Increasing expression of the PR1 gene in quince (Cydonia oblanga) by application of Bion elicitor

Document Type : Research Paper

Authors

1 Graduated M.Sc. Student, Payame Nour Univ., Karaj, Iran.

2 Associate Professor, Horticultural Research Institute, Cold and Temperate Center, Agricultural Research, Education and Extension Organization, Karaj, Iran.

3 Associate Professor, Agricultural Biotechnology Research institute, Agricultural Research, Education and Extension Organization, Karaj

4 Associate Professor, Payame Nour Univiversity, Karaj, Iran.

Abstract

One of the safe methods for fire blight disease management in quince plant (Cydonia oblanga) is through activating plant indigenous defense systems using defense elicitors such as Bion (Benzothiadiazole). Investigating the effect of PR1 defense genes group in induced defense mechanism by Bion in quince was the purpose of this study. For this, RNA was extracted from leaf tissues of bion-sprayed (400 mg/L) and water sprayed (control) plants was used for cDNA synthesis. First, a 750 bp fragment of the actin gene from quince, as a house keeping gene, was cloned and sequenced. The result of sequencing showed it has 99% homology with appleactin gene. Specific primers for quince actin gene were designed and used to study changes in PR1 gene expression in bion-treated comparing control plants using real-time PCR method. Based on the results, Bion treatment caused 10 times increase in the PR1 gene expression. Based of result, the effect of Bion in relative control of fire blight in quince can partly be related to PR1 defense proteins activities.

Keywords


افزایش بیان ژن دفاعی PR1 در گیاه به (Cydonia oblanga) با کاربرد ماده محرک بیون

 

نسیم سرهنگی1، منصوره کشاورزی*2، علی محمد شکیب3، محمد علی ابراهیمی4

 

1 دانشجوی سابق کارشناسی ارشد بیوتکنولوژی کشاورزی دانشگاه پیام نور تهران، تهران، ایران.

2دانشیار پژوهشکده میوه های معتدله و سردسیری، موسسه تحقیقات علوم باغبانی، سازمان تحقیقات آموزش و ترویج کشاورزی، کرج، ایران.

3 دانشیار پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی، سازمان تحقیقات آموزش و ترویج کشاورزی، کرج، ایران.

4 دانشیار گروه بیوتکنولوژی، دانشگاه پیام نور تهران، تهران، ایران.

تاریخ دریافت: 28/11/1396، تاریخ پذیرش: 05/06/1397

 

 

چکیده

یکی از روش­های سالم مدیریت بیماری­ آتشک در گیاه به (Cydonia oblanga)، فعال سازی سیستم­های دفاعی درونزاد گیاه با استفاده از مواد محرک دفاعی از جمله بیون(Benzothiadiazole, Bion)  است. هدف از این تحقیق، بررسی مکانیسم دفاع القا شده توسط بیون در گیاه به با تاکید بر تغییر بیان ژن­های دفاعی گروه PR1 بود.بدین منظور، ابتدا از برگ گیاهان تیمار که دو نوبت با محلول بیون (400 میلی­گرم در لیتر)محلول­پاشی شدند و آب (شاهد) RNA استخراج شد و برای ساخت cDNA مورد استفاده قرار گرفت. سپس برای کنترل داخلی، یک قطعه 750 جفت بازی از ژن خانه دار actin همسانه سازی و تعیین توالی شد. نتیجه توالی­یابی نشان داد که 99% تشابه بین ژن اکتین گیاه به با گیاه سیب(Malus domesticus) وجود دارد. بر اساس آن توالی، آغازگرهای اختصاصی برای گیاه به طراحی و سپس تغییرات ایجاد شده در بیان ژن PR1 پس از تیمار درختان به با بیون توسط real-time PCR بررسی و با شاهد مقایسه شد. نتایج این واکنش نشان داد که تیمار بیون موجب 10 بار افزایش بیان ژن PR1 می­شود. بر این اساس، اثر ماده بیون در کنترل نسبی بیماری آتشک می­تواند با فعالیت پروتئین­های دفاعی گروه PR1 مرتبط باشد.

واژگان کلیدی: به، پروتئین­های دفاعی،  actin،real-time PCR.

 

 

 

مقدمه

 

بیماری باکتریایی آتشک با عامل (Burrill)  Erwinia amylovora(Wislow et al., 1920) از مهم­ترین بیماری­های درختان میوه دانه دار است و به­خصوص در سیب، به و گلابی از اهمیت اقتصادی بالایی برخوردار است. روش­های مبارزه متعددی برای مهار این بیماری وجود دارد که از جمله می­توان به فعال­سازی سریع و موثر واکنش­های دفاع درونزاد گیاه با استفاده از مواد محرک اشاره نمود(Maloni et al., 2005). ترکیبات آلی و غیرآلی مختلفی می­توانند واکنش دفاعی گیاه را فعال کنند. از جمله این مواد محرک،Acibenzolar-S-methyl است که ترکیبی از Benzothiaduazole بوده و با نام تجاری بیونBion®  تولید می­شود. این ماده در ایالات متحده در سطح تجاری برای کنترل بیماری­های لکه و اسپک باکتریایی گوجه­فرنگی، سفیدک پودری اسفناج و کپک آّبی توتون استفاده می­شود (Moffat, 2001). همچنین در سطح آزمایشی، اثر آن در کاهش شدت برخی بیماری­های قارچی، ویروسی و باکتریایی در گیاهان زراعی مانند شلغم (Godard et al., 1999)، خیار (Ishii et al., 1999) و سویا (Abdel-Monaim et al., 2012) و در گیاهان باغی از جمله در گلابی علیه لکه سیاه (Faize et al., 2004) و آتشک (Sparlaet al., 2004) و در سیب علیه  آتشک (Baysal et al., 2002; Brisset et al., 2000; Hassan et al., 2007; Maxson-Stein et al., 2002)  اثبات شده است. همچنین نتایج تحقیقات انجام شده در ایران نیز نشاندهنده تاثیر ماده بیون در کنترل بیماری آتشک در سیب در شرایط برون تنی (Shahiniet al., 2010) و در گیاه به در شرایط اسکرین هاوس (Balajoo et al., 2012) بوده است. 

مکانیسم­های القا شده با واسطه مواد محرک در بسیاری از موارد با افزایش بیان ژن­های دفاعی همراه بوده و منجر به افزایش سطوح مقاومتگیاه می­شوند (Adrienne & Barbara, 2006; Durrant and Dung, 2004). بررسی­های قبلی نشان داده است که پروتئین­های دفاعی (Pathogenesis-related proteins) در دفاع القایی با واسطه ماده بیون نیز نقش دارند (Francis et al., 2009; Herman et al., 2008). به­عنوان مثال، در برنج، نسخه برداری ژن­های کدکننده کینازها، پروتئین فسفاتازها و چندپروتئین دیگر در واکنش­های دفاعی القا شده با بیون، افزایش می­یابد (Cao et al., 2008; Li et al., 2008; Liu et al., 2008; Luo et al., 2005; Zhang et al., 2008).  همچنین در گیاه به، مکانیسم ملکولی دفاع القا شده توسط بیون با افزایش نسخه­برداری ژن­های مسئول سنتز پروتئین­های دفاعی گروه PR2 (بتاگلوکانازها) همراه بوده است (Sarhangi et al., 2015).

تاکنون بیش از 16 خانواده از پروتئین­های دفاعی در گیاهان شناخته شده­اند که یکی از گسترده­ترین آن­ها خانواده PR1 است. پروتئین­های این خانواده در پاسخ به آلودگی­های قارچی و باکتریایی درسطوح بسیار بالایی بیان می­شوند.  به عنوان مثال، بیان ژن­های کد کننده PR1 متعاقب شرایط تنش در توتون بیش از 1000 بار افزایش می­یابد و به­همراه سایر پروتئین­های دفاعی (مانند گلوکانازها، کینازها، کیتینازها) و آنزیم­های متابولیسم ثانویه (مانند آنزیم­های دخیل در بیوسنتز فیتوالکسین­ها) موجب افزایش سطح مقاومت می­شوند (Alexander et al., 1993). برخی از اعضای این خانواده پروتئینی به­عنوان بخشی در طی واکنش فوق حساسیت ترشح می­شوند و با انتشار به بافت­های سالم، در مسیر مقاومت اکتسابی سیستمیک نقش دارند (Abdel-Monaim et al., 2012; Van Loon and Strain, 1999). 

با وجود گستردگی پروتئین­های PR1 و ارتباط آن­ها با دفاع گیاه، مکانیسم عمل آن­ها هنوز تا حدود زیادی ناشناخته مانده است.با توجه به اینکه این پروتئین­ها همولوژی بالایی با برخی پروتئین­های مشابه در مخمرها، حشرات و مهره­داران دارند، بررسی مکانیسم عمل پروتئین­های مشابه می­تواند به شناخت مکانیسم عمل آنها در گیاهان کمک کند (Van Loon and Strain, 1999). برخی هومولوگ­های پروتئین­های PR1 در انسان فعالیت پروتئازی و RNase دارند (Yamakawa et al., 1998) اما تا کنون فعالیت آنزیمی ازPR1 های گیاهی گزارش نشده است. اولین نشانه غیر مستقیم اثر ضد میکروبی پروتئین­های خانواده PR1 در لاین­های تراریخته توتون حاوی تراژن PR1aبود که با افزایش مقاومت بهPrenosporatabacinaو .Pparasiticaتوام بود (Alexander et al., 1993).  همچنین پس از خاموش کردن ژن­های PR1، حساسیت بهPhytophthoraparasitica افزایش یافت (Riviere et al., 2008).در شرایط برون تنی و در برگ، پروتئین­های PR1 خالص­سازی شده از گوجه فرنگی مانعجوانه زدن زئوسپور و کاهش شدت پوسیدگی ناشی ازPhytophthora infestans شدند (Niderman et al., 1995).

با توجه به مشاهدات قبلی مبنی بر کاهش شدت بیماری آتشک در گیاه به در اثر تیمار با ماده محرک بیون (Balajoo et al., 2012) و روشن شدن نقش پروتئین­های دفاعی خانواده PR2 در این دفاع القایی (Sarhangi et al., 2015)، این تحقیق با هدفبررسی گسترده­تر مکانیسم عمل بیون در گیاه به انجام گرفت و با توجه به گستردگی پروتئین­های خانواده PR1، برای اولین بار تغییرات بیان ژن­های این خانواده پس از دفاع القایی با واسطه بیون در این گیاه بررسی شد.

 

 


 

مواد و روش­ها

در اواسط بهار، نهال­های سه ساله به رقم اصفهان کاشته شده در 2 تکرار (هر تکرار حاوی یک درخت) در باغ بیماری شناسی موسسه تحقیقات باغبانی کرجدر دو نوبت با فاصله چهار روز با محلول بیون (به غلظت 400 میلی گرم در لیتر)(Syngenta, USA) محلول­پاشی شدند (Balajoo et al., 2012). پنج روز پس از دومین محلول پاشی، از برگ­های جوان نمونه برداری و در یخدان به آزمایشگاه و فریزر 80- درجه سانتی­گراد منتقل شدند. RNA کل برگ با استفاده از کیت RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen، هلند) استخراج و برای ساخت cDNA از کیت cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad) استفاده شد. به منظور طراحی آغازگرهای اختصاصی برای ژن­های خانواده PR1 از توالی این ژن (شماره دسترسیJQ917106) استفاده شد. به منظور استفاده از ژن کنترل داخلی در واکنش زنجیره­ای پلیمراز زمان واقعی(real-time PCR)، ابتدا بر اساس هم ردیفی ژن­های actin از گیاهان: سیب (شماره دسترسیGQ339778)، سویا (شماره بازیابی XM003547311)، لوبیا (شماره دسترسیKF033666) و توت فرنگی (شماره دسترسیXM004294460)، یک جفت آغازگر توسط نرم افزار  Primer3طراحی و توسط آن، بخشی از این ژن از گیاه به همسانه سازی و توالی یابی شد و سپس آغازگرهای اختصاصی برای ژن actin گیاه به طراحی شد. واکنش زنجیره­ای پلیمراز شامل یک مرحله واسرشت اولیه در دمای 94 درجه سانتی­گراد به­مدت 5 دقیقه و سپس 30 چرخه شامل: اتصال در دمای 49 درجه سانتی­گراد به مدت 1 دقیقه و تکثیر در دمای ژن 72 درجه سانتی­گراد به مدت 1 دقیقه و سپس بسط نهایی در دمای 72 درجه به مدت 10 دقیقه بود.  محصول واکنش روی ژل آگارز 1% برده شد و توسط کیت تخلیصFermentas خالص شد. سپس قطعه مورد نظر در ناقل پلاسمیدی pTZ57R/T الحاق و با روش شوک حرارتی به باکتری E. coli سویه XL1Blue منتقل شد. جهت تشکیل کلونی،20 میکرولیتر مخلوط انتقال بر روی محیط کشت LB agar حاوی 100 میلی­گرم برمیلی­لیتر آمپی­سیلین کشت شد. پلاسمید نوترکیب با کشت یک کلونی استخراج و حضور قطعه ژن درون پلاسمید با واکنش زنجیره­ای پلیمراز تایید و پس از توالی­یابی، با نرم­افزار­های موجود با سایر توالی­های موجود در پایگاه اطلاعات DNA مقایسه شد.

غلظت مناسب آغازگرهای ژن­های PR1و actin، بهینه سازی برنامه واکنش زنجیره­ای پلیمراز جهت انجام real-time و رسم منحنی استاندارد با رقت سریالی cDNA با آغازگرها جهت تعیین غلظت مناسب cDNA انجام گرفت. میزان بیان با استفاده از مقادیر حدود آستانه حاصل از تکثیر ژن PR1 بر روی نمونه‌­های شاهد و تیمار شده با دو تکرار زیستی به روش 2-ΔΔCT با نرم افزار مربوط به شرکتBio-Rad محاسبه و به­صورت نسبت بیان ژن بین گیاه تیمار شده و شاهد آورده شد.

 

نتایج و بحث

در بررسی­های کمی بیان ژن، به یک ژن کنترل داخلی نیاز است. یکی از ژن­هایی که در این زمینه در گیاهان استفاده می­شود، ژناکتین است. با استفاده از cDNA ساخته شده به عنوان الگو و آغاز­گرهای طراحی شده برای ژن اکتین، یک قطعه­ 750 جفت بازی این ژن از گیاه به تکثیر شد که پس از خالص­سازی و همسانه­سازی توالی آن تعیین شد. مقایسه توالی­ این قطعه با سایر توالی­های موجود در بانک DNA نشان داد که بالاترین تشابه (99%) در سطح اسید نوکلئیک و پروتئین با ژن اکتین سیب (شماره دسترسی(GQ339778.1 دارد. این توالی با شماره دسترسیKF981879 ثبت شد. بر اساس توالی قطعه تکثیر شده،  یک جفت آغازگر اختصاصی با توالی F:5'-TCACACGTTCTACAATGAAC-3' و R:5'-TACTTCCTCTCAGGTGGAGC-3´ طراحی و ساخته شد. از واکنش زنجیره­ای پلیمراز با استفاده از این جفت آغازگر، باند229 جفت بازی برای ژن اکتین که مورد انتظار بود بدست آمد (شکل­های 1 و 2).

بر اساس توالی ژن PR1 گیاه به (شماره دسترسی JQ917106.1) آغازگرهای اختصاصی با توالی F:5'-CCAAGACACACCCCAAGACT-3' و R:5'-AGTGCTCATGGCAAGGTTTT-3' طراحی شد. از واکنش زنجیره­ای پلیمراز با استفاده از این آغازگر، یک باند184 جفت بازی برای این ژن که مورد انتظار بود بدست آمد (شکل1).

 

 

1

3

4

M

2

500 bp

شکل1- نقوش الکتروفورزی محصولات حاصل از تکثیر ژن­های PR1 و actin. چاهک­های 1 و 3 کنترل منفی: چاهک­های 2 و4 به ترتیب PR1 و اکتین: M نشانگر وزن مولکولی 1kb.

Figure1- Electrophoretic patterns of PCR products for actin and PR1 genes. 1 and 3 lanes: negative control; 2 and 4 lanes: PR1 and actin genes, respectively; M: 1kb DNA weight ladder.

 

 

 

میزان بیان ژن­های PR1 و اکتین در نمونه­های تیمار شده و شاهد با استفاده ازreal-time PCR بررسی و نمودارهای حدود آستانه و ذوب رسم شدند (شکل­های2، 3، 4و5).  بررسی میزان بیان با استفاده از مقادیر حدود آستانه حاصل از تکثیر ژن  PR1در نمونه‌­های شاهد و تیمارشده نشان داد که  تیمارماده بیون  روی درختان به باعث افزایش 10 برابری بیان ژن  PR1می­شود (شکل6). در برخی درختان دیگر نیز واکنش­­های دفاعی با افزایش بیان ژن PR1 توام بوده است. به عنوان مثال در سیب (Malus domesticus)، ماده بیون قادر به القای بیان ژن­های خانواده PR1 در برابر بیماری آتشک بود و سطح آن را تا 10 بار افزایش داد (Maxson-Stein et al., 2002). افزایش بیان ژن PR1 در رز (Rosa damascena) در برابر عامل بیماری لکه سیاه (Suo and Leung, 2002)، در کلم (Brassica oleracea) در برابر عامل بیماری سفیدک پودری (Ziadi et al., 2001) و در لوبیا (Phaseolus vulgaris) در برابر قارچ Uromyces fabae (Rauscher et al., 1999) نیز گزارش شده است.

 

 

 

شکل 2-  نمودار تکثیر و حدود آستانه تکثیر ژن actin در گیاهان به تیمار شده با بیون و شاهد.

Figure 2- Graph for amplification and threshold value of the actin gene Bion-treated and control Cydonia oblanga plants.

 

 

شکل3- نمودار ذوب تکثیر ژن actin در گیاهانبه تیمار شده با بیون و شاهد.

Figure 3- Melting pattern for actin gene amplification in bion-treated and control Cydonia oblanga plants.

 

 

 

تیمار شده

شاهد

شکل4-  نمودار تکثیر و حدود آستانه ژن PR1 در گیاهان به تیمار شده با بیون و شاهد.

Figure 4- Amplification and limit pattern for PR1 gene in bion-treated and control Cydonia oblanga plants.

 

 

شکل5-  نمودار ذوب تکثیر ژن  PR1در گیاهان به تیمار شده با بیون و شاهد.

Figure 5- Melting pattern for PR1 gene amplification in bion-treated and control Cydonia oblanga plants.

 

 

 

 

شکل6-مقایسه بیان نسبی ژن PR1 بین گیاه­هان به تیمار شده با بیون و شاهد.

Figure 6- Comparison of relative expression of PR1 gene between bion-treated and control Cydonia oblanga plants.

 

 

در بررسی گیاهان تراریخته توتون که در آن پروتئین­های PR1 اسیدی خاموش شده بودند، پس از تیمار با اسید سالسیلیک، بیان پروتئین PR1g بازی افزایش یافت و میزان فعالیت بتا-1-3 گلوکوناز ( که توسط ژن PR2 بیان می­شود) در فضای بین سلولی بالا رفت اما میزان کالوز کاهش یافت. این گیاهان پس از تیمار با پروتئین PR1 نوترکیب، حالت برگشت نشان دادند (Riviereet al., 2008). این محققان نتیجه گرفتند که پروتئین­های PR1 اسیدی نقش تنظیمی در کاهش پروتئین­های بازی و کاهش فعالیت گلوکانازها در فضای خارج سلولی دارند که احتمالا با اتصال پروتئین­های PR1 اسیدی با گلوکانازها صورت می­گیرد. مطالعات در گیاه آرابیداپسیس نشان داد که فعال شدن PR1 از طریق NPR1 (Nonexpressor of pathogenesis-related proteins)  و عناصر نسخه برداری گروه TGA2 صورت می­گیرد (Rochonet al., 2006). سالیسیلیک اسید مسیرهای سیگنالی دفاعی را از طریق ملکول­های سیگنال NPR1  فعال می­کند. این مولکول­هادر سیتوزول به­صورت غیر فعال وجود دارد و اسید سالیسیلیک آن­ها را احیا و فعال می­کند. مولکول­های فعال شده از سیتوزول به هسته منتقل شده و بیان ژن­های دفاعی را تحریک می­­کنند (Brosche and Kanagasjavi, 2012; Lindermayer et al., 2010; Tada et al., 2008). با افزایش اسیدسالیسیلیک، پروتئین NPR1 در هسته با فاکتور نسخه برداری TGA2 (که کنترل منفی بیان ژن PR1 را برعهده دارد) واکنش نموده و با خارج کردن آن از روی DNAی هدف، آن­را غیرفعال می­کند که در نتیجه، بیان ژن­های دفاعی از جمله PR1 فعال می­شود (Boyle et al., 2009). 

مکانسیم عمل پروتئین­های دفاعی خانواده PR1 در گیاهان هرچه باشد، توالی یابی آن­ها نشان می­دهد که در گیاهان به­شدت حفاظت شده و فراوان هستند که موید این است که از منشا تکوینی واحدی نشات گرفته­و فعالیت آن­ها برای بقای موجودات زنده ضروری است (Edreva, 2005; Van Loon, 2001). نتایج این تحقیق نیز نشان داد که پروتئین­های دفاعی خانواده PR1، بخشی از مکانیسم دفاعی القا شده در گیاه به هستند که نسخه برداری ژن­های کدکننده آن­ها متعاقب تحریک با مواد محرک دفاعی چندین بار افزایش می­یابد. براین اساس، نقش و نحوه اثر ماده محرک بی­خطر بیون در القای سیستم­های درونزاد مقاومت گیاهی بیشتر مشخص می­شود.

 

 

منابع

Abdel-Monaim MF, Ismail ME, Morsy KM (2012). Induction of systemic resistance in soybean plants against Fusarium wilts disease by seed treatment with Benzothiadiazole and humic acid. African Journal of Biotechnology 110: 2454-2465.

Adrienne CS, Barbara JH (2006). Parallels in fungal pathogenesis on plant and animal hosts. Eukaryot Cell 5: 1941-1949.

Alexander DR, Goodman RM, Gut-Rella M, Glascock C, Weymann K, Friedrich L, Maddox D, Ahl-Goy P, Luntz T, Ward E, Ryals J (1993). Increased tolerance to two oomycete pathogens in transgenic tobacco expressing pathogenesis-related protein1a. Proceedings National Academyof Sciences U.S.A 90:7327-7331.

Baysal O, Laux P, Zeller W (2002). Systemic acquired resistance (SAR) against fireblight. Acta Horticulturae 590: 269-272.

Balajoo OM, Kesahavarzi M, Zahabi A, Danesh YR, Haghjuyan R (2012).  Protective effect of acibenzolar-s-methyl on fireblight severity in quince and characterization of the Erwiniaamylovora strains involved. Journal of Plant Pathology 94: 211-214.

Boyle P, Su E, Rochen A, Shearer H, Murmu S,Chu J, Fobert P,Despre C (2009). The BTB/POZ Domain of the Arabidopsis disease resistance protein NPR1 Interacts with the repression domain of TGA2 to Negate Its Function. Plant Cell 21: 3700-3713.

Brisset MN,Cesbron S,Thomson SV, Paulin JP (2000). Acibenzolar-S-methyl induces the accumulation of defense-related enzymes in apple and protects from fireblight. European Journal of Plant Pathology 106: 529-536.

Brosche M, Kangasjarvi J (2012). Low antioxidant concentrations impact on multiple signaling pathways in Arabidopsis thaliana partly through NPR1. Experimental Botany 63: 1849-1861.

Cao Y,Yang Y, Zhang H, Li D, Zheng Z (2008). Overexpression of a rice defense-related F-box protein gene OsDRF1 in tobacco improves disease resistance through potentiation of defense gene expression. Physiol Plant 134:440-452.

Durrant WE, Dong X (2004). Systemic acquired resistance. Annual Review ofPhytoPhatology 42: 158-209.

Edreva A (2005). Pathogenesis-related proteins: research progress in the last 15 years. General and Applied Plant Physiology 31: 105-124.

Faize M, Faize L, Koike N, Ishizaka M, Ishii H (2004). Acibenzolar-S-methyl-induced resistance to Japanese pear scab is associated with potentiating of multiple defense responses. Phytopathology 94: 604-612.

Francis MI,Redondo A, Burns JK, Graham JH (2009). Soil application of imidacloprid and related SAR-inducing compounds produces effective and persistent control of citrus canker. European Journal of Plant Pathology 124: 283-292.

Godard JP,Ziadi S, Monot C, Le Corre D,Silue D (1999). Benzothiadiazole (BTH) induces resistance in cauliflower (Brassica oleraceavar botrytis) to downy mildew of crucifers caused by Peronosporaparasitica. Crop Protection 18: 397-405.

Hassan MAE, Buchenauer H (2007). Induction of resistance to fire blight in apple by acibenzolar-S-methyl and DL-3-aminobutyric acid. Plant Diseases and Protection 114: 151-158.

Herman MAB, Davidson JK, Smart CD (2008). Induction of plant defense gene expression by plant activators and Pseudomonas syringaepv. tomato in greenhouse-grown tomatoes.  Phytopathology 98:1226-1232.

Ishii H, Tomita Y, Hirio T, Narusaka Y, Nakazawa Y,Ivamoto S (1999). Induced resistance of Acibenzolar-S-methyl to cucumber and Japanese pear diseases. European Journal of Plant Pathology 105:77-85.

Li D, Liu H,Zhang H, Wang A, Song F (2008). OsBIRH1, a DEAD-box RNA helicase with functions in modulating defense responses against pathogen infection and oxidative stress. Experimenal Botany 59:2133-2146.

Lindermayr CS, Cell B, Muller B, Leister D,Duner J (2010). Redoxregulation of NPR1-TGA1 system of Arabidopsis thaliana by nitric oxide. Plant Cell 22: 2894-2907.

Liu H,Wang X, Zhang H, Yang Y, Ge X, Song F (2008). A rice serine carboxypeptidase-like gene OsBISCPL1 is involved in regulation of defense responses against biotic and oxidative stress. Gene 420:57-65.

LuoH, Song F, Goodman RM, Zheng Z (2005). Up-regulation of OsBIHD1, a rice gene encoding BELL homeodomain transcriptional factor, in disease resistance responses. Plant Biology 7:459-568.

Maloni M, Venisse JS, Chevreau E (2005). Expression of a bacterial effector, harpinN, causes increased resistance to fire blight in Pyruscommunis. Tree Genetic Genomes 1: 41-49.

Maxon-Stein K, He ES, Hammerschmidt RJones A (2002). Effect of treating apple trees with Acibenzolar-S- methyl on fire blight and expression of pathogenesis related protein genes. Plant Disease 86:785-790.

Moffat AS (2001). Finding new ways to fight plant diseases. Science 292: 270-273.

Niderman T, Genetet I, Bruyère T, Gees R, Stintzi A,Legrand M,Fritig B, Mösinger E (1995). Pathogenesis-related PR-1 proteins are antifungal. Isolation and characterization of three 14-kilodalton proteins of tomato and of a basic PR-1 of tobacco with inhibitory activity against Phytophthorainfestans. Plant Physiology 108: 17-27.

Rauscher M, Ádám AL, Wirtz S, Guggenheim R, Mendgen K, Deising HB (1999). PR-1 protein inhibits the differentiation of rust infection hyphae in leaves of acquired resistant broad bean. Plant Journal 19: 625-633.

Riviere M, Marais A, Ponchet M, Willats W, Glliana E (2008). Silensing of acidic pathogenesis-related PR1 genes increases extracellular (1-3)-glucanase activity at the onset of tobacco defense reactions. Experimental Botany 59: 1225-1239.

Rochon A,Boyle P, Wings T, Fobert PR, Despres C (2006). The coactivator function of Arabidopsis NPR1 requires the core of its BTB/POZ domain and the oxidation of C-terminal cysteines. Plant Cell 18: 3670-3685.

Sarhangi N, Shakib AM, Keshavarzi M, Ebrahimi MA, Ahmad-Raji M (2015). Effect of the BTH chemical elicitor on expression of the PR2 gene and fire blight disease severity in quince. Seed and Plant Journal 31: 249-262 (In Farsi).

Shahini S, Keshavarzi M,Hasanzadeh N, Hashemi M,Abdollahi H, Tavoosi M (2010).  In vitro evaluation of Acilbenzolar-S-methyl on inhibition of fire blight in apple c.v. Golden delicious. Iranian Journal of Plant Pathology 46: 77-79. (In Farsi). 

Sparla F, Rotino L, Valgimigli CM, Pupillo P, Trost P (2004). Systemic resistance induced by Benzothiadiazole in pear inoculated with the agent of fireblight. ScientiaHorticulturae 101: 269-279.

Suo Y, Leung DWM (2002). BTH-induced accumulation of extracellular proteins and blackspot disease in repse. BiologiaPlantarum 42: 273-279.

Tada Y,Spoel SH, Pajerowaka-Mukhtar K,Moo ZS, Song JQ, Wang C, Zuo JR, Dong XN (2008). Plant immunity erquires conformational charges of NPR1 via S-nitrosylation and thioredxins. Science 321: 952-956.

Van Loon LC (2001). The families of pathogenesis-related proteins. The6th International Workshop on PR-proteins. Spa, Belgium: 9-10.

Van Loon LC, Strrain EA (1999). The families of pathogenesis-related proteins, their functionsand comparativeanalysis of PR-1 type proteins. Physiological and Molecular Plant Pathology 55: 85-97.

Yamakawa T, Miyata S, Ogawa N, Koshikawa N, Yasumitsu H, Kanamori T, Miyazaki K (1998). cDNA cloning of a novel trypsin inhibitor with similarity to pathgenesis-realted proteins and its frequent expression in human brain cancer cells. Biochemica et BiophysicaActa 1395: 202-208.

Zhang W, Chen JJ, Zhang H, Song F (2008). Overexpression of a rice diacylglycerol kinase gene OsBIDK1 enhances disease resistance in transgenic tobacco. Molecular Cells 26:258–264.

Ziadi S, Barbedette S, Godard JF, Monot C, Corre DL, Silue D (2001). Production of pathogenesis related proteins in the cauliflower (Brassica oleracea var. botrytis)-downy mildew (Perenosporaparasitica) pathosystem treated with Acibenzolar-S-methyl. Plant Pathology 50:579-586.


 

 

Increasing expression of the PR1 gene in quince (Cydonia oblanga) by application of Bion elicitor

 

Sarhangi N.1, Keshavarzi M.2*, Shakib A.M.3, Ebrahimi M.A.4

 

1 Graduated M.Sc. Student, Payame Nour Univ., Karaj, Iran.

2Associate Professor, Horticultural Research Institute, Cold and Temperate Center, Agricultural Research, Education and Extension Organization, Karaj, Iran.

3Associate Professor, Agricultural Biotechnology Research institute, Agricultural Research, Education and Extension Organization, Karaj

4Associate Professor, Payame Nour Univiversity, Karaj, Iran.

 

Abstract

One of the safe methods for fire blight disease management in quince plant (Cydonia oblanga) is through activating plant indigenous defense systems using defense elicitors such as Bion (Benzothiadiazole). Investigating the effect of PR1 defense genes group in induced defense mechanism by Bion in quince was the purpose of this study. For this, RNA was extracted from leaf tissues of bion-sprayed (400 mg/L) and water sprayed (control) plants was used for cDNA synthesis. First, a 750 bp fragment of the actin gene from quince, as a house keeping gene, was cloned and sequenced. The result of sequencing showed it has 99% homology with appleactin gene. Specific primers for quince actin gene were designed and used to study changes in PR1 gene expression in bion-treated comparing control plants using real-time PCR method. Based on the results, Bion treatment caused 10 times increase in the PR1 gene expression. Based of result, the effect of Bion in relative control of fire blight in quince can partly be related to PR1 defense proteins activities.

Keywords: Quince, Actin, Defense proteins, Real-Time PCR.

 

 



*نویسنده مسئول: منصوره کشاورزی                              تلفن: 09122640046                  Email: kmansureh@gmail.com

Abdel-Monaim MF, Ismail ME, Morsy KM (2012). Induction of systemic resistance in soybean plants against Fusarium wilts disease by seed treatment with Benzothiadiazole and humic acid. African Journal of Biotechnology 110: 2454-2465.
Adrienne CS, Barbara JH (2006). Parallels in fungal pathogenesis on plant and animal hosts. Eukaryot Cell 5: 1941-1949.
Alexander DR, Goodman RM, Gut-Rella M, Glascock C, Weymann K, Friedrich L, Maddox D, Ahl-Goy P, Luntz T, Ward E, Ryals J (1993). Increased tolerance to two oomycete pathogens in transgenic tobacco expressing pathogenesis-related protein1a. Proceedings National Academyof Sciences U.S.A 90:7327-7331.
Baysal O, Laux P, Zeller W (2002). Systemic acquired resistance (SAR) against fireblight. Acta Horticulturae 590: 269-272.
Balajoo OM, Kesahavarzi M, Zahabi A, Danesh YR, Haghjuyan R (2012).  Protective effect of acibenzolar-s-methyl on fireblight severity in quince and characterization of the Erwiniaamylovora strains involved. Journal of Plant Pathology 94: 211-214.
Boyle P, Su E, Rochen A, Shearer H, Murmu S,Chu J, Fobert P,Despre C (2009). The BTB/POZ Domain of the Arabidopsis disease resistance protein NPR1 Interacts with the repression domain of TGA2 to Negate Its Function. Plant Cell 21: 3700-3713.
Brisset MN,Cesbron S,Thomson SV, Paulin JP (2000). Acibenzolar-S-methyl induces the accumulation of defense-related enzymes in apple and protects from fireblight. European Journal of Plant Pathology 106: 529-536.
Brosche M, Kangasjarvi J (2012). Low antioxidant concentrations impact on multiple signaling pathways in Arabidopsis thaliana partly through NPR1. Experimental Botany 63: 1849-1861.
Cao Y,Yang Y, Zhang H, Li D, Zheng Z (2008). Overexpression of a rice defense-related F-box protein gene OsDRF1 in tobacco improves disease resistance through potentiation of defense gene expression. Physiol Plant 134:440-452.
Durrant WE, Dong X (2004). Systemic acquired resistance. Annual Review ofPhytoPhatology 42: 158-209.
Edreva A (2005). Pathogenesis-related proteins: research progress in the last 15 years. General and Applied Plant Physiology 31: 105-124.
Faize M, Faize L, Koike N, Ishizaka M, Ishii H (2004). Acibenzolar-S-methyl-induced resistance to Japanese pear scab is associated with potentiating of multiple defense responses. Phytopathology 94: 604-612.
Francis MI,Redondo A, Burns JK, Graham JH (2009). Soil application of imidacloprid and related SAR-inducing compounds produces effective and persistent control of citrus canker. European Journal of Plant Pathology 124: 283-292.
Godard JP,Ziadi S, Monot C, Le Corre D,Silue D (1999). Benzothiadiazole (BTH) induces resistance in cauliflower (Brassica oleraceavar botrytis) to downy mildew of crucifers caused by Peronosporaparasitica. Crop Protection 18: 397-405.
Hassan MAE, Buchenauer H (2007). Induction of resistance to fire blight in apple by acibenzolar-S-methyl and DL-3-aminobutyric acid. Plant Diseases and Protection 114: 151-158.
Herman MAB, Davidson JK, Smart CD (2008). Induction of plant defense gene expression by plant activators and Pseudomonas syringaepv. tomato in greenhouse-grown tomatoes.  Phytopathology 98:1226-1232.
Ishii H, Tomita Y, Hirio T, Narusaka Y, Nakazawa Y,Ivamoto S (1999). Induced resistance of Acibenzolar-S-methyl to cucumber and Japanese pear diseases. European Journal of Plant Pathology 105:77-85.
Li D, Liu H,Zhang H, Wang A, Song F (2008). OsBIRH1, a DEAD-box RNA helicase with functions in modulating defense responses against pathogen infection and oxidative stress. Experimenal Botany 59:2133-2146.
Lindermayr CS, Cell B, Muller B, Leister D,Duner J (2010). Redoxregulation of NPR1-TGA1 system of Arabidopsis thaliana by nitric oxide. Plant Cell 22: 2894-2907.
Liu H,Wang X, Zhang H, Yang Y, Ge X, Song F (2008). A rice serine carboxypeptidase-like gene OsBISCPL1 is involved in regulation of defense responses against biotic and oxidative stress. Gene 420:57-65.
LuoH, Song F, Goodman RM, Zheng Z (2005). Up-regulation of OsBIHD1, a rice gene encoding BELL homeodomain transcriptional factor, in disease resistance responses. Plant Biology 7:459-568.
Maloni M, Venisse JS, Chevreau E (2005). Expression of a bacterial effector, harpinN, causes increased resistance to fire blight in Pyruscommunis. Tree Genetic Genomes 1: 41-49.
Maxon-Stein K, He ES, Hammerschmidt RJones A (2002). Effect of treating apple trees with Acibenzolar-S- methyl on fire blight and expression of pathogenesis related protein genes. Plant Disease 86:785-790.
Moffat AS (2001). Finding new ways to fight plant diseases. Science 292: 270-273.
Niderman T, Genetet I, Bruyère T, Gees R, Stintzi A,Legrand M,Fritig B, Mösinger E (1995). Pathogenesis-related PR-1 proteins are antifungal. Isolation and characterization of three 14-kilodalton proteins of tomato and of a basic PR-1 of tobacco with inhibitory activity against Phytophthorainfestans. Plant Physiology 108: 17-27.
Rauscher M, Ádám AL, Wirtz S, Guggenheim R, Mendgen K, Deising HB (1999). PR-1 protein inhibits the differentiation of rust infection hyphae in leaves of acquired resistant broad bean. Plant Journal 19: 625-633.
Riviere M, Marais A, Ponchet M, Willats W, Glliana E (2008). Silensing of acidic pathogenesis-related PR1 genes increases extracellular (1-3)-glucanase activity at the onset of tobacco defense reactions. Experimental Botany 59: 1225-1239.
Rochon A,Boyle P, Wings T, Fobert PR, Despres C (2006). The coactivator function of Arabidopsis NPR1 requires the core of its BTB/POZ domain and the oxidation of C-terminal cysteines. Plant Cell 18: 3670-3685.
Sarhangi N, Shakib AM, Keshavarzi M, Ebrahimi MA, Ahmad-Raji M (2015). Effect of the BTH chemical elicitor on expression of the PR2 gene and fire blight disease severity in quince. Seed and Plant Journal 31: 249-262 (In Farsi).
Shahini S, Keshavarzi M,Hasanzadeh N, Hashemi M,Abdollahi H, Tavoosi M (2010).  In vitro evaluation of Acilbenzolar-S-methyl on inhibition of fire blight in apple c.v. Golden delicious. Iranian Journal of Plant Pathology 46: 77-79. (In Farsi). 
Sparla F, Rotino L, Valgimigli CM, Pupillo P, Trost P (2004). Systemic resistance induced by Benzothiadiazole in pear inoculated with the agent of fireblight. ScientiaHorticulturae 101: 269-279.
Suo Y, Leung DWM (2002). BTH-induced accumulation of extracellular proteins and blackspot disease in repse. BiologiaPlantarum 42: 273-279.
Tada Y,Spoel SH, Pajerowaka-Mukhtar K,Moo ZS, Song JQ, Wang C, Zuo JR, Dong XN (2008). Plant immunity erquires conformational charges of NPR1 via S-nitrosylation and thioredxins. Science 321: 952-956.
Van Loon LC (2001). The families of pathogenesis-related proteins. The6th International Workshop on PR-proteins. Spa, Belgium: 9-10.
Van Loon LC, Strrain EA (1999). The families of pathogenesis-related proteins, their functionsand comparativeanalysis of PR-1 type proteins. Physiological and Molecular Plant Pathology 55: 85-97.
Yamakawa T, Miyata S, Ogawa N, Koshikawa N, Yasumitsu H, Kanamori T, Miyazaki K (1998). cDNA cloning of a novel trypsin inhibitor with similarity to pathgenesis-realted proteins and its frequent expression in human brain cancer cells. Biochemica et BiophysicaActa 1395: 202-208.
Zhang W, Chen JJ, Zhang H, Song F (2008). Overexpression of a rice diacylglycerol kinase gene OsBIDK1 enhances disease resistance in transgenic tobacco. Molecular Cells 26:258–264.
Ziadi S, Barbedette S, Godard JF, Monot C, Corre DL, Silue D (2001). Production of pathogenesis related proteins in the cauliflower (Brassica oleracea var. botrytis)-downy mildew (Perenosporaparasitica) pathosystem treated with Acibenzolar-S-methyl. Plant Pathology 50:579-586.