Studying exon 4 of kappa-casein gene in Kermani sheep using PCR-RFLP

Authors

1 Department of Animal Science, Faculty of Agriculture, College of Agriculture, Shahid Bahonar University of Kerman

2 Assistant Professor, Department of Animal Science, College of Agriculture, Shahid Bahonar University of Kerman, Kerman, Iran.

3 Professor, Department of Animal Science, College of Agriculture, Shahid Bahonar University of Kerman, Kerman, Iran.

Abstract

Kappa casein plays an essential role in the case of micelle stabilization and their size and the specific biological function. Hence, the purpose of this study was to investigate polymorphism in the exon 4 gene of CSN3 using the PCR-RFLP technique. For this purpose, blood samples were taken from 150 Kermani sheep, and genomic DNA was extracted. The polymerase chain reaction (PCR) was performed a pair of specific primer. PCR productions were separated using agarose gel. The amplified fragment was digested with HaeIII enzyme and determining the genotype was performed. The results of this study led to the identification of two genotypes that allele frequencies were estimated by Popgene software. Allele frequency of A and B alleles for CSN3 gene was respectively 70% and 30% for the Kermani sheep population. Chi-square test showed that studied population is not in Hardy-Weinberg equilibrium (P≤0.05). Number of observed allele, number of effective allele, observed heterozygosity, expected heterozygosity, Nei’s index, mean of heterozygosity and Shanon’s index were obtained 2, 1.72, 0.60, 0.43, 0.42, 0.42 and 0.61 respectively. In conclusion, it can be concluded that studied Kermani sheep population has a high degree of genetic variability. Therefore, next studies on these animals, especially on native animals should aim to determine crucial relationship between kappa casein genotypes and maternal characteristics, as selection could be enhanced by the inclusion of genetic markers in breeding decisions.

Keywords


بررسی اگزون چهارم ژن کاپاکازئین گوسفند کرمانی با تکنیک PCR-RFLP

 

مریم محمودی*1، احمد آیت اللهی مهرجردی2، محمدرضا محمدآبادی3

 

1دانشجوی کارشناسی ارشد بخش علوم دامی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شهید باهنر کرمان، کرمان، ایران.

2استادیار، بخش علوم دامی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شهید باهنر کرمان، کرمان، ایران.

3استاد بخش علوم دامی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شهید باهنر کرمان، کرمان، ایران.

تاریخ دریافت: 12/4/1396، تاریخ پذیرش: 20/08/1396

چکیده

کاپاکازئین در پایداری میسل­های کازئین و  اندازه و عملکرد اختصاصی آن­ها اصلی­ترین نقش را در بین پروتئین­های شیر دارد. لذا، هدف مطالعه حاضر بررسی چندشکلی در ناحیه اگزون چهار ژن CSN3 با استفاده از تکنیک PCR-RFLP بود. بدین منظور از 30 راس گوسفند نژاد کرمانی خونگیری و DNA ژنومی استخراج گردید. واکنش زنجیره­ای پلی­مراز (PCR) با استفاده از یک جفت پرایمر اختصاصی انجام گرفت، محصولات PCR روی ژل آگارز الکتروفورز شدند. قطعه تکثیر شده با آنزیم HaeIII هضم شد و تعیین ژنوتیپ انجام گرفت. نتاج بررسی­ها منجر به شناسایی دو ژنوتیپ شد که فراوانی­های آللی به وسیله نرم افزار Popgene برآورد شدند. فراوانی­های آللی A و B برای ژن CSN3 به­ ترتیب برابر 7/0 و 3/0 برای جمعیت مورد بررسی به دست آمد. آزمون مربع کای بیانگر عدم تعادل هاردی-وینبرگ در جمعیت گوسفند کرمانی بود (05/0P≤). تعداد آلل مشاهده شده (na)، تعداد آلل موثر (ne)، هتروزیگوسیتی مشاهده شده، هتروزیگوسیتی مورد انتظار، شاخص نئی، متوسط هتروزیگوسیتی و شاخص شانون برای این جمعیت به ترتیب 2، 72/1، 60/0، 43/0، 42/0، 42/0 و 61/0 به دست آمد. در مجموع می­توان نتیجه گرفت که جمعیت­های گوسفند مورد بررسی در این پژوهش با توجه به جایگاه­های مورد مطالعه، از تنوع ژنتیکی نسبتاً بالایی برخوردار هستند. بنابراین، مطالعات بعدی روی این دا مها، به ویژه دام های بومی باید به سمت و سویی سوق داده شوند تا همبستگی قطعی بین ژنوتیپ­های کاپاکازئین و خصوصیات مادری تعیین شود تا بتوان با وارد کردن اطلاعات نشانگرهای ملکولی درطرح­های اصلاح نژادی، پاسخ به انتخاب را افزایش داد.

واژه­های کلیدی: پلی مورفیسم##، ژن CSN3##، ##PCR RFLP، گوسفند کرمانی##.

 

 

مقدمه

نژادهای بومی در هر کشور به‌عنوان سرمایه­ ملی و محصولی استراتژیک در اقتصاد و رونق آن کشور محسوب می­شوند. از طرف دیگر،  به دلیل شدت انتخاب پایین، تعداد زیاد پرورش‌دهندگان و محدودیت استفاده از تلقیح مصنوعی در گوسفند و بز، معمولا از تنوع ژنتیکی بالایی برخوردارند (Vajed Ebrahimi et al., 2016). از طرفی با گذشت زمان و کسب آگاهی بیشتر نسبت به اهمیت صفات مختلف، نیازهای جدیدی مطرح می­شود که متخصصین اصلاح نژاد را بر آن می­دارد که از ذخیره ژنی دام­های بومی استفاده نمایند. این مسئله، به خصوص با افزایش تولید محصولات دامی و تولید محصولات پیش‌بینی‌نشده در آینده، لزوم حفظ تنوع ژنتیکی در دام­های بومی را الزامی ساخته است (Vajed Ebrahimi et al., 2016) چرا که یک گونه بدون تنوع ژنتیکی کافی قادر به سازگاری با تغییرات محیطی و مبارزه با انگل­ها نیست (Mohammadabadi et al., 2017). به طور کلی در بیشتر کشورهای جهان هدف از اصلاح نژاد گوسفند سودآوری از طریق بهبود یک یا چند صفت اقتصادی در جامعه است (Soufy et al.,  2009). در ایران بیش از 50 میلیون رأس گوسفند، شامل 26 نژاد گوسفند در ایران وجود دارد که با مناطق مختلف سازگار شده­اند (Mohammadabadi and Sattai Mokhtari, 2013; Zamani et al.,  2015; Khodabakhshzadeh et al., 2016). گوسفند کرمانی یکی از مهم­ترین نژادهای گوسفند بومی ایران است و به خوبی با شرایط محیطی خشن و نامطلوب قسمت جنوب شرقی کشور که عمدتا آب و هوای گرم و خشک غالب است و مراتع کم و کم کیفیت هستند، سازگار شده است (Vajed Ebrahimi et al., 2017). این گوسفند دنبه دار با اندازه متوسط و پشم سفید است (Mohammadabadi et al., 2017) و در استان کرمان بسیاری از نیازهای مردم عشایر و دامپروران این استان را تأمین می‌کند (Mohammadabadi, 2017). از این رو، توجه به بحث اصلاح نژاد این دام و بهبود شرایط محیطی و ژنتیکی گوسفند کرمانی کمک به سزایی در تأمین بخشی از نیازهای دامی مردم کرده است؛ لذا، باید تنوع ژنتیکی آنها محاسبه شده و سپس در حفظ این نژادهای بومی تلاش شود. حفاظت باید بر اساس دانش عمیقی از منابع ژنتیکی نژادهای خاص باشد؛   در این راستا، تلاش برای شناسایی و تعیین خصوصیات ژنتیکی نژادهای بومی و محلی بسیار اهمیت دارد (Shojaei et al., 2010). استفاده از نشانگرهای مولکولی در سال­های اخیر جهت تعیین تنوع ژنتیکی بین جمعیت­ها و حیوانات حفاظت‌شده، کاربرد گسترده­ای یافته است. میزان چندشکلی به‌دست‌آمده از این نشانگرهای ژنتیکی، یکی از پارامترهای قابل ارزیابی برای مطالعه جمعیت­های مختلف و درک تفاوت­های ژنتیکی بین جمعیت­هاست (Vajed Ebrahimi et al., 2016). گوسفند از نظر تعداد نژاد از تمام حیوانات اهلی متنوع­تر و در هر منطقه و موقعیت جغرافیایی دارای ویژگی­های همان منطقه می­باشد. به طور اعم و صرف نظر از شرایط گوناگون جغرافیایی، پرورش گوسفند در کلیه نقاط دنیا به منظور بهره­برداری از صفات تولیدی آن صورت می­گیرد. تولید شیر میش متناسب با تقاضای بازار و احتیاجات غذایی دامداران مورد توجه قرار گرفته و دامداران ترجیح می­دهند که میش­های شیروار را در گله خود حفظ نمایند. طی سال های 1383 تا 1387 تولید شیر دارای یک روند رو به رشد بوده است (Kharrati Koopaei, et al., 2011). با وجود روند افزایشی تولید شیر در کشور،  اما هنوز سرانه مصرف شیر از حد استاندارد جهانی پایین تر است. سرانه مصرف شیر در کشور برای هرنفر برابر با 95 کیلوگرم می باشد، در حالی که سرانه مصرف شیر در جهان برابر با 169 کیلوگرم و در اروپا برابر با 350 کیلوگرم در سال است (Kharrati Koopaei, et al., 2011). با توجه به آمار و اطلاعات موجود می­توان دریافت که اهداف اصلاح نژادی در ایران بایستی برای افزایش تولید شیر در کشور برنامه ریزی شود. لذ،ا مطالعه و بررسی ژن­هایی که روی تولید و ترکیب شیر نقش موثری دارند اهمیتی دو چندان می یابد (Kharrati Koopaei, et al., 2012). پروتئین اصلی شیر کازئین نام دارد که در فرآیند تولید پنیر نقش اساسی دارد. کازئین حدود 80% از پروتئین­های شیر را به خود اختصاص داده و دارای اشکال متفاوتی است (Alinaghizadeh et al., 2007). کازئین­ها توسط چهار ژن دسته­بندی و کدگذاری می­شوند و حدود 250 کیلوباز از DNA ژنومی را شامل می­شوند (Yahyaoui, 2003). کازئین­ها: آلفا S1 کازئین، آلفا S2 کازئین، بتا کازئین و کاپاکازئین در گوسفند به ترتیب توسط ژن­های اتوزومی CSN1S1، CSN1S2، CSN2 و CSN3 که بر روی کروموزوم شماره شش قرار دارند کد می­شوند (Rijnkels et al., 2002). کاپاکازئین نقش اصلی را در تعیین میسل­های شیر ایفا می­کند و مسئول انعقاد شیر می­باشد (Alinaghizadeh et al., 2007). کاپاکازئین یکی از مهم­ترین پروتئین­های شیر است (شکل 1) و در گوسفند توسط ژنی با پنج اگزون و چهار اینترون کنترل می­گردد (Supakorn, 2009). نواحی کد کننده ژن کاپاکازئین شامل بخشی از اگزون 3 با 9 اسید آمینه و اگزون 4 با 162 اسید آمینه می­باشد (Yahyaoui et al., 2003). 90 درصد ناحیه کد شونده­ی پروتئین بالغ آن توسط اگزون شماره­ی 4 کد می­شود (Yahyaoui et al., 2000). ژن کاپاکازئین در گاوهای ایرانی مطالعه شده است (Alinaghizadeh et al., 2007)، اما در گوسفندان ایرانی و به ویژه گوسفند کرمانی مورد مطالعه قرار نگرفته است. با توجه به موارد ذکر شده هدف این مطالعه بررسی چندشکلی در ناحیه اگزون چهار ژن CSN3 با استفاده از تکنیک PCR-RFLP  بود.


 

 

 

شکل 1- ساختار ژن کاپاکازئین. اگزون­ها در شکل به عنوان جعبه­هایی با اعداد و اندازه­های ذکر شده در بالا به تصویر کشیده شده­اند. جعبه­های سفید مناطق غیر کد کننده، قسمت­های هاشورخورده قسمتی از اگزون کد کننده پپتید سیگنال و جعبه­های سیاه قسمتی از اگزون­های کد کننده پروتئین بالغ را نشان می دهند (Yahyaoui et al., 2000).

Figure 1- Kappa casein gene structure. Exons are depicted schematically as boxes, white (5’ and 3’untranslated regions), dashed (part of exon encoding the signal peptide), and black (part of exons encoding the mature protein). Exon numbers and sizes are indicated above and below the boxes, respectively (Yahyaoui et al., 2000).

 


مواد و روش­ها

در این تحقیق از 30 راس گوسفند نژاد کرمانی (10 راس میش و 20 راس قوچ) به­صورت تصادفی از گله­های موجود در استان کرمان خون­گیری به­عمل آمد. نمونه­های خون کامل از سیاهرگ وداج گردن و با استفاده از لوله خلاء دار 5/2 میلی­لیتری حاوی ماده ضد انعقاد EDTA تهیه و در داخل یخ در دمای چهار درجه سانتی­گراد گذاشته شد. نمونه­ها، در فلاسک یخ به آزمایشگاه منتقل و تا زمان استخراج DNA، در دمای 20- درجه سانتی­گراد نگهداری شدند. استخراج DNA از نمونه‌های خون کامل به روش بهینه ‌شده و تغییریافته استخراج نمکیانجام گردید (Abadi et al. 2009). برای تجزیه سلول­های قرمز از بافر شستشو و نیز برای تجزیه اسیدهای نوکلئیک از بافر لایسیز، استفاده گردید. کیفیت و کمیت نمونه­های DNA استخراج شده با ژل آگارز 1% تعیین شدند. برای تکثیر قطعه­ی مورد نظر جایگاه ژن کاپاکازئین دام­ها از آغازگرهای 5´-TCC CAA TGT TGT ACT TTC TTA ACA TC-3´  و  5´-GCG TTG TCC TCT TTG ATG TCT CCT TAG-3´ استفاده شد.  

در این تحقیق از دستگاه ترموسایکلر peqSTAR 96X ساخت آلمان، با بلوک 96 تایی برای تیوب‌های PCR به حجم 2/0 میلی‌لیتر، استفاده گردید. برنامه دمایی برای آغازگرها مورد مطالعه به‌ صورت واسرشته سازی اولیه در دمای 95 درجه سانتی­گراد به مدت 5 دقیقه و به دنبال آن 30 چرخه شامل واسرشته سازی در دمای 95 درجه سانتی­گراد به مدت 30 ثانیه، اتصال آغازگرها در دمای 58 درجه سانتی­گراد به مدت 45 ثانیه، بسط اولیه در دمای 72 درجه سانتی­گراد به مدت 45 ثانیه و سرانجام بسط نهایی در دمای 72 درجه سانتی­گراد به مدت 10 دقیقه بهینه شد. واکنش­های PCR در حجم نهایی 25 میکرولیتر انجام شد. محصولات PCR روی ژل آگارز الکتروفورز شدند.

از آنزیم برشی BsuRI (HaeIII) با جایگاه برشی 5´GG↓CC3´ برای هضم محصولات PCR استفاده شد. از حجم 5/1 میکرولیتر آنزیم برشی برای هضم هر نمونه از محصولات PCR استفاده شد. سپس تمامی نمونه­های آنزیمی به مدت 16 ساعت، در دمای 37 درجه سانتی­گراد در بن ماری نگهداری شد، و پس از اتمام زمان هضم آنزیمی برای بررسی قطعات برشی از ژل آگارز 2% استفاده شد تا قطعات حاصل از هضم به خوبی از هم تفکیک شوند. آزمون نسبت درست نمایی برای تعادل هاردی- واینبرگ (05/0P<) در هریک از جایگاه­ها، همچنین تنوع درون جمعیتی به ‌صورت متوسط هتروزیگوسیتی مورد انتظار و معیارهای چندشکلی از جمله تعداد آلل مشاهده ‌شده و مؤثر، با استفاده از نرم‌افزار PopGene انجام گردید (Yeh et al. 1999).

 

نتایج و بحث

نتایج حاصل از الکتروفورز روی ژل آگارز 1% نشان داد که کیفیت DNA های استخراج‌ شده با استفاده از روش نمکی بهینه‌شده بسیار مناسب و تقریباً تمامی باندهای نمونه‌ها شفاف و بدون کشیدگی بودند (شکل 2).

 

 

 

شکل 2- الکتروفورز چند نمونه DNA استخراج‌شده گوسفندان مورد مطالعه روی ژل آگارز 1 درصد.

Figure 2- Electerophoresis of some studied sheep DNA samples on 1% Agarose gel.

 

 

نتیجه الکتروفورز محصولات واکنش زنجیره­ای پلی­مراز روی ژل آگارز، صحت تکثیر قطعه­ 645 جفت بازی از ژن CSN3 را مورد تایید قرار داد (شکل 3). نتایج حاصل از هضم آنزیمی و الکتروفورز بر روی ژل آگارز 2%، برای آگزون چهار ژن CSN3 (جایگاه 645 جفت بازی) در شکل 4 نشان داده شده است. در این جایگاه آلل A  شامل دو قطعه 416 و 229 جفت بازی (با یک سایت برش) و آلل B شامل یک قطعه 645 جفت بازی (بدون سایت برش) است. لذا، باید ژنوتیپ AA شامل دو قطعه 416 و 229 جفت بازی، ژنوتیپ BB شامل یک قطعه 645 جفت بازی و ژنوتیپ AB شامل سه قطعه 645، 416 و 229 جفت بازی باشد. در این پژوهش تعداد 12 ژنوتیپ AA (40%) و تعداد 18 ژنوتیپ AB (60%) مشاهده شدند و ژنوتیپ BB مشاهده نشد (جدول 1 و شکل 4).

 

 

 

جدول 1- فراوانی­های ژنوتیپی و آللی مشاهده شده در گوسفندان مورد مطالعه.

Table 1- Genotype and allele frequencies in studied sheep.

ژنوتیپ

Genotype

تعداد

Number

فراوانی

Genotype frequency

آلل

Allele

فراوانی

Allele frequency

AA

12

0.40

A

0.7

AB

18

0.60

BB

0

0.00

B

0.3

 

 

 

شکل 3- الکتروفورز محصولات PCR روی ژل آگارز یک درصد. نشانگر اندازه: M100.

Figure 3- Electrophoresis of PCR products on a 1% Agarose gel. Size marker: M100.

 

 

شکل 4- الکتروفورز محصولات  حاصل از هضم برای ژن CSN3. نشانگر اندازه: M100.

Figure 4- Electrophoresis of digested products for the CSN3 gene. Size marker: M100.

 

 

در این تحقیق فراوانی آلل­های A و B به ترتیب 70 و 30 درصد محاسبه گردید. آزمون مربع کای بیانگر عدم تعادل هاردی-وینبرگ در جمعیت گوسفند کرمانی بود (05/0P≤). این عدم تعادل می­تواند به دلیل تعداد کم نمونه، اثر انتخاب انجام شده در این دام­ها، جهش­های صورت گرفته و یا به دلیل خویشاوندی و همخونی باشد. تعداد آلل مشاهده شده (na)، تعداد آلل موثر (ne)، هتروزیگوسیتی مشاهده شده، هتروزیگوسیتی مورد انتظار، شاخص نئی، متوسط هتروزیگوسیتی و شاخص شانون برای این جمعیت به ترتیب 2، 72/1، 60/0، 43/0، 42/0، 42/0 و 61/0 به دست آمد. در مجموع می­توان نتیجه گرفت که جمعیت­های گوسفند مورد بررسی در این پژوهش با توجه به جایگاه­های مورد مطالعه، از تنوع ژنتیکی نسبتاً بالایی برخوردارند. در پژوهشی Feligini et al. (2005) چندشکلی تک نوکلنوتیدی ناحیه کد کننده ژن کاپاکازئین را در 120 گوسفند از سه کشور کرواسی، صربستان و ایتالیا مورد بررسی قرار دادند و نشان دادند که فراوانی آلل­های A و B به ترتیب برابر 12/0 و 88/0 برای گوسفندان نژاد Pag  کرواسی، 27/0 و 73/0 برای گوسفندان نژاد Sarda ایتالیا و 45/0 و 55/0 برای گوسفندان نژاد Pramenka صربستان است. در پژوهشی Mohammadi et al. (2009) چندشکلی ژنتیکی ژن کاپاکازئین گاوهای محلی و هلشتاین استان کرمان را  با استفاده از تکنیک PCR-RFLP مطالعه نمودند. این محققین فراوانی آلل­های A و B را به ترتیب 70 و 30 درصد گزارش کردند. آزمون مربع کای بیانگر تعادل هاردی-وینبرگ در جمعیت مورد مطالعه آنها بود. با توجه به این که اثر ژن کاپاکازئین بر خصوصیات پنیرسازی شیر در گاو گزارش شده است (Aleandri et al. 1990; Lodes et al., 1996; Alinaghizadeh et al., 2007)، باید این ارتباط در گوسفند هم مورد بررسی قرار گیرد، چرا که در شیر گوسفند که بیشتر برای ساخت پنیر استفاده می­شود این موضوع دارای اهمیت بیشتری است. بنابراین، مطالعات بعدی روی این دا مها، به ویژه دام های بومی باید به سمت و سویی سوق داده شوند تا ارتباط قطعی بین ژنوتیپ­های کاپاکازئین و خصوصیات مادری تعیین شود تا بتوان با وارد کردن اطلاعات نشانگرهای ملکولی در طرحهای به نژادی پاسخ به انتخاب را افزایش داد. با توجه به این که نشانگرهای ملکولی در سطح ژنوم احتیاج به بیان ژن ندارند و می توانند حتی در دام­های نر، بزغاله­ها و دام­های ماده  غیرشیرده جهت تشخیص ژنوتیپ صفات مربوط به شیر و رشد مورد استفاده قرار گیرند و با توجه به این که تعیین ژنوتیپ براساس DNA توسط نشانگرهای ملکولی بسیار دقیق و سریع است و در هر مرحله از حیات حیوان می تواند در اصلاح نژاد مورد استفاده قرار گیرد، استفاده از نشانگرهای DNA در دام های کشور و استان پیشنهاد می گردد. به علت این که انتخاب به کمک نشانگرهای ملکولی هزینه­های اجرایی را به شدت کاهش می­دهد و باعث کاهش فاصله نسل در اصلاح نژاد دام می­گردد، استفاده از نشانگرهای DNA موجبات پیشرفت ژنتیکی بیشتری را فراهم خواهد آورد.

 

 

 

منابع

Abadi MRM, Askari N, Baghizadeh A, Esmailizadeh AK (2009). A directed search around caprine candidate loci provided evidence for microsatellites linkage to growth and cashmere yield in Rayini goats. Small Ruminant Research 81: 146-151.##

Aleandri R, Buttazzoni LG, Schneider JC, Caroli A, Davoli R (1990). The effects of milk protein polymorphisms on milk components and cheese-producing ability. Journal of Dairy Science 73: 241–255.##

Alinaghizadeh R, Mohammad Abadi MR, Moradnasab Badrabadi S (2007). Kappa-casein gene study in Iranian Sistani cattle breed (Bos indicus) using PCR-RFLP. Pakistan Journal of Biological Sciences 10: 4291-4294.##

Feligini M, Vlaco S, Curik VC, Parma P, Greppi GF, Enne G (2005). A single nucleotide polymorphism in the sheep kappa-casein coding region. Journal of Dairy Research 72: 1–5.##

Feligini M, Cubric V, Parma P, Curik I, Greppi GF, Enne G (2002). Designed DNA test for discrimination of A and B alleles. Food Technology and Biotechnology 40: 293-298.##

Kharrati Koopaei H, Mohammad Abadi MR, Ansari Mahyari S, Tarang AR, Potki P, Esmailizadeh AK (2012). Effect of DGAT1 variants on milk composition traits in Iranian Holstein cattle population. Animal Science Papers and Reports 30: 231-240.##

Kharrati Koopaei H, Mohammadabadi MR, Ansari Mehyari S, Esmailizadeh AK, Tarang A, Nikbakhti M (2011). Genetic Variation of DGAT1 Gene and its Association with Milk Production in Iranian Holstein Cattle Breed Population. Iranian Journal of Animal Science Research 3: 185-192 (In Farsi).##

Khodabakhshzadeh R, Mohammadabadi MR, Esmailizadeh Koshkoieh A, Moradi-Shahrebabak H, Bordbar F, Ansari Namin S (2016). Identification of point mutations in exon 2 of GDF9 gene in Kermani sheep. Polish Journal of Veterinary Sciences 19: 281–289.##

Lodes A, Krause I, Buchberger J, Aumann J, Klostermeyer H (1996). The influence of genetic variants of milk proteins on the compositional and technological properties of milk. 1. Casein micelle size and the content of non-glycosylated k-casein. Milchwissenschaft 51: 368–373.##

Mohammadabadi MR (2017). Role of clostridium perfringens in pathogenicity of some domestic animals. Journal of Advances in Agriculture 7: 1117-1121.##

Mohammadabadi MR, Esfandyarpoor E, Mousapour A (2017). Using Inter Simple Sequence Repeat Multi-Loci Markers for Studying Genetic Diversity in Kermani Sheep. Journal of Research and Development 5: 154-157.##

Mohammadabadi MR, Sattayimokhtari R (2013). Estimation of (co) variance components of ewe productivity traits in Kermani sheep. Journal of Animal Science 46: 45-51.##

Mohammadi A, Mohammadabadi MR, Mirzaei H, Baghizadeh A, Dayani O, Asadi Fozi M, Bahrampoor V (2009). Study of Kappa Casein gene of local and Holstein dairy cattle in Kerman province using PCR-RFLP method. Journal of Agricultural Science and Natural Resources 16: 125-132 (In Farsi).##

Rijnkels M (2002). Multispecies comparison of the casein gene loci and evolution of casein gene family. Journal of Mammary gland Biology and Neoplasia 7: 327-345.‏##

Shojaei M, Mohammad Abadi MR, Asadi Fozi M, Dayani O, Khezri A, Akhondi M (2010). Association of growth trait and Leptin gene polymorphism in Kermani sheep. Journal of Cell and Molecular Research 2: 67-73.##

Soufy B, Mohammadabadi MR, Shojaeyan K, Baghizadeh A, Ferasaty S, Askari N, Dayani O (2009). Evaluation of Myostatin gene polymorphism in Sanjabi sheep by PCR-RFLP method. Animal Science Reserches 19: 81-89 (In Farsi).##

Supakorn CH (2009). The important candidate genes in goats. Walailak Journal of Science and Technology 6: 17-36.##

Vajed Ebrahimi MT, Mohammad Abadi MR, Esmailizadeh AK (2016). Analysis of genetic diversity in five Iranian sheep population using microsatellites markers. Journal of Agricultural Biotechnology 7: 143-158.##

Vajed Ebrahimi MT, Mohammad Abadi MR, Esmailizadeh AK (2017). Using microsatellite markers to analyze genetic diversity in 14 sheep types in Iran. Archiv fuer Tierzucht (Arch. Anim. Breed) 60: 183-189.##

Yahyaoui MH, Angiolillo A, Pilla F, Sanchez A, Folch JM (2003). Characterization and genotyping of the caprine κ-casein variants. Journal of Dairy Science 86: 2715-2720.‏##

Yahyaoui MH, Coll A, Sanchez A, Folch JM (2000). Genetic polymorphism of the caprine kappa casein gene. Journal of Dairy Research 68: 209-216.##

Yeh FC, Yang R, Boyle T (1999). POPGENE. Microsoft Window based freeware for population genetic analysis. Version 1.32. Centre for International Forestry Research, University of Alberta.‏##

Zamani P, Akhondi M, Mohammadabadi MR (2015). Associations of Inter-Simple Sequence Repeat loci with predicted breeding values of body weight in sheep. Small Ruminant Research 132: 123-127.##

 

 

 

 

 

Studying exon 4 of kappa-casein gene in Kermani sheep using PCR-RFLP

 

Mahmoodi M.*1, Ayatollahi Mehrjerdi A.2, Mohammadabadi M.R.3

 

1MSc Student, Department of Animal Science, Faculty of Agriculture, College of Agriculture, Shahid Bahonar University of Kerman, Kerman, Iran.

2Assistant Professor, Department of Animal Science, College of Agriculture, Shahid Bahonar University of Kerman, Kerman, Iran.

3Professor, Department of Animal Science, College of Agriculture, Shahid Bahonar University of Kerman, Kerman, Iran.

 

 

Abstract

Kappa casein plays an essential role in the case of micelle stabilization and their size and the specific biological function. Hence, the purpose of this study was to investigate polymorphism in the exon 4 gene of CSN3 using the PCR-RFLP technique. For this purpose, blood samples were taken from 150 Kermani sheep, and genomic DNA was extracted. The polymerase chain reaction (PCR) was performed a pair of specific primer. PCR productions were separated using agarose gel. The amplified fragment was digested with HaeIII enzyme and determining the genotype was performed. The results of this study led to the identification of two genotypes that allele frequencies were estimated by Popgene software. Allele frequency of A and B alleles for CSN3 gene was respectively 70% and 30% for the Kermani sheep population. Chi-square test showed that studied population is not in Hardy-Weinberg equilibrium (P≤0.05). Number of observed allele, number of effective allele, observed heterozygosity, expected heterozygosity, Nei’s index, mean of heterozygosity and Shanon’s index were obtained 2, 1.72, 0.60, 0.43, 0.42, 0.42 and 0.61 respectively. In conclusion, it can be concluded that studied Kermani sheep population has a high degree of genetic variability. Therefore, next studies on these animals, especially on native animals should aim to determine crucial relationship between kappa casein genotypes and maternal characteristics, as selection could be enhanced by the inclusion of genetic markers in breeding decisions.

Keywords: polymorphism, CSN3 gene, PCR-RFLP, Kermani sheep.

 



*  نویسنده مسئول: مریم محمودی                  تلفن: 03431322689                                              Email:  mary.mahmoodi89@gmail.com

* Corresponding Author: Mahmoodi M.           Tel:  03431322689            Email: mary.mahmoodi89@gmail.com

Abadi MRM, Askari N, Baghizadeh A, Esmailizadeh AK (2009). A directed search around caprine candidate loci provided evidence for microsatellites linkage to growth and cashmere yield in Rayini goats. Small Ruminant Research 81: 146-151
Aleandri R, Buttazzoni LG, Schneider JC, Caroli A, Davoli R (1990). The effects of milk protein polymorphisms on milk components and cheese-producing ability. Journal of Dairy Science 73: 241–255
Alinaghizadeh R, Mohammad Abadi MR, Moradnasab Badrabadi S (2007). Kappa-casein gene study in Iranian Sistani cattle breed (Bos indicus) using PCR-RFLP. Pakistan Journal of Biological Sciences 10: 4291-4294
Feligini M, Vlaco S, Curik VC, Parma P, Greppi GF, Enne G (2005). A single nucleotide polymorphism in the sheep kappa-casein coding region. Journal of Dairy Research 72: 1–5
Feligini M, Cubric V, Parma P, Curik I, Greppi GF, Enne G (2002). Designed DNA test for discrimination of A and B alleles. Food Technology and Biotechnology 40: 293-298
Kharrati Koopaei H, Mohammad Abadi MR, Ansari Mahyari S, Tarang AR, Potki P, Esmailizadeh AK (2012). Effect of DGAT1 variants on milk composition traits in Iranian Holstein cattle population. Animal Science Papers and Reports 30: 231-240
Kharrati Koopaei H, Mohammadabadi MR, Ansari Mehyari S, Esmailizadeh AK, Tarang A, Nikbakhti M (2011). Genetic Variation of DGAT1 Gene and its Association with Milk Production in Iranian Holstein Cattle Breed Population. Iranian Journal of Animal Science Research 3: 185-192 (In Farsi
Khodabakhshzadeh R, Mohammadabadi MR, Esmailizadeh Koshkoieh A, Moradi-Shahrebabak H, Bordbar F, Ansari Namin S (2016). Identification of point mutations in exon 2 of GDF9 gene in Kermani sheep. Polish Journal of Veterinary Sciences 19: 281–289
Lodes A, Krause I, Buchberger J, Aumann J, Klostermeyer H (1996). The influence of genetic variants of milk proteins on the compositional and technological properties of milk. 1. Casein micelle size and the content of non-glycosylated k-casein. Milchwissenschaft 51: 368–373.
Mohammadabadi MR (2017). Role of clostridium perfringens in pathogenicity of some domestic animals. Journal of Advances in Agriculture 7: 1117-1121
Mohammadabadi MR, Esfandyarpoor E, Mousapour A (2017). Using Inter Simple Sequence Repeat Multi-Loci Markers for Studying Genetic Diversity in Kermani Sheep. Journal of Research and Development 5: 154-157
Mohammadabadi MR, Sattayimokhtari R (2013). Estimation of (co) variance components of ewe productivity traits in Kermani sheep. Journal of Animal Science 46: 45-51.
Mohammadi A, Mohammadabadi MR, Mirzaei H, Baghizadeh A, Dayani O, Asadi Fozi M, Bahrampoor V (2009). Study of Kappa Casein gene of local and Holstein dairy cattle in Kerman province using PCR-RFLP method. Journal of Agricultural Science and Natural Resources 16: 125-132 (In Farsi).
Rijnkels M (2002). Multispecies comparison of the casein gene loci and evolution of casein gene family. Journal of Mammary gland Biology and Neoplasia 7: 327-345.‏
Shojaei M, Mohammad Abadi MR, Asadi Fozi M, Dayani O, Khezri A, Akhondi M (2010). Association of growth trait and Leptin gene polymorphism in Kermani sheep. Journal of Cell and Molecular Research 2: 67-73
Soufy B, Mohammadabadi MR, Shojaeyan K, Baghizadeh A, Ferasaty S, Askari N, Dayani O (2009). Evaluation of Myostatin gene polymorphism in Sanjabi sheep by PCR-RFLP method. Animal Science Reserches 19: 81-89 (In Farsi).
Supakorn CH (2009). The important candidate genes in goats. Walailak Journal of Science and Technology 6: 17-36.
Vajed Ebrahimi MT, Mohammad Abadi MR, Esmailizadeh AK (2016). Analysis of genetic diversity in five Iranian sheep population using microsatellites markers. Journal of Agricultural Biotechnology 7: 143-158
Vajed Ebrahimi MT, Mohammad Abadi MR, Esmailizadeh AK (2017). Using microsatellite markers to analyze genetic diversity in 14 sheep types in Iran. Archiv fuer Tierzucht (Arch. Anim. Breed) 60: 183-189.
Yahyaoui MH, Angiolillo A, Pilla F, Sanchez A, Folch JM (2003). Characterization and genotyping of the caprine κ-casein variants. Journal of Dairy Science 86: 2715-2720
Yahyaoui MH, Coll A, Sanchez A, Folch JM (2000). Genetic polymorphism of the caprine kappa casein gene. Journal of Dairy Research 68: 209-216
Yeh FC, Yang R, Boyle T (1999). POPGENE. Microsoft Window based freeware for population genetic analysis. Version 1.32. Centre for International Forestry Research, University of Alberta
Zamani P, Akhondi M, Mohammadabadi MR (2015). Associations of Inter-Simple Sequence Repeat loci with predicted breeding values of body weight in sheep. Small Ruminant Research 132: 123-127