Document Type : Research Paper
Authors
1 Department of Food Science & Technology- Ferdowsi University of Mashhad
2 Ph.D. Student of Agricultural Biotechnology Department, Faculty of Agriculture, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran.
3 Ph.D. Student of Food Microbiology, Department of Food Science & Technology, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran.
4 Ph.D. Student of Animal Science Department, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran.
Abstract
Keywords
بررسی فعالیت ضد باکتریایی و سمیت پپتید نوترکیب LasioglossinΙΙΙ بر پاتوژن های شاخص مواد غذایی
محمد باقر حبیبی نجفی*1، عباس تنهاییان2، پریا رهنما3، مرجان ازغندی4
1استاد گروه علوم و صنایع غذایی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه فردوسی مشهد، مشهد، ایران.
2دانشجوی دکتری بیوتکنولوژی کشاورزی، گروه بیوتکنولوژی و به نژادی گیاهی، دانشگاه فردوسی مشهد، مشهد، ایران.
3دانشجوی دکتری میکروبیولوژی مواد غذایی، گروه علوم و صنایع غذایی، دانشگاه فردوسی مشهد، مشهد، ایران.
4دانشجوی دکتری علوم دامی، گروه علوم دامی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه فردوسی مشهد، مشهد، ایران.
تاریخ دریافت: 22/04/1397، تاریخ پذیرش: 24/08/1397
چکیده
افزایش مقاومت میکروارگانیسمها به آنتی بیوتیکهای رایج منجر به یافتن ترکیبات ضد میکروبی جدید شده است. پپتیدهای ضد میکروبی یکی از گزینههای مناسب برای جایگزینی آنتی بیوتیکهای موجود میباشند. لازیوگلوسینها گروهی از پپتیدهای زیست فعال میباشند که در مطالعه حاضر، عملکرد ضد میکروبی پپتید نوترکیب لازیوگلوسین ɪɪɪ بر پنج عامل بیماری‌زای باکتریایی غذایی (باکتری های استافیلوکوکوس اورئوس، سالمونلا تیفی موریوم، انتروکوکوس فکالیس، لیستریا مونوسیتوژنز و اشرشیا کلی) و همچنین بررسی دوز سمیت آن بر یک رده سلول انسانی مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج حکایت از عملکرد ضد میکروبی مناسب پپتید نوترکیب دارد به صورتیکه حداقل غلظت بازدارندگی(MIC ) و کمترین غلظت کشندگی(MBC) پپتید لازیوگلوسین ɪɪɪ بر باکتری های مورد آزمون به ترتیب در محدوده µg/ml 625/8-851/3 و µg/ml 406/15-703/7 بود. نتایج حاکی از آن بود که باکتری استافیلوکوکوس اورئوس بیشترین حساسیت را به این پپتید دارد به طوری که مقادیر MIC و MBC آن به ترتیب 851/3 و 703/7 بود. غلظتی از پپتید که اثر سمی بر روی سلولهای کلیه جنین انسان نشان داد (1652 µg/ml) به مراتب بیشتر از مقادیر MIC و MBC بدست آمده بود. نتایج این مطالعه نشان داد خاصیت باکتریکشی این پپتید با آنتی بیوتیکهای رایج قابل رقابت میباشد.
کلمات کلیدی: پپتید لازیوگلوسین ɪɪɪ، پپتید ضد میکروبی، سمیت سلولی، پاتوژن غذایی.
مقدمه
ایمنی مواد غذایی یک نگرانی رو به رشد در سراسر جهان است. بیماریهای ایجاد شده بوسیله مواد غذایی از مهمترین مشکلات سلامت عمومی به شمار میروند و همه ساله موجب ابتلا و مرگ و میر تعداد قابل توجهی از مردم میشوند. علل شایع بیماری های منتقله از غذا شامل باکتریها، سموم باکتریایی، ویروس ها و انگلها هستند. شایعترین این عوامل باکتری ها هستند، چراکه اقدامات نامناسب برای تهیه و جابه جایی غذا باعث آلودگی، بقا و رشد باکتریهای بیماری زا میگردد (Chopra et al., 2015; Koek et al., 2006). صنعت غذا برای حفظ کیفیت و افزایش زمان ماندگاری مواد غذایی به طور گسترده از نگهدارنده های شیمیایی استفاده می کند. از طرفی مصرف غذاهای فرآوری شده با مواد نگهدارنده شیمیایی منجر به افزایش نگرانی مصرف کنندگان و تقاضا برای مصرف غذاهای طبیعی و با حداقل مواد نگهدارنده شیمیایی شده است. لذا نیاز مبرم به یافتن نگهدارنده های طبیعی برای مواد غذایی احساس می شود (Espitia et al., 2012). مشکل اصلی در صنایع غذایی آلودگی مواد غذایی با پاتوژنهایی مثل سالمونلا، شیگلا، میکروکوکوس، انترکوکوس فکالیس، باسیلوس لیچنیفرمیس، اشرشیاکلی، لیستریا مونوسیتوژنز و ... میباشد لذا باید به فکر یافتن ترکیبات ضد باکتریایی طبیعی بر علیه آنها بود. تحقیقات نشان میدهد پپتیدهای ضد میکروبی میتوانند بر علیه پاتوژن های غذایی موثر باشند و بنابراین بدون داشتن اثرات جانبی نقش مهمی در نگهداری مواد غذایی ایفا کنند (Hintz et al.,2012; Kraszewska et al., 2016). پپتیدهای ضد میکروبی به خانواده جدیدی از آنتی بیوتیکها تعلق دارند. مزیت عمده پپتیدهای ضد میکروبی به مکانیسم عمل آنها مربوط میشود که تفاوت عمدهای با آنتی بیوتیکهای متداول دارند. ﭘﭙﺘﯿﺪﻫﺎی ﺿﺪ ﻣﯿﮑﺮوﺑﯽ ﺑﺮ اﺳﺎس وﯾﮋگیهای ﺑﯿﻮﺷﯿﻤﯿﺎﯾﯽ ﻣﺜﻞ ﺑﺎر ﺧﺎﻟص به دو گروه پپتیدهای کاتیونی و پپتیدهای آنیونی تقسیم میشوند. اغلب پپتیدهای ضد میکروبی کاتیونی هستند (Marshall, 2003). هر چند مکانیسم دقیق عملکرد آنها هنوز بهطور دقیق مشخص نشده است ولی تصور بر آنست که این پپتیدهای باردار مثبت پوشش سلولی باکتریایی که بار منفی دارد را هدف قرار میدهند. سپس با نفوذ به درون غشای سلول ساختار سلول را تخریب کرده و منجر به تراوش اجزای سیتوپلاسم به بیرون و نهایتا مرگ سلولی می شوند (Bagley, 2014). در حالی که پپتیدهای ضد میکروبی آنیونی ﮔﯿﺮﻧﺪهﻫﺎی وﯾﮋهای را ﻫﺪف ﻗﺮار داده و ﺑﻪ ﻋﻨﻮان ﺑﺎزدارﻧﺪهﻫﺎی اﺻﻠﯽ مسیرهای متابولیکی رفتار میکنند(Cotter et al., 2013). از میان بیش از 900 پپتید ضد میکروبی ایزوله شده از تعداد زیادی از میکروارگانیسمها، پپتیدهای مارپیچ آلفا کاتیونی خطی بیشترین گروه مورد مطالعه بودهاند. اینها پپتیدهای کوچکی هستند که از 10 تا 45 اسید آمینه بلند زنجیره، هیدروفوب و بازی تشکیل شده اند. این گروه از پپتیدها اغلب در زهر حشرات گزنده مثل زنبورها یافت می شوند. چنین پپتیدهایی به عنوان الگویی برای توسعه پپتیدهای آنتی بیوتیکی جدید و موثر می توانند به کار گرفته شوند(Cerovsky et al., 2009). Lasioglossinها گروهی از پپتیدهای ضد میکروبی طبیعی هستند که به تازگی شناسایی شده اند و در زهر زنبور عسل وحشی(Lasioglossum laticeps) وجود دارند. سه نوع Lasioglossin از نظر ساختاری شناسایی شدهاند و با اسامی Lasioglossin Ι, ΙΙ, ΙΙΙ نامگذاری شدهاند(Vrablikova et al., 2017). این پپتیدها عملکرد ضد میکروبی بر برخی باکتریهای گرم مثبت و گرم منفی نشان دادند. پپتیدهای Lasioglossin فعالیت همولیتیک کمی در برابر اریتروسیتهای موش آزمایشگاهی نشان دادند که یک ویژگی مهم برای آنها می باشد زیرا مشکل اصلی در کاربرد بسیاری از پپتیدهای ضد میکروبی توانایی آنها برای لیز کردن سلولهای یوکاریوتی میباشد که به عنوان فعالیت همولیتیکی مطرح میشود و در این پپتیدها این ویژگی در حداقل میباشد. از بین سه نوع، Lasioglossin نوع ΙΙΙ بهترین پتانسیل ضد میکروبی، ضد توموری و ضد مخمر کاندیدا را نشان داده است(Vrablikova et al., 2017). در مطالعات پیشین انجام شده اثر ضد میکروبی پپتید Lasioglossin ΙΙΙ که به شکل نوترکیب در فضای پریپلاسمی سنتز شده باشد بر علیه پاتوژنهای شاخص غذایی بررسی نشده است. از این رو در این تحقیق، با توجه به در دسترس بودن نوع نوترکیب این پپتید از مطالعه دیگر(نتایج گزارش نشده است)، ابتدا اثر ضد میکروبی این پپتید نوترکیب برعلیه پاتوژنهای اشرشیا کلی، استافیلوکوکوس اورئوس، سالمونلا تیفی موریوم، انتروکوکوس فکالیس و لیستریا مونوسیتوژنز مورد بررسی قرار گرفت و سپس عدم سمیت این پپتید ارزیابی شد تا چشم انداز روشنی در معرفی این پپتید به عنوان نگهدارنده مواد غذایی فراهم گردد.
مواد و روشها
باکتریهای استافیلوکوکوس اورئوس (ATCC25923)، سالمونلا تیفی موریوم (ATCC 14028)، انتروکوکوس فکالیس (ATCC 29212) ، لیستریا مونوسیتوژنز (ATCC 19111) و اشرشیا کلی (ATCC 25922) از کلکسیون میکروبی گروه علوم و صنایع غذایی دانشگاه فردوسی مشهد تهیه گردیدند.
پپتید نوترکیب Lasioglossin ΙΙΙ از آزمایشگاه گروه صنایع غذایی دانشگاه فردوسی مشهد تهیه گردید. این پپتید به صورت نوترکیب و با تجمع در فضای پری پلاسمی در باکتری E. Coli سویه BL21 ترانسفورم شده با وکتور pET22b نوترکیب، دارنده توالی کدکننده لازیوگلوسین ΙΙΙ، سنتز شد و پس از استخراج پپتید از فضای پری پلاسمی و تخلیص آن، غلظت آن تعیین گردید. سپس پپتید جهت ارزیابی ضدمیکروبی به کار برده شد.
برای تعیین حداقل غلظت مهار کنندگی (MIC[1]) و حداقل غلظت کشندگی ([2]MBC) از روش میکرودایلوشن استفاده گردید (Wikler et al., 2009; Wiegand et al., 2008). برای این منظور ابتدا از باکتریها کشت 24 ساعته تهیه شد. پس از تهیه 5/0 مک فارلند از باکتریها در محیط مولر هینتون براث (مرک، آلمان)، مقدار 100 میکرولیتر از سوسپانسیون تهیه شده به هر یک از چاهکهای پلیت 96 خانه اضافه شد. سپس به چاهک اول 100 میکرولیتر پپتید اضافه شد و کاملا مخلوط گردید و از آن 100 میکرولیتر برداشته به چاهک بعدی اضافه شدو این رویه را در جاهکهای بعدی ادامه داده به صورتی که سریالی از رقتهای پپتید حاصل شد. کنترل منفی (بدون افزودن باکتری) و کنترل مثبت (بدون افزودن پپتید ) نیز در هر ردیف در نظر گرفته شد. بعد از 16 تا 18 ساعت گرمخانهگذاری میکروپلیت در دمای C° 37، جذب تمامی چاهکها بوسیله الایزا خوان (مدل ELX800 بیوتک، امریکا) در 620 نانومتر اندازه گیری شد. اولین چاهکهایی که حاوی پپتید بود و جذبی در 620 نانومتر نداشتند و شفاف بوده به عنوان MIC در نظر گرفته شد. به منظور تعیین حداقل غلظت کشندگی نیز 50 میکرولیتر از چاهکهایی که در آنها رشد باکتری صورت نگرفته بود یعنی همان رقت MIC و رقتهای بالاتر از آن به محیط مولر هینتون آگار (مرک، آلمان) منتقل شد و پس از پخش بوسیله سواپ استریل به مدت 24 ساعت در C° 37 گرمخانه گذاری شدند. پلیتهایی که حاوی کمترین غلظت از پپتید بودند و همچنین در آن رشدی مشاهده نشد به عنوان MBC در نظر گرفته شدند.
سمیت پپتید روی سلولهای کلیه جنین انسان بررسی شد. تقریبا103 ×3 سلول در 100 µl محیط DMEM[3] (10% حجمی-حجمی FBS[4]) (سیگما، انگلستان) در هر چاهکِ یک پلیت دارای 96 چاهک کشت داده شدند. سلول ها به مدت 1 شب در دمای C °37 در یک اینکوباتور مرطوب با 5% دی اکسید کربن گرمخانهگذاری شدند. سلولها سپس با پپتید تیمار شدند. سلولها به مدت 72 ساعت در دمای C °37 تحت شرایط یکسان گرمخانهگذاری شدند. تست MTT برای دیدن اثر بازدارندگی پپتید در سلولهای نرمال انجام شد. طی این ارزیابی lµ 10 از رنگ MTT تهیه شده (PBS 5 mg/ml) در هر یک از خانهها اضافه شد و به منظور متابولیزه شدن ماده MTT توسط سلولهای زنده و ایجاد بلورهای فورمازان، پلیت96 خانه ای به مدت 4 ساعت در دمای C 037 گرمخانه گذاری شد. سپس محتویات خانهها تخلیه و lµ 150 DMSO [5]( سیگما، انگلستان ) به هر یک از خانهها افزوده شد. DMSO حلال بلورهای فورمازان است. افزودن DMSO باعث ایجاد درجهی متفاوتی از شدت رنگ بنفش تا سفید میشود. شدت رنگ این محلولها ، معیاری از تعداد سلولهای زنده در محیط میباشد. میزان رنگ تولید شده با تعداد سلولهایی که از نظر متابولیک فعال هستند رابطه مستقیم دارد. سپس میزان جذب خانهها در طول موج nm 570 توسط دستگاه الایزا اندازهگیری شد (Ghandehari et al.,2015).
در این مطالعه برای تجزیه دادهها از نرم افزار SPSS.22 استفاده شد. بررسی خواص ضد باکتریایی در 4 تکرار و در قالب طرح کاملا تصادفی انجام شد. برای مقایسه میانگین دادهها از از آزمون تحلیل واریانس و آزمون چند دامنهای دانکن در سطح اطمینان 05/0 استفاده شد.
نتایج و بحث
هر روز اثرات زیانآور نگهدارنده های شیمیایی از جمله عوارض سرطانزایی و نیز باقی ماندههای سمی بر سلامت انسان به اثبات میرسد و تقاضا برای مصرف مواد غذایی که عمر ماندگاری آنها به صورت طبیعی افزایش مییابد، بیشتر میشود. لذا محققین مواد غذایی درصدد جایگزینی آنها با نمونههای طبیعی شدهاند. از طرفی تعداد پاتوژنهای مقاوم به آنتی بیوتیک روز به روز در حال افزایش است و ترکیبات ضد میکروبی موجود برای کنترل عفونتهای باکتریایی جوابگو نمیباشند (Okuda et al., 2015). پپتیدهای ضد میکروبی میتوانند جایگزین آنتی بیوتیکهای موچود برای کنترل و مبارزه با عفونتهای باکتریایی باشند. این پپتیدهای ضد میکروبی نه تنها عملکرد ضد باکتریایی دارند بلکه در بسیاری موارد اثر کشندگی بر روی ویروسها و حتی سلولهای سرطانی نشان دادهاند. عملکرد پپتیدهای ضد میکروبی به طور عمده به سطح سلولهای باکتریایی و ترکیب آمینو اسیدی پپتید بستگی دارد. پپتیدهای ضد میکروبی ابتدا به سطح سلول باکتریایی که به احتمال زیاد توسط پیوند الکترواستاتیک بین پپتید کاتیونی و سطح باکتریایی ایجاد میشود متصل میشوند. احتمال آن میرود که پپتیدهای کاتیونی ابتدا توسط مولکولهای لیپوپلیساکارید دارای بار منفی موجود در باکتریهای گرم منفی جذب می شوند (Brogden, 2005). هر چند یافتههای Ebbensgaard et al. (2015) نشان داد که لیپوپلیساکارید در باکتری اشرشیا کلی نه فقط در جذب و اتصال پپتیدهای ضد میکروبی به غشای خارجی نقش دارد بلکه به عنوان مانع حفاظتی بر علیه پپتیدهای ضد میکروبی کاتیونی عمل میکند. زیرا سویههای باکتریایی اشرشیا کلی جهش یافتهی دارای نقص در لیپوپلیساکارید، حساسیت بیشتری به پپتیدهای ضد میکروبی بکار رفته نشان دادند. که این امر دلالت بر این دارد که لیپوپلیساکارید به عنوان جزء ضروری در فعالیت ضد میکروبی پپتیدهای کاتیونی نقش ندارد همچنانکه بسیاری از پپتیدهای ضد میکروبی کاتیونی فعالیت ضد میکروبی بر علیه باکتریهای گرم مثبت که فاقد لیپوپلیساکارید هستند نشان دادند (Ebbensgaard et al., 2015).
تعیین فعالیت ضد میکروبی به روش تعیین حداقل غلظت ممانعت کننده (MIC) یکی از پرکاربرد ترین روشها است و توسط اکثر محققین به عنوان معیاری برای تعیین فعالیت ضد میکروبی پذیرفته شده است. فاکتورهای متعددی بر روی میزان MIC تاثیر می گذارند از جمله دما، میزان تلقیح و نوع میکروارگانیسم (Lambert, 2000). نتایج مربوط به حداقل غلظت بازدارندگی و حداقل غلظت کشندگی پپتید لازیوگلوسین ΙΙΙ بر روی 5 باکتری پاتوژن در جدول 1 نشان داده شده و با آنتی بیوتیکهای استاندارد مقایسه شده است. نتایج نشان داد کمترین MIC و MBC به باکتری استافیلوکوکوس اورئوس مربوط بود، یعنی این باکتری بیشترین حساسیت به این پپتید را نشان داد. اثر مهار کنندگی این پپتید بر رشد استافیلوکوکوس اورئوس در مقایسه با آنتی بیوتیکهای ونکومایسین، جنتامایسین و سیپروفلو کساسین خیلی بیشتر بود ولی آنتی بیوتیک آمپی سیلین اثر مهار کنندگی بیشتری نسبت به پپتید لازیوگلوسین ΙΙΙ بر روی رشد استافیلوکوکوس اورئوس داشت. اثر مهار کنندگی این پپتید بر رشد سالمونلا تیفی موریوم تقریبا مشابه اثر آنتی بیوتیک سیپروفلوکساسین بود ولی در مقایسه با آنتی بیوتیکهای آمپی سیلین، کافتازیدیم، پیپراسیلین و جنتامایسین اثر مهار کنندگی بیشتری بر رشد سالمونلا تیفی موریوم نشان داد. اثر بازدارندگی پپتید مذکور بر رشد باکتری انتروکوکوس فکالیس از آنتی بیوتیکهای آمپی سیلین، ونکومایسین، جنتامایسین و سیپروفلوکساسین کمتر بود. هر چند اثر کشندگی این پپتید بر انتروکوکوس فکالیس از آنتی بیوتیکهای آمپی سیلین (16µg/ml)، ونکومایسین (256µg/ml)، جنتامایسین (128µg/ml) و سیپروفلوکساسین (16µg/ml) خیلی بیشتر بود. نتایج MIC بر باکتری لیستریا مونوسیتوژنز نشان داد اثر مهار کنندگی پپتید لازیوگلوسین ΙΙΙ بر رشد لیستریا خیلی بیشتر از اثر مهار کنندگی آنتی بیوتیکهای آمپی سیلین، پیپراسیلین و جنتامایسین بود. از بین باکتریهای مورد بررسی مقاومترین باکتری به پپتید لازیوگلوسین ΙΙΙ باکتری اشرشیا کلی بود که هرچند در برابر دو آنتی بیوتیک آمپی سیلین و سیپروفلوکساسین حساستر بود ولی مقاومت بیشتری در برابر آنتی بیوتیکهای کافتازیدیم، پیپراسیلین و جنتامایسین نشان داد. بررسی نتایج MBC نشان داد پپتید لازیوگلوسین ΙΙΙ در مقایسه با آنتی بیوتیک آمپی سیلین(6/1 µg/ml MBC=) اثر کشندگی کمتری بر باکتری استافیلوکوکوس اورئوس نشان داد. از بین باکتریهای مورد آزمون حداقل غلظت مهار کنندگی رشد با حداقل غلظت کشندگی رشد پپتید بر علیه باکتری اشرشیا کلی یکسان بود (CLSI, 2017). پپتید لازیوگلوسین ΙΙΙ همچنین بر روی یوکاریوت های ابتدایی نیز تاثیر بازدارندگی نشان داد به طوری که مخمر کاندیدا آلبیکانس در حضور لازیوگلوسین ΙΙΙ LL و لازیوگلوسین ΙΙΙ-D LLبه ترتیب در غلظتهای µM5/11 و µM21 به مدت 3 روز قادر به رشد بود (Vrablikova et al., 2017).
در پژوهش انجام شده توسط Mishra et al. (2013) اثر ضد میکروبی پپتید لازیوگلوسین ΙΙΙ که بصورت شیمیایی سنتز شده بود بر باکتری اشرشیا کلی ATCC8739 و استافیلوکوکوس اورئوس ATCC 6538 مورد بررسی قرار گرفت. نتایج MIC برای هر دو پاتوژن 75/1 میکروگرم بر لیتر بود که از نتایج حاصل از پژوهش ما که نوع نوترکیب این پپتید بکار رفته بود خیلی کمتر بود. همچنین آنالیز انجام شده با میکروسکوپ الکترونی روبشی توسط آنها نشان داد که سلولهای باکتریایی تیمار شده با پپتید لازیوگلوسین ΙΙΙ در مقایسه با سلولهای تیمار نشده تفاوتهای آشکاری در مورفولوژی غشایی داشتند. آنالیزهای بعدی آنها نشان داد که این پپتید میتواند باعث تخریب غشای خارجی شود (Mishra et al., 2013). با توجه به اینکه مطالعه بر روی اثرات ضد میکروبی این پپتید در ایران و جهان محدود بوده لذا به بررسی موارد مشابه بر روی پپتیدهای دیگر پرداختیم. در مطالعه حاضر نتایج حاکی از آن بود که مقادیر MBC پپتید لازیوگلوسین ΙΙΙ بر علیه باکتریهای استافیلوکوکوس اورئوس، سالمونلا تیفی موریوم، انتروکوکوس فکالیس و لیستریا مونوسیتوژنز تقریبا دو برابر مقادیر MIC بود که این یافتهها در تطابق با نتایج Ilić et al. (2013) بود که بر روی فعالیت ضد میکروبی طیف وسیعی از پپتیدهای ضد میکروبی آزمایشاتی انجام دادند. در پژوهشی Slaninová et al (2012) اثر ضد میکروبی پپتید لازیوگلوسین ایزوله شده از زهر زنبور عسل در برابر باکتریهای گرم مثبت و گرم منفی و همچنین سمیت آنها را بر علیه سلولهای نرمال و سرطانی انسان بررسی کردند. نتایج نشان داد لازیوگلوسین ΙΙΙ و یکی ازآنالوگهای آن میتوانند به عنوان داروهای ضد میکروبی بکار روند. بطوری که سمیت 3 تا 5 برابر بیشتر بر علیه سلولهای سرطانی نسبت به سلولهای نرمال داشتند. آزمایشات in vivo در موش نیز نشان داد لازیوگلوسین ΙΙΙ ترکیبی فعال و غیر سمی میباشد. (Slaninová et al., 2012). در مطالعه انجام شده توسط Ebbensgaard et al. (2015) تاثیر ضد میکروبی پپتیدهای Cap11و Cap18 (که همچون پپتید لازیوگلوسین دارای ساختمان مارپیچ آلفا بودند) بر روی سویه های E.coli در مقایسه با باکتریهای گرم مثبت بیشتر بود در حالی که در این مطالعه تاثیر بازدارندگی پپتید لازیوگلوسین ΙΙΙ بر باکتری E.coli در مقایسه با باکتریهای گرم مثبت کمتر بود هر چند اثر کشندگی پپتید لازیوگلوسین ΙΙΙ بر باکتری E.coliنسبت به لیستریا و انتروکوکوس بیشتر بود. پپتید ملیتین[6] که از زنبور عسل ایزوله شده بود نیز همچون پپتید لازیوگلوسین ΙΙΙ فعالیت ضد میکروبی خوبی بر علیه باکتریهای پاتوژن گرم مثبت بویژه استافیلوکوکوس اورئوس، انتروکوکوس فکالیس و لیستریا مونوسیتوژنز داشت. به طوریکه MIC ملیتین بر علیه هر سه باکتری استافیلوکوکوس اورئوس ATCC29213، انتروکوکوس فکالیس ATCC29212 و لیستریا مونوسیتوژنز N22-2 4-2 میکروگرم بر میلی لیتر بود. MIC ملیتین بر علیه باکتری اشرشیا کلی ATCC25922 16 میکروگرم بر میلی لیتر بود که تقریبا دو برابر MIC پپتید لازیوگلوسین ΙΙΙ بر علیه این باکتری بود. به این معنی که قدرت بازدارندگی پپتید لازیوگلوسین ΙΙΙ بر علیه اشرشیا کلی دو برابر قدرت پپتید ملیتین بود. علت قدرت بازدارندگی کمتر پپتید ملیتین بر علیه باکتری اشرشیا کلی وجود غشای خارجی در باکتری های گرم منفی می باشد که در نتیجه میزان نفوذ اجزای هیدروفوب به لایه لیپوپلیساکارید را محدود می کند(Ebbensgaard et al., 2015). در پژوهش دیگری که توسط Ilić et al. (2013) صورت گرفت میزان MIC پپتیدهای ADP1، ADP2 و ADP3 در برابر باکتری اشرشیا کلی ATCC25922 به ترتیب 4-2، 1و 4 میکروگرم بر میلی لیتر بود که از MIC پپتید بکار رفته در پژوهش ما کمتر بود. ولی میزان کشندگی پپتید ADP3 بر روی باکتری اشرشیا کلی با میزان کشندگی پپتید بکار رفته در این پژوهش تقریبا برابر بود. که تاثیر این پپتیدها در مهار رشد باکتری استافیلوکوکوس اورئوس ATCC25923 خیلی کمتر از پپتید لازیوگلوسین ΙΙΙ بود. همچنین میزان مهار پپتید ADP2 بر روی سالمونلا تیفی موریوم خیلی کمتر از پپتید لازیوگلوسین ΙΙΙ بود (Ilić et al., 2013).
آنچه کاربرد پپتیدهای ضد میکروبی را به عنوان یک عامل ضد باکتری در مواد غذایی و استفاده دارویی با مشکل مواجه می سازد سمیت آنها در برابر سلولهای یوکاریوت میباشد. لذا پپتیدهای ضد میکروبی در کنار خاصیت ضد میکروبی قوی، برای کاربردهای غذایی و دارویی باید از نظر عدم سمیت مورد بررسی قرار بگیرند (Lee et al., 2013). در این پژوهش نیز در کنار بررسی ویژگی بازدارندگی رشد و کشندگی پپتید لازیوگلوسین ΙΙΙ بر روی باکتریهای پاتوژن، ویژگی عدم سمیت آن روی سلولهای کلیه جنین انسان نیز مورد بررسی قرار گرفت. غلظت اولیه برای تست عدم سمیت با ارزیابی سمیت پپتید لازیوگلوسین ΙΙΙ تخلیص شده برابر با 1652 میکروگرم بر میلی لیتر بود که در این غلظت که بالاترین مقدار ممکن از پپتید بود هیچ گونه سمیت معناداری مشاهده نشد (P > 0.05). این غلظت از پپتید به ترتیب 429، 383، 292، 5/214 و 5/191 برابر بیشتر از MIC باکتریهای استافیلوکوکوس اورئوس، سالمونلا تیفی موریوم ، انتروکوکوس فکالیس، لیستریا مونوسیتوژنز و اشرشیا کلی و همچنین به ترتیب 5/214، 5/191، 146، 107 و 5/191 برابر بیشتر از MBC این باکتریها بود. پپتیدهای لازیوگلوسین در مطالعه Cerovsky et al. (2009) اثر سمیت بر روی سلولهای سرطانی در شرایط in vitro نشان دادند. کمترین غلظت سمیت این پپتید بر روی سلولهای مخاطی نرمال موش آزمایشگاهی بود که غلظت آن µM19 بود.
نتیجه گیری
نتایج پژوهش حاضر نشان از قابلیت رقابت پپتید لازیوگلوسین ΙΙΙ با آنتی بیوتیکهای رایج از نظر خاصیت ضد باکتریایی و کشندگی باکتریایی دارد. با توجه به غلظت چندین برابر بیشتر از MIC و MBC اعمال شده در تست عدم سمیت پپتید لازیوگلوسین ΙΙΙ بر روی یک رده سلول انسانی، عدم سمیت پپتید مذکور به اثبات رسید. با ارزیابیهای تکمیلی و انجام تستهای عدم سمیت بر روی ردههای سلولی انسانی دیگر و غلظتهای مطلوب قابل رقابت با ترکیبات ضد میکروبی متداول می توان چشم انداز روشنی را برای این پپتید به عنوان نگهدارنده مواد غذایی در نظر داشت.
سپاسگزاری
این مطالعه با حمایت مالی دانشگاه فردوسی مشهد (معاونت پژوهشی) در قالب طرح شماره 45804/2 انجام گرفت. بدین وسیله مجری طرح از حمایت مالی سپاسگزاری می نماید.
جدول1- میانگین حداقل غلظت مهار کننده رشد و کشندگی پپتید نوترکیب لازیوگلوسین ΙΙΙ در مقایسه با آنتی بیوتیک های متداول بر روی 5 باکتری پاتوژن (CLSI).
Table 1-The average values of MIC and MBC for lasioglossin LL ΙΙΙ recombinant peptide in comparison with commercial antibiotics against five pathogenic bacteria (CLSI).
|
باکتری Bacteria |
حداقل غلظت کشندگی MBC (µg/ml) |
حداقل غلظت بازدارندگی MIC (µg/ml) |
||||||
|
|
Lasioglossin ΙΙΙ
|
آمپیسیلین Ampicillin |
کافتازیدیم Caftazidime |
ونکومایسین Vancomycin |
پیپراسیلین Piperacillin |
جنتامایسین Gentamicin |
سیپروفلوکساسین Ciprofloxacin |
|
|
استافیلوکوکوس اورئوس Staphylococcus aureus(ATCC25923) |
7.703±0.57 |
3.851±0.31 |
0.5-2 |
- |
≥16 |
- |
≥16 |
≥16 |
|
سالمونلا تیفی موریوم Salmonella typhimurium (ATCC 14028) |
8.625±0.15 |
4.312±0.22 |
≥32 |
≥16 |
- |
≥128 |
≥16 |
≥4 |
|
انتروکوکوس فکالیس Enterococcus faecalis (ATCC 29212) |
11.31±0.22 |
5.655±0.24 |
4 |
- |
4 |
- |
4 |
1 |
|
لیستریا مونوسیتوژنز Listeria monocytogenes(ATCC 19111) |
15.406±0.33 |
7.703±0.43 |
≥32 |
- |
- |
≥128 |
≥16 |
- |
|
اشرشیا کلی Escherichia coli (ATCC 25922) |
8.625±0.09 |
8.625±0.41 |
2-8 |
≥16 |
- |
≥128 |
≥16 |
≥4 |
.
منابع
Bagley C (2014(. Potential role of synthetic AMPs in animal health to combat growing
concerns of antibiotic resistance - A review. Wyno Academic Journal of Agricultural Sciences 2: 19–28
Brogden KA )2005(. Antimicrobial peptides: pore formers or metabolic inhibitors in bacteria. Nature Reviews Microbiology 3: 238-250
Chopra L, Singh G, Kumar Jena K, Sahoo DK (2015). Senorensin: a new bacteriocin with potential of an anti-biofilm agent and a food biopreservative. Scientific Reports 5: 13412
Cerovsky V, Budesnsky M, Hovorka O, Cvacka J, Voburka Z, Slaninov J, Borovicˇkov L, Fuck V, Bednrov L, Votruba I, Straka J )2009(. Lasioglossins: Three Novel Antimicrobial Peptides from the Venom of the Eusocial Bee Lasioglossum laticeps (Hymenoptera: Halictidae). ChemBioChem 10: 2089 – 2099
Clinical & Laboratory Standards Institute (CLSI). M100-S27 (2017). performance standards for antimicrobial susceptibility testing; Twenty-seventh informational supplement. Retrieved January 1, 2017, from https://standards.globalspec.com/std/10066309/m100-s27
Cotter PD, Ross RP, Hill C (2013). Bacteriocins—A viable alternative to antibiotics. Nature Reviews Microbiology 11: 95–105
Ebbensgaard A, Mordhorst H, Toft Overgaard M, Gyrup Nielsen C, Møller Aarestrup F, and Bech Hansen E (2015). Comparative Evaluation of the Antimicrobial Activity of Different Antimicrobial Peptides against a Range of Pathogenic Bacteria. PLoS One 10: e0144611
Espitia P, Soares N, Coimbra J, Andrade N, Cruz R, Medeiros E (2012). Bioactive peptides: synthesis, properties, and applications in the packaging and preservation of food. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety 11: 187–204
Ghandehari F, Behbahani M, Pourazar A, Noormohammadi Z (2015). In silico and in vitro studies of cytotoxic activity of different peptides derived from vesicular stomatitis virus G protein. The Iranian Journal of Basic Medical Sciences 18: 47–52
Hintz T, Matthews KK, Di R (2015). The use of plant antimicrobial compounds for food preservation. BioMed Research International 2015: 1-12
Ilić N, Novković M, Guida F, Xhindoli D, Benincasa M, Tossi A, Juretić D (2013). Selective antimicrobial activity and mode of action of adepantins, glycine-rich peptide antibiotics based on anuran antimicrobial peptide sequences. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes 1828: 1004-1012
Koek AG, Bovée LP, van den Hoek JA, Bos AJ, Bruisten SM (2006). Additional value of typing Noroviruses in gastroenteritis outbreaks in Amsterdam, The Netherlands. Journal of Clinical Virology 35: 167-172
Kraszewska J, Beckett MC, James TC, Bond U (2016). Comparative analysis of the antimicrobial activities of plant defensin-like and ultrashort peptides against food-spoiling bacteria. Applied and Environmental Microbiology AEM-00558
Lambert RJW (2000). Susceptibility testing: inoculum size dependency of inhibition using the Colworth MIC technique. Applied and Environmental Microbiology 89: 275-279
Lee MT, Sun TL, Hung WC, Huang HW (2013). Process of inducing pores in membranes by melittin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 110: 14243–14248
Marshall SH (2003). Antimicrobial peptides: A natural alternative to chemical antibiotics and a potential for applied biotechnology. Electronic Journal of Biotechnology 6: 271-284
Mishra B, Basu A, Saravanan R, Xiang L, Kai Yang L, and Su Jan Leong S (2013). Lasioglossin-III: antimicrobial characterization and feasibility study for immobilization applications. RSC Advances 3: 9534-9543
Okuda D, Yomogida S, Kuwahara-arai K (2015). Augmentation of the antimicrobial activities of guinea pig cathelicidin CAP11-derived peptides by amino acid substitutions. International Journal of Molecular Medicine 23: 501–508
Slaninová J, Mlsová V, Kroupová H, Alán L, Tůmová T, Monincová L, Borovičková L, Fučík V, Čeřovský V (2012). Toxicity study of antimicrobial peptides from wild bee venom and their analogs toward mammalian normal and cancer cells. Peptides 33:18–26
Vrablikova A, Czernekova L, Cahlikova R, Novy Z, Petrik M, Imran S, Novak Z, Krupka M, Cerovsky V, Turanek J, Raska M (2017). Lasioglossins LLIII affect the morphogenesis of Candida albicans and reduces the duration of experimental vaginal candidiasis in mice. Microbiology and Immunology 61: 474–481
Wikler MA, Cockerill FR, Bush K, Dudley MN, Eliopoulos GM, Hardy DJ (2009). Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. approved standard—eighth edition. Retrieved January, 11, 2018, Clinical and Laboratory Standards Institute, from https://clsi.org/standards/products/microbiology/documents/m07
Wiegand I, Hilpert K and Hancock REW (2008). Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nature Protocols 3: 163–175
Study on antibacterial activity and cytotoxicity of recombinant peptide, Lasioglossin ɪɪɪ, against foodborne pathogens
Habibi Najafi M.B.1*, Tanhaian A. 2, Rahnama P. 3, Azghandi M.4
1Department of Food Science & Technology, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran.
2Ph.D. Student of Agricultural Biotechnology Department, Faculty of Agriculture, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran.
3Ph.D. Student of Food Microbiology, Department of Food Science & Technology, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran.
4Ph.D. Student of Animal Science Department, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran.
Abstract
The increasing microbial resistance to existing antibiotics has increased the interest in novel antimicrobial compounds. Antimicrobial peptides (AMPs) represent an attractive alternative to classical antibiotics. Lasioglossins are a group of peptides with antimicrobial activity. The inhibitory effects of a recombinant synthetic Lasioglossin, Lasioglossin ɪɪɪ, on five food pathogens (Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Enterococcus faecalis, Listeria monocytogenes and Escherichia coli) and its cytotoxicity on the normal cell line was investigated in vitro. The findings showed great antimicrobial function of the peptide. Minimum inhibition concentration and minimum bactericidal concentration of Lasioglossin ɪɪɪ on the pathogens were the range of 3.851-8.625 and 7.703-15.406, respectively. Results indicated Staphylococcus aureus showed the highest sensitivity to Lasioglossin ɪɪɪ. The Lassioglossin demonstrated cytotoxic effect on human embryonic kidney cells in higher concentration (1652 µg/ml) in comparison to MIC and MBC values. The results indicate that this peptide can be competed with common antibiotics in terms of the bactericidal properties.
Keywords: Lasioglossin ɪɪɪ, Antimicrobial peptide, cytotoxicity, food pathogen.
* نویسنده مسئول: محمدباقز حبیبی نجفی تلفن تماس: 05138805772 Email: habibi@um.ac.ir
[1] Minimum inhibitory concentration
[2] Minimum bactericidal concentration
[3] Dulbecco’s modified eagle medium
[4] Foetal bovine serum
[6] Melittin
* Corresponding author: Habibi Najafi M.B. Tel: 051 38805772 Email: habibi@um.ac.ir
)
