Agrobacterium-mediated transformation of wheat (Triticum aestivum) using chitinase and glucanase genes

تراریزش گیاه گندم بواسطه اگروباکتریوم به منظور انتقال ژن‌های کیتیناز و گلوکاناز

نگین محمدی ‌زاده*¹، مسعود توحیدفر²، مطهره محسن‌پور³

¹کارشناس ارشد بیوتکنولوژی پژوهشکده بیوتکنولوژی کرج  

²عضو هیئت علمی پژوهشکده بیوتکنولوژی کرج

³دانشجوی دکتری دانشگاه مازندران

چکیده

به منظور تولید گیاهچه تراریخته گندم Triticum aestivum)) مقاوم به قارچ‌های فوزاریوم و ارایزیف، از 4 سویه اگروباکتریوم LBA4404، AGL،  EHA101و C58، حامل پلاسمید pBI121 نوترکیب، حاوی ژن‌های کیتیناز و گلوکاناز هر کدام به طور جداگانه تحت کنترل پیشبرCaMV35S  و نیز ژن انتخابگر نئومایسین فسفوترانسفراز تحت کنترل پیشبر NOS استفاده شد. ریزنمونه‌های جنین نارس 5 ژنوتیپ از ارقام (مغان، آرتا، سایسون و گاسکوژن) و لاین A، پس از هم‌کشتی با سوسپانسیون باکتری به محیط گزینشی کالوس‌دهی حاوی 50 میلی گرم بر لیتر کانامایسین منتقل شدند. کالوس‌های جنین‌زا پس از رشد در محیط گزینشی، انتخاب و به محیط باززایی حاوی ۲۵ میلی‌گرم بر لیترکانامایسین انتقال یافتند. دراین پژوهش دو گیاهچه حاصل از تلقیح با سویه C58 با درصد تراریزش (31/0) درصد و 1 گیاهچه حاصل از تلقیح با سویه LBA4404 با درصد تراریزش (074/0) درصد از رقم آرتا حاصل شد. در سایر ارقام و سویه‌ها هیچ گیاهچه تراریخته‌ای مشاهده نشد. واکنش زنجیره‌ای پلیمراز و آنالیز لکه‌گذاری DNA نشان داد که گیاهان تراریخته احتمالی در مقایسه با شاهد حداقل یک نسخه از ژن‌های کیتیناز، گلوکاناز و نیز نئومایسین فسفوترانسفراز را در ژنوم خود دارا هستند.

کلمات کلیدی: اگروباکتریوم، کیتیناز، گلوکاناز، گندم تراریخته.

مقدمه

گندم مهمترین محصول ایران و جهان است. سطح زیر کشت این محصول در دنیا برابر 230-220 میلیون هکتار و در ایران در حدود 5/6 میلیون هکتار است که از سایر غلات بیشتر و برابر 22 درصد سطح زیر کشت کلیه غلات است (Kazemi Arbat, 2005). تولید کل غلات در جهان برابربا 8/1 میلیارد تن می باشد که بیشترین میزان آن (حدود 500 تا 600 میلیون تن) به گندم اختصاص دارد و از نظر سطح زیر کشت و تولید سالانه نیز گندم در درجه اول اهمیت قرار دارد (Safikhani, 2007)، به همین علت غذای عمدة بیش از ۴۰ کشور جهان می‌باشد که جوابگوی ۳۵ درصد جمعیت دنیاست (Bushuk, 1998). در ایران نیز این محصول تامین کننده بیشترین نیاز غذایی کشور بوده و روزانه حدود 47 درصد از کالری مصرفی سرانه کشور را تامین می‌نماید (Safikhani, 2007). بوته‌های گندم در تمام مراحل رشد و در تمام محیط‌های طبیعی در معرض تنش‌های گوناگون مکانیکی، فیزیولوژیکی و زیستی قرار دارند که رشد، عملکرد و تکامل طبیعی آن‌ها را مختل می‌سازد. از جمله عوامل عمده زنده در کاهش عملکرد، بیماری‌های قارچی هستند که بزرگترین و قدیمی‌ترین گروه پاتوژن‌های گندم‌اند (Shahcheraghi and Masoumi, 1997) و از آن جمله می‌توان به قارچ فوزاریوم[1] و ارایزیف‌گرامینیس[2] اشاره کرد. با وجود پیشرفت‌هایی که از طریق روش‌های اصلاحی استاندارد صورت گرفته، اما اصلاح مقاومت به روش‌های مرسوم، یک فرایند سخت، وقت‌گیر و مداوم است، بدان علت که، در اکثر موارد، صفات تحت کنترل چندین ژن بروز یافته و حتی هنگامی که ارقام مقاوم حاصل می‌شوند، به علت نمو دائمی و نیز موتاسیون پاتوژن‌ها، این ارقام نمی‌توانند برای مدت زمان طولانی، مقاومت پایداری از خود نشان دهند (Friesen et al., 2006). در سال‌های اخیر، بیوتکنولوژی گیاهی منبعی سرشار از ابداع و خلاقیت بوده و انتقال ژن‌های مطلوب ویژه را، بدون همراهی با هیچ ژن نا‌مطلوبی، به گیاه زراعی میسر ساخته است (Farsi and Zolala, 2006). ارزیابی ژرم‌پلاسم گندم مقدار بسیار ناچیزی از مقاومت به قارچ را نشان می‌دهد، به همین علت، ورود ژن‌های آنتی‌توکسین و ضد قارچی منحصر به فرد از طریق تراریزش ژنتیکی، موجب افزایش پتانسیل مقاومت در ارقام گندم می شود. ژن‌های ضد قارچی، گروهی از پروتئین‌ها به نام پروتئین‌های مربوط به بیماریزایی را رمز می کنند که موجب تخریب دیواره‌های سلول قارچی، ایجاد اختلال در غشا‌های سلولی آن، تقویت سیستم پاسخ دفاعی میزبان، دخالت در بیماریزایی و سنتز پروتئین‌های ضد قارچی می شوند (Dahleen et al., 2001). یک گروه از این ژن‌ها پروتئین‌هایی مانند β - 1 و3 گلوکاناز و کیتیناز را رمز می‌کنند (Mackintosh et al., 2007). سوبسترای آنزیم کیتیناز، کیتین است. کیتین عبارت است از یک همو‌پلیمر خطی از واحد‌های N ـ استیل‌ ـ دی ‌‌ـ گلوکز آمین که با پیوندهای β ـ 4،1 به هم متصل هستند. کیتیناز پیوند بین کربن‌های 1و4 از دو N - استیل گلوکز امین متوالی در ساختمان کیتین را می‌شکند (Shin  et al., 2008). آنزیم β – 1 و 3 گلوکاناز نیز، پیوند پلی‌ساکارید بین کربن‌های 1و3 در ساختمان گلوکان موجود در دیواره سلولی قارچ را تخریب می‌کند (Leah  et al., 1991). در بافت‌های بیمار تجمع کیتینازها به ویژه به موازات تجمع β– 1 و 3 گلوکاناز‌ها انجام می‌گیرد که این امر موجب ایجاد مقاومت افزایشی به قارچ‌ها می‌شود و در صورت وجود این دو آنزیم در گیاه گندم، این گیاه قادر خواهد بود که مقاومت بهتر و پایداری را در برابر قارچ‌های عامل بیماری زنگ زرد، قهوه‌ای، سیاهک، سفیدک و فوزاریوم از خود نشان دهد. بنابراین مهندسی ژن‌های رمز کننده کیتیناز به همراه سایر ژن‌های رمز کننده پروتئین‌های ضد قارچی در گیاهان، حفاظت آنها را در برابر پاتوژن‌های قارچی افزایش می‌دهد (Tohidfar  et al., 2005). این مسیر می‌تواند منجر به کنترل طیف وسیعی از پاتوژن‌های قارچی گردد (Mauch  et al.,1988). تکنولوژی نوین مهندسی ژنتیک، ورود نه تنها یک ژن، بلکه چندین ژن را، با روش‌های دقیق، قابل کنترل و قابل پیش‌بینی‌تر از آنچه در روش‌های مرسوم اصلاحی انجام می‌شده است، فراهم می‌کند. بنابراین به‌کار‌گیری مهندسی ژنتیک و بیوتکنولوژی برای فراهم نمودن غذا جهت رویارویی با نیازمندی‌ها در آینده نزدیک مورد نیاز است و می‌توان پیشرفت‌های زیادی را در چارچوب زمانی کوتاه‌تر نسبت به روش‌های مرسوم که در گذشته صورت گرفته‌اند، انجام داد (Kole and Timothy, 2008). هدف از این پژوهش، تراریزش گندم با استفاده از دو ژن کیتیناز و گلوکاناز برای مقاومت به بیماری‌های قارچی به ویژه فوزاریوم[3] و ارایزیف[4] می‌باشد که می‌تواند به کاهش مصرف سموم قارچکش منجر گردد.

مواد گیاهی

بذور 4 رقم تجاری گندم نان شامل ارقام پائیزه (سایسون و گاسکوژن) و ارقام بهاره (آرتا، مغان) و نیز لاین A از بخش غلات موسسه تحقیقات و اصلاح نهال و بذر کرج تهیه و به عنوان مواد گیاهی استفاده شد.

سازه ژنی و سویه‌های باکتری

در این پژوهش از 4 سویه اگروباکتریوم نوترکیب شامل LBA4404، AGL،  EHA101و C58، حامل پلاسمید pBI121-ChiGlu(-) (Mohsenpour  et al., 2008)، به منظور تلقیح ریز‌نمونه‌‌ها استفاده شد. همچنین جنین نارس گندم به عنوان ریز‌نمونه جهت تراریزش با اگروباکتریوم مورد استفاده قرار گرفت.

آماده‌سازی سوسپانسیون باکتریایی تلقیح

سویه‌های اگروباکتریوم جهت انتقال ژن، در محیط LB مایع حاوی 50 میلی‌گرم‌ بر‌ لیتر کانامایسین و 75 میلی‌گرم‌ بر‌ لیتر ریفامپیسین، در دمای 28 درجه سانتی‌گراد در دستگاه شیکر - انکوباتور با دور rpm200 کشت شدند‌. پس از طی مدت زمان 22-18 ساعت، به منظور افزایش کارایی تراریزش، 500 میکرولیتر از محلول باکتری رشدیافته به همراه ماده القاء‌گر استوسرینگون با غلظت 400 میکرو مولار، به 3 میلی‌لیتر محیط LB جدید حاوی آنتی‌بیوتیک‌های کانامایسین و ریفامپیسین اضافه شده و برای رشد باکتری‌های تازه، در دستگاه شیکر – انکوباتور قرار گرفت، _nm٦۰۰OD مناسب باکتری جهت تلقیح در این پژوهش 2/1-1 در نظر گرفته شد.

آماده‌سازی و تلقیح ریزنمونه‌ها

در ادامه، بذور مورد آزمایش در گلدان کشت و پس از طی کلیه مراحل داشت در گلخانه، بذور نارس آنها در فاصله زمانی 12 الی 18 روز پس از گرده‌افشانی برداشت شد. بذور نارس ابتدا به مدت 5 دقیقه در الکل 70 درصد ضد‌عفونی و سپس آبشویی شده، پس از آن به مدت 20 دقیقه در هیپوکلریت سدیم 5/2 درصد به طور کامل ضد‌عفونی شدند و پس از آبشویی و خشک شدن بر روی کاغذ خشک‌کن استریل در مقابل هود کشت، در زیر میکروسکوپ جدا شده و بر روی پتری دیش‌‌های حاوی 35 میلی‌لیتر محیط کشت کالوس‌دهی شامل نمک‌ها و ویتامین‌های MS، ۲ میلی‌گرم‌بر‌لیتر توفوردی، ۴۰ میلی‌گرم‌بر‌لیتر تیامین، 200 میلی‌گرم‌بر‌‌‌‌‌‌‌‌‌لیتر کازئین، ۵۰۰ میلی‌گرم‌بر‌لیتر گلوتامین، ۳۰ گرم‌بر‌لیتر ساکارز، ۸ گرم‌بر‌لیتر آگار و ۸/5pH=  قرار گرفتند، به گونه‌ای که سپرچه جنین رو به بالا و سمت دیگر آن که بر اثر برش مریستم ساقه-ریشه، زخمی شده، بر روی محیط قرار گیرد. پس از آن محلول باکتری با 2/1-1 = _nm٦۰۰OD، به وسیله سمپلر بر روی تک تک ریز نمونه‌ها قطره‌گذاری شد. سپس جنین‌های نارس آغشته به باکتری، به مدت 20 دقیقه در مقابل هود خشک شده و پس از بستن درب پتریدیش، به مدت ۲ الی ۳ روز تحت شرایط تاریکی و دمای 26 درجه سانتی گراد در فیتوترون قرار گرفتند. این زمان جهت رشد و نفوذ باکتری به جنین مورد نیاز است. پس از طی این مدت، جنین‌ها با محلول سفوتاکسیم با غلظت 250 میلی‌گرم‌ بر‌ لیتر شستشو و بر روی کاغذ صافی خشک شدند.

باززایی گیاهچه‌های تراریخته احتمالی

جنین‌های تلقیح شده به محیط کالوس‌دهی انتخابی حاوی 50 میلی‌گرم‌ بر‌ لیتر کانامایسین و 250 میلی‌گرم ‌بر ‌لیتر سفوتاکسیم جهت کنترل رشد باکتری منتقل شده و تحت شرایط تاریکی و دمای ۲٦ درجه سانتی‌گراد در فیتوترون به مدت ۱۵ تا ۱۸ روز نگهداری شدند. در طی این مدت، فاکتور‌هایی نظیر درصد کالوس‌دهی (نسبت کالوس‌های تولید شده به کل جنین‌های نارس × 100) و درصد جنین‌زایی (نسبت کالوس‌های جنین‌زا به کل کالوس‌ها × 100) بررسی شد. پس از طی مدت زمان کالوس‌دهی، کالوس‌های جنین‌زا به محیط باززایی انتخابی شامل نمک‌ها و ویتامین‌های MS، 2 میلی‌گرم‌بر‌لیترBAP، ۱/۰ میلی‌گرم‌بر‌لیتر IAA، ۳۰ گرم‌بر‌لیتر ساکارز، ٧ گرم‌ بر ‌لیتر آگار و ٧/۵ pH= به همراه 25 میلی‌گرم‌ بر‌ لیتر کانامایسین و 250 میلی‌گرم‌ بر‌ لیتر سفوتاکسیم جهت کنترل رشد باکتری و همچنین تحریک شاخه‌زایی و ریشه‌زایی، تحت شرایط دمایی ۲٦ درجه سانتی‌گراد و ۱٦ ساعت نور با شدت 10000 لوکس و ۸ ساعت تاریکی، به فیتوترون، انتقال یافتند. کالوس‌های جنین‌زا، به رنگ کرم روشن بوده و ظاهری ترد و شکننده دارند. در مراحل بعدی با مشاهده شاخه‌زایی، آنتی‌بیوتیک‌ها از محیط حذف شده و گیاهچه‌های باززا شده، به محیط باززایی حاوی ۵/۱ گرم‌بر‌لیتر ذغال فعال جهت تولید ریشه منتقل شدند. واکشت نمونه‌ها هر دو هفته یکبار انجام و فاکتور‌هایی نظیر درصد شاخه‌زایی (نسبت کالوس‌های جنین‌زای شاخه‌دار‌شده به کل کالوس‌های جنین‌زا × 100) و ریشه‌زایی (نسبت گیاهچه‌ها و کالوس‌های جنین‌زا‌ی ریشه‌دار‌شده به کل کالوس‌های جنین‌زا × 100) و در صد تراریزش (نسبت گیاهچه‌های تراریخته به کل جنین‌های نارس تلقیح‌شده با اگروباکتریوم × 100) بررسی شد. گیاهچه‌های باززاشده در درون شیشه، ابتدا به گلدان‌های کوچک در شرایط فیتوترون و سپس به گلدا‌ن‌های بزرگ در شرایط گلخانه منتقل شدند.

تائید مولکولی گیاهچه‌های تراریخته

استخراج DNA از برگ گیاهچه‌های گندم به روش دلاپورتا (Dellaporta et al., 1983) انجام گرفت. به منظور اثبات تلفیق ژن‌های کیتیناز، گلوکاناز و nptII، واکنش زنجیره‌ای پلیمراز در حجم 25 میکرولیتری حاوی یک واحد آنزیم DNA پلیمراز Taq، 25 نانوگرم DNA، 5/2 میکرولیتر dNTPs (2/0 میلی مولار)، 2 میکرولیتر MgCl₂ (25 میلی‌مولار) و 5/2 میکرولیتر بافر X10 PCR و 10 پیکو‌مول از آغازگر‌های اختصاصی انجام گرفت. برای اثبات حضور ژن کیتیناز از آغاز‌گر‌های اختصاصی رو به عقب ژن کیتیناز و رو به جلو پیشبر CaMV35S استفاده شد. همچنین جهت اثبات حضور ژن گلوکاناز نیز از آغازگر‌های اختصاصی رو به عقب ژن گلوکاناز و رو به جلو پیشبر CaMV35S استفاده شد. برای هر دو ژن، واکنش در 94 درجه سانتی‌گراد 5 دقیقه و 35 چرخه (هر چرخه شامل یک دقیقه در 94 درجه، 30 ثانیه در 60 درجه و یک دقیقه در 72 درجه سانتی‌گراد و تکمیل بسط در 72 درجه 7 دقیقه) انجام شد. این برنامه، برای اثبات تلفیق ژن نشانگر انتخابی nptII در ژنوم گیاهان تراریخته احتمالی، با استفاده از آغاز‌گر‌های اختصاصی رو به عقب و رو به جلو ژن نئومایسین فسفو‌ترانسفراز، با دمای بهینه اتصال 58 درجه سانتی‌گراد انجام شد. در هر سه واکنش از نمونه آب (فاقد هر گونه DNA ) و DNA گیاه شاهد به عنوان کنترل منفی و از نمونه پلاسمید به عنوان کنترل مثبت، برای تائید تراریزش گیاه استفاده گردید. همچنین برای تایید بیشتر تلفیق ژن، آزمون لکه گذاری DNA با استفاده از کاوشگرهای اختصاصی برای ژن nptII و پیشبر CaMV35S، براساس روش Sambrook and Russell (2001) انجام شد. عمل نشاندار کردن کاوشگر‌ها نیز به روش کیتDIG Labeling شرکت Roche انجام شد. توالی آغازگر‌ها در جدول 1 آمده است. برای اثبات حضور ژن کیتیناز، با آغازگرهای اختصاصی رو به عقب ژن کیتیناز و رو به جلو پیشبر CaMV35S و برای اثبات حضور ژن گلوکاناز با آغازگرهای اختصاصی رو به عقب ژن گلوکاناز و رو به جلو پیشبر CaMV35S و نیز برای اثبات حضور ژن nptII با آغاز‌گر‌های اختصاصی رو به عقب و رو به جلو ژن نئومایسین فسفو‌ترانسفراز، بررسی شدند.

جدول 1- آغازگر‌های مورد استفاده در واکنش زنجیره‌ای پلیمراز جهت تایید تراریزش گیاهان تراریخته احتمالی.

Table 1- Primers used in PCR analysis for accuracy of putative transgenic plants.

نتایج

در این تحقیق 5 گیاهچه باززا شده رقم آرتا بدست آمد که از میان آن‌ها 3 گیاهچه، شامل 1 گیاهچه حاصل تلقیح با سویه LBA4404 با درصد تراریزش اولیه 074/0 درصد و دو گیاهچه حاصل تلقیح با سویه C58 با درصد تراریزش اولیه 31/0 درصد، تراریختی را نشان دادند (جدول 2). بیشترین درصد کالوس‌دهی 77 درصد و بیشترین درصد شاخه‌زایی 1/2 درصد مربوط به رقم آرتا تلقیح شده با سویه LBA4404 و بیشترین درصد جنین‌زایی 3/23 درصد و نیز بیشترین درصد ریشه‌زایی 9/1 درصد مربوط به رقم آرتا تلقیح شده با سویه C58 بدست آمد (جدول 2). واکنش زنجیره‌ای پلیمراز نشان داد که 3 گیاهچه تراریخته احتمالی در مقایسه با شاهد، حداقل یک نسخه از ژن‌های کیتیناز، گلوکاناز و نئومایسین فسفوترانسفراز ((nptII را در ژنوم خود دارا هستند (شکل های 4، 5 و 6). آنالیز لکه‌گذاری DNA تلفیق ژن‌های فوق را در ژنوم این 3 گیاهچه در مقایسه با گیاه شاهد نشان داد که تائید بیشتری بر نتایج حاصل از واکنش زنجیره‌ای پلیمراز بود. این 3 گیاه، در واکنش زنجیره‌ای پلیمراز و آزمون لکه‌گذاری DNA پاسخ مثبت نشان دادند (شکل های 7 و 8).

شکل 1- وکتور دوگانه pBI121 نوترکیب حاوی ژن‌های کیتیناز و گلوکاناز.

Figure 1- pBI121 Recombinant binary vector containing chitinase and gluconase genes.

شکل 2- گیاهچه آلبینو در محیط کشت دارای آنتی بیوتیک کانامایسین.

Figure 2- Albino explants in medium containing kanamycin.

جدول 2- فراوانی تراریزش گیاهچه های باززا شده از جنین های نارس گندم در تراریزش با اگروباکتریوم.

* درصد تراریزش از (نسبت گیاهچه‌های تراریخت به تعداد جنین‌های نارس تلقیح شده با اگروباکتریوم × 100)، بدست آمد.

Table 2- Transformation Frequency of regenerated explants from wheat immature embryo using Agrobacterium-mediated transformation.

استفاده از آنتی‌بیوتیک کانامایسین به عنوان نشانگر انتخابی در محیط‌های کشت کالوس‌دهی و باززایی اثرات سوئی نظیر عدم شاخه‌زایی، عدم ریشه‌زایی و فراوانی بالای آلبینیسم را به همراه داشت. نتایج حاصل از این مشاهدات نشان دادند که آنتی‌بیوتیک کانامایسین به میزان 50 میلی‌گرم بر لیتر در محیط کالوس‌دهی و باززایی موجب عدم باززایی می‌شود. همچنین با استفاده از مقادیر 50 میلی‌گرم بر لیتر کانامایسین در محیط کالوس‌دهی و 25 میلی‌گرم بر لیتر در محیط باززایی، شاخه زایی به میزان بسیار کم دیده شد که این تعداد نیز پس از چند روز دچار رنگ‌پریدگی شده و در نهایت آلبینیسم را نشان دادند (شکل 2). با حذف کانامایسین از محیط‌ کالوس‌دهی و استفاده از غلظت 25 میلی‌گرم بر لیتر در محیط باززایی، شاخه‌زایی بطور بارز مشاهده شد اما ریشه‌زایی دیده نشد. گیاهچه‌های فوق نیز پس از مدتی دچار رنگ‌پریدگی شدند. با انتقال گیاهچه‌ها به محیط باززایی فاقد کانامایسین و حاوی 5/1 گرم در لیتر ذغال فعال، رنگ سبز گیاهچه‌ها مجددا پدیدار شد. ذغال فعال در محیط باززایی، علاوه بر جلوگیری از تولید ترکیبات فنولی که موجب عدم ریشه‌زایی می شوند، محیطی کم نور، مناسب با رشد ریشه را نیز فراهم می‌آورد (شکل 3- ج). از این رو، به منظورجلوگیری از تاثیر سوء آنتی‌بیوتیک کانامایسین بر باززایی ارقام آرتا، مغان، سایسون، گاسکوژن و نیز لاین A، کالوس‌های جنین‌زا که دارای ظاهری ترد و شکننده و رنگ کرم روشن بودند، در محیط کالوس‌دهی و باززایی فاقد کانامایسین قرار گرفتند. مراحل مختلف رشد گیاهچه تراریخته احتمالی در شکل 3 نشان داده شده است. هر 3 گیاهچه باززا شده، به واکنش زنجیره ای پلیمراز (شکل4، 5 و 6 ) و آزمون لکه‌گذاری DNA (شکل های 7 و 8) پاسخ مثبت نشان دادند و تراریزش آنها حداقل در وجود یک نسخه از هر کدام از ژن‌های کیتیناز، گلوکاناز و نئومایسین‌فسفو‌ترانسفراز تایید شد. آزمون لکه‌گذاری DNA، حضور ژن نئومایسین فسفوترانسفراز و پیشبر CaMV35S، رادر 3 گیاه تراریخته تایید کرد.

شکل 3- مراحل مختلف رشد گیاه تراریخته. الف) کالوس در ابتدای باززایی، ب) کالوس باززا شده، ج) گیاهچه باززا شده در شیشه، د) گیاهچه باززا شده در گلدان، ه) انتقال گیاهچه‌ها به گلخانه، ی) بذور تراریخته.

Figure 3- different stages of transgenic plant growth. (A) initial callus regeneration, (B) regenerated callus, (C) invitro regenerated explants, (D) regenerated explant in pot, (E) transferring explants to green house, (F) transgenic seeds.

شکل 4- واکنش زنجیره‌ای پلیمراز با استفاده از آغازگر‌های اختصاصی رو به جلو و رو به عقب ژنnptII  برای اثبات تراریختی رقم آرتا، M، نشانگر وزن ملکولی DNA (plus  1 Kb)، چاهک 1 پلاسمید (کنترل مثبت)، چاهک 2 گیاه شاهد، چاهک 3 گیاه تراریخته آرتا تلقیح شده با سویه LBA4404، چاهک 4 و 5 گیاهان تراریخته آرتا تلقیح شده با سویه C58، چاهک 6 نمونه آب (واکنش PCR بدون الگوی DNA).

Figure 4- PCR analysis using nptII gene forward and reverse specific primers for accuracy of Arta cultivar transformation, M : DNA molecular weigth (1 Kb plus) ladder, lane 1 : plasmid (positive control), lane 2 : control plant, lane 3 : Arta transgenic plant inoculated by LBA4404 strain, lane 4 and 5 : Arta transgenic plants inoculated by C58 strain, lane 6 : water sample (PCR reaction without DNA template).

شکل 5- واکنش زنجیره‌ای پلیمراز با استفاده از آغاز‌گر‌های اختصاصی رو به جلوی پیشبر CaMV 35S و رو به عقب ژن کیتیناز برای اثبات تراریختی رقم آرتا، M، نشانگر وزن ملکولی DNA ( 1 Kb)، چاهک 1 . پلاسمید (کنترل مثبت)، چاهک 2 . نمونه آب (واکنش PCR بدون الگوی DNA )، چاهک 3 و 4 . گیاهان تراریخته آرتا تلقیح شده با سویه C58، چاهک 5 . گیاه شاهد، چاهک 6 . گیاه تراریخته آرتا تلقیح شده با سویه LBA4404.

Figure 5- PCR analysis using CaMV 35S  forward and chitinase gene reverse primers for accuracy of Arta cultivar transformation, M : DNA molecular weigth (1 Kb) ladder, lane 1 : plasmid (positive control), lane 2 : water sample (PCR reaction without DNA template), lane 3 and 4 : Arta transgenic plants inoculated by C58 strain, lane 5 : control plant, lane 6 : Arta transgenic plant inoculated by LBA4404 strain.

شکل 6- واکنش زنجیره‌ای پلیمراز با استفاده از آغاز‌‌گر‌های اختصاصی رو به جلوی پیشبر CaMV 35S و رو به عقب ژن گلوکاناز برای اثبات تراریختی رقم آرتا، M، نشانگر وزن ملکولی DNA (1 Kb)، چاهک 1 پلاسمید (کنترل مثبت)، چاهک 2 نمونه آب (واکنش PCR بدون الگویDNA (، چاهک 3 و 4 گیاهان تراریخته آرتا تلقیح شده با سویه C58، چاهک 5 گیاه تراریخته آرتا تلقیح شده با سویه  LBA4404، چاهک 6 گیاه شاهد.

Figure 6- PCR analysis using CaMV 35S  forward and gluconase gene reverse primers for accuracy of Arta cultivar transformation, M : DNA molecular weigth (1 Kb) ladder, lane 1 : plasmid (positive control), lane 2 : water sample (PCR reaction without DNA template), lane 3 and 4 : Arta transgenic plants inoculated by C58 strain, lane 5 : Arta transgenic plant inoculated by LBA4404 strain, lane 6 : control plant.

شکل 7- آزمون لکه‌گذاری برای اثبات تراریختی گندم با استفاده از کاوشگر تهیه شده برای پیشبر CaMV35S. نمونه 1، 3 و 4 گیاهچه‌های تراریخت، نمونه 2 پلاسمید (کنترل مثبت)، نمونه 5 گیاه شاهد(کنترل منفی).

Figure 7- Dot blot analysis for accuracy of wheat transformation using synthesized prob of CaMV35S promoter, sample 1,3 and 4 : transgenic plants, sample 2 : plasmid (positive control), sample 5 : control plant (negative control).

شکل 8- آزمون لکه‌گذاری برای اثبات تراریختی گندم با استفاده از کاوشگر تهیه شده برای ژن نئومایسین فسفوترانسفراز. نمونه 1 گیاه شاهد(کنترل منفی)، نمونه 2، 3 و 4 گیاهچه‌های تراریخت، نمونه 5 پلاسمید (کنترل مثبت(

Figure 8- Dot blot analysis for accuracy of wheat transformation using synthesized prob of nptII gene, sample 1 : control plant (negative control), Sample 2 ,3 and 4 : transgenic plants, sample 5 : plasmid (positive control).

بحث

با وجود آنکه انتقال ژن به روش زیست‌پرتابی روشی موفق برای تراریزش ژنتیکی گندم بوده و بدون وجود هر گونه محدودیت بیولوژیکی یا محدودیت میزبانی، به طور رایج، برای تولید مفید ژرم پلاسم گندم تراریخت مورد استفاده قرار می‌گیرد، (Rakszegi  et al., 2001)، اما به علت ورود چندین نسخه از ژن خارجی گرایش بالا برای خاموشی ژن و در نتیجه کارایی کم تراریزش را به همراه دارد (Montemurro et al., 2008). در مقابل، استفاده از روش انتقال ژن به واسطه اگروباکتریوم مزایای متعددی از جمله، توانایی انتقال و الحاق قطعه DNA با بازآرایی کمتر درون ژنوم میزبان، ورود تعداد نسخه‌های کمتر و پایدار ژن خارجی، عدم حضور توالی‌های بدنه ناقل و نیز هزینه کمتر آزمایشات را در پی خواهد داشت، علاوه بر آن در تراریزش به واسطه اگروباکتریوم، DNA در صورت ورود به درون ناحیه فعال رونویسی، فعالیتی مطمئن از رونویسی و بیان ژن‌های خارجی را نشان می‌دهد. با این حال کاربرد این روش در مقیاس گسترده در ژنوتیپ‌های مختلف دارای محدودیت است (Patnaik  et al., 2006). فاکتور‌هایی مانند ژنوتیپ، سویه اگروباکتریوم، ریزنمونه، ناقل دوگانه، نشانگر انتخابی، پیشبر، شرایط و محیط‌های تلقیح و هم‌کشتی، تیمار‌های اسمزی، غلظت اگروباکتریوم، کشت بافت و محیط باززایی ممکن است بر سودمندی تراریزش و بهبود پایداری سلول‌های گیاهی، پس از آلوده‌سازی با اگروباکتریوم تاثیر بگذارند (Montemurro et al., 2008). با ارزیابی صفات (کالوس‌دهی، جنین‌زایی، شاخه‌زایی و ریشه‌زایی) در ارقام (سایسون، گاسکوژن، آرتا، مغان) و لاین A، مشاهده شد که ارقام بهاره در مقایسه با ارقام پائیزه، پس از تراریزش با اگروباکتریوم، عملکرد مناسب‌‌تری در جهت تراریختی از خود نشان می‌دهند. یکی از دلایل مهم که می‌توان به آن اشاره کرد، نوع ژنوتیپ است. همانطور که گفته شد، تراریزش با اگروباکتریوم به نوع ژنوتیپ‌ها و واریته‌های مورد آزمایش بستگی دارد و فقط تعداد محدودی از واریته‌ها تراریخته می‌شوند، که اساسا به علت تفاوت‌های زیاد در توانایی تولید کالوس و باززایی در میان واریته‌های گندم پس از آلوده‌سازی با اگروباکتریوم اتفاق می‌افتد (Machii  et al., 1998). در روش انتقال ژن به واسطه اگروباکتریوم، تراریزش حاصل تلفیق ژن خارجی در کروموزوم گیاه می‌باشد. به همین علت برای انتخاب کالوس‌های تراریخته احتمالی، از ژن‌های نشانگر انتخابی که به همراه ژن‌های هدف در ژنوم میزبان وارد می‌شوند، استفاده می شود. ژن نئومایسین فسفو‌ترانسفراز (nptII)، موجب مقاومت گیاه در برابر آنتی‌بیوتیک کانامایسین می‌شود، همچنین به دلیل اینکه این ژن همراه با ژن‌های کیتیناز و گلوکاناز بر روی پلاسمید قرار دارد، با انتخاب گیاه بر اساس مقاومت به این آنتی‌بیوتیک در محیط کشت، به طور غیر‌‌مستقیم نه با احتمال 100 درصد، گیاهانی که حاوی ژن‌های هدف می‌باشند، انتخاب می‌گردند. با این وجود در این تحقیق پس از اعمال آنتی‌بیوتیک کانامایسین در محیط‌های کشت کالوس‌دهی و باززایی، پدیده هایی نظیر عدم شاخه‌زایی، عدم ریشه‌زایی و آلبینیسم به میزان بالایی بیش از حد انتظار دیده شد. نتایج بدست آمده از مشاهدات این نکته را بیان داشت که آنتی‌بیوتیک کانامایسین حتی در مقادیر کم نیز موجب از بین رفتن سبزینه گیاه در ارقام فوق شده و از ریشه‌زایی آنها جلوگیری به عمل می‌آورد، از این‌رو بهتر است به جای کانامایسین از آنتی‌بیوتیک دیگری نظیر جنیتیسین استفاده کرد. در ادامه با حذف آنتی‌بیوتیک کانامایسین از محیط کشت باززایی، اکثریت کالوس‌های جنین‌زا به تدریج شاخه‌زایی، ریشه‌زایی و نیز باززایی را نشان دادند، سپس از طریق واکنش زنجیره‌ای پلیمراز و آنالیز لکه‌گذاری DNA تراریختی آن‌ها بررسی شد. نکته بسیار مهم دیگر در این تحقیق، وجود توالی‌هایی مشابه با ژن‌های کیتیناز و گلوکاناز در ژنوم گیاه شاهد است به همین علت استفاده از این ژن‌ها برای تشخیص تراریختی گیاه به دلیل دیده شدن باند مورد انتظار در واکنش زنجیره‌ای پلیمراز گیاه شاهد، با مشکل مواجه خواهد شد. استفاده از آغاز‌گر‌های طراحی شده نظیر توالی پیشبر، توالی پایانبر و نیز نشانگر انتخابی، به تنهایی و یا همراه با یکی از آغازگر‌های ژن‌های کیتیناز و گلوکاناز، به علت هم‌جواری با این ژن ها در ناحیه T-DNA و در نتیجه عدم حضور این توالی ها در ژنوم گیاه غیر‌تراریخت، اثبات تراریزش را ممکن خواهد ساخت. انتظار می‌رود گیاهان حاصل با دریافت دو ژن کد‌کننده پروتئین‌های ضد‌قارچی مقاومت پایداری را نسبت به بیماری‌های قارچی از خود نشان دهند. از این رو آنالیز‌های‌ بیشتری برای اثبات حضور و بیان ژن‌های وارد شده و نیز آزمایشات زیست‌سنجی جهت اثبات مقاومت به بیماری‌های قارچی و در نهایت آنالیز نسل‌های تراریخته برای اثبات پایداری ژن در آینده مورد نیاز خواهد بود.