Protein engineering of human tissue type plasminogen activator (tPA) using active site of plant-cuscutain enzyme to increase its permanent and activity

مهندسی پروتئین فعال کننده پلاسمینوژن بافتی (tPA) انسانی با افزودن قطعه ژن کاسکوتین سس جهت افزایش پایداری و فعالیت آن

حیدر سیفی نبی­آباد¹، خسرو پیری[1]2^*، معصومه امینی³

¹ عضو هیات علمی گیاهان دارویی دانشگاه نهاوند، نهاوند، ایران

² عضو هیئت علمی گروه بیوتکنولوژی دانشگاه بوعلی سینا، همدان، ایران.

³ فارغ ااتحصیل دکتری بیوتکنولوژی گیاهی دانشگاه بوعلی سینا، همدان، ایران.

تاریخ دریافت: 11/10/1395، تاریخ پذیرش: 22/04/1396

چکیده

پروتئین tPA یکعاملاختصاصیفیبریناستکهموجبحلکردنلخته­هایخونیوجلوگیریاز سکته­هیقلبیومغزیمی­گردد. کاسکوتین یک پروتئاز با فعالیت و پایداری بالا می­باشد که در گیاهانی مثل سس وجود دارد و گیاه پارازیت از آن برای نفوذ به میزبان استفاده می­کند. هزینه تولید پروتئین­های نوتوکیب در گیاهان 10 الی 50 برابر کمتر از تولید همان پروتئین توسط باکتری است. اما تولید پروتئین­های نوترکیب در گیاهان هنوز با چالش­های مهمی از جمله عملیات پایین دستی و تخلیص، پایین بودن فعالیت و پایداری پروتئین روبرو می­باشد. پروتئین نوترکیب tPA تولید شده در گیاهان پایداری و فعالیت پایینی دارد. هدف این تحقیق،  افزایش پایداری tPA با استفاده از مهندسی پروتئین و افزودن جایگاه فعال آنزیم کاسکوتین از گیاه سس به tPA و تولید پروتئین شیمری می باشد. ابتدا از گیاه سس استخراج DNA صورت گرفت و سپس با استفاده از آغازگرهای اختصاصی قطعه مورد نطر از ژن کاسکوتین تکثیر گردید. سپس به کمک تکنیک SOEing PCR قطعه کاسکوتین به ژن tPA متصل شد. قطعه tPA شیمری حاصله تحت کنترل پیشبر CaMV 35S و خاتمه دهنده NOS قرار گرفت. توالی افزایش دهنده Kozak  و ترادف رمز کننده پپتید نشانه KDEL، به ترتیب به دو انتهای آمینی و کربوکسیلی ژن tPA افزوده شدند. سازه تهیه شده(pBI(tPA  به روش انتقال ژن مبتنی بر اگروباکتریوم به ژنوم گیاه توتون منتقل و گیاهان تراریخت روی محیط حاوی کانامایسین انتخاب شدند. ارزیابی گیاهان تراریخت با استفاده از فنون PCR، RT-PCR، SDS-PAGE ، وسترن بلات و زیموگرافی انجام شد.  نتایج نشان داد که ژن شیمریtPA  به گیاهان توتون منتقل شده و در مقایسه با tPA نرمال فعالیت و  پایداری آن بهبود یافته است. بنابراین مهندسی پروتئین و استفاده از بخش­هایی از پروتئین­های گیاهی با فعالیت و پایداری بالاتر جهت افزایش ماندگاری و فعالیت داروهای نوترکیب، می­تواند راهکار جدیدی برای افزایش کارایی این داروها باشد.

کلمات کلیدی: مهندسی پروتئین، فعال کننده پلاسمینوژن بافتی، شیمری، افزایش فعالیت، کاسکوتین.

مقدمه

در دنیای امروز تقاضا برای داروهای زیستی روز به روز در حال افزایش می­باشد و چون معمولاً قیمت این داروها، فراوانی آنها را محدود می­کند، لازم است سیستم­هایی توسعه یابند که بتوانند داروهای زیستی را با قیمت مناسب در اختیار مصرف کنندگان قرار دهند (Pen et al., 1992; Saify et al., 2011). پروکاریوت­هایی مثل اشیریشیاکولی(E.coli) با توجه به سهولت دستکاری و سادگی بیان پروتئین رایج­ترین سیستم بیانی برای پروتئین­های نوترکیب می­باشند(Darabi et al., 2017). اما، تولید پروتئین­های نوترکیب در باکتری ممکن است با مواد سمی همراه باشد که استفاده داوریی آن را محدود می­سازد. همچنین امکان تخریب پروتئولیتیک پروتئین نوترکیب یوکاریوتی در داخل باکتری­ها وجود دارد. بعلاوه پروتئین نوترکیب می­تواند داخل باکتری بصورت نامحلول در آمده و منجر به تشکیل انکلوژن بادی­های[2] نامحلول گردد، که نیازمند شکل گیری مجدد و مراحل تخلیص پرزحمت وگرانقیمتی است (Daniell, 2003; Ma et al., 1999). فعال کننده­های پلاسمینوژن در سیستم فیبرینولیتیک قادر به تبدیل پلاسمینوژن به فرم فعال کاتالیتیک آن (پلاسمین) می­باشند که شبکه فیبرینی همراه با لخته­های خونی را هضم می­کند (شکل 1). دو نوع اصلی فعال کننده­های پلاسمینوژن وجود دارند که عبارتند از: فعال کننده پلاسمینوژن نوع اروکیناز[3] و فعال کننده پلاسمینوژن بافتی [4](t-PA) (Chen et al., 2005; Mosher, 1990).  پروتئین tPA، فعال کننده اصلی پلاسمینوژن در خون می­باشد در صورتی که نقش اصلی uPA پروتئولیز وابسته به بافت است و عقیده بر این است که نقش آن در حذف فیبرین داخل عروقی نسبت به tPA، ثانویه می­باشد (Amiri et al., 2015). فرایند فیبرینولیز بطور عمده در سطح فیبرین شروع شده و سپس در داخل رگ منتشر می­شود. زیرا این سطح، محل­های اتصال برای تماس بهینه بین تعدادی از اجزای سیستم فیبرینولیتیک بخصوص پلاسمینوژن و tPA را مهیا می­کند. این اثر تحریکی، غلظت بالائی از پلاسمینوژن و tPA را در رسوبات فیبرین بوجود می­آورد و موجب متمرکز شدن فعالیت پلاسمین در این ناحیه می­گردد (Ausubel et al., 2003; Brown, 1985). بیماری­های قلبی- عروقی مثل سکته، حمله میوکاردیال حاد[5] و ترومبوامبولیسم وریدی[6] احتمالاً اصلی­ترین عامل مرگ و میر در جمعیت انسانی می­باشند (Bawon, 1985). مهمترین عامل مطرح در این شرایط، اغلب انسداد لخته­ای در رگ­های خونی مهم می­باشد که موجب نرسیدن خون به اندام­های حیاتی (قلب و مغز) می­گردد. یک دیدگاه درمانی ترومبوز، تزریق داخل وریدی فعال کننده­های پلاسمینوژن به عنوان داروی حل کننده لخته خون می­باشد (Daniel, 2006).  استرپتوکایناز یک فعال کننده پلاسمینوژن با منشاء باکتریائی است که توسط بعضی از سویه­های استرپتوکوکوس تولید شده و در کلینیک­ها نیز استفاده می­شود. این دارو نسبتاً گران بوده و به دلیل منشاء غیر انسانی آن (مخمر و باکتری)، استفاده از آن با واکنش های نامطلوب و تب زا همراه است. علاوه بر این، استرپتوکایناز نه فقط پلاسمینوژن متصل به فیبرین بلکه پلاسمینوژن موجود در گردش خون را نیز فعال می­کند که خطر خونریزی شدید وجود دارد. اما پروتئین tPA  اختصاصی عمل کرده و به لخته­های خونی بطور نسبتاً قوی متصل می­شود و ترجیحاً پلاسمینوژن به دام افتاده در داخل لخته­ها را فعال می­کند و اثر کمی روی پلاسمینوژن موجود در گردش خون یا دیگر فاکتورهای موثر در لخته خون دارد. بنابراین tPA نوترکیب احتمالاً موثرترین عامل فیبرینولیتیک است زیرا تمایل اتصال فیبرین به tPA ، نه تنها فعالیت کاتالیتیک را به لخته متمرکز می­کند بلکه کارائی کاتالیتیک tPA را نیز افزایش می­دهد (Sandra et al., 1985). از نظر بیوشیمیایی، cDNAی ژن tPA دارای 2530 باز (بجز توالی polyA) می­باشد که 562 اسیدآمینه را رمز می­کند. از 35 اسیدآمینه موجود در قبل از شروع توالی پروتئین بالغ (1- تا 35-)، احتمالا 23-20 اسیدآمینه آن مربوط به سیگنال پپتید آبگریز می­باشد که در ادامه آن توالی 15-12 اسیدآمینه­ای مربوط به توالی آبدوست پروتئین قرارگرفته است. بهر حال پس از ترجمه و ترشح tPA ، توالی 35 تائی فوق حذف و پروتئین بالغ با 527 اسیدآمینه بدست می­آید (Pennica et al., 1983; Rouf, 1996). مطالعات نشان داده است که در گیاه سس­ حاوی هوستوریوم (مکینه) یکسری از ژن­ها بیشترین بیان را نسبت به سس­های فاقد هوستوریوم دارد، که از این ژن­ها می­توان به ژن کد کننده یک پروتئیناز اختصاصی هوستوریومی به نام کاسکوتین اشاره کرد که پایداری و فعالیت بالایی داشته و در طول پروسه آلوده­سازی سس نقش مهمی را ایفا می­کند (Marc et al., 2010). این ژن دارای ویژگی بیان مکانی بوده طوری که ساقه­های سس فاقد هوستوریوم بیان بسیار کمی از این ژن را دارند در حالیکه ساقه­های دارای هوستوریا که بعد از 3 روز اتصال به میزبان برداشت شده بودند، بیشترین میزان بیان این ژن را دارند. این ژن یک pre-pro-protein را کد می­کند که هر یک از زیرواحدهای این پروتئین نقش مجزایی دارد ( شکل 2). زیرواحد پروپپتیدی این ژن دارای یک موتیفی به نام ERFIN-motif می­باشد که نقش مهارکنندگی فعالیت سیستئین پروتئینازی این آنزیم را برعهده دارد. زیر واحد پروتئازی آن نیز نقش اصلی در هضم دیواره سلولی گیاهی و نفوذ پارازیت به گیاه میزبان دارد (Marc et al., 2010). با توجه به پایین بودن فعالیت و پایداری tPA نوترکیب تولیدی از طریق گیاهان (Saify et al., 2011) در این مطالعه اقدام به تولید tPA شیمری با استفاده از اتصال جایگاه فعال ژن کاسکوتین گیاهی گردید.

شکل 1- مکانیسم عمل فیبرینولیتیک را نشان می­دهد. فعال سازی پلاسمینوژن به پلاسمین در خون توسط t-PA ترشح شده از سلول­های اندوتلیال کاتالیز می­شود. پلاسمین با اثر بر روی فیبرینوژن و تبدیل آن به فیبرین موجب باز شدن لخته خونی می­شود.

Figure 1- Action mechanism of fibrinolitic. Activation of plasminogen to plasmin by secreted tPA from epithelial cells. Plasmin is acts on fibrinogen and convert it to fibrin, therefore dissolves the clots.

شکل 2- شماتیک بخش­های مختلف ژن کاسکوتین (A) و ژن tPA (B).

Figure 2- Schematic of Cuscutain gene (A) and tPA gene (B).

مواد و روش ها

ناقل های ژنی و سویه های باکتری

از باکتری E.coli سویه F' Top10 و ناقلpGEM^®-T Easy Vector برای همسانه­سازی استفاده شد. برای تراریختی گیاهان از باکتری اگروباکتریوم (Agrobacterum tumefaciens) سویه LBA4404 و پلاسمید(Novagen)  pBI121 استفاده گردید.

تکثیر قطعات ژن­های tPA و کاسکوتین و ساخت قطعه شیمری

استخراج DNA از گیاه سس توتون با استفاده از روش CTAB صورت گرفت (Saify et al., 2009). سپس با استفاده از آغازگرهای اختصاصی A و Aʹ (جدول 1) قطعه مربوط به جایگاه فعال آنزیم کاسکوتین (bp 300) با برنامه دمایی واسرشت کردن C° 94 برای 4 دقیقه، 35 چرخه اولیه دردمایC° 94 برای یک دقیقه، اتصال در C° 61 به مدت یک دقیقه و بسط در C°72 به مدت 2دقیقه و بسط نهایی C° 72 به مدت 5 دقیقه تکثیر شد. همچنین قطعه bp 1500 از ابتدای tPA با چرخه دمایی مشابه کاسکوتین (تنها تفاوت دمای اتصال C°60 بود) با استفاده از آغازگرهای B و Bʹ تکثیر گردید (شکل 2). پس از تکثیر قطعات و الکتروفورز ژل اگارز 1 درصد، قطعات مورد نظر از روی ژل با استفاده از کیت بازیافت و استخراج DNA (شرکت ترموسینتیفیک) از روی ژل خالص سازی شد. برای اتصال دو قطعه تکثیر شده نیز از روش SOEing-PCR استفاده شد. بدین صورت که از هرکدام از قطعات کاسکوتین و tPA میزان 5 میکرولیتر در میکروتیوب ریخته شد و سپس 1 میکرولیتر dNTP، 1 میکرولیتر DMSO، 10 میکرولیتر بافر فیوژن[7] و 5/27 میکرولیتر ddH₂O به هر میکروتیوب اضافه گردید. تکثیر قطعه شیمری شامل دو مرحله PCR می­باشد. در مرحله اول برنامه دمایی واسرشت اولیه C° 98 برای 100 ثانیه، 5 چرخه دمای C° 94 برای 60 ثانیه، اتصال در C° 60 به مدت 60 ثانیه و بسط در C°72 به مدت 120 ثانیه بود. پس از PCR مرحله اول به میکروتیوب­ها آنزیم پلیمراز فیوژن و آغازگرهای B و  Aʹ  اضافه و PCR مرحله دوم با چرخه دمایی واسرشت کردن C° 98 برای 60 ثانیه، 25 چرخه شامل: دمای C° 94 برای 60 ثانیه، اتصال در C° 60 به مدت 60 ثانیه، بسط در C°72 به مدت 120 ثانیه و بسط نهایی C°72  بود.

همسانه­سازی ژن شیمیری tPA

پس از تکثیر و تخلیص ژن شیمری از ژل، ژن­های مورد نظر در ناقل T Easy Vector (Promaga) همسانه سازی شدند. سازه تهیه شده به سلول­های مستعد E .coli منتقل گردید. به منظور شناسایی کلنی­های مثبت، بر روی کلنی­های سفید رشد کرده در محیط انتخابی (حاوی50 میلی­گرم در لیتر آمپی سیلین، IPTG و X-Gal)، کلنی-PCR انجام شد. سپس کلون­های مثبت انتخاب شده با هضم آنزیمی مورد بررسی قرار گرفته و تائید شدند. جهت حصول اطمینان از صحیح بودنکلون­های شناسایی شده پس از توالی­یابی قطعات DNA هدف، آنالیزهای لازم با استفاده از برنامه BLAST و  نرم افزار  Clustalw صورت پذیرفت. پس از همسانه­سازی ژن  tPAدر ناقل بیانی گیاهی pBI121 و تهیه سازه pBI-tPA، ژن هدف با روش مبتنی بر آگروباکتریوم به هسته سلول­های گیاه توتون منتقل گردید و از سلول­های تراریخت گیاهان تراریخت بدست آمده و گیاهان انتخابی در سطوح DNA، RNA و پروتئین  مورد بررسی قرار گرفت. استخراج RNA از برگ­های جوان و با استفاده از کیتRNX-Plus TM   شرکت سیناکلون انجام گرفت. برای سنتز cDNA، از کیت ReverteAid First Strand cDNA Synthesis  شرکت ترموساینتیفیک استفاده شد و آزمون RT-PCR انجام گردید.

همسانه­سازی tPA نرمال

در این مطالعه ژن نرمال tPA نیز به عنوان کنترل و جهت مقایسه با tPA شیمری همسانه­سازی، و به گیاهان توتون منتقل گردید.

جهت استخراج پروتئین از روش  Guy و همکاران استفاده شد. 100 میلی­گرم از نمونه­های گیاهی برای استخراج پروتئین استفاده گردید. غلظت پروتئین با استفاده از کیت کمیت سنجی پروتئین برادفورد (Bio-Rad) تعیین شد. میزان 100 میکروگرم از پروتئین­ها روی ژل   SDS-PAGE 12 درصد بارگذاری، و رنگ آمیزی کوماسی بریلیانت بلو انجام شد.  آزمونزیموگرافی: مقدار 100 میکروگرم از پروتئین استخراج شده با مقدار مساوی از بافر بارگذاری  مخلوط و در ژل 12% اکریلامید حاوی ژلاتین 1% و پلاسمینوژن، با جریان 10 میلی آمپر در اتاق سرد، الکتروفورز شد. سپس ژل با تریتون (5/2%) به مدت یک ساعت در دمای اتاق شستشو داده شد و سپس به مدت 3 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد در داخل گلایسین 1/0 مولار قرار داده شد. در نهایت، ژل با کوماسی بلو به مدت 30 دقیقه رنگ آمیزی شده و سپس به صورت کامل رنگ بری شد. آزمون وسترن بلاتینگ: در طی این آزمون مقدار 100 میکروگرم از پروتئین در ژل 12% اکریلامید ران شد و سپس با استفاده از دستگاه انتقال دهنده، باندها به کاغذ نیتروسلولز منتقل شدند. سپس بلاک کردن کاغذ نیتروسلولز با استفاده از سرم آلبومین گاوی 15% انجام شد.

پس از سه بار شستشو با بافر فسفات و تریتون، آنتی بادی اولیه tPA افزوده و به مدت 3 ساعت شیکر شد و دوباره 3 بار شستشو کرده و  سپس آنتی بادی ثانویه افزوده شده و 5/1 ساعت شیکر شد. در نهایت 3 بار دیگر شستشو داده و سوبسترای Dab را روی کاغذ نیتروسلولز اضافه نموده و  حضور پروتئین موردنظر  به صورت باند مشخص شد.

جدول 1- آغازگرهای اختصاصی مورد استفاده برای مراحل PCR.

Table 1- Applied specific primers in PCR steps.

نتایج و بحث

نتایج PCR روی ژل آگارز نشان داد که قطعات تکثیر شده کاسکوتین و tPA توسط تکنیک SOEing-PCR به هم متصل، و ژن tPA شیمری ساخته شده است (شکل 3). نتایج غربالگری آبی/سفید، هضم با آنزیم­های برشی، PCR و توالی­یابی نشان داد که tPA شیمری به درستی همسانه شده است.

نتایج PCR روی گیاهان تراریخت نیز نشان داد که یک قطعه bp 1800 تکثیر می­شود که در نمونه­های غیر تراریخت دیده نمی­شود (شکل a4). پس از استخراج  RNAکل و تولید cDNA، واکنشRT-PCR  به کمک آغازگرهای اختصاصی موجب تکثیر باندهای1800 جفت بازی گردید (شکلb4). بنابراین ژن­های انتقال یافته در گیاهان تراریخت رونویسی می­شوند. 

شکل 3- ساخت قطعه tPA شیمری: M مارکر DNA (مارکر مخلوط شرکت ژن رولر)، چاهک 1 قطعه تکثیر شده کاسکوتین، چاهک 2 قطعه tPA، چاهک 3 قطعه تکثیر شده tPA شیمری، چاهک 4 قطعه tPA نرمال.

Figure 3- Construction of chimeric-tPA. M: DNA marker (lader mix, Gene ruler), line 1: cuscutain segment, line 2: tPA segment, line 3: constructed chimeric-tPA, line 4: normal-tPA and line.

شکل 4- الف (راست): بررسی گیاهان تراریخت با استفاده از PCR. M مارکر DNA (kb1)، چاهک 1و2 گیاهان حاوی tPA شیمری، چاهک­های 3 و 4 گیاهان حاوی tPA نرمال. چاهک C کنترل منفی(آب) و چاهک N گیاهان غیر تراریخت. ب (چپ): نتایج بررسی بیان ژن tPA با روش RT-PCR. چاهک C- کنترل منفی، چاهک های 1و2 گیاهان تراریخت حاوی tPA نرمال، چاهک­های 3 و 4 و 5 گیاهان تراریخت حاوی tPA شیمری، + کنترل مثبت (پلاسمید حاوی tPA)، چاهک   M مارکر 1 کیلو بازی.

Figure 4- A (Right): Analysis of plants using PCR. M: DNA ladder (1 kb), line 1and 2: transgenic plants containing chimeric-tPA, line 3 and 4: transgenic plants containing normal-tPA, Line C: negative control and line N is non-transgenic plants. B (Left): Results of tPA expression using RT-PCR. Line 1 and 2: transgenic plants containing normal-tPA, line 3, 4 and 5: transgenic plants containing chimeric-tPA, M: 1kb DNA ladder, and line + is plasmid containing tPA as positive control.

شکل5- آنالیز SDS-PAGE پروتئین­های استخراج شده گیاهان تراریخت و شاهد(غیر تراریخت). M: نشانگر پروتئینی، T1: گیاه تراریخت حاوی tPA نرمال، NT: گیاه شاهد (غیر تراریخت) و T2 گیاهان تراریخت حاوی tPA شیمری. در چاهک­های T یک باند اضافی معادل کنترل مثبت  مشاهده می­شود، در حالی که در گیاه شاهد این باند مشاهده نگردید.

Figure 5- SDS-PAGE analysis of purified proteins from transgenic and non-transgenic plants. M is protein ladder, T1 transgenic plants containing normal-tPA, NT non-transgenic plants and T2 transgenic plants containing chimeric-tPA. In T lines an extra band was observed while not seen in non-transgenic plants.

شکل6 – نتایج آزمون زیموگرافی. چاهک C کنترل مثبت (داروی اکتیواز)، چاهک 1 عصاره پروتئینی از گیاهان غیر تراریخت، چاهک 2 عصاره پروتئینی از گیاهان تراریخت حاوی tPA نرمال و چاهک 3 عصاره پروتئینی گیاهان تراریخت حاوی tPA شیمری

Figure 6- Results of zymography. Line C is positive control (Activase drug), line 1 plant extract from non-transgenic plants, line 2 plant extract of transgenic plant containing normal-tPA and line 3 protein extract of transgenic plant containing chimeric-tPA.

شکل 7- نتایج وسترن بلات. چاهک -C عصاره گیاه غیر تراریخت. چاهک­های 1 و 2 عصاره پروتئینی از گیاهان تراریخت حاوی tPA نرمال، چاهک­ 3 عصاره پروتئینی گیاهان تراریخت حاوی tPA شیمری و چاهک 4 کنترل مثبت (داروی اکتیواز).

Figure 7- result of western blotting. Line –C is non-transgenic plants, lines 1 and 2 protein extract of transgenic plants containing normal-tPA, line 3 protein extract of transgenic plants containing chimeric-tPA and line 4 posetive control (Activase drug).

انجام SDS-PAGE روی پروتئین استخراجی

در این آزمون پروتئین های استخراج شده از گیاهان تراریخت، در مقایسه با گیاهان شاهد یک باند اضافی با وزن مولکولی حدود 63-65 کیلودالتون(KDa )  نشان دادند که برابر وزن پروتئین موردنظر (tPA ) می‌باشد (شکل5).

آزمون زیموگرافی

نتایج آزمون زیموگرافی نشان داد که در محل چاهک مربوط به tPA به علت فعالیت پروتئولیتیکی اختصاصی آن زمینه آبی ژل سفید شده، در حالی که کنترل منفی (سایر پروتئین­ها) چنین خصوصیتی را نداشته و چاهک مربوط به آنها آبی می­ماند (شکل6). همچنین آزمون زیموگرافی نشان داد که با وجود بارگذاری مقدار برابر از tPA شیمری و نرمال، میزان فعالیت tPA شیمری بیشتر می­باشد (شکل 6 چاهک 3).  آنالیز وسترن بلات بر روی پروتئین های استخراج شده از گیاهان تراریخت نیز وجود یک باند مشخص با وزن حدود 63- 65 کیلو دالتون را نشان داد که برابر وزن مولکولی پروتئین tPA می‌باشد. در حالی که باند مشابهی در مورد پروتئین استخراج شده از گیاهان شاهد مشاهده نگردید (شکل7).

امروزه از مهندسی پروتئین و تولید پروتئین­های شیمری برای کاربردهای بیوتکنولوژی، صنعتی، پزشکی به منظور تولید پروتئین­های دارویی (Zhou et al., 2004)، متابولیت­های ثانویه (Hwang et al., 2013) و سوخت­های زیستی استفاده می­شود (Kim et al., 2011). در این مطالعه tPA نرمال و tPA شیمری جهت مقایسه میزان فعالیت و پایداری آنها با استفاده از روش اگروباکتریوم به گیاهان توتون منتقل گردیدند. گزارشات مختلفی از تاثیر جایگزینی بخش­های پروتئینی روی میزان بیان، پایداری و فعالیت پروتئین­های نوترکیب وجود دارد (Wu et al., 2004). بیان ژن Cry9Aa شیمری در گیاهان توتون نشان داد که مقدار پروتئین در مقایسه با پروتئین طبیعی افزایش بیشتری داشته است (Kuvshinov et al., 2001).  بیشتر مطالعات پروتئین­های شیمری با دستکاری در ساختار خود پروتئین بوده است (Guzma´n et al., 2014)، اما در این تحقیق برای اولین بار یک قطعه از پروتئین گیاهی با یک پروتئین انسانی همجوش شده است. قطعه پروتئین گیاهی که از آنزیم کاسکونین گرفته شده است که دارای فعالیت آنزیمی قوی و پایداری بالایی می­باشد (Marc et al., 2010). به همین علت، ژن tPA شیمری به کمک روش­های مهندسی پروتئین سنتز و به همراه tPA طبیعی انسانی در گیاهان توتون بیان گردید. الحاق ژن انتقالی به ژنوم و رونویسی آن در گیاهان تراریخت توتون با استفاده از PCR و RT-PCR تایید شد. بعد از ساخت ژن شیمری tPA توسط روش SOEing PCR از ناقل بیانی  pBI121 جهت کلونینگ وانتقال ژن شیمری به توتون استفاده گردید. این ناقل به علت دارا بودن یک سری ویژگی های مطلوب به میزان زیادی در انتقال ژن به گیاهان مورد استفاده قرار می گیرد (Chen et al., 2005). جهت افزایش رونویسی، ژن شیمری مورد نظر بین خاتمه دهنده NOS و پیش بر CaMV 35S قرار داده شد، زیرا پیش برنده CaMV 35S می­تواند میزان بیان را در مقایسه با پیش­برهای دیگر مانندUbi  تا 60 برابر افزایش دهد (Sunil et al., 2003).

نتایج تکنیک  PCRو  RT-PCR روی گیاهان تراریخت، نشان از انتقال ژن شیمری tPA به گیاهان باززایی شده و رونویسی آن می­باشد. در آزمایشاتSDS-PAGE  و وسترن بلات تنها تفاوت بین گیاهان تراریخت و غیر تراریخت وجود یک باند اضافی پروتئینی با وزن مولکولی حدود 63-65 کیلودالتون در گیاهان تراریخت است که نشان می­دهد ژن شیمری منتقل شده ترجمه می­شود (Hahn et al., 2008 and Huessen at al., 1993).

برای ارزیابی فعالیت سرین پروتئازی tPA از آنالیز زیموگرافی استفاده شد. نتایج نشان داد که این آزمون فوق العاده حساس است و مقادیر کمتر از 8 پیکوگرم از ماتریکس متالوپروتئاز روی زیموگرام ژلاتین قابل شناسائی است که از این لحاظ با آزمون ELISA  قابل مقایسه می باشد (Joosten et al., 2003). در آزمون زیموگرافی پروتئین­های استخراج شده از نمونه­های گیاهی غیر تراریخت نواحی شفاف را نشان ندادند ولی نمونه­های تراریخت نواحی شفافی را مشابه با داروی اکتیواز نشان دادند. اگرچه مقدار برابری از عصاره پروتئینی حاوی tPA شیمری و نرمال بارگذاری شد، نتایج ژل زیموگرافی نشان ­داد که در مقایسه با tPA نرمال میزان نواحی شفاف در tPA شیمری بیشتر است و این نشان می دهد که فعالیت و پایداری tPA شیمری بهبود یافته است، بنابراین قطعه افزوده شده کاسکوتین به ژن tPA موجب افزایش فعالیت و یا پایداری آن شده است. در بعضی از گیاهان تراریخت با وجود تکثیر قطعه ژن شیمری احتمالا به دلیل قرار گرفتن ژن در ناحیه هتروکروماتینی ژنوم گیاه و یا اثرات موضعی ژن وارد شده، پروتئین موردنظر تولبد نشد. عدم وجود فعالیت زیموژنی پروتئین تولید شده نیز به علت حضور پروتئازهای گیاهی در داخل عصاره پروتئینی و تجزیه پروتئین موردنظر شده می­باشد (Ma et al., 1999). اهمیت زیموگرافی در این است که فعالیت دامین سرین پروتئاز را بصورت باند­های مجزا روی ژل SDS-PAGE نشان می­دهد، اما اندازه باندها در زیموگرام معادل باندهای وسترن بلات نیست. نمونه­های گیاهی غیر تراریخت نواحی شفاف را نشان ندادند، ولی نمونه های تراریخت نواحی شفافی را نشان دادند که در ژل دارای پلاسمینوژن نتیجه عملtPA می باشد. مبدع این روش نیز نشان داده است که پروتئازهای غیروابسته به پلاسمینوژن را می­توان بوسیله حذف پلاسمینوژن از ماتریکس ژلاتین- پلی آکریل آمید، مشخص نمود (Huessen et al., 1980). در طی تحقیق، بعضی از نمونه های پروتئینی گیاهی که در آنالیز زیموگرافی فعالیت نشان می دادند در آنالیز وسترن بلات حضور پروتئین موردنظر را اثبات نکردند که این می تواند اثبات کننده حساسیت بالای آنالیز زیموگرافی نسبت آنالیز وسترن بلات باشد. آنالیز وسترن بلات با استفاده از آنتی بادی­های مونو یا پلی­کلونال، آنتی­ژن­های خاصی را شناسائی می­کند. بنابراین با توجه به نتایج وسترن بلات می­توان گفت که پروتئین شیمری tPA به درستی بیان شده و دارای ساختار مناسبی می­باشد که با آنتی بادی مونوکلونال عکس­العمل نشان می­دهد. همانطور که در شکل 7 نیز مشاهده می­شود علی الرغم بارگذاری مقادیر برابر از غلظت­های عصاره پروتئینی حاوی  tPA شیمری و نرمال در وسترن بلات، اما باند مربوط به tPA شیمری بزرگتر می­باشد که این می­تواند به علت پایداری بیشتر tPA شیمری و عدم تجزیه آن باشد. نتایج tPA شیمری در گیاهان ترارخت نوید بخش تولید این پروتئین دارویی مهم در سطح تجاری می­باشد. همچنین می­توان گفت که تکنولوژی پروتئین­های شیمری راهکار بسیار خوبی برای رفع برخی چالش­های مهم پیش روی تولید داروهای نوترکیب مثل پایداری و فعالیت آنها می­باشد.

سپاسگزاری

اعتبار این طرح توسط دانشگاه بوعلی سینا تامین شده است و از کلیه کسانی که در این پژوهش ما را یاری رسانده­اند کمال قدردانی را داریم.