Effects of Different Concentrations of Plant Growth Regulators on Callus Induction and Shoot Regeneration in St. John’s Wort (Hypericum perforatum)

Effects of Different Concentrations of Plant Growth Regulators on Callus Induction and Shoot Regeneration in St. John’s Wort (Hypericum perforatum)

Mehdi Soltanpour

MSc Student, Department of Horticultural Sciences, Faculty of Agriculture, University of Tabriz, Tabriz, Iran, Email: mehdisoltanpour67@gmail.com

Nasser Mahna

*Associate Professor, Department of Horticultural Sciences, Faculty of Agriculture University of Tabriz, Tabriz, Iran, Tel: 33392027 Email: mahna@tabrizu.ac.ir; n.mahna@gmail.com

Nader Farsad Akhtar

Assistant Professor, Department of Plant Biology, Faculty of Natural Science, University of Tabriz, Tabriz, Iran, Email: naderfarsad@gmail.com

Abstract

Objective

St. John’s wort belongs to Hypericaceae family and has been used since ancient Greeks as a herb for the treatment of anxiety, depression, wounds and burns. In present study, the effects of different concentrations of CPPU and BA (each in three concentrations) in combination with two concentrations of IAA on callus production and shoot regeneration of Hypericum perforatum from leaf and stem explants were evaluated to identify the best growth regulator combination for obtaining the highest yield of in vitro regenerated shoots.

Materials and methods

This was implemented in a CRD-based factorial experiment with three replicates and five samples in each replicate and the traits including callus fresh weight, number of shoots, shoot length, length of the tallest shoots, and the number of nodes of the tallest shoots were measured and examined.

Results

 Results showed that the most effective combination for regeneration was 1.5 mg/l CPPU and 1 mg/l IAA, which may be a proof for more effectiveness of CPPU in comparison with BA as cytokinin source on shoot regeneration in Hypericum perforatum.

Conclusions

 The use of 1 mg/l IAA in combination with 1.5 mg/l CPPU or BA resulted in a significant increase in shoot regeneration. It was also showed that 1 mg/l IAA in combination with 0.5 mg/l BA could cause a significant increase in callus fresh weight.

Key Words: BA, CPPU, Hypericum perforatum, IAA, Regeneration.

Citation: Soltanpour M, Mahna N, Farsad Akhtar N (2019) Effects of Different Concentrations of Plant Growth Regulators on Callus Induction and Shoot Regeneration in St. John’s Wort (Hypericum perforatum). Agricultural Biotechnology Journal 10 (4), 75-92.

DOI: 10.22103/jab.2018.2211

Received: August 23, 2018; Accepted: November 3, 2018

© Faculty of Agriculture, Shahid Bahonar University of Kerman-Iranian Biotechnology Society

اثر غلظت‏های مختلف تنظیم کننده‏های رشد بر کالوس زایی و باززایی گل راعی (Hypericum perforatum)

مهدی سلطانپور

دانش آموخته کارشناسی ارشد گروه علوم باغبانی دانشکده کشاورزی دانشگاه تبریز، تبریز، ایران، ایمیل: mehdisoltanpour67@gmail.com

ناصر مهنا

* نویسنده مسئول: دانشیار گروه علوم باغبانی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه تبریز، تبریز، ایران، تلفن: 33392027 ایمیل: n.mahna@gmail.com; mahna@tabrizu.ac.ir

نادر فرساد اختر

استادیار گروه زیست گیاهی دانشگاه تبریز، تبریز، ایران، ایمیل: naderfarsad@gmail.com

تاریخ دریافت: 18/07/1397، تاریخ پذیرش: 13/11/1397

چکیده

هدف:گیاه گل راعی (Hypericum perforatom) متعلق به خانواده هایپریکاسه بوده و از زمان یونان باستان به عنوان یک گیاه دارویی برای درمان اضطراب، افسردگی، زخم و سوختگی استفاده شده است. در مطالعۀ حاضر، اثر غلظت‏های مختلف CPPU و  BA (هر کدام در سه غلظت) در ترکیب با دو غلظت IAA بر کالوس‏زایی و باززایی شاخساره گل راعی از ریزنمونه‏های برگ و میان‏گره به منظور تعیین مناسبترین غلظت تنظیم کننده‏های رشد اکسینی و سیتوکینینی و مشخص نمودن مناسب ترین ترکیب هورمونی برای به دست آوردن بیشترین باززایی شاخساره در محیط کشت پایه  MSانجام گرفت.

مواد و روش‏ها: این آزمایش در قالب آزمایش فاکتوریل بر پایه طرح کاملاً تصادفی در سه تکرار و پنج ریزنمونه در هر تکرار مورد بررسی قرار گرفت و صفات وزن تر کالوس، تعداد شاخساره، طول شاخساره و تعداد گره بلندترین شاخساره اندازه‏گیری و بررسی شد.

نتایج: براساس نتایج حاصل در بین تیمار‏های هورمونی،‌ ترکیب هورمونی 5/1 میلی‏گرم در لیتر CPPU و 1 میلی‏گرم در لیتر IAA بیشترین اثر را روی باززایی گل راعی داشت که اثبات کننده نقش تنظیم کنندگی سیتوکینینیCPPU  در باززایی شاخساره در گل راعی به خوبی مشاهده گردید.

نتیجه گیری: غلظت 1 میلی‏گرم درلیتر IAA به همراه 5/1 میلی‏گرم در لیتر CPPU یا BA باعث افزایش معنی‏داری در باززایی شاخساره گردید. همچنین، غلظت 1 میلی‏گرم در لیتر IAA در ترکیب با 5/0 میلی‏گرم در لیتر BA باعث افزایش وزن تر کالوس در گل راعی شد.

واژه‏های کلیدی:باززایی، IAA، علف چای، CPPU، BA

مقدمه

در سال‏های اخیر به دلیل روشن شدن عوارض جانبی تعداد زیادی از داروهای شیمیایی گرایش نسبت به استفاده از گیاهان دارویی افزایش یافته و این گیاهان در درمان بیماری‏های مختلف مورد استفاده قرار گرفته اند (Aktuna 2014). گیاه گل راعی (Hypericum perforatum) با نام‏های مختلف دیگر مانند هوفاریقون و علف چای، گیاهی چندساله، علفی و با برگهای متقابل، بیضی و کمی دراز است .(Cui et al. 2010) استفاده از گونه ‏های مختلف گل راعی(Hypericum perforatum) به عنوان یک گیاه دارویی به زمان یونان باستان برمی‏گردد. گل راعی دارای ده‏ها مواد فعال بیولوژیکی می‏باشد که از میان آن‏ها هیپریسین و هیپرفورین بیشترین کاربرد را در صنایع دارویی دارند (Klemow et al. 2004). گل راعی معمولاً بیش از سه سال در مزارع کشت نمی‏شود که علت آن مربوط به بیماری قارچی آنتراکنوز است (Gaudin et al. 2002). از سوی دیگر جمعیت‏های طبیعی و لاین‏های اصلاح شده از لحاظ تولید میزان مواد فعال بسیار متنوع می‏باشند (Cellarova 2003). روش درون شیشه‏ای ابزاری مهم برای بدست آوردن گیاهان یکنواخت ژنتیکی است (Santarém and Astarita 2003). از طرف دیگر، برای انجام انتقال ژن به این گیاه پروتکل باززایی کارایی لازم می باشد. برای نیل به این دو هدف، تعیین غلظت مواد تنظیم کننده‏های رشد در محیط کشت بسیار مهم است (Chawla 2002). از جمله این تنظیم کننده‏های رشد، برخی از مشتقات اوره را می توان نام برد که ترکیبات مصنوعی هستند و روی تقسیم و تمایز سلول‏ها اثر مثبت دارند. به عنوان مثال، CPPU[1] به عنوان یک سیتوکینین‏ اوره ای به خوبی شناخته شده است و به طور گسترده‏ای در کشت بافت گیاهان برای مطالعات مورفوژنز استفاده می‏شود و فعالیت شبه سیتوکینینی آن اغلب بیشتر از ترکیبات آدنین‏دار است (Ricci and Bertoletti 2009). در مورد کاربرد و تاثیر تنظیم کننده‏های رشد بر روی علف چای کارهای مختلفی انجام شده است.Farsad Akhtar et al.  (2013) بالاترین تعداد شاخساره در ریزنمونه برگ علف چای را در غلظت 1 و 5/1 میلی‏گرم در لیتر BAP بدست آوردند. از بین سیتوکینین‏های فنیل اوره‏ای اثر TDZ روی گل راعی مورد مطالعه قرار گرفته است. نتایج حاصل بیانگر این است که kinetin و BAP اثر بیشتری نسبت به TDZ بر شاخه‏زایی این گیاه داشته است (Santarém and Astarita 2003). تاثیر CPPU نیز بر گیاهان مختلف بررسی شده است. مثلاTsuro et al.  (1999) سرعت تشکیل شاخه و شاخه‏زایی را در محیط کشت موراشیگ و اسکوگ (MS) حاوی سیتوکینین‏های BA، CPPU وTDZ [2] در گیاه اسطوخودوس مورد بررسی قرار دادند و بیش‏ترین شاخه‏زایی را در محیط کشت حاوی 4/4 میکرو‏مولار BA و 4/0 میکرو مولار CPPU مشاهده کردند. ولی، تاکنون گزارشی در مورد تاثیر غلظت‏های مختلف تنظیم کننده‏های رشد CPPU بر باززایی گیاه علف چای به ثبت نرسیده است. در این مطالعه، اثر غلظت‏های مختلف تنظیم کننده‏ی رشد CPPU بر کالوس زایی و باززایی گل راعی در مقایسه با BA مورد بررسی قرار گرفت.

موادوروش‏ها

بذور علف چای (Hypericum perforatum) رقم Helos (یک رقم اصلاح شده با مقاومت خوب در برابر آنتراکنوز) که از یکنواختی بالایی برخوردار می‏باشد، از شرکت ریکترز کانادا تهیه گردید. این آزمایش در آزمایشگاه بیوتکنولوژی گیاهی دانشگاه تبریز انجام گردید. بذور برای ضدعفونی زیر هود لامینار ‏ایر فلو ابتدا با اتانول 70 درصد به مدت 2 دقیقه و سپس با هیپوکلریت سدیم 2 درصد به مدت 20 دقیقه ضدعفونی گردیدند. بعد از ضدعفونی سطحی بذور روی محیط کشت MS استریل شده در دمای 121 درجه‏ سانتی‏گراد و فشار یک اتمسفر به مدت 20 دقیقه، برای جوانه‏زنی قرار داده شد و به اتاق رشد با دمای 2±23 درجه‏ سانتی‏گراد و تناوب نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی منتقل شدند (Murashige and Skoog 1962). ریز‏نمونه‏های برگی و میان‏گره در 6 هفتگی از نمونه‏ها جدا و بر روی محیط MS حاوی ویتامین‏های B5 باضافه­ی 30 گرم در لیتر ساکارز انتقال یافتند. تنظیم کننده‏های رشد مورد استفاده در این محیط غلظت‏های مختلفی از CPPU (5/0، 0/1، 5/1 میلی‏گرم در لیتر) در ترکیب با IAA (0/0 و 0/1 میلی‏گرم در لیتر) و BA (5/0، 0/1، 5/1 میلی‏گرم در لیتر) در ترکیب با IAA (0/0 و 0/1 میلی‏گرم در لیتر) بود. برای انجام این تحقیق از آزمایش فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار و پنج ریزنمونه در هر تکرار استفاده شد. بعد از 20 روز وزن تر کالوس اندازه‏گیری شد و پس از 30 روز کالوس‏های حاوی شاخساره‏های باز‏زایی شده به ظروف شیشه‏ای حاوی تنظیم کننده‏های فوق انتقال یافته و به دوره نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی در اتاق رشد منتقل و بعد از 14 روز صفات مورد نظر اندازه گیری شد.

صفات مورد اندازه‏گیری در این آزمایش وزن تر کالوس، تعداد شاخساره، طول شاخساره و تعداد گره بلندترین شاخساره بودند. برای اندازه‏گیری وزن تر کالوس از ترازو با دقت 001/0 گرم استفاده شد. برای محاسبه تعداد شاخساره تعداد شاخساره در هر ریزنمونه شمارش گردید و میانگین تعداد شاخساره در هر ریزنمونه ثبت گردید. برای محاسبه طول شاخساره در هر ریزنمونه، میانگین طول شاخساره‏های تولید شده در هر ریزنمونه محاسبه شد. برای اندازه‏گیری تعداد گره بلندترین شاخساره، تعداد گره بلندترین شاخساره در هر ریزنمونه را شمارش کرده و میانگین تعداد گره در بلندترین شاخساره محاسبه گردید. داده ها با استفاده از نرم افزار IBM SPSS v. 22 و MSTATC تجزیه گردیدند و مقایسه میانگین‏ها با استفاده از آزمون چنددامنه‏ای دانکن در سطح احتمال 5 درصد صورت گرفت. نمودارها با نرم افزار MS Excel رسم شدند.

نتایج و بحث

در مورد صفت وزن تر کالوس نتایج تجزیه واریانس داده‏ها نشان داد که اثرات ریزنمونه وIAA  در سطح احتمال 1 درصد و اثر متقابل BA ×IAA  در سطح احتمال 5 درصد معنی‏دار بودند (جدول 1).

جدول 1. تجزیه واریانس ویژگی‏های مورد مطالعه گل راعی در پاسخ به سطوح مختلف BAP، IAA و ریز نمونه

Table 1. Analysis of variance of some of the studied characteristics in different levels of IAA, BA and explants in St. John’s wort

ns ، _* و _** به ترتیب غیر معنی‏دار و معنی‏دار در سطوح احتمال 5 و 1 درصد

ns: Non-significant, _* and _**: Significant at 0.05 and 0.01 probability levels, respectively

نتایج این یافته نشان داد که غلظت 5/0 میلی‏گرم در لیتر BA به‏همراه 1 میلی‏گرم در لیتر IAA با میانگین 68/36 میلی‏گرم دارای بیشترین وزن تر کالوس و محیط کشت‏های فاقد IAA دارای کمترین وزن تر کالوس بودند (شکل 1). سلول‏های گیاه در پاسخ به IAA، بعضی از عوامل نرم کننده دیواره سلولی (یون هیدروژن) را خارج می‏کنند که انبساط پذیری دیواره را افزایش می‏دهد و باعث اسیدی شدن دیواره سلول می‏شود که در کنترل بزرگ شدن سلولی و تحریک طویل شدن سلول نقش دارد (Taiz and Zeiger 2010). بر این اساس مشاهده ‏شد که غلظت 1 میلی‏گرم در لیترIAA  در ترکیب با 5/0 میلی‏گرم در لیتر BA منجر به افزایش وزن تر کالوس می‏شود.

شکل ۱. اثرات متقابل غلظتهای مختلف بنزیل آدنین و ایندول استیک اسید بر وزن تر کالوسگل راعی حروف متفاوت نشان دهنده تغییرات معنی دار براساس آزمون دانکن در سطح 5 درصد می‏باشد

Figure 1- Interaction between different concentration of BA and callus fresh weight of St. John’s wort Different letters show significance based on Duncan’s multiple range test (p≤0.05)

تعداد شاخساره

نتایج تجزیه واریانس داده‏ها نشان داد که تمامی اثرات اصلی و متقابل برای صفت تعداد شاخساره در سطح احتمال ۱ درصد معنی‏دار بود (جدول 1). نتایج مطالعات نشان می‏دهد که بیش‏ترین تعداد شاخساره در غلظت 5/1 میلی‏گرم در لیتر BA به‏ همراه 1 میلی‏گرم در لیتر IAA با میانگین 06/43 مربوط به ریزنمونه برگ و کم‏ترین تعداد شاخساره در غلظت 5/0 میلی‏گرم در لیتر BA به‏همراه صفر میلی‏گرم در لیتر IAA با میانگین 25/15 مربوط به ریز نمونه میان‏گره می‏باشد (شکل 2). باززایی یک فرآیند فوق العاده پیچیده است که عوامل متعدد کمی و کیفی مانند خصوصیات ژنتیکی گیاه، میزان مواد رشد گیاهی، مقدار مواد تنظیم کننده رشد و غیره بر آن تأثیر می‏گذارند (Bagheri and Saffari 1997). معلوم شده است که هورمونها اثر متقابل روی یکدیگر داشته و می‏توانند اثرات همدیگر را بهبود بخشند Del Poza et al. 2005)). بر این اساس مشاهده می‏شود که در شرایط درون شیشه‏ای تشکیل شاخساره به نوع ریز نمونه مورد استفاده در محیط کشت وابسته است و اکسین ‏ها و سیتوکینین ‏ها نیز در تشکیل شاخساره در گونه‏های مختلف گل راعی موثر هستند (Namli et al. 2010).

شکل 2. اثرات متقابل غلظت‏های مختلف ریزنمونه، بنزیل آدنین و ایندول استیک اسید بر تعداد شاخسارهگل راعی. حروف متفاوت نشان دهنده تغییرات معنی دار براساس آزمون دانکن در سطح 5 درصد می‏باشد

Figure 2- Interaction between different concentrations of BA, IAA and explant, on shoot number of St. John’s wort Different letters show significance based on Duncan’s multiple range test (p≤0.05)

در گل راعی BA به عنوان موثرترین سیتوکینین در تشکیل شاخساره از قسمت‏های مختلف جدا شده از دانهال معرفی شده است (Pretto and Santarem 2000) و براین اساس مشاهده شده است که افزایش غلظت BA تا 5/1 میلی‏گرم در لیتر موجب افزایش تعداد شاخساره در هر ریزنمونه می‏شود (شکل3).

شکل3. شاخه‏های باززایی شده از ریزنمونه برگ در محیط کشت حاوی 5/0 میلی‏گرم در لیتر BA به‏همراه 1 میلی‏گرم در لیتر IAAشکل (A) و 5/1 میلی‏گرم در لیتر BA به‏همراه 1 میلی‏گرم در لیتر IAA 44 روز بعد از کاشت (B)

Figure 3. Regenerated shoots from leaf explants on the culture medium containing 0.5 mg / L BA and 1 mg / L IAA (A) and 1.5 mg / L BA and 1 mg / L IAA 44 days after planting (B)

طول شاخساره

در بیش‏تر تیمار‏ها شاخساره سه هفته بعد از کشت تشکیل شد (شکل4). نتایج تجزیه واریانس داده‏ها نشان داد که اثرات ریزنمونه، IAA و BA و نیز اثر متقابل ریزنمونه ×IAA  در سطح احتمال 1 درصد و اثر متقابل ریزنمونه ×BA  در سطح احتمال 5 درصد معنی‏دار بود (جدول ۱).

شکل 4. شاخه‏های باززایی شده از ریزنمونه برگ (A) و میان‏گره (B) در محیط کشت حاوی 1 میلی‏گرم در لیتر BA به‏همراه 1 میلی‏گرم در لیتر IAA 21 روز بعد از کاشت

Figure 4. Regenerated shoots from leaf explants (A) and stem segments (B) on the culture medium containing 1 mg / L BA and 1 mg / L IAA 21 days after planting

نتایج این مطالعه نشان داد که بیش‏ترین طول شاخساره با میانگین 73/25 میلی‏متر مربوط به ریزنمونه برگ در غلظت 1 میلی‏گرم در لیتر IAA و کم‏ترین آن با میانگین‏های 85/8 و 92/10 میلی‏متر به ترتیب مربوط به ریزنمونه‏های میان‏گره و برگ در غلظت صفر میلی‏گرم در لیتر IAA بود (شکل 5). بر این اساس مشاهده می‏شود که با افزایش غلظت اکسین طول شاخساره افزایش می‏یابد. بنا به نظر 2010) Taiz and Zeiger.)، IAA از مهم‏ترین اکسین‏های طبیعی گیاهان می‏باشد که رشد طولی ساقه و کولئوپتیل‏ها را افزایش می‏دهد. بنابرین می‏توان نتیجه گرفت که ساقه‏ها به طیف وسیعی از غلظت اکسین واکنش نشان می‏دهد و باعث تحریک رشد و طویل شدن آن می‏شود در حالی که رشد ریشه ها در قسمت اعظمی از دامنه غلظت اکسین کند می‏شود .(Gardner 2010) نتایج مقایسه میانگین نشان داد که بیشترین طول شاخساره با میانگین‏های 23/20 و 96/18 میلی‏متر به ترتیب در غلظت‏های 5/1 و 1 میلی‏گرم در لیتر BA مربوط به ریزنمونه برگ و کمترین طول شاخساره با میانگین 64/11 و 49/13 میلی‏متر به ترتیب در غلظت‏های 1 و 5/0 میلی‏گرم در لیتر BA مربوط به ریزنمونه میان‏گره می‏باشد (شکل 6).

شکل 5. اثرهای متقابل غلظت‏های مختلف ایندول استیک اسید و ریزنمونه بر طول شاخسارهگل راعی. حروف متفاوت نشان دهنده تغییرات معنی دار براساس آزمون دانکن در سطح 5 درصد می‏باشد

Figure 5. Interaction between different concentration of IAAand explant on length of shoot in St. John’s wort. Different letters show significance based on Duncan’s multiple range test (p≤0.05)

نتایج مطالعاتAkbaş et al. (2011) که اثر غلظت‏های مختلف BAP روی باززایی گیاه H. spectabile از طریق ریزنمونه برگ را بررسی کردند، مشخص کردند که از بین شش غلظت BAP (25/0، 5/0، 1، 5/1، 2، 5/2 میلی‏گرم در لیتر) بیشترین طول شاخساره با میانگین 3 سانتی‏متر در غلظت 1 میلی‏گرم در لیتر BAP مشاهده می‏شود.

تعداد گره بلندترین شاخساره

نتایج تجزیه واریانس نشان داد که اثرات اصلی ریزنمونه و IAA و اثر متقابل ریزنمونه × IAA در سطح احتمال 1 درصد و اثر متقابل ریزنمونه × BA وBA × IAA  در سطح احتمال 5 درصد معنی‏دار بود (جدول 1). نتایج مقایسه میانگین نشان داد که غلظت 1 میلی‏گرم در لیتر BA به‏همراه 1 میلی‏گرم در لیتر IAA با میانگین 16/4 بیش‏ترین تعداد گره و در غلظت‏های مختلف BA که فاقد IAA بودند کم‏ترین تعداد گره در بلندترین شاخساره مشاهده شد (شکل 7). پس می‏توان نتیجه گرفت که IAA نقش مهمی در تنظیم رشد و تمایز سلول گیاهی دارد. در شاخه‏های توسعه یافته جوان اکسین رشد طولی را با افزایش انبساط پذیری دیواره سلولی و تحریک رشد سلول و طویل شدن آن تنظیم می‏کند (Taiz and Zeiger 2010). بر این اساس مشاهده می‏شود که IAA  در ترکیب با BA برای افزایش تعداد گره بلندترین شاخساره ضروری می‏باشد.
تاثیر غلظت‏های مختلف CPPU و IAA بر صفات مورد مطالعه

وزن تر کالوس

در رابطه با وزن تر کالوس نتایج تجزیه واریانس داده‏ها نشان داد که اثرات ریزنمونه و IAA در سطح احتمال 1 درصد معنی‏دار بود (جدول 2).

شکل 6. اثرات متقابل غلظت‏های مختلف ریزنمونه و بنزیل آدنین بر طول شاخسارهگل راعی. حروف متفاوت نشان دهنده تغییرات معنی دار براساس آزمون دانکن در سطح 5 درصد می‏باشد

Figure 6. Interaction between different concentration of explant and BA on lengths of shoot of St. John’s wort. Different letters show significance based on Duncan’s multiple range test (p≤0.05)

شکل 7. اثرات متقابل غلظتهای مختلف بنزیل آدنین و ایندول استیک اسید بر تعداد گره بلندترین شاخسارهگل راعی. حروف متفاوت نشان دهنده تغییرات معنی دار براساس آزمون دانکن در سطح 5 درصد می‏باشد

Figure 7. Interaction between different concentration of BA and IAA on node number of tallest shoots of St. John’s wort. Different letters show significance based on Duncan’s multiple range test (p≤0.05)

جدول 2. تجزیه واریانس برخی ویژگی‏های مورد مطالعه گل راعی در سطوح مختلف IAA، CPPU و ریزنمونه

Table 2. Analysis of variance of some of the studied characteristics in different levels of IAA, CPPU and explants in St. John’s wort

ns ، * و ** به ترتیب غیر معنی‏دار و معنی‏دار در سطوح احتمال 5 و 1 درصد

ns: Non-significant, * and **: Significant at 0.05 and 0.01 probability levels, respectively

بر اساس نتایج مقایسه میانگین مشاهده شد که ریزنمونه میان‏گره با میانگین 4/23 میلی‏گرم دارای بیشترین و ریزنمونه برگ با میانگین 37/20 میلی‏گرم دارای کمترین وزن تر کالوس بودند (شکل 8). بر این اساس می‏توان نتیجه گرفت که ریزنمونه میان‏گره برای افزایش وزن تر کالوس مناسب‏تر از ریزنمونه برگ می‏باشد.

شکل 8.مقایسه میانگین اثر نوع ریزنمونه بر وزن تر کالوس گل راعی

Figure 8. Comparison of means of the effect of explant type on the callus fresh weight in St. John’s wort

همچنین غلظت 1 و صفر میلی‏گرم در لیتر به‏ترتیب با میانگین‏های 32/32 و46/11 میلی‏گرم دارای بیشترین و کمترین وزن تر کالوس بودند (شکل 9).

شکل 9. مقایسه میانگین اثر غلظت‏های مختلفIAA  بر وزن تر کالوس گل راعی

Figure 9. Comparison of means of the effect of different concentrations of IAA on callus fresh weight in St. John’s wort

تعداد شاخساره

نتایج تجزیه واریانس داده‏ها نشان داد که اثرات ریزنمونه، CPPU و IAA و اثر متقابل ریزنمونه × IAA در سطح احتمال 1 درصد و همچنین اثر متقابل ریزنمونه × CPPU و CPPU × IAA در سطح احتمال 5 درصد معنی‏دار بود (جدول 2). نتایج مقایسه میانگین نشان داد که در بین ترکیبات تیماری مختلف غلظت 5/1 میلی‏گرم در لیتر CPPU به‏همراه 1 میلی‏گرم در لیتر IAA با میانگین 98/41 دارای بیش‏ترین و غلطت 5/0 میلی‏گرم در لیتر CPPU به‏همراه صفر میلی‏گرم در لیترIAA با میانگین 19/18 دارای کمترین تعداد شاخساره بودند (شکل 10). این نتایج مشابه نتایج Wójcik and Podstolski (2007)، بود که نشان دادند بیش‏ترین تعداد شاخساره از کالوس برگ زمانی بدست می‏آید که  BAPبه همراه IAA استفاده شود. همچنین استفاده از اکسین باعث تشکیل کالوس و باززایی شاخساره‏ها می‏شود و در ترکیب با سیتوکینین باعث سریعتر شدن سرعت تقسیم سلولی و در نهایت باعث تشکیل تعداد زیادی سلول‏های کوچک و تمایز نیافته می‏شود Mendoza and Kaeppler 2002)).

شکل 10. اثرات متقابل غلظت‏های مختلف فورکلرفنورون و ایندول استیک اسید بر تعداد شاخسارهگل راعی. حروف متفاوت نشان دهنده تغییرات معنی دار براساس آزمون دانکن در سطح 5 درصد می‏باشد

Figure 10. Interaction between different concentration of CPPU and IAA on shoot number of St. John’s wort. Different letters show significance based on Duncan’s multiple range test (p≤0.05)

بر این اساس مشاهده شد که غلطت 5/1 میلی‏گرم در لیتر CPPU در ترکیب با 1 میلی‏گرم در لیتر IAA برای افزایش باززایی گل راعی موثر می‏باشد (شکل11).

طول شاخساره

نتایج تجزیه واریانس نشان داد که اثرات ریزنمونه، CPPU،IAA  و اثر متقابل CPPU × IAA در سطح احتمال 1 درصد معنی‏دار بود (جدول 2). دربین ترکیبات تیماری مختلف غلظت 5/1 میلی‏گرم در لیتر CPPU به‏ همراه 1 میلی‏گرم در لیتر IAA با میانگین 43/30 میلی‏متر دارای بیش‏ترین و غلظت 5/0 میلی‏گرم در لیتر CPPU به‏همراه صفر میلی گرم در لیتر IAA با میانگین 4/12 میلی‏متر دارای کم‏ترین طول شاخساره بودند (شکل 12).

شکل 11. ریزنمونه برگ گل راعی در محیط کشت حاوی 5/0 میلی‏گرم در لیترCPPU  (A) و 5/1 میلی‏گرم در لیترCPPU  به‏همراه 1 میلی‏گرم در لیتر IAA 44 روز بعد از کشت (B)

Figure 11. St. John’s wort leaf explants in the medium containing 0.5 mg/l CPPU (A) and 1.5 mg/l CPPU and 1 mg/l IAA 44 days after planting (B)

براین اساس مشاهده می‏شود که IAA به‏همراه CPPU نقش موثرتری در افزایش طول شاخساره در گیاه گل راعی دارد. اکسین‏ها در غلظت پایین اثر بازدارنده مقادیر زیاد سیتوکینین بر رشد طولی ساقه‏های جانبی را خنثی نموده و روند رشد ساقه‏ها را به حالت عادی باز می‏گردانند (Chawla 2002). بنابراین، استفاده از غلظت 5/1 میلی‏گرم در لیترCPPU در ترکیب با 1 میلی‏گرم در لیتر IAA باعث بهبود رشد طولی شاخساره در گیاه دارویی گل راعی می‏شود.

تعداد گره بلندترین شاخساره

نتایج تجزیه واریانس داده‏ها نشان داد که اثر اصلی IAA برای تعداد گره بلندترین شاخساره در سطح احتمال 1 درصد و اثر متقابل سه جانبه ریزنمونه × IAA × CPPU در سطح احتمال 5 درصد معنی‏دار بود (جدول۲). نتایج مقایسه میانگین نشان داد که در بین ترکیبات تیماری مختلف غلظت 5/1 و 1 میلی‏گرم در لیتر CPPU به‏همراه 1 میلی‏گرم در لیتر IAA با میانگین‏های 01/6 و 16/5 در هر ریزنمونه برگ دارای بیش‏ترین و غلظت‏های مختلف CPPU که فاقد IAA بودند دارای کمترین تعداد گره در بلندترین شاخساره در هر دو ریزنمونه برگ و میان‏گره بودند (شکل 13). پس می‏توان نتیجه گرفت که هورمون‏ها اثر متقابل روی یکدیگر دارند و اثرات همدیگر را با افزایش بزرگ شدن سلولی و تقسیم سلولی بهبود می‏بخشند. علت تعامل اکسین با سیتوکینین در تقسیم سلولی این است که در سلول ابتدا باید بزرگ شدن سلول اتفاق بیفتد وسپس تقسیم سلولی صورت گیرد و تا زمانی که اندازه سلول به یک حد معین نرسیده باشد تقسیم صورت نخواهد گرفت، همچنین مراحل اولیه تقسیم سلولی نیازمند حضور اکسین می‏باشد (Wang et al. 1981; Bayliss 1985). بنابراین، غلظت 1 و 5/1 میلی‏گرم در لیتر CPPU در ترکیب با 1میلی‏گرم در لیتر IAA نقش موثری را در افزایش صفت فوق در ریزنمونه برگ دارد.

شکل 12. اثرات متقابل غلظتهای مختلف فورکلرفنورون و ایندول استیک اسید بر طول شاخسارهگل راعی. حروف متفاوت نشان دهنده تغییرات معنی دار براساس آزمون دانکن در سطح 5 درصد می‏باشد

Figure 12. Interaction between different concentration of CPPU and IAA on shoot length of St. John’s wort. Different letters show significance based on Duncan’s multiple range test (p≤0.05)

شکل 13. اثرات متقابل غلظتهای مختلف ریزنمونه، ایندول استیک اسید و CPPU بر تعداد گره بلندترین شاخساره گل راعی. حروف متفاوت نشان دهنده تغییرات معنی دار براساس آزمون دانکن در سطح 5 درصد می‏باشد

Figure 13. Interaction between different concentration of explant, IAA and CPPU on node number of tallest shoots of St. John’s wort. Different letters show significance based on Duncan’s multiple range test (p≤0.05)

نتیجه‏گیری

باززایی شاخساره در گل راعی تحت تاثیر غلظت‏های مختلف تنظیم کننده‏های رشد قرار گرفت. به‏طور کلی نقش تنظیم کنندگی CPPU به عنوان هورمون سیتوکینین در گل راعی ثابت شد. حضور اکسین در محیط کشت باززایی در ترکیب با سیتوکینین باعث افزایش معنی‏دار باززایی می‏شود. بیشترین میزان باززایی شاخساره مربوط به ریزنمونه برگ در غلظت 5/1 میلی‏گرم در لیتر CPPU در ترکیب با 1 میلی‏گرم در لیتر IAA می‏باشد. غلظت 5/1 میلی‏گرم در لیتر CPPU یا BA در ترکیب با IAA باعث افزایش معنی‏دار باززایی شد. غلظت 1 میلی‏گرم در لیتر IAA در ترکیب با 5/0 میلی‏گرم در لیتر BA باعث افزایش وزن تر کالوس در گل راعی شد.

منابع

باقری عبدالرضا، صفاری مهری (1376) مبانی کشت بافت‏های گیاهی. انتشارات دانشگاه فردوسی مشهد. 406 صفحه.

References

Akbaş F, Karakuş P, Başaran D (2011) Direct plant regeneration from in vitro-derived leaf explants of Hypericum spectabile, a medicinal plant. J Med Plants Res 5, 2175-2181.

Aktuna O ( 2014) Optimization of hypericin extraction from Hypericum perforatum L. Tissues and evaluation of ITS applicabiy in dye-sensitized solar cells. Middle East Technical University Press. PP. 1-14.

Bagheri A, Saffari M (1997) In vitro culture of higher plants. Ferdowsi University of Mashhad Press. 406 pages (In Persian).

Bayliss M (1985) Control of cell division in cultured cells. In: Bryant JA and Francis D (eds) The cell division cycle in plants. Cambridge University Press. pp. 157-178.

Cellarova E (2003) Culture and biotechnology of Hypericum In: Ernst, E. (ed.). Hypericum, Medicinal and Aromatic Plants Industrial Profiles. CRC Press PP. 65-75.

Chawla H (2002) Introduction to plant biotechnology. Science Publishers pp. 39-56

Cui XH, Chakrabarty D, Lee EJ, Paek KY (2010). Production of adventitious roots and secondary metabolites by Hypericum perforatum L. in a bioreactor. Bioresour Technol 101, 4708-4716.

Del-Poza Jc, Lopez-Matas MA, Ramirez-Parra E, Gutierrez C (2005) Hormonal control of the plant cell cycle. Physiol Plant 123, 173-183.

Farsad Akhtar N, Aharizad S, Mohammadi SA et al. (2013) In vitro shoot regeneration and hypericin production in four Hypericum perforatum L. genotypes. Int J Agric: Res Rev. 3, 887-893.

Gardner FP, Pearce RB, Mitchell RL( 2010) Physiology of crop plants. Published by Scientific Publishers pp. 180-230.

Gaudin M, Simonnet X, Debrunner N, Ryser A (2002) Breeding for a Hypericum perforatum L. variety both productive and Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) tolerant. J Herbs Spices Med Plants 9, 107-120.

Klemow KM, Bartlow A, Crawford J, et al. Medical Attributes of St. John’s Wort (Hypericum perforatum) In: Benzie IFF, Wachtel-Galor S, editors. Herbal Medicine: Biomolecular and Clinical Aspects. 2nd edition. Boca Raton (FL): CRC Press/Taylor & Francis; 2011. Chapter 11.

Mendoza MG, Kaeppler HF (2002) Auxin and suger effects on callus induction and plant regeneration Frequencies from mature embryos of wheat (Triticum aestivum L.). In Vitro Cell Dev Biol Plant 38, 39-45.

Murashige T, Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant 15, 473-497

Namli S, Akbas F, Isikalan C et al. (2010) The effect of different plant hormones (PGRs) on multiple shoots of Hypericum retusum Aucher. Plant Omics 3, 12-17.

Pretto F R, Santarem E R (2000) Callus formation and plant regeneration from Hypericum perforatum leaves. Plant Cell Tissue Organ Cult 62, 107-113.

Ricci A, Bertoletti C (2009) Urea derivatives on the move: cytokinin‐like activity and adventitious rooting enhancement depend on chemical structure. Plant Biol (Stuttg) 11, 262-272.

Santarém ER, Astarita LV (2003) Multiple shoot formation in Hypericum perforatum L. and hypericin production. Braz J Plant Physiol 15, 43-47.

Taiz L, Zeiger E (2010) Plant physiology Fifth Edition. Sinauer Associates Inc., Publishers Sunderland, Massachusetts USA pp. 545-640

Tsuro M, Koda M, Inoue M (1999) Comparative effect of different types of cytokinin for shoot formation and plant regeneration in leaf-derived callus of lavender (Lavandula vera DC). Sci Hortic (Amsterdam) 81(3), 331-336.

Wang TL, Everett NP, Gould AR, Street HP (1981) Studies on the control of the cell cycle in cultured plant cells. Protoplasma 106, 23-35.

Wójcik A, Podstolski A (2007) Leaf explant response in in vitro culture of St. John’s wort (Hypericum perforatum L.). Acta Physiol Plant 29, 151-156.