بهینه سازی توالی کدکننده فاکتور رشد فیبروبلاستی بازی انسانی بمنظور بیان در گیاه برنج و همسانه سازی آن تحت کنترل توالی­های تنظیم کننده ژن ramy3D در ناقل دوتایی pCAMBIA1304

میثم بسطامی¹، رامین حسینی*²

¹دانشجوی دکتری، گروه بیوتکنولوژی، دانشکده کشاوزی و منابع طبیعی، دانشگاه بین المللی امام خمینی (ره)، قزوین، ایران.

²دانشیار، گروه بیوتکنولوژی، دانشکده کشاوزی و منابع طبیعی، دانشگاه بین المللی امام خمینی (ره)، قزوین. ایران.

تاریخ دریافت: 17/07/1396، تاریخ پذیرش: 29/10/1396

چکیده

فاکتور رشد فیبروبلاستی بازی انسانی (bFGF) یک پروتئین بسیار با ارزش با کاربردهای گسترده درمانی و تحقیقاتی است. در حال حاضر تولید این فاکتور رشد بشکل نوترکیب در بسترهای مرسوم میکروبی و سلول­های حشرات با مشکلاتی همراه است که منجر به هزینه تولید بالا و در نتیجه محدود ساختن کاربرد آن شده است. کشت سلولی گیاه برنج بستری کارامد، ایمن و کم هزینه برای تولید پروتئین­ نوترکیب است. هدف از این تحقیق تهیه یک سازه بیانی مناسب برای بیان بالای نسخه بهینه سازی شده­ای از فاکتور رشد انسانی bFGF در کشت سلولی گیاه برنج تحت کنترل عوامل تنظیمی ژن ramy3D بوده است. برای این منظور ابتدا توالی کدکننده فاکتور bFGF بر اساس شاخص­های کاربرد کدونی و محتوای GC برای بیان در گیاه برنج بهینه سازی و در ادامه سنتز شد. بدنبال فرایند بهینه سازی، شاخص سازگاری کدونی از 76/0 به 82/0 و محتوای GC از 65/52 درصد به 45/55 درصد ارتقا یافت. توالی­های تنظیم کننده ژن ramy3D برنج در قالب دو قطعه مجزا از روی DNA ژنومی تکثیر و همسانه سازی شدند. در ادامه اقدام به سرهم سازی توالی­های تنظیم کننده ژن ramy3D در ناقل دوتایی گیاهی pCAMBIA1304 و سپس درج توالی کدکننده بهینه سازی شده­ی bFGF در حدفاصل توالی پپتید راهنما و 3′UTR شد. از جمله مزیت­های سیستم بیانی Ramy3D می­توان به میزان بیان بالای ژن انتقالی، القاپذیر بودن و همچنین سهولت تخلیص پروتئین بواسطه ترشح به محیط اشاره کرد.

کلمات کلیدی: فاکتور رشد bFGF، Ramy3D، برنج، پروتئین نوترکیب.

مقدمه

فاکتورهای رشد فیبروبلاستی (FGFs) خانواده­ای متشکل از پروتئین­های متصل شونده به هپارین بوده که به لحاظ ساختاری و عملکرد بیولوژیک دارای تشابه هستند (An et al., 2013). فاکتور رشد فیبروبلاستی بازی انسانی (bFGF) عضوی مهم از این خانواده ژنی بشمار می­رود. این فاکتور رشد دارای اثرات میتوژنیک بسیار قوی بر روی انواعی از سلول­های با منشا میان پوستی (مزودرمی) و اکتودرم عصبی (نورواکتودرمی) شامل سلول­های اندوتلیال عروقی است (Gospodarowicz et al., 1986). بر همین اساس این فاکتور رشد نقش مهمی را در تنظیم فرایندهای رگ زایی (آنژیوژنز) و نو رگ­زایی (نئو واسکولاریزاسیون) در طول نمو، التیام زخم و تشکیل تومور ایفا می­کند (Fernig & Gallagher, 1994). این فاکتور رشد در تکثیر، مهاجرت، تمایز و حیات سلول­های مختلفی از جمله فیبروبلاست­ها، سلول­های اندوتلیال، سلول­های ماهیچه صاف و سلول­های عصبی نقشی کلیدی ایفا می­کند (Bikfalvi et al., 1997). فاکتور رشد bFGF دارای کاربردهای درمانی متعددی در پیوند بافت، التیام زخم، درمان بیماری­های قلبی و عروقی، بازسازی سلول­های عصبی و جلوگیری از آسیب به مغز در اثر بیماری آسم است (Bikfalvi et al., 1997; Delrieu, 2000; Liu & Zhu, 1998). علاوه بر خواص درمانی ذکر شده، فاکتور رشد انسانی bFGF دارای کاربرد تحقیقاتی در زمینه کشت سلول­های بنیادی انسانی است. این فاکتور رشد از تمایز سلول­های بنیادی جلوگیری کرده و سبب ابقای آنها در حالت تمایز نیافته می­شود و از این جهت جزء کلیدی ترکیبات محیط کشت سلول­های بنیادی جنینی انسانی بشمار می­رود (Chen et al., 2012).

با توجه به کاربردهای درمانی و تحقیقاتی متعدد فاکتور رشد bFGF، نیاز به آن بسیار بالاست. این فاکتور برای اولین بار در سال 1978 میلادی در مغز گاو گزارش شد (Gospodarowicz et al., 1978) و خالص سازی آن در سال 1984 میلادی انجام پذیرفت (Böhlen et al., 1984). میزان bFGF طبیعی در بافت­های جانوری بسار اندک است، بطوری که تخلیص این پروتئین از این طریق نمی­تواند تامین کننده نیازهای روزافزون به آن باشد (Gasparian et al., 2009). از این رو در طول سه دهه گذشته تلاش­های فراوانی برای بیان این فاکتور رشد بصورت نوترکیب در موجودات مختلفی همچون باکتری Escherichia coli، باکتری Bacillus subtilis، مخمر Pichia pastoris، کرم ابریشم (Bombyx mori L.)، بذور گیاهان سویا (Glycine max) و برنج (Oryza sativa) و همچنین کلروپلاست گیاه توتون (Nicotiana tabacum) صورت پذیرفته است (An et al., 2013; Ding et al., 2006; Ke et al., 1992; Kwong et al., 2013; Mu et al., 2008; Wang et al., 2015; Wu et al., 2001). در حال حاضر فاکتور bFGF به صورت تجاری و در فرم نوترکیب در بسترهای بیانی مختلفی اعم از باکتری­های E. coli و B. subtilis، مخمر P. pastoris و همچنین کشت سلولی حشرات تولید می­شود (Wang et al., 2015). تولید فاکتور bFGF انسانی در بسترهای ذکر شده با مشکلات متعددی همچون میزان تولید پائین، تشکیل اینکلوژن بادی­ها و فرآوری پیچیده و همچنین پروتئولیز و استیلاسیون همراه است (An et al., 2013; Kwong et al., 2013). در نتیجه قیمت این فاکتور رشد در حال حاضر بسیار بالا بوده بگونه­ای که استفاده از این فاکتور را برای اهداف درمانی و همچنین تحقیقاتی با محدودیت مواجه ساخته است.

توالی­های تنظیم کننده ژن آلفا آمیلاز 3D (ramy3D) گیاه برنج موفقترین سیستم بیانی بکار گرفته شده در زمینه تولید پروتئین­های نوترکیب در کشت سلولی گیاهان است (Xu et al., 2011). میزان تولید پروتئین نوترکیب با استفاده از این سیستم بیانی در کشت سوسپانسیون سلولی گیاه برنج بسیار قابل توجه است بگونه­ای که این سیستم را به سیستمی قابل رقابت با سیستم­های مرسوم باکتریایی و کشت سلولی پستانداران بدل ساخته است (Hellwig et al., 2004). با این حال، مزیت اصلی این سیستم بیانی را می­توان القاپذیر بودن آن بدنبال حذف قند از محیط دانست. این ویژگی، امکان جدا سازی فاز رشدی از فاز تولید پروتئین نوترکیب را، مشابه با آنچه در سیستم­های باکتریایی مرسوم است، فراهم می­سازد (Xu et al., 2011). مزیت دیگر استفاده از این سیستم بیانی، امکان ترشح پروتئین نوترکیب به فضای خارج سلولی (محیط کشت در کشت سلولی) با بکارگیری پپتید راهنمای پروتئین Ramy3D است. این ویژگی فرایند خالص سازی پروتئین نوترکیب را بسیار تسهیل می­کند (Huang et al., 2015).

هدف از این تحقیق بهینه سازی توالی کدکننده (CDS) فاکتور رشد انسانی bFGF برای بیان در گیاه برنج و در ادامه همسانه سازی توالی بهینه شده، تحت کنترل توالی­های تنظیمی ژن ramy3D گیاه برنج، در یک ناقل دوتایی بوده است. از این طریق زمینه لازم برای بیان بالای این فاکتور رشد در کشت سوسپانسیون سلولی گیاه برنج فراهم ­می­گردد. برای این منظور با استفاده از نرم افزارهای بیوانفورماتیکی اقدام به بهینه سازی توالی CDS فاکتور bFGF بر اساس شاخص­های کاربرد کدونی و محتوای GC گیاه برنج شد. توالی­های تنظیمی ramy3D در دو قطعه مجزا از ژنوم گیاه برنج تکثیر و همسانه سازی گردید. در نهایت اقدام به سرهم سازی قطعات بدست آمده در غالب یک سازه بیانی در ناقل دوتایی گیاهی pCAMBIA1304 شد.

مواد و روش­ها

بهینه­سازی و سنتز توالی CDS فاکتور bFGF

با مراجعه به پایگاه داده کاربرد کدونی (http://www.kazusa.or.jp/codon)، جدول کاربرد کدونی ژنوم گیاه برنج دریافت شد. توالی CDS فاکتور رشد انسانی bFGF (با شماره دسترسی AAA52448.1) از پایگاه NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) دریافت شد. نرم افزار Gene Designer 2.0 از وب سایت DNA2.0 (به نشانی https://www.atum.bio/resources/genedesigner) دانلود شد. با استفاده از نرم افزارGene Designer، توالی CDS فاکتور bFGF بر اساس شاخص­های سازگاری کدونی(Codon Adaptation Index) و محتوای GC، برای بیان در گیاه برنج بهینه سازی شد. توالی­ بهینه سازی شده بوسیله الگوریتم OptimumGene شرکت GenScript از نظر حضور موتیف­های ناپایدار کننده RNA (ARE) در ساختار ثانویه mRNA و توالی­های تکراری مورد بررسی قرار گرفت. در ادامه مکان­های برشی دو آنزیم BamHI و SacI بترتیب به ابتدا و انتهای توالی بهینه سازی شده، بمنظور استفاده در مراحل سرهم سازی کاست بیانی، درج شدند. توالی بهینه سازی شده توسط شرکت Generay Biotech (چین) سنتز و در ناقل pGH همسانه سازی شد. ناقل تهیه شده تحت عنوان pGH-bFGF نامگذاری شد.

استخراج DNA ژنومی از گیاه برنج

DNA ژنومی گیاه برنج با استفاده از روش CTAB از برگ­ استخراج شد (Doyle, 1987). محلول محتوی DNA استخراج شده در ژل آگارز 1% الکتروفورز و با استفاده از محلول اتیدیوم برماید رنگ آمیزی شد و در دستگاه ژل داک برای تایین کیفیت و کمیت مورد بررسی قرار گرفت.

همسانه سازی توالی­های تنظیم کننده ژن ramy3D

در این مرحله توالی­های تنظیم کننده ژن ramy3D گیاه برنج در قالب دو قطعه مجزا از ژنوم این گیاه تکثیر شدند. قطعه اول (تحت عنوان قطعه PRO) شامل پروموتر، 5′UTR و توالی کدکننده پپتید راهنما و قطعه دوم (تحت عنوان قطعه TER) شامل 3′UTR و ترمیناتور ژن ramy3D (با شماره دسترسی M24287.1) بود. با استفاده از نرم افزار Primer-Blast وب سایت NCBI، طراحی پرایمرهای اختصاصی برای تکثیر دو قطعه PRO و TER صورت پذیرفت (جدول 1). مکان­های برشی آنزیم­های HinDIII و BamHI به ترتیب به ابتدا و انتهای قطعه PRO و مکان­های برشی آنزیم­های SacI و EcoRI بترتیب به ابتدا و انتهای قطعه TER، از طریق درج آنها در پرایمرهای طراحی شده، اضافه شدند. با استفاده از واکنش PCR و پرایمرهای اختصاصی، قطعه PRO (با طول bp 1008) و قطعه TER (با طول bp 851) تکثیر شدند. واکنش PCR طی مراحل زیر انجام گرفت: یک چرخه دمایی بمدت 5 دقیقه در دمای °C95، 32 چرخه دمایی هر یک شامل 30 ثانیه در دمای °C95، 35 ثانیه در دمای °C62 برای تکثیر قطعه PRO و °C58 برای قطعه TER، 1 دقیقه در دمای °C72 برای قطعه PRO و 50 ثانیه در دمای °C72 برای قطعه TER و یک چرخه دمایی بمدت 10 دقیقه در دمای °C72. قطعات تکثیر شده در واکنش PCR، با استفاده از آنزیم T4 DNA Ligase، در حامل همسانه سازی خطی pTG19-T (شرکت Vivantis، مالزی) درج شدند. تهیه سلول­های مستعد و تراریخت سازی آنها با استفاده از روش TSS انجام پذیرفت (Chung et al., 1989). غربالگری کلونی­های حاوی پلاسمید نوترکیب با استفاده از تست آبی-سفید انجام شد. تعدادی از کلنی­های سفید انتخاب و از روش Alkaline Lysis برای استخراج پلاسمید استفاده شد (Bimboim & Doly, 1979). بمنظور بررسی درج قطعه، پلاسمیدهای استخراج شده، با آنزیم BamHI، که سایت برشی آن در دو سمت جایگاه همسانه سازی (MCS) حامل pTG19-T موجود است، هضم شدند. محصول واکنش هضم آنزیمی در ژل آگاروز 1% الکتروفورز و نتیجه آن بررسی شد. در مورد قطعه PRO حامل تهیه شده pTG-PRO و در مورد قطعه TER حامل تهیه شده pTG-TER نامگذاری شد.

تهیه ناقل دوتایی گیاهی حاوی توالی­های تنظیم کننده ramy3D

در این مرحله اقدام به سرهم سازی توالی­های تنظیم کننده ramy3D در غالب یک قطعه واحد و درج آن در ناقل دوتایی گیاهی pCAMBIA1304 شد. برای این منظور با استفاده از آنزیم­های EcoRI و SacI، قطعه TER از حامل pTG-TER جداسازی و در حامل pTG-PRO بریده شده با همان دو آنزیم، در پایین دست قطعه PRO درج گردید. قطعه تهیه شده، حاوی تمامی توالی­های تنظیم کننده ramy3D شامل پروموتر، 5′UTR، توالی کدکننده پپتید راهنما، 3′UTR و ترمیناتور، تحت عنوان قطعه EXPCAS و ناقل محتوی این قطعه تحت عنوان pTG-EXPCAS نامگذاری شد.

جدول 1- توالی پرایمرهای اختصاصی برای تکثیر دو قطعه PRO و TER. pPRO.c: پرایمر رفت برای تکثیر قطعه PRO، pPRO.r: پرایمر برگشت برای تکثیر قطعه PRO، pTER.c: پرایمر رفت برای تکثیر قطعه TER، pTER.r: پرایمر برگشت برای تکثیر قطعه TER. زیر توالی آنزیم­های برشی خط کشیده شده است.

Table 1- The sequences of specific primers for amplification of PRO and TER fragments. pPRO.c: forward primer for PRO fragment amplification, pPRO.r: reverse primer for PRO fragment amplification, pTER.c: forward primer for TER fragment amplification, pTER.r: reverse primer for TER fragment amplification. The sequences of restriction enzymes are underlined.

در ادامه قطعه EXPCAS با استفاده از دو آنزیم EcoRI و HinDIII از ناقل pTG-EXPCAS بریده و در ناقل دوتایی گیاهی pCAMBIA1304 بریده شده با همان دو آنزیم، درج گردید. ناقل دوتایی نوترکیب حاصل، تحت عنوان pCAM-EXPCAS نامگذاری شد. بمنظور بررسی درج قطعه، حامل pCAM-EXPCAS با آنزیم­های HinDIII و EcoRI و همچنین آنزیم­های HinDIII و EcoRI و BamHI هضم گردید. محصول واکنش هضم آنزیمی در ژل آگاروز 1% الکتروفورز شد.

تهیه ناقل بیانی فاکتور bFGF

بمنظور تهیه سازه بیانی فاکتور bFGF تحت کنترل توالی­های تنظیم کننده ramy3D، توالی کدکننده بهینه سازی شده فاکتور bFGF، در ناقل pCAM-EXPCAS در حد فاصل توالی کدکننده پپتید راهنما و 3′UTR ژن ramy3D درج شد. برای این منظور حامل pGH-bFGF با آنزیم­های BamHI و SacI هضم و قطعه خارج شده (قطعه bFGF با طول bp 552) در حامل pCAM-EXPCAS بریده شده با همان دو آنزیم، درج گردید. حامل نوترکیب حاصل pCAM-EXPCAS-bFGF و قطعه تهیه شده (حاصل از ادغام سه قطعه PRO، bFGF و TER) EXPCAS-bFGF نامگذاری شد. بمنظور بررسی درج قطعه EXPCAS-bFGF در حامل pCAM-EXPCAS-bFGF، حامل تهیه شده با آنزیم­های HinDIII، BamHI، SacI و EcoRI هضم گردید. محصول واکنش هضم آنزیمی در ژل آگارز 1% الکتروفورز شد.

نتایج و بحث

در طول سه دهه گذشته استفاده از کشت سلولی گیاهان تراریخت در جهت تولید پروتئین­های با ارزش دارویی و صنعتی بسیار مورد توجه قرار گرفته است. در این زمینه کشت سلولی گیاهی مزیت­های متعددی را نسبت به سیستم­های مرسوم میکروبی و کشت سلولی پستانداران دارا می­باشد. از یک سو گیاهان بدلیل عاری بودن از ویروس­ها و پاتوژن­های انسانی و همچنین اندوتوکسین باکتریایی بستری ایمن را برای تولید پروتئین­های نوترکیب فراهم می­سازند. از سوی دیگر، در حالی که محیط کشت سلول گیاهان همانند باکتری­ها ساده و کم هزینه است، اما بعنوان یوکاریوت­های عالی گیاهان قادر به سنتز پروتئین­های چند جزئی و پیچیده و همچنین اعمال تغییرات پس از ترجمه همانند گلیکوزیلاسیون هستند. این در حالی است که باکتری­ها این توانایی­ها را ندارند. همچنین بایستی به هزینه پایین تخلیص پروتئین نوترکیب در این سیستم اشاره کرد (Hellwig et al., 2004; Saber et al., 2015). کشت سلولی برنج و توالی­های تنظیم کننده ژن ramy3D بستری بسیار مناسب برای بیان پروتئین نوترکیب است. پروموتر ژن ramy3D جزء پروموتر­های القا شونده طبقه بندی شده که در شرایط فقدان ساکارز به شدت بیان می­­شود. زمانی که بافت کالوس گرفته شده از اسکوتلوم بذر برنج، در کشت سوسپانسیون سلولی قرار می­گیرد، ایزوزایم آلفا آمیلاز Ramy3D یکی از فراوانترین پروتئین­های ترشح شده به محیط کشت بدنبال حذف ساکارز از محیط است (Huang et al., 1993). تا به امروز این پروموتر موفق­ترین پروموتر القا شونده استفاده شده برای بیان پروتئین­های نوترکیب در سیستم کشت سوسپانسیون سلولی گیاهی بوده است. استفاده از این پروموتر منجر به سطح بیان بالای بسیاری از پروتئین­های نوترکیب مانند rAAT، hGM-CSF، hG-CMS، هورمون رشد انسانی، bryodin-1، لیزوزیم، و آلبومین سرم انسانی در کشت سوسپاسیون سلولی برنج شده است (Xu et al., 2011). در یک مطالعه سطح بیان پروتئین hGM-CSF در کشت سوسپانسیون سلولی برنج تراریخت، تحت کنترل پروموتر ramy3D، 1000 برابر بالاتر از سطح بیان این پروتئین در کشت سوسپانسیون سلولی توتون تراریخت تحت کنترل راه­انداز 35S ویروس موزائیک تنباکو (CaMV) بود (Shin et al., 2003). سطح بیان بالای پروتئین­های نوترکیب تحت کنترل پروموتر ramy3D در کشت سوسپانسیون سلولی برنج، در نتیجه­ی قدرت بیان بالای این راه­انداز تحت شرایط فقدان ساکارز و همچنین کاهش فعالیت پروتئازهای خارج سلولی است.

هدف از این تحقیق تهیه سازه بیانی مناسب برای بیان فاکتور bFGF نوترکیب در کشت سوسپانسیون سلولی گیاه برنج بوده است. در این تحقیق توالی CDS فاکتور bFGF بر اساس کاربرد کدونی گیاه برنج بهینه سازی و توالی بهینه شده تحت کنترل توالی­های تنظیمی ramy3D همسانه سازی شد. در شکل 1 تصویر نمادین سازه بیانی فاکتور bFGF ارائه شده است.

شکل 1- تصویر نمادین سازه بیانی تهیه شده در ناقل دوتایی pCAMBIA1304. Ramy3D P: پروموتر و 5′UTR ژن ramy3D، Ramy3D SP: توالی کدکننده پپتید راهنمای Ramy3D، hbFGF: توالی کدکننده بهینه سازی شده فاکتور رشد انسانی bFGF، Ramy3D T: 3′UTR و ترمیناتور ramy3D.

Figure 1- Schematic picture of the prepared expression cassette in the binary vector, pCAMBIA1304. Ramy3D P: ramy3D′s promoter and 5′ UTR, Ramy3D SP: Ramy3D′s signal peptide coding sequence, hbFGF: human basic Fibroblastic Growth Factor coding sequence, Ramy3D T: ramy3D′s 3′ UTR and terminator.

یکی از مهمترین مراحل در انتقال یک ترانسژن بمنظور تولید پروتئین نوترکیب تغییر کاربرد کدونی در جهت انطباق با ژنوم میزبان است (Ullrich et al., 2015). به فرایند جایگزینی کدون­های کمیاب با کدون­های مناسب، بهینه سازی کدونی اطلاق می­شود (Gould et al., 2014). در مطالعات پیشین نشان داده شده است که بهینه سازی کاربرد کدونی ترانسژن­ها مطابق با سلول میزبان، بیان ژن نوترکیب را افزایش می­دهد (Mozhgan et al., 2018; Ullrich et al., 2015). در این تحقیق بدنبال جایگزینی کدون­های دارای کاربرد پایین با کدون­های دارای کاربرد بالا بر اساس جدول کابرد کدونی گیاه برنج، شاخص سازگاری کدونی (Codon Adaptation Index) از 76/0 به 82/0 افزایش یافت (شکل 2-a). شاخص سازگاری کدونی (CAI) شاخصی بسیار مفید برای پیش­بینی میزان بیان ژن در یک موجود خاص بوده و مرسوم­ترین پارامتر برای نشان دادن میزان انطباق کاربرد کدونی یک ژن در یک موجود زنده است (Sharp & Li, 1987; Ullrich et al., 2015). این شاخص عبارت است از میانگین هندسی سازگاری نسبی تمامی کدون­های یک ژن، که عددی بین صفر و یک است. سازگاری نسبی هر کدون با تقسیم کاربرد آن کدون بر کاربرد فراوانترین کدون برای همان اسید آمینه محاسبه می­شود (Sharp & Li, 1987). یک روش­ دیگر برای افزایش بیان ترانسژن، تغییر محتوای GC در جهت انطباق با ژن­های میزبان است. بر اساس مطالعات پیشین انطباق محتوای GC ترانسژن با ژن­های میزبان یکی از فاکتورهای مهم برای بیان بالای آن است (Jackson et al., 2014). با استناد به پایگاه کاربرد کدونی، میانگین محتوای GC در نواحی کدکننده گیاه برنج 26/55 درصد است. در این تحقیق در فرایند جایگزینی کدون­ها این شاخص نیز در نظر گرفته شد که در نتیجه آن میانگین محتوای GC توالی کدکننده فاکتور bFGF از 65/52 درصد به 45/55 درصد ارتقا یافت (شکل 2-b). توالی بهینه سازی شده از نظر ساختار ثانویه mRNA، توالی­های ناپایدار کننده RNA و توالی­های تکراری توسط الگوریتم OptimumGene شرکت GenScript مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان دهنده­ی نبود ساختار­های ناپایدار کننده در توالی بهینه سازی شده بود.

نتیجه الکتروفورز DNA ژنومی استخراج شده از برگ گیاه برنج در شکل 3-a نشان داده شده است. در چاهک شماره 1 باند مربوط به DNA با وزن مولکولی بالا مشاهده می­شود. مطابق انتظار بدنبال واکنش PCR برای تکثیر قطعه PRO، قطعه­ای با طول bp 1008 تکثیر شد (شکل 3-b). در نتیجه واکنش PCR برای تکثیر قطعه TER نیز، قطعه ای با طول bp 851 تکثیر شد که با طول باند مورد نظر برای قطعه TER مطابقت داشت (شکل 3-c).

شکل 3-d و 3-e، بترتیب نتیجه الکتورفورز محصول هضم آنزیمی حامل­های pTG-PRO و pTG-TER  با آنزیم BamHI در ژل آگارز را نشان می­دهد. همانگونه که در تصاویر مشخص است، بدنبال هضم آنزمی حامل pTG-PRO، قطعه­ی PRO با طول bp 1008 برش و از حامل خارج شد که نشان دهنده درج صحیح قطعه مورد نظر در حامل می­باشد. همچنین بدنبال هضم آنزیمی حامل pTG-TER (شکل 3-e)، قطعه­ای با طول bp 851 برش و از حامل خارج شده است که نشانگر قطعه TER است. نقشه حامل همسانه سازی pTG19-T (با طول bp 2880) در شکل 4 نشان داده شده است. با توجه به جهت درج قطعه PRO در ناقل pTG-PRO، که بدنبال توالی یابی این ناقل مشخص گردید (شکل 5-a)، مکان­های برشی EcoRI و SacI که بخشی از جایگاه همسانه سازی چندگانه (MCS) ناقل pTG19-T هستند، در ناحیه پایین دست قطعه PRO قرار داشت. بر همین اساس قطعه TER مابین دو جایگاه یاد شده در ناقل pTG-PRO درج گردید.

شکل 2- a: نمودار توزیع کاربرد کدونی در طول توالی کدکننده فاکتور bFGF قبل (راست) و بعد (چپ) از فرایند بهینه سازی کدونی تهیه شده توسط نرم افزار OptimumGene شرکت GenScript. محور افقی موقعیت کدون و محور عمودی کاربرد کدونی کدون­ها را در گیاه برنج نشان می­دهد. شاخص سازگاری کدونی (CAI) در زیر نمودار نشان داده شده است. CAI بزرگتر از 8/0 مقداری مطلوب را از نظر میزان بیان ترانسژن نشان می­دهد. b: هیستوگرام فراوانی کدون­ها در 10 گروه کاربرد کدونی. هیستوگرام راست مربوط به توالی bFGF پیش از بهینه سازی و هیستوگرام چپ مربوط به توالی بهینه سازی شده است. عدد 100 در محور افقی نشان دهنده بالاترین کاربرد کدونی برای یک کدون خاص در سیستم بیانی برنج است.

Figure 2- a: Codon usage distribution along bFGF coding sequence before (right) and after (left) codon optimizing process prepared by OptimumGene software from GenScript. Horizontal axis is showing codon position and vertical axis shows relative frequency of each codon in rice. Codon Adaptation Index has been shown below the chart. Transgene with CAI higher than 0.8 has a high expression level. b: codon frequency histogram in 10 codon usage bins. Right histogram is showing bFGF sequence before optimization and left histogram shows optimized sequence. In the horizontal axis 100 shows the highest codon usage for a specific codon in a defined (rice) organism.

این امر امکان سر هم سازی دو قطعه یاد شده را در جهت مناسب نسبت به یکدیگر در ناقل همسانه سازی فراهم کرد. شکل 5-b نتیجه هضم آنزیمی حامل pTG-EXPCAS با آنزیم­های EcoRI و HinDIII را نشان می­دهد. با توجه به نقشه MCS حامل pTG19-T و همچنین مکان­های برشی در نظر گرفته شده برای قطعات PRO و TER، می­بایستی که بدنبال هضم حامل pTG-EXPCAS با آنزیم­های EcoRI و HinDIII، کل قطعه EXPCAS، متشکل از دو قطعه PRO و TER، با طول bp 1859، برش و از حامل خارج شود که این امر در تصویر مشخص است.

نقشه ناقل دوتایی گیاهی pCAMBIA1304 در شکل 6 نشان داده شده است. این ناقل دوتایی حاوی ژن­های gfp (Green Fluorescent Protein)  و gus (β-Glucuronidase) به عنوان ژن­های گزارشگر و ژن مقاومت به آنتی بیوتیک هیگرومایسین hpt (Hygromycin Phosphotranspherase) به عنوان ژن گزینش­گر است. نوع عامل گزینشگر فاکتور بسیار مهمی در یک فرایند ترانسفورماسیون موفق است (Hiei & Komari, 2008).

یکی از دلایل استفاده از این ناقل دوتایی در تحقیق حاضر حضور ژن hpt به عنوان ژن گزینشگر است. آنتی بیوتیک کانامایسین، که رایجترین عامل گزینشگر در ترانسفورماسیون گیاهان دو لپه­ای است، در مورد گیاهان تک لپه­ای همچون برنج براحتی قابل استفاده نیست چراکه گیاهان تک لپه­ای نسبت به غلضت­های بالایی از این آنتی بیوتیک مقاوم هستند. در مورد برنج نشان داده شده است که 70% کالوس­های غیر تراریخت قادر به رشد بر روی محیط حاوی 100 میلی گرم در لیتر از آنتی بیوتیک کانامایسین هستند (Wilmink & Dons, 1993). از سوی دیگر ژن مقاومت به هیگرومایسن hpt موثرترین مارکر استفاده شده برای ترانسفورماسیون گیاه برنج است (Hiei & Komari, 2008). ثابت شده است که غلظت­های 25-50 میلی گرم از این آنتی بیوتیک (بسته به نوع واریته) بگونه­ای موثر در فرایند غربالگری کالوس­های تراریخت در گیاه برنج عمل می­کند (Nishimura et al., 2006; Wang, 2006). مزیت دیگر استفاده از ناقل دوتایی pCAMBIA1304 در تهیه کشت سوسپانسیون سلولی برنج تولید کننده پروتئین نوترکیب، حضور ژن کدکننده پروتئین فلورسنت gfp به عنوان ژن گزارش­گر است. یکی از عوامل محدود کننده ظرفیت کشت­های سلولی گیاهی برای تولید پروتئین نوترکیب، ناپایدار بودن سطح تولید پروتئین نوترکیب در کشت­های طولانی مدت است. یکی از دلایل این امر ناهمگونی کشت سلولی اولیه از لحاظ حضور سلول­های با فرم تراریختگی متفاوت به لحاظ تعداد و جایگاه درج ترانسژن و همچنین تغییرات ژنتیکی و اپی­ژنتیکی است که بدنبال کشت­های متمادی ایجاد می­شوند (Kirchhoff et al., 2012).

شکل 3- a: تصویر الکتروفورز ژل آگارز DNA ژنومی گیاه برنج. چاهک 1: DNA ژنومی. b: تصویر الکتروفورز محصول PCR قطعه PRO. چاهک 1: محصول PCR قطعه PRO. c: تصویر الکتروفورز محصول PCR قطعه TER. چاهک 1: محصول PCR قطعه TER. d: تصویر الکتروفورز هضم آنزیمی حامل pTG-PRO با آنزیم BamHI. چاهک 1: محصول هضم آنزیمی حامل pTG-PRO با آنزیم BamHI. e: تصویر الکتروفورز هضم آنزیمی حامل pTG-TER با آنزیم BamHI. چاهک 1: محصول هضم آنزیمی حامل pTG-TER با آنزیم BamHI. در تمامی تصاویر چاهک M به نشانگر اندازه مولکولی اشاره دارد.

Figure 3- a: Gel electrophoresis picture of rice genomic DNA. Lane 1: Genomic DNA. b: Gel electrophoresis picture of PRO fragment PCR product. Lane 1: PRO fragment PCR product. c: Gel electrophoresis picture of TER fragment PCR product. Lane 1: TER fragment PCR product. d: Gel electrophoresis picture of pTG-PRO digested with BamHI. Lane 1: pTG-PRO digestion product with BamHI. e: Gel electrophoresis picture of pTG-TER digested with BamHI. Lane 1: pTG-TER digestion product with BamHI. In all figures M refers to size marker.

شکل 4- نقشه حامل همسانه سازی pTG19-T. در این حامل غربالگری باکتری­های تراریخت از طریق مقاومت به آنتی بیوتیک آمپیسیلین و تست آبی-سفید انجام می­پذیرد.

Figure 4- PTG19-T cloning vector map. Transgenic bacteria are screened by ampicillin resistance and white-blue test.

شکل 5-a: تصویر نمادین ناقل نوترکیب pTG-PRO. جهت درج قطعه PRO نشان داده شده است. b: تصویر الکتروفورز محصول هضم آنزیمی حامل pTG-EXPCAS با آنزیم­های EcoRI و HinDIII در ژل آگاروز. M: نشانگر اندازه مولکولی. چاهک 1: محصول هضم آنزیمی حامل pTG-EXPCAS با آنزیم­های EcoRI و HinDIII.

Figure 5- a: Schematic picture of recombinant pTG-PRO vector. The direction of PRO fragment insertion has been shown. b: electrophoresis picture of pTG-EXPCAS digestion with EcoRI and HinDIII on agarose gel. M: size marker. Lane 1: product of pTG-EXPCAS digestion with EcoRI and HinDIII.

یکی از روش­های غلبه بر این مشکل استفاده از پروتئین­های گزارشگر فلورسنت همانند GFP در جهت ایجاد لاین سلولی مونوکلونال از جمعیت ناهمگون اولیه از طریق تکنیک flow sorting است (Kirchhoff et al., 2012). در نتیجه ناقل دوتایی تهیه شده در این تحقیق علاوه بر مزیت­های بهینه سازی توالی کدکننده فاکتور bFGF، استفاده از سیستم بیانی بسیار قدرتمند و قابل القای ramy3D و امکان ترشح پروتئین نوترکیب به فضای بیرون سلولی و تسهیل خالص سازی آن، از نظر فرایند غربالگری لاین­های تراریخت و همچنین امکان تهیه سوسپانسیون سلولی یکنواخت و مونوکلونال نیز بسیار مناسب است. شکل 7-a نتیجه هضم آنزیمی حامل pCAM-EXPCAS با آنزیم­های HinDIII و EcoRI و همچنین آنزیم­های EcoRI، HinDIII و BamHI را نشان می­دهد. همانگونه که در تصویر مشخص است در نتیجه هضم آنزیمی با آنزیم­های HinDIII و EcoRI قطعه EXPCAS با طول bp 1859از حامل خارج شده است و این نشان دهنده درج قطعه مذکور در جایگاه MCS حامل pCAMBIA1304 می­باشد. همچنین با توجه به حضور سایت برشی BamHI در حد فاصل دو قطعه PRO و TER در قطعه EXPCAS، می­بایستی که با هضم آنزیمی حامل pCAM-EXPCAS با آنزیم­های EcoRI، HinDIII و BamHI، هر دو قطعه PRO و TER همزمان از حامل برش خورده و خارج گردند. در تصویر مشاهده می­شود که بدنبال واکنش آنزیمی یاد شده هر دو قطعه PRO و TER با طول­های مورد نظر برش خورده و از حامل خارج شده­اند. ناقل دوتایی نوترکیب pCAM-EXPCAS تهیه شده در این تحقیق، تمامی اجزای لازم را برای بیان یک پروتئین نوترکیب تحت کنترل توالی­های تنظیمی ژن ramy3D در کشت سوسپانسیون سلولی گیاه برنج دارا می­باشد (شکل 7-b). از این ناقل می­توان برای بیان پروتئین­های با ارزش دارویی و صنعتی، از طریق درج توالی کدکننده پروتئین مورد نظر در حد فاصل توالی کدکننده پپتید راهنما و ترمیناتور ramy3D با استفاده از مکان­های برشی BamHI و SacI استفاده نمود. شکل 8 نتیجه هضم آنزیمی حامل pCAM-EXPCAS-bFGF را با آنزیم­های BamHI، SacI، HinDIII و EcoRI نشان می­دهد. در نتیجه این هضم آنزیمی، می­بایستی که هر سه قطعه PRO، TER و bFGF برش خورده و از حامل خارج می­شدند. همانگونه که در تصویر مشخص است بدنبال هضم آنزیمی ذکر شده، هر سه قطعه PRO با طول bp 1008 ، TER با طول bp 851 و bFGF با طول bp 552 از حامل خارج شده­اند­ که این امر نشان دهنده قرار گیری هر سه قطعه در جهت مورد نظر در حامل pCAM-EXPCAS-bFGF می­باشد.

در تمامی مراحل پس از تایید تهیه حامل مورد نظر بوسیله واکنش هضم آنزیمی، حامل تهیه شده بمنظور توالی یابی به شرکت Bioneer (کره جنوبی) فرستاده و پس از انجام خوانش، نتیجه با توالی مورد انتظار مقایسه و صحت انجام همسانه سازی مجددا تایید شد.

نتیجه­گیری

در این تحقیق اقدام به تهیه یک ناقل باینری مناسب برای بیان بالای فاکتور رشد انسانی bFGF در کشت سوسپانسیون سلولی گیاه برنج شد. از جمله مزیت­های استفاده از این ناقل برای بیان فاکتور رشد انسانی bFGF می­توان به: بهینه سازی توالی کدکننده فاکتور bFGF برای بیان در گیاه برنج، استفاده از سیستم بیانی بسیار قدرتمند و قابل القای ramy3D برای بیان پروتئین نوترکیب، ترشح پروتئین نوترکیب به فضای خارج سلولی و در نتیجه تسهیل فرایند خالص سازی، امکان غربالگری موثر لاین­های تراریخت بواسطه استفاده از ژن مقاومت به آنتی بیوتیک هیگرومایسین بعنوان ژن گزینشگر و همچنین امکان تهیه سوسپانسیون سلولی یکنواخت و مونوکلونال بواسطه حضور ژن گزارشگر gfp اشاره کرد.

شکل 6- نقشه حامل دوتایی pCAMBIA1304.

Figure 6- PCAMBIA1304 binary vector map.

شکل 7- a: تصویر الکتروفورز محصول هضم آنزیم ناقل pCAM-EXPCAS با آنزیم­های EcoRI، HinDIII و BamHI. M: نشانگر اندازه مولکولی. چاهک 1: نتیجه هضم آنزیمی حامل pCAM-EXPCAS با آتزیم­های HinDIII و EcoRI. چاهک 2: نتیجه هضم آنزیمی حامل pCAM-EXPCAS با آنزیم­های EcoRI، HinDIII و BamHI. b: تصویر نمادین ناقل pCAM-EXPCAS.

Figure 7- a: Electrophoresis picture of pCAM-EXPCAS digestion with EcoRI, HinDIII and BamHI. M: size marker. Lane 1: pCAM-EXPCAS digestion product with EcoRI and HinDIII. Lane 2: pCAM-EXPCAS digestion product with EcoRI, HinDIII and BamHI. b: Schematic picture of pCAM-EXPCAS vector.

شکل 8- تصویر الکتروفورز محصول هضم آنزیمی حامل pCAM-EXPCAS-bFGF با آنزیم­های BamHI، SacI، HinDIII و EcoRI. M: نشانگر اندازه مولکولی، چاهک 1: هضم حامل pCAM-EXPCAS-bFGF با آنزیم­های BamHI، SacI، HinDIII و EcoRI. چاهک 2: حامل pCAM- EXPCAS_bFGF هضم نشده.

Figure 8- Electrophoresis picture of pCAM-EXPCAS-bFGF digestion with EcoRI, HinDIII, BamHI and SacI. M: size marker. Lane 1: pCAM-EXPCAS-bFGF digestion product with EcoRI, HinDIII, BamHI and SacI. Lane 2: undigested pCAM-EXPCAS-bFGF.

منابع

An N, Ou J, Jiang D, Zhang L, Liu J, Fu K, Dai Y, Yang D (2013). Expression of a functional recombinant human basic fibroblast growth factor from transgenic rice seeds. International journal of molecular sciences 14:3556-3567

Bikfalvi A, Klein S, Pintucci G, Rifkin DB (1997). Biological Roles of Fibroblast Growth Factor-2 1. Endocrine reviews 18:26-45

Bimboim H, Doly J (1979). A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic acids research 7:1513-1523

Böhlen P, Baird A, Esch F, Ling N, Gospodarowicz D (1984). Isolation and partial molecular characterization of pituitary fibroblast growth factor. Proceedings of the National Academy of Sciences 81:5364-5368

Chen R, John J, Lavrentieva A, Müller S, Tomala M, Zhao Y, Zweigerdt R, Beutel S, Hitzmann B, Kasper C (2012). Cytokine production using membrane adsorbers: Human basic fibroblast growth factor produced by Escherichia coli. Engineering in Life Sciences 12:29-38

Chung C, Niemela SL, Miller RH (1989). One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution. Proceedings of the National Academy of Sciences 86:2172-2175

Delrieu I (2000). The high molecular weight isoforms of basic fibroblast growth factor (FGF-2): an insight into an intracrine mechanism. FEBS letters 468:6-10

Ding S-H, Huang L-Y, Wang Y-D, Sun H-C, Xiang Z-H (2006). High-level expression of basic fibroblast growth factor in transgenic soybean seeds and characterization of its biological activity. Biotechnology letters 28:869-875

Doyle JJ (1987). A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem bull 19:11-15

Fernig DG, Gallagher JT (1994). Fibroblast growth factors and their receptors: an information network controlling tissue growth, morphogenesis and repair. Progress in growth factor research 5:353-377

Gasparian M, Elistratov P, Drize N, Nifontova I, Dolgikh D, Kirpichnikov M (2009). Overexpression in Escherichia coli and purification of human fibroblast growth factor (FGF-2). Biochemistry (Moscow) 74:221-225

Gospodarowicz D, Bialecki H, Greenburg G (1978). Purification of the fibroblast growth factor activity from bovine brain. Journal of Biological Chemistry 253:3736-3743

Gospodarowicz D, Neufeld G, Schweigerer L (1986). Molecular and biological characterization of fibroblast growth factor, an angiogenic factor which also controls the proliferation and differentiation of mesoderm and neuroectoderm derived cells. Cell differentiation 19:1-17

Gould N, Hendy O, Papamichail D (2014). Computational tools and algorithms for designing customized synthetic genes. Frontiers in bioengineering and biotechnology 2

Hellwig S, Drossard J, Twyman RM, Fischer R (2004). Plant cell cultures for the production of recombinant proteins. Nature biotechnology 22:1415

Hiei Y, Komari T (2008). Agrobacterium-mediated transformation of rice using immature embryos or calli induced from mature seed. Nature Protocols 3:824

Huang L-F, Tan C-C, Yeh J-F, Liu H-Y, Liu Y-K, Ho S-L, Lu C-A (2015). Efficient secretion of recombinant proteins from rice suspension-cultured cells modulated by the choice of signal peptide. PloS one 10:e0140812

Huang N, Chandler J, Thomas BR, Koizumi N, Rodriguez RL (1993). Metabolic regulation of α-amylase gene expression in transgenic cell cultures of rice (Oryza sativa L.). Plant molecular biology 23:737-747

Jackson MA, Sternes PR, Mudge SR, Graham MW, Birch RG (2014). Design rules for efficient transgene expression in plants. Plant biotechnology journal 12:925-933

Ke Y, Wilkinson MC, Fernig DG, Smith JA, Rudland PS, Barraclough R (1992). A rapid procedure for production of human basic fibroblast growth factor in Escherichia coli cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Gene Structure and Expression 1131:307-310

Kirchhoff J, Raven N, Boes A, Roberts JL, Russell S, Treffenfeldt W, Fischer R, Schinkel H, Schiermeyer A, Schillberg S (2012). Monoclonal tobacco cell lines with enhanced recombinant protein yields can be generated from heterogeneous cell suspension cultures by flow sorting. Plant biotechnology journal 10:936-944

Kwong KW, Ng KL, Lam C-C, Wang YY, Wong W (2013). Authentic human basic fibroblast growth factor produced by secretion in Bacillus subtilis. Applied microbiology and biotechnology 97:6803-6811

Liu X, Zhu X (1998). Basic fibroblast growth factor protected forebrain against ischemia-reperfusion damage in rats. Zhongguo yao li xue bao= Acta pharmacologica Sinica 19:527-530

Mozhgan S, Abdolreza B, Mokhtar J, Alireza S, Mahdi B, Fatemeh K (2018). Study of the effect of codon optimization on Anti-VEGF nanobody expression. Journal of Agricultural Biotechnology 9:81-100

Mu X, Kong N, Chen W, Zhang T, Shen M, Yan W (2008). High-level expression, purification, and characterization of recombinant human basic fibroblast growth factor in Pichia pastoris. Protein expression and purification 59:282-288

Nishimura A, Aichi I, Matsuoka M (2006). A protocol for Agrobacterium-mediated transformation in rice. Nature Protocols 1:2796

Saber AZ, Khadijeh B, Mokhtar JJ, Fereydoun M (2015). Expression of recombinant gamma interferon in tobacco plant seeds. Journal of Agricultural Biotechnology 7

Sharp PM, Li W-H (1987). The codon adaptation index-a measure of directional synonymous codon usage bias, and its potential applications. Nucleic acids research 15:1281-1295

Shin YJ, Hong SY, Kwon TH, Jang YS, Yang MS (2003). High level of expression of recombinant human granulocyte‐macrophage colony stimulating factor in transgenic rice cell suspension culture. Biotechnology and bioengineering 82:778-783

Ullrich KK, Hiss M, Rensing SA (2015). Means to optimize protein expression in transgenic plants. Current opinion in biotechnology 32:61-67

Wang K (2006) Agrobacterium protocols, vol 1. Springer

Wang Y-P, Wei Z-Y, Zhong X-F, Lin C-J, Cai Y-H, Ma J, Zhang Y-Y, Liu Y-Z, Xing S-C (2015). Stable expression of basic fibroblast growth factor in chloroplasts of tobacco. International journal of molecular sciences 17:19

Wilmink A, Dons J (1993). Selective agents and marker genes for use in transformation of monocotyledonous plants. Plant Molecular Biology Reporter 11:165-165

Wu X, Kamei K, Sato H, Sato S-i, Takano R, Ichida M, Mori H, Hara S (2001). High-level expression of human acidic fibroblast growth factor and basic fibroblast growth factor in silkworm (Bombyx mori L.) using recombinant baculovirus. Protein Expression and Purification 21:192-200

Xu J, Ge X, Dolan MC (2011). Towards high-yield production of pharmaceutical proteins with plant cell suspension cultures. Biotechnology Advances 29:278-299