Expression of recombinant human bone morphogenetic protein 2 (rhBMP2) in tobacco transgenic hairy roots

بیان فاکتور رشد استخوانی نوترکیب انسانی2 (rhBMP2) در ریشه­های موئین تراریخت توتون

بلال دهقانی¹، امیر موسوی²*، صادق حسن نیا ³، علی هاتف سلمانیان⁴، علی شرفی⁵، محمد رضا افتخاریان قمصری⁶

¹ کارشناسی ارشد بیوتکنولوژی کشاورزی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران، ایران.

²دانشیار، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران، ایران.

³دانشیار، دانشکده علوم زیستی ، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران.

⁴استاد، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران، ایران.

⁵ استادیار، دانشکده داروسازی، دانشگاه علوم پزشکی زنجان، ایران.

⁶ مربی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران، ایران.

تاریخ دریافت: 01/05/1396، تاریخ پذیرش: 29/10/1396

چکیده

با توجه به افزایش جمعیت جهان، امروزه تقاضا برای تولید پروتئین­های نوترکیب در بافت­های گیاهی در حال افزایش است.  ریشه­های موئین بخاطر زیست توده و ثبات ژنتیکی بالا به عنوان بافت هدفی مناسب مدنظر می باشند. گلیکوپروتئین تنظیمی BMP2، به عنوان یکی از مهمترین فاکتورهای رشد با کاربرد درمانی و تحقیقاتی در مهندسی بافت مطرح می­باشد. انتخاب میزبان گیاهی مناسب، بافت مطلوب و سازه ژنی مناسب، از عوامل مهم در بالا بردن میزان تولید پروتئین نوترکیب است. در راستای حصول این هدف، در مطالعه حاضر تولید پروتئین نوترکیبBMP2  در ریشه­های مویینه تراریخت گیاهان توتون و کلزا مورد بررسی قرار گرفت.  برای تهیه سازه ژنی، در بالادست ژن BMP2، توالی­هایUTR) TMV (5′و KOZAK  جهت افزایش بیان و در پایین دست ژن، توالی شش تایی هیستیدینی جهت تخلیص پروتئین و توالیKDEL  بعنوان سیگنال نگهدارنده پروتئین درشبکه اندوپلاسمی تعبیه شدند. این توالی ژنی تحت کنترل پیشبرنده  CaMV 35Sبیان شد. برای انتقال سازه ژنی مذکور به ریز نمونه­های برگی توتون یک ماهه به عنوان گیاه مدل و انتهای کوتیلدونی کلزا شش روزه به عنوان یک گیاه زراعی از باکتری Agrobactrium rhizogenes استفاده گردید. پس از رشد ریشه های موئین و غربالگری آن ها به روش PCR ، تایید درسطح رونویسی با روش RT-PCR انجام گرفت. در عین حال، تایید بیان پروتئین نوترکیب در میزبان با روش های آزمون الایزا و لکه گذاری وسترن صورت پذیرفت. نتایج این تحقیق بیان گر کارایی بالای سیستم ریشه های مویینه برای تولید فاکتورهای نوترکیب درمانی می­باشد، که استفاده از آنها را در رآکتورهای زیستی مطرح می سازد.

کلمات کلیدی: پروتئین نوترکیب، BMP، کشاورزی مولکولی، توتون، ریشه موئین، کلزا.

مقدمه

امروزه پتانسیل بالای سیستم­های تولید بر پایه­ی میزبان گیاهی برای تولید پروتئین­های نوترکیب  اثبات شده است (Yoo, 2014). سیستم های بیانی و میزبان های گیاهی با توجه به دارا بودن مزایایی چون هزینه تولید پایین­تر، ساختار صحیح محصول پروتئینی نوترکیب و مشابهت تقریبا یکسان فرایند تغییرات پس از ترجمه همچون گلیکوزیلاسیون با سلول­های جانوری نسبت به سیستم­های بیانی دیگر از اهمیت ویژه­ای برخوردار می باشند (da Cunha, Vianna, da Almeida Lima, & Rech, 2014; Xu, 2011) . در گیاهان محصولات می­توانند در ابعاد صنعتی در اندام­های ذخیره­ای مناسب مانند بذر، غده و یا ریشه های مویین تولید شوند (Castilho, 2012). تاکنون انواع پروتئین­های درمانی مانند دارو­های زیستی انسانی، زیرواحد­های نوترکیب واکسن و آنتی بادی­های نوترکیب و پروتئین های غیر درمانی مانند تریپسین با موفقیت در میزبان­های مختلف گیاهی تولید و تجاری شده­اند (da Cunha et al., 2014; Yoo, 2014). فاکتور­های رشدی Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) عضوخانواده­ی فاکتورهای رشد ترانسفرمی بتا (TGF- β) بوده و از گلیکوپروتئین­های تنظیمی درگیر در مسیرهای تمایز سلول­های بنیادی مزانشیمی می­باشند (Capra P, 2009). این فاکتورهای رشد در تبدیل مرحله جنینی سلول­ها به بافت استخوانی نقش اساسی داشته و در بافت استخوانی جانوران به وفور یافت می­شوند(Sieber C, 2009). در ژنوم انسان 20 نوع از این فاکتورها کد می­شود که از جمله مهم­ترین آنها می­توان به BMP2 و BMP7 اشاره نمود، فاکتور شماره­ی دو بعنوان یک فاکتور قوی در استخوان زایی مطرح است (Tang, 2012). علی رغم کاربردهای درمانی این دو فاکتور در ترمیم ضایعات استخوانی، مشکلاتی چون عدم مقرون به صرفه بودن به علت دوز مصرف بالا، عوارض جانبی و مشکلات استخراج و خالص سازی، نیاز به بهبود کمی و کیفی این محصول را ایجاد کرده است.  یکی از راه حل­های فائق آمدن بر این مشکل استفاده از BMPهای با قابلیت فیزیولوژیک بالاتر است که در دوز کمتری قادر به القای بافت استخوانی باشند، می باشد (Tang, 2012). با پیشرفت مهندسی ژنتیک طی سالیان گذشته، بیان فاکتور نوترکیب BMP2 در سیستم­های مختلفی از جمله E. coli ، لاین­های سلولی جانوری همچون سیستم­های CHO، COS و حتی در لاروهای کرم ابریشم مورد بررسی قرارگرفته است (Tang, 2012). سیستم­های مذکور، معایبی چون هزینه بالا، میزان کم محصول، فعالیت زیستی پایین و خطر بالای آلودگی به عوامل بیماری زای مشترک انسانی (پریون و ویروس) را در بر دارند (Ishida, 1994). جهت تولید محصولات نوترکیب، بافت­های مختلف گیاه، ازجمله برگ، بذر، میوه و ریشه می­تواند به عنوان یک بستر تولیدی مناسب استفاده شوند. در میان این میزبان­ها ریشه­های موئین به دلایلی همچون آسان بودن امکان بهره­وری در سطح صنعتی، سرعت رشد بالا، عدم نیاز به هورمون ها و پایداری بیشتر محتوای ژنتیکی، برتری نسبی به سایر بافت­های تراریخت گیاهی دارند (Häkkinen, 2013). در این تحقیق، ما برای تولید فاکتور نوترکیب انسانی BMP2 (rhBMP2) گیاهچه­های توتون و کلزا را با هدف تولید زیست توده­ی ریشه­های موئین تراریخت مورد استفاده قرار دادیم.

مواد و روش­ها

طراحی و ساخت سازه ژنی pBI121/BMP2

 در این تحقیق برای بالا بردن بیان پروتئین نوترکیب در میزبان­های گیاهی، از توالی کزاک و توالی نوکلئوتیدی غیرترجمه شونده­ی ویروس موزائیک توتون TMV (Ω) در بالا دست کدون شروع استفاده شد (Lucy W, 2012). برای ایجاد امکان حذف توالی  Ω  و بررسی نقش آن جایگاه برشی  BamHI در بالا دست KOZAK و به منظور همسانه سازی سازه درناحیه 5' جایگاه برشی XbaI و در ناحیه 3' آن جایگاه برشی SacI تعبیه شد. همچنین یک دنباله­ی هیستیدینی شش تایی و پپتید نشانه­ی KDEL برای انتقال پروتئین به شبکه­ی اندوپلاسمی و در قسمت ′5 آن در نظر گرفته شد. این سازه­ی نوترکیب بعد از بهینه سازی ترجیح کدونی گیاهی در نهایت برای سنتز مصنوعی به شرکت ((Shinegene Biotech Co. فرستاده شد. سازه ژنی ساخته شده پس از دریافت در ناقل pUC19، در ناقل بیانی گیاهی pBI121 تحت کنترل پیش برنده CaMV 35S زیر همسانه­ سازی شد (شکل 1). انتقال سازه های ژنی نوترکیب pBI121/BMP2 BMP2 & Ω pBI121/ با واسطه Agrobacterium rhizogenes سویه­ی 15834 به ریزنمونه­های گیاهی انجام پذیرفت (Bhalla, 2008). ریز نمونه­های برگی گیاهان توتون یک ماهه دو گونه   Nicotiana tabacum cv. Samson  و Nicotiana benthamiana و انتهای کوتیلدونی جوانه­ی کلزاهای شش روزه (Brassica napus cv. PF-7045-91) باAgrobacterium rhizogenes سویه­ی 15834 ناقل سازه های pBI121/ΩBMP2 & pBI121/BMP2 آلوده شدند. غربالگری لاین­های تراریخت با انتقال و واکشت آن ها بر روی محیط انتخابی حاوی غلظت­های مختلف کانامایسین به ترتیب (غلظت های 5، 8 و 12 میلی گرم در لیتر برای ریز نمونه­های کلزا و غلظت­های 75 و 100 میلی گرم در لیتر برای ریز نمونه­های توتون) صورت گرفت.     

شکل 1-  نقشه ناقل pBI121 حاوی ژن نوترکیب BMP2. الف) سازه فاقد توالی TMV ب) سازه دارای توالی افزاینده TMV.

Figure 1- The vector map of pBI121 containing recombinant BMP2 gene. The above construct lacks TMV sequence and the below construct has a TMV inducer sequence.  

در نهایت از هر گونه­ی گیاهی برای هر کدام از سازه­ها 20 لاین ریشه موئین تراریخت حاصل شد. برای رشد ریشه­های موئین­ کلزا از محیط کشت MS استفاده گردید (Murashige T, 1962). برای رشد ریشه­های گونه N. tabacum و گونه­ی N. benthamiana از محیط کشت رشدی B5 استفاده شد (Larsen, 2012).

شکل2- نمونه­های جداکشت برگی توتون (راست) و دمبرگ های لپه ای کلزا (چپ) که ریشه­های موئینه از آنها جوانه زده اند.

Figure 2- Tobacco leaf explants (right) and cotyledonary petioles of canola (left) in which the hairy roots have emerged.  

استخراج DNA ژنومی از ریشه­های موئین20 روزه­ی رشد یافته در محیط انتخابی صورت گرفت (Kang, 2004). از ژنوم به عنوان الگو به همراه آغازگرهای اختصاصی ژن rhBMP2 در واکنش زنجیره­ای پلی مراز (PCR) استفاده گردید. جهت تایید وجود mRNA مربوط به rhBMP2 در لاین­های PCR مثبت از روش RT-PCR  استفاده شد (Hoffmann.B, 2013). استخراج RNA تام با استفاده ازکیت RNX-Plus (SinaClon BioScience Co.) صورت پذیرفت. قبل از انجام RT-PCR برای اطمینان از حذف کامل آلودگی DNA ژنومی احتمالی از تیمار آنزیمی RNase-free DNase I (TaKaRa Co.) استفاده گردید و در ادامه، سنتز رشته ی cDNA از روی الگوی mRNA صورت پذیرفت.

از بافت تازه ریشه­های تراریخت، پروتئین محلول تام استخراج شد. از هر لاین مقدار 5/0 گرم ریشه در هاون چینی استریل حاوی نیتروژن مایع پودر و به ویال­های استریل منتقل شد. یک میلی لیتر از بافر استخراج پروتئین (PBS, pH 6.0) به همراه ,5mM EDTA 5mM 2-mercaptoethanol و2mM PMSF (Phenylmethylsulfonyl Fluoride)   اضافه و طبق دستورالعمل استخراج انجام گرفت و غلظت پروتئین تام استخراجی با روش برادفورد تعیین گردید (Bradford, 1976). بعد از تایید بیان mRNA ژن نوترکیب برای بررسی­های کمی پروتئین آزمون سنجش الایزا گذاشته شد، تا لاین­هایی که بیان بیشتری داشتند برای لکه گذاری کیفی پروتئینی (Western blot) انتخاب شوند (Cornuault, 2011; Illana.V.O, 2012). ساندویچ الایزا در پلیت 96 تایی (NUNCLON Co. Denmark) برای هیبریداسیون با آنتی بادی (HRP-Conjugate) آنتی His-tag (Sigma Co. 1:1000) انجام گردید. سپس جذب نوری واکنش در طول موج 450 نانومتر خوانش شد.

پروتئین تام استخراجی لاین­های تراریخت توتون بر روی ژل SDS-PAGE حاوی 12 درصد آکریل آمید جداسازی شد. بارگذاری مقدار مساوی محلول پروتئین از هر کدام از نمونه­ها بر روی ژل انجام شد. پس از جدا شدن پروتئین­ها از یکدیگر بر اساس وزن مولکولی، آنها را به غشای PVDF (BIO-RAD Co.) منتقل گردید. با توجه به اینکه در کاست ژنی در انتهای 3" دنباله ی هیستدینی بکار برده شد بنابراین برای شناسایی پروتئین نوترکیب از آنتی بادی استفاده شد که به دنباله ی هیستدینی متصل می­شود. هیبریداسیون آنتی بادی HRP کانجوگه (1:1000 Sigma) علیه(متصل شونده به) دنباله هیستدینی که این دنباله 6 تایی در انتهایrhBMP2 وجود دارد انجام گرفت. لکه گذاری بر روی غشا با کیت وسترن بلات (NAJM Biotech CO. Iran) انجام گرفت (Chankova, 2013; Martina D, 2016). به منظور حصول زیست توده­ی تراریخت جهت بیان BMP2 در میزبان­های گیاهی، ریز نمونه­های گونه­های مورد آزمایش با اگروباکتری نوترکیب،  تیمار شدند و پس از 14روز میزان 2 گرم زیست توده­ی تولیدی گونه­ی N. tabacum  و 7/1 گرم گونه­ی N. benthamiana بود. اما ریشه­های موئین کلزا رشد مناسبی نداشتند. به­منظور تایید تراریختی لاین­های رشد یافته در محیط انتخابی کانامایسین دار از واکنش زنجیره ای پلیمراز با آغازگرهای رفت و برگشت اختصاصی ژن BMP2 استفاده شد. نتایج حاصله تراریختی ژنومی لاین­ها ریشه موئین را تایید کردند. نتایج واکنش غربالگری زنجیره­ای پلی مراز  روی DNA ژنومی در شکل 3 نشان داده شده است، طول قطعه­ی تکثیر شده 380 نوکلئوتید بود.

شکل 3-  تصویر الکتروفورز ژل آگارز به منظور غربالگری ریشه­های تراریخت از طریق PCR از روی DNA ژنومی (طول قطعه 380 نوکلئوتید). الف. نمونه­های توتون (N. benthamiana و N. tabacum): M. نشانگر وزن مولکولی (100 bp Fermentas)؛ 1-13. لاین­های تراریخت N. tabacum؛ 14-26. لاین­های تراریخت N. benthamiana؛ 27. کنترل مثبت (pUC19/BMP2)؛ 28. کنترل منفی(ریشه موئین توتون حاصل از اگروباکتری فاقد سازه ژنی). ب. نمونه­های کلزا: M. نشانگر وزن مولکولی (100 bp Fermentas)؛ 1. کنترل مثبت (pUC19/BMP2)؛ 2-13. لاین­های تراریخت؛ 14. کنترل منفی (ریشه موئین کلزا حاصل از اگروباکتری فاقد سازه ژنی).

Figure 3- Agarose gel electrophoresis for screening of transgenic roots by PCR using genomic DNA (the target fragment is a 380 bp band). Left image shows the gel containing tobacco samples (N. benthamiana and N. tabacum): M, 100 bp molecular weight marker (Fermentas); 1-13. Transgenic lines N. tabacum; 14-26. Transgenic lines N. benthamiana; 27. Positive control (pUC19 / BMP2); 28. Negative control (tobacco hairy root derived from Agrobacterium without gene construct). Right image shows the gel containing canola samples: M, 100 bp molecular weight marker (Fermentas); 1, Positive Control (pUC19 / BMP2); 2-13. transgenic lines; 14. Negative control (canola hairy root derived from Agrobacterium without gene construct).

پس از تایید تراریختی ژنومی، به­منظور بررسی مولکولی BMP2 در سطح mRNA واکنش زنجیره ای پلیمراز با آغازگرهای اختصاصی رفت و برگشتی ژن BMP2 بر روی cDNA مربوطه انجام شد. نتایج حاصل حضور mRNA را تایید کردند. نتایج RT-PCR که نشان دهنده­ی تأیید حضور mRNA مربوط به ژن rhBMP2 می­باشند، در شکل 4 نشان داده شده است. طول قطعه­ی تکثیر شده 380 نوکلئوتید بود.

شکل4- تصویر الکتروفورز ژل آگارز قطعات مربوط به غربالگری ریشه های تراریخت از طریق RT-PCR(طول قطعه 380 نوکلئوتید): الف. لاین­های N. benthamiana و N. tabacum: 3-15. لاین تراریخت؛ 1. کنترل مثبت (pUC19/BMP2)؛ 2. کنترل منفی (نمونه شاهد حاوی آب به جای DNA)؛ M. نشانگر وزن مولکولی (Ladder Mix Fermentas). ب. لاین­های B.napus: 1 تا 13 لاین تراریخت؛ 14. کنترل مثبت (pUC19/BMP2)؛ 15. کنترل منفی (نمونه شاهد)؛ M. نشانگر وزن مولکولی (Ladder Mix Fermentas).

Figure 4-. Agarose gel electrophoresis of the fragments amplified from transformed roots using RT-PCR (the target fragment is a 380 bp band); Left image shows the gel containing the fragments of the lines of N. benthamiana and N. tabacum: 3-15. transgenic line; 1. Positive control (pUC19 / BMP2); 2. Negative control (control sample containing distilled water instead of DNA); M. Ladder mix (Fermentas). Right image shows the gel containing B.napus lines: 1 to 13, transgenic lines; 14, Positive control (pUC19 / BMP2); 15. Negative control (blank sample); M. Ladder mix (Fermentas).

در این مرحله به دلیل عدم تولید زیست توده­ی مناسب از ریشه­های موئین­ی کلزا، استخراج پروتئین تام جهت انجام آزمون های مرتبط با پروتئین ممکن نبود، بنابراین نتایج بررسی­های مولکولی پروتئین فقط برای پروتئین تام استخراجی از لاین­های تراریخت دو گونه­ی توتون انجام شد. پس از بررسی­های غلظت پروتئینی در نمونه­های RT-PCR مثبت مختلف با آزمون برادفورد، از هر نمونه غلظت یکسانی از پروتئین تام را در آزمون الایزا استفاده گردید، که نتایج حاصل بیانگر تفاوت­های بیانی در لاین­های مختلف را دارند. نتایج آزمون الایزا در شکل 5 نشان داده شده است. جهت تایید کیفی بیان پروتئین از واکنش وسترن بلات با آنتی بادی ضد توالی هیستدینی استفاده شد که بر اساس نتایج به دست آمده از نمونه­هایی که در آزمون کمی الایزا بیشترین جذب OD مربوطه را داشتند انجام شد. نتایج حاصله که تایید بیان ژن در سطح پروتئین است در شکل 6 آورده شده است.  

شکل5- نتایج آزمون کمی الایزا: الف. نمونه­های N. tabacum: N.T(Nicotiana tabacum)؛ ,a (بیان تحت تاثیر توالی امگا)؛ 101 تا 114 تعداد لاین­های بررسی شده. ب. نمونه­های  N. tabacum: .b(بیان بدون تاثیر توالی امگا)؛ 116 تا 129 تعداد لاین­های بررسی شده. ج. نمونه­های  N. benthamiana: N.B(Nicotiana benthamiana)؛ a (بیان تحت تاثیر توالی امگا)؛ 201 تا 214 تعداد لاین­های بررسی شده. د. نمونه­های N. benthamiana: b (بیان بدون تاثیر توالی امگا)؛ 216 تا 229 تعداد لاین­های بررسی شده.

Figure 5- Quantitative test results of ELISA: Upper left image shows N. tabacum samples: N.T (Nicotiana tabacum); a, expression affected by omega sequence); 101 to 114 numbers of studied lines. Upper right image shows N. tabacum samples: b, expression without omega sequencing; 116 to 129 numbers of studied lines. Left bottom image shows N. benthamiana samples: N.B (Nicotiana benthamiana); a, expression affected by omega sequencing; 201 to 214, numbers of examined lines. Right bottom image shows N. benthamiana samples: b (expression without omega sequence); 216 to 229 numbers of studied lines.

شکل6- آشکار سازی قطعات پروتئینی توسط دستگاه IMAGE SCANNING Typhon(Amersham Co. UK): چاهک 1- نمونه­ی کنترل مثبت پروتئین نوترکیب غیر از rhBMP2 که حاوی توالی His-tag تولید شده در E. coli جهت تایید واکنش لکه گذاری؛ چاهک2. لاین توتون N.T a,105 (در واکنش الایزا بیشترین OD را داشت)؛ چاهک3. N.T a,108؛ چاهک 4. N.T b,121؛ چاهک 5. N.B a,207؛ چاهک 6. N.B a, 212؛ چاهک 7.N. benthamiana (پروتئین تغلیظ شده با اولترا فیلتر آمیکون Millipore Co.)؛ چاهک 8. N.B b,217؛ چاهک 9. N. tabacum (پروتئین تغلیظ شده با اولترا فیلتر آمیکون Millipore Co.).

Figure 6- Detecting protein fragments by IMAGE SCANNING Typhon (Amersham Co. UK).  1, Positive test sample of a recombinant protein other than rhBMP2 containing the His-tag sequence expressed in E. coli to confirm the blotting reaction; 2, The N. T a, 105 (in the ELISA response had the highest OD); 3, NT a, 108; 4, NT b, 121; 5, NB a, 207; 6, NB a, 212; 7, N. benthamiana (Millipore Co. filtered ultrafiltration protein); 8, NB b, 217; 9, N. tabacum (Millipore Co. Ultra Ammonon Filter Condensation Protein).

انتخاب میزبان جهت تولید یک پروتئین نوترکیب را توالی و نوع مصرف آن پروتئین مشخص میکند. بدین منظور میزبان های مختلف یوکاریوتی و پروکاریوتی استفاده می­شوند. امروزه بسیاری از گیاهان از جمله گوجه فرنگی، موز، سیب زمینی، برنج، بادام زمینی، ذرت، کاهو، اسفناج، هویج، آرابیدوبسیس، سویا، یونجه، به منظور تولید پروتئین­های مختلف مورد استفاده قرار می­گیرند (Franconi, 2010). هر کدام از این گیاهان دارای مزایا و معایب خاص خود می­باشند، از میان اینها توتون به دلیل دست ورزی و تکثیر آسان (Yoo, 2014) و کلزا به دلیل کشت وسیع و میزان پایین تولید ترکیبات آلکالوئیدی بسیار مورد توجه قرار گرفته­اند (Robinson, 2013). انتخاب گونه­ی گیاهی و بافتی که پروتئین می­بایست در آن بیان و تجمع یابد، بسیار حائز اهمیت است (He, 2011). جهت تولید پروتئین در گیاه، در اکثر موارد بهتر است پروتئین هدف به صورت اختصاصی و فقط در یک بافت خاص بیان شود. تاکنون بافت­های مختلفی از گیاهان مانند برگ، ریشه، میوه و دانه هدف تراریختی قرارگرفته­اند. استفاده از کشت ریشه­های موئین دارای مزایای متعددی است؛ به طور معمول دست ورزی گیاه به منظور ایجاد ریشه­های موئین آسان بوده و ریشه­های ایجاد شده نیز با سرعت زیادی رشد می­کنند، خصوصا ریشه­های موئین توتون که در گزارشات قبلی هم به این مهم اشاره شده است (Georgiev, 2012; Häkkinen, 2013). گلیکو پروتئین BMP2 به عنوان فاکتور رشد مورد نیاز در درمان­های کلینیکالی و تحقیقات آزمایشگاهی مهندسی بافت مطرح است (Du Y, 2010). سیستم­های بیانی گیاهی دارای فواید ویژه­ای مانند پایین بودن هزینه، ایمنی محصول و فعالیت بالای پروتئین می باشند (Tadatoshi Sugio., 2008). مشخص شده که ویژگی­های ساختاری ناحیه غیرترجمه شونده­ی بالا دست کدون شروع (5‘UTR) می­تواند تأثیر زیادی روی میزان آغاز ترجمه­ی ژن بگذارد (Edgar Garcia., 2013; Lucy W, 2012). این نحوه­ی کارایی ترجمه­ی mRNA های یوکاریوتی به توالی نوکلئوتیدی مجاور کدون شروع مثل توالی کزاک بستگی دارد (Kozak, 1989; Mozafari A., 2015). هدف ما مطالعه و بررسی بیان rhBMP2 در ریشه­های موئین سه میزبان مختلف بود. در این تحقیق از توالی کزاک ACCACCATGGCT برای افزایش کارایی آغاز ترجمه، توالی 5‘UTR (TMV)  استفاده شد.  توالی 5‘UTR (TMV)  را در اصطلاح اومگا هم می­گویند به دلیل اینکه در قسمت 5‘ mRNA تشکیل ساختاری ثانویه ای به شکل حرف اومگای یونانی می­دهد (Larsen, 2012). در واقع نحوه­ی عملکردش هم بیشتر وابسته به این ساختار ثانویه است، بدین گونه که پس از اتصال کامل کمپلکس ریبوزوم به mRNA  این ساختار اومگا شکل سرعت حرکت کمپلکس ریبوزم روی mRNA را به نحو مطلوبی کنترل می­کند که شناسایی کدون متیونین اولیه برای کمپلکس ریبوزم در بهترین حالت رخ دهد و از طریق میزان بیان را افزایش می­دهد (Edgar Garcia., 2013). راه انداز CaMV35S که از فاکتورهای کلیدی در بیان یک ژن می­باشند نیز استفاده شد. نتایج بررسی­های مولکولی DNA ژنومی،RT-PCR ، آزمون الایزا و وسترن بلات نشان دادند که ژن rhBMP2 در ژنوم ریشه­های توتون و کلزا وارد و با موفقیت بیان شد. اما طبق مشاهدات این مطالعه بیان  BMP2در ریشه­های موئین کلزا مانع از رشد ریشه­ها در مقایسه با  لاین ریشه موئین کلزا غیرتراریخت گردید. این اثر در گزارش های افراد قبلی در رابطه با القای ریشه­ی موئین کلزا که هم در آزمایشگاه بیوتکنولوژی گیاهی پژوهشگاه اجرا گردیده نیز مشاهده شده بود. در گزارشات دیگری القای ریشه­ی موئینه در گونه های مختلف جنس کلزا و بیان ژن GUS بطور موفقیت آمیزی صورت پذیرفته است (Bhalla, 2008). در پاره­ای از موارد، آنتی بیوتیک انتخابی  از محیط کشت ریشه­های کلزا حذف گردید اما باز رشدی صورت نگرفت، در گزارشات قبلی برای رشد بهتر ریشه موئینه کلزا از محیط نیمه جامد استفاده شده است (Edgar Garcia., 2013). اما، این شیوه پس از بکارگیری در این مطالعه اثری مشاهده نگردید. با توجه به نتایج حاصل ریشه­های موئینه­ی N. tabacum برای تولید BMP2 از میان این سه میزبان گیاهی مناسب­تر است، این گونه میزان زیست توده­ی و پرونئین بیشتری نسبت به گونه­ی N. benthamiana بیان پروتئین بیشتری داشت. نتایج نشان دادند که استفاده از ناحیه­ی غیرترجمه شونده در گونه­ی N. tabacum تاثیر بیشتری دارد (نتایج پروتئینی حاصل از لاین شماره 105، که این لاین بدون استفاده از پروتوکل تغلیظ پروتئین در واکنش لکه گذاری کیفی به خوبی باند مربوطه را ظاهر کرد). در خصوص فعالیت زیستی rhBMP2 می­توان به گزارشات ساختاری و عملکردی پروتئین های نزدیک به این پروتئین تقریبا استناد کرد، BMP7 در کشت سوسپانسیسون N. benthamiana توسط شرکت ProspecBio تولید و تجاری سازی شده که ساختار و عملکردی مشابه BMP2 دارد، به دلیل مشابهت عملکردی فاکتور 7 و 2 می­توان نتیجه گرفت که میزبان توتون استفاده شده در این مطالعه برای BMP2 میزبان مناسبی است. همین فاکتور شماره ی 7 در سلول­های E. coli، CHO و HEK تولید وتجاری سازی شده که قیمت فاکتور تولیدی در توتون چند برابر محصول E. coli و برابر با محصول CHO می­باشد. این قیمت ارزانتر احتمالا به دلیل این است که باکتری سیستم چاپرون­ها را ندارد و توانایی گلیکوزیلاسیون هم ندارد(Kwang, 2016). پروتئین­های نوترکیب امروزه کاربردهای فراوانی در پزشکی و صنعت دارند و بهینه کردن روش­های تولید این محصولات از ملزومات پروسه تولید است. بررسی­های بیان rhBMP2 در ریشه موئین از طریق RT-PCR و لکه گذاری پروتئینی نشان دهنده­ی موفقیت این پروژه بوده است و میزبان ریشه موئینه توتون را بعنوان میزبان کارآمدی در این عرصه معرفی می­کند. نتیجه­ی حاصل دریچه ای بر روی تحقیقات پروتئین نوترکیب می­گشاید چرا که تغییرات در کاست ژنی در این بیان کارآمد بود و با میزبان گیاهی توتون، در وهله اول می­توان محصول ایمنی برای تحقیقات سلولی به دست آورد و از طرفی هم هزینه­های تولید کاهش می­یابد.