیر) استان تهران به دلیل همکاری و مساعدت در امر نمونه­گیری تشکر و قدردانی می­شود.