Document Type : Research Paper
Authors
1 Institute of Biotechnology, Shiraz University
2 Associate Professor, Institute of Biotechnology, Faculty of Agriculture, Shiraz University, Shiraz, Iran.
Abstract
Keywords
تاثیر نانوامولسیون صمغ زدو- اسانس آویشن شیرازی در مهار رادیکالهای آزاد خارج سلولی و بیان ژن NAD (P) H oxidase در گندم
فاطمه سهرابی*1، غلامرضا کاووسی2
1دانشجوی کارشناسی ارشد بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شیراز، شیراز، ایران.
2دانشیار پژوهشکده بیوتکنولوژی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شیراز، شیراز، ایران.
تاریخ دریافت: 27/01/1397، تاریخ پذیرش: 05/06/1397
چکیده
تولید گونههای فعال اکسیژن به خصوص پراکسید هیدروژن امری اجتناب ناپذیر در متابولیسم هوازی است. از آنجا که این ترکیبات در غلظتهای متفاوت، بر فرآیندهای گوناگونی در سلول موثر هستند و افزایش بیش از حد آنها به تنشهای اکسیدی منجر میشود، کنترل غلظت آنها امری ضروری به نظر میرسد. در این پژوهش از اسانس آویشن شیرازی با ترکیبات فنولی (تیمول، کارواکرول) فراوان و پلیمر صمغ زدو به منظور کپسوله سازی و تولید نانوامولسیون استفاده گردید. تاثیر نانوامولسیون صمغ زدو- اسانس آویشن شیرازی در مهار رادیکالهای آزاد 2،2-آزینوبیس-(3-اتیلبنزوتیازولین-6-سولفونیک اسید (ABTS: 2,2-azinobis-3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonic acid) و پراکسیدهیدروژن در خارج از سلول و بیان ژن (NOX: NAD(P)H oxidase) با شماره دسترسی AY561153 (بزرگترین تولید کننده گونههای فعال اکسیژن) مورد بررسی قرار گرفت. نانوامولسیون با محتوای فنول 88 میلیگرم در گرم، توانایی بالایی در مهار رادیکالهای آزاد ABTS و پراکسید هیدروژن از خود نشان داد. از طرفی نانوامولسیون در غلظتهای 25 و 50 میکروگرم در میلیلیتر موجب افزایش و در غلظتهای 100، 150 و 200 میکروگرم در میلیلیتر موجب کاهش بیان ژن NOX گردید. با توجه به نتایج به نظر میرسد نانوامولسیون در غلظتهای متفاوت بر گونههای فعال اکسیژن تاثیر داشته و در نتیجه توانایی کنترل تنشهای اکسیدی را دارا است.
واژههای کلیدی: گونههای فعال اکسیژن، آویشن شیرازی، صمغ زدو، ژن .NAD(P)H oxidase
مقدمه
تولید گونههای فعال اکسیژن (Reactive oxygen species ROS:) امری اجتناب ناپذیر از متابولیسم هوازی است. این ترکیبات توسط میتوکندری، کلروپلاست، پراکسیزوم و آنزیمهای NAD (P) H oxidase تولید میشوند. در این میان آنزیمهای خانواده NOX، واقع در غشای سلولی، به دلیل این که بزرگترین تولیدکنندگان گونههای فعال اکسیژن هستند، نقش اساسی را در پاسخهای ایمنی گیاه بازی میکنند. آنها آنیون سوپراکسید را با انتقال الکترون از NAD (P) H به اکسیژن مولکولی تولید مینمایند ( Sagi and Fluhr, 2006 ). گونههای فعال در سطح فیزیولوژیکی به عنوان مولکولهای پیامرسان در بسیاری از فعالیتهای سلولی عمل میکنند اما در غلظتهای بالا، صدمات جبران ناپذیری را به ماکرومولکولهای زیستی وارد کرده و تنش اکسیدی و مرگ سلول را موجب میشوند (Nawkar et al., 2013). گیاهان حاوی مجموعهای از سیستمهای دفاع آنتیاکسیدانی آنزیمی (سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز و پراکسیدازها) و غیرآنزیمی (اسید آسکوربیک، فنول، فلاونوئید و... ) هستند (Zagorchev et al., 2013). بنابراین جهت کنترل گونههای فعال در حد فیزیولوژیک و مقابله با تنشهای اکسیدی، تقویت قدرت آنتیاکسیدانی سلول از یک سو و کنترل آنزیمهای تولید کننده گونههای فعال اکسیژن از سوی دیگر امری ضروری به نظر میرسد. در این میان گیاهان دارویی مانند آویشن شیرازی (Zataria multiflora) از خانواده نعناعیان با داشتن ترکیبات فراوان فنولی مانند تیمول و کارواکرول با خواص ضد میکروبی، ضد قارچی و آنتیاکسیدانی ویژه، بسیار مورد توجه هستند (Kavoosi and Rabiei, 2015). تیمول و کارواکرول مونوترپنهای فنولی با گروههای عملکردی متیل و ایزوپروپیل در موقعیت پارا نسبت به یکدیگر هستند. تفاوت این دو تنها به دلیل اختلاف موقعیت گروه هیدروکسیل در حلقه فنولی است. ترکیبات فنولی از طریق گروه هیدروکسیل آزاد روی حلقه آروماتیک عمل آنتی اکسیدانی خود را انجام میدهند. فعالیت آنتی اکسیدانی آنها به تعداد گروههای هیدروکسیل موجود وابسته است (Berger, 2007). با وجود مزایای مختلف، اسانس گیاهان دارویی دارای محدودیتهایی از جمله ناپایداری، تبخیر و فرار بودن هستند. تولید نانوامولسیونهایی از اسانس گیاهان دارویی و پلیمرهای زیستی مانند صمغ زدو در برطرف ساختن این نواقص بسیار مفید میباشد. زدو، صمغی (گروهی از پلی ساکاریدها) اسـت شـفاف، به سه رنگ سفید، زرد و قرمز کـه از درخت بـادامکـوهی (Amygdalus scoparia) تراوش میشود. ایـن صـمغ که بـه نامهای صمغ فارسی و شیرازی نیز معـروف اسـت جهت کپسوله سازی، امولسیون کننـدگی، بهبود و پایداری بافت در صنایع غذایی کاربرد دارد (Persin et al., 2011). در این پژوهش از یک سو محتوای فنول و توانایی مهار رادیکالهای آزاد 2،2-آزینوبیس-(3-اتیلبنزوتیازولین-6-سولفونیک اسید (ABTS: 2,2-azinobis-3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonic acid) و پراکسید هیدروژن نانوامولسیون صمغ زدو- اسانس آویشن شیرازی (Zedo-ZMO) در خارج از سلول و از سوی دیگر تاثیر این نانوامولسیون را در غلظتهای مختلف بر بیان ژن NAD (P) H oxidase (بزرگترین تولیدکننده گونههای فعال اکسیژن) بررسی قرار داده شد.
مواد و روشها
صمغ زدو از درخت بادام کوهی در اطراف شهرستانهای مرودشت و ارسنجان (استان فارس) جمع آوری شد. نمونههای حاصل با کمک آسیاب (ناسیونال) پودر شده و از الک 1/0 سانتیمتر عبور داده تا پودر ریز و یکنواختی به دست آید. جهت آماده سازی نانوامولسیون صمغ زدو، یک گرم از پودر را در 80 میلی لیتر آب مقطر در دمای 50 درجه سانتیگراد حل کرده بعد از سونیکه شدن با امواج مافوق صوت (140 وات) در دمای 30 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه، به نانوامولسیون تولیدی 100 میلیگرم سورفاکتانت پلیزوربات 20 (Polysorbate 20, Sigma) اضافه و در پایان در دمای 40 درجه سانتیگراد، حجم محلول با آب مقطر به 100 میلیلیتر رسانده شد. بخشهای هوایی آویشن شیرازی را از اطراف شهرستان ارسنجان (استان فارس) تهیه، اسانس گیری از برگها به روش تقطیر آبی با دستگاه کلونجر (Clevenger, Herbal Exir Co., Mashhad, Iran ) به مدت 3 ساعت صورت گرفت. اسانسها با سولفات سدیم بدون آب خشک و در دمای 5 درجه سانتىگراد در شیشههای تیره رنگ که با فویل آلومینیومی پوشیده شده بود، نگهداری شدند. به نانوامولسیون صمغ زدو یک میلیلیتر اسانس آویشن، 100 میلیگرم پلیزوربات 20 اضافه و در پایان در دمای 40 درجه سانتیگراد، حجم محلول با آب مقطر به 100 میلیلیتر رسانیده شد. نانوامولسیون حاصله تحت نام Zedo-ZMO در دمای 4 درجه نگهداری شد (El Asbahani et al., 2015). در این آزمایش هر میلی لیتر اسانس معادل یک گرم در نظر گرفته شد. هرچند که اعتقاد بر این است که معیار نمی باشد. از آنجا که برای تهیه نانوامولسیون صمغ زدو-اسانس آویشن، یک میلیلیتر معادل یک گرم اسانس استفاده شد، بنابراین غلظت نهایی نانوامولسیون (استوک) معادل یک درصد یا 10 میلی گرم در میلیلیتر بود. بنابراین استوک را با آب مقطر رقیق کرده تا غلظتهای مختلف 25، 50، 100، 150 و 200 میکروگرم در میلیلیتر حاصل شوند.
میزان محتوای فنول در نانوامولسیون براساس روش رنگ سنجی فولین– سیوکالتو (Folin-ciocalteu) و استاندارد گالیک اسید انجام شد. 200 میکرولیتر از نانوامولسیون یک درصد یا استاندارد گالیک اسید (500- 0 میکروگرم در میلیلیتر گالیک اسید در آب مقطر) به یک میلیلیتر معرف فولین سیوکالتو (10درصد) افزوده، به مدت پنج دقیقه در دمای اتاق شیک و سپس 300 میکرولیتر کربنات سدیم (10درصد) به آنها اضافه و جذب در طول موج 765 نانومتر با اسپکتروفتومتر (Spectrophotometer, UV/Vis 2150) خوانده شد (Marinova et al., 2005).
20 میکرولیتر از نانوامولسیون یا استاندارد گالیک اسید به 1میلیلیتر از محلول رادیکال ABTS (7میلی مولار ABTS، 54/2 میلیمولار پرسولفات پتاسیم) به رنگ سبز-آبی افزوده و جذب نانوامولسیون در طول موج 734 نانومتر با اسپکتروفتومتر خوانده شد. درصد مهار ABTS با استفاده از فرمول زیر محاسبه میشود:
100 × A734ABTS – A734Test) /A734ABTS])] =
=A734ABTSجذب محلول ABTS در 734 نانومتر، =A734Testجذب محلول ABTS در حضور نانوامولسیون و یا استاندارد گالیک اسید است. غلظتی از نانوامولسیون که 50 % رادیکالهای ABTS را مهار میکند (IC50: 50% Inhibitory concentration) بر اساس نمودار درصد مهار در برابر غلظتهای مختلف آنتی اکسیدان محاسبه شد (Re et al., 1999).
جهت تعیین فعالیت مهار کنندگی رادیکال پراکسید هیدروژن توسط نانوامولسیون، 20میکرولیتر نانوامولسیون را با یک میلیلیتر از محلول پراکسید هیدروژن (50 میلیمولار در 100 میلیمولار بافر فسفات با 4/7pH=) در 37 درجه سانتیگراد به مدت 60 دقیقه انکوبه، سپس جذب نانوامولسیون و محلول پراکسید هیدروژن بدون آنتیاکسیدان در طول موج 230 نانومتر با اسپکتروفتومتر خوانده شد. درصد مهار به صورت زیر محاسبه شد:
100 × A230blank – A230test) /A230blank])]=
A230blank= جذب محلول پراکسید هیدروژن بدون نانوامولسیون، =A230test جذب محلول حاوی نانوامولسیون و یا استاندارد گالیک اسید است. IC50واکنش نیز محاسبه شد (Kavoosi et al., 2012). بذرهای گندم رقم سیروان از مرکز تحقیقات کشاورزی استان فارس تهیه، پس از ضد عفونی در اتاقک کشت تحت شرایط 16/8 روشنایی/تاریکی، دمای روز/شب 27/24 درجه سانتیگراد و رطوبت نسبی 60 درصد به مدت 14 روز کشت شدند. وقتی طول برگها به 10 سانتیمتر رسید، گیاهان به مدت سه روز با 100 میلیلیتر از غلظتهای 25، 50، 100، 150 و 200 میکروگرم در میلیلیتر نانوامولسیون Zedo-ZMO تیمار و غلظت یک درصد از نانوامولسیون صمغ زدو نیز به عنوان شاهد استفاده شد. پس از گذشت 24 ساعت، برگهای گندم جهت استخراج RNA و بررسی بیان ژن NOX برداشت و در نیتروژن مایع در دمای 80- درجه سانتیگراد نگهداری شدند. با استفاده از کیت شرکت دنا زیست، RNA از بافت برگی استخراج شد. کمیت RNA با استفاده از نانودراپ ND1000 (DE, USA Themo Fisher Scientcec, Wilmington) در طول موج 260 نانومتر و کیفیت آن روی ژل آگارز یک درصد بررسی شد (شکل 1). جهت حذف DNA ژنومی از آنزیم DAase1 (Thermo Fisher) استفاده و سنتز cDNA Thermo Fisher)) بر اساس دستورالعمل انجام گرفت. بررسی بیان ژن NOX با استفاده از دستگاه ترموسایکلر (Line- gene K) و کیت SYBR Premix Ex Taq TM II، (Taraka, Japan) انجام شد. ترکیب واکنش Real time PCR شامل5 میکرولیتر cDNA 5 بار رقیق شده، 10 میکرولیتر 1× QuantiFast SYBER Green PCR Master mix (حاوی SYBER Green، Taq DNA پلیمراز و بافر PCR)، آغازگرهای رفت و برگشت هرکدام 6/0 میکرولیتر و آب عاری از نوکلئاز 8/3 میکرولیتر در حجم نهایی 20 میکرولیتر فراهم گردید. واکنش PCR مطایق دستورالعمل کیت شامل مرحله واسرشت سازی اولیه در 94 درجه سانتیگراد (15 دقیقه)، به دنبال آن40 چرخه شامل واسرشت سازی در 94 درجه سانتیگراد (10 ثانیه)، اتصال در 58 درجه سانتیگراد (10 ثانیه)، توسعه در 72 درجه سانتیگراد (30 ثانیه) انجام شد. جهت اطمینان از صحت تکثیر محصولات PCR چرخههای منحنی ذوب در دمای 90-50 درجه سانتیگراد با اختلاف 5/0 درجه سانتیگراد در هر چرخه اجرا شد. محصولات تکثیر Real time PCR روی ژل آگارز بارگذاری شد تا وجود باند صحیح تایید شود (شکل 2). به منظور استاندار نمودن دادهها از ژن کنترل داخلی 18S rRNA استفاده شد. آغازگرهای مورد استفاده در (جدول 1) توسط نرم افزار AlleleID7 برای ژن هدف NOX و ژن کنترل داخلی 18S rRNA به ترتیب با شماره دسترسی (AY561153 ، Aj272181) در گندم طراحی شدند (Teoh et al., 2013) و سپس نرخ بیان نسبی ژن NOX در حالت تیمار با غلظتهای 25، 50، 100، 150 و 200 میکروگرم در میلیلیتر نانوامولسیون صمغ زدو-اسانس آویشن نسبت به حالت کنترل (غلظت یک درصد از نانوامولسیون صمغ زدو) با استفاده از فرمول 2-[∆CTsample - ∆CTcontrol] محاسبه شد (Livak and Schmittgen, 2001). آزمایش در قالب طرح کاملاً تصادفی و با سه تکرار انجام و میانگینها با استفاده از روش (LSD) در سطح 5 درصد مقایسه شدند.
نتایج و بحث
سنجش محتوای فنول کل نانوامولسیون نشان میدهد که صمغ زدو هیچ ترکیب فنولی نداشته اما اسانس آویشن شیرازی دارای 2 ± 88 میلیگرم در گرم مواد پلی فنولی بود.
شکل 1- بررسی کیفیت RNA روی ژل آگارز 1%.
Figure 1- Evaluation of RNA quality on agarose gel 1%.
شکل2- بررسی محصول Real time Pcr روی ژل آگارز 1%.
Figure 2- Evaluation of Real time Pcr production on agarose gel 1%.
جدول 1- آغازگرهای استفاده شده در واکنش .Real time PCR
Table 1- Primers in Real time PCR reaction.
|
نام ژن Gene name |
شماره دسترسی Accession number |
رفت و برگشت Forward/Reverse |
توالی پرایمر Sequence of Primers |
|
NOX |
AY561153 |
Forwardرفت |
ACAGATTTGAATTGCATTGGCGA |
|
NOX |
AY561153 |
Reverse برگشت |
GCAGATTTCCCAACATTTGCTGA |
|
18S |
Aj272181 |
Forwardرفت |
CGCTCCTACCGATTGAATGG |
|
rRNA |
Aj272181 |
Reverseبرگشت |
CCTTGTTACGACTTCTGCTTCC |
میزان فنول در این نانوامولسیون به دلیل مونوترپنهای حلقوی نظیر تیمول و کارواکرول است (Lee et al., 2005).
صمغ زدو هیچ گونه فعالیت آنتیاکسیدانی نداشته است و توانایی مهار رادیکال ABTS توسط نانوامولسیون با 32 = IC50 میلیگرم در میلیلیتر، امری وابسته به غلظت است. اضافه کردن آنتیاکسیدانها به کاتیون ABTS موجب کاهش آن به ABTS غیررادیکالی در نتیجه کاهش جذب در 734 نانومتر میشود (جدول 2). کاهش جذب در 734 نانومتر به طور مستقیم مربوط به حضور ترکیبات فنولی در گیاهان دارویی است (Huang et al., 2010). مطالعات فراوانی همبستگی مثبتی میان مونوترپنهای فنولی، تیمول، کارواکرول، فلاونوئیدها، ترکیبات آلکالوئیدی و مهار رادیکال ABTS را نشان میدهند (Huang et al., 2010; Karimian et al., 2012).
صمغ زدو هیچ گونه فعالیت آنتیاکسیدانی نداشته و توانایی مهار رادیکال پراکسید هیدروژن توسط نانوامولسیون با 70 = IC50 میلیگرم در میلیلیتر، امری وابسته به غلظت است (جدول 3). توانایی مهار پراکسید هیدروژن، توسط ترکیبات مونوترپن فنولی، توسط سایر پژوهشها مورد تایید قرار گرفته است (Katalinic et al., 2006; Huang et al., 2011).
جدول 2- غلظتموثر نانوامولسیون صمغ زدو، صمغ زدو- اسانس آویشنشیرازی در مهار رادیکالهای .ABTS
Table 2- Effective concentration of zedo gum, zedo gum- Zataria multiflora essential (ZMEO) nanoemulsion for inhibition of ABTS radicals.
|
پارامترهای آنتی اکسیدان Antioxidan parameters |
صمغ زدو Zedo gum |
صمغ زدو-اسانس آویشن شیرازی Zedo-ZMEO |
|
IC50 (µg/mL) |
- |
32 ± 1.5 |
|
شاخص آنتی اکسیدانی Antioxidant index |
- |
31 ± 2.5 |
|
معادل گالیک اسید Galic acid equivalent (µg/µg) |
- |
0.093 ± 0.007 |
دادهها به صورت میانگین ± انحراف معیار با حداقل سه تکرار مستقل بیان شده اند. (IC50)، غلظتیاز نانوامولسیون است که 50 % رادیکالهایABTS را مهار میکند. شاخص آنتی اکسیدان با تقسیم 1000 به IC50 محاسبه میشود. اکیوالان (معادل) گالیک اسید از طریق تقسیم IC50 مهار رادیکال ABTS مربوط به گالیک اسید بر IC50مهار رادیکال ABTS مربوط به آنتی اکسیدانهای آزمایش شده محاسبه میشود.
Data represent mean ± standard deviation from at least three sets of independent repeats. (IC50), The concentrations of nanoemulsion that were inhibited 50% ABTS radicals. Antioxidant index was calculated by dividing 1000 to IC50. Galic acids equivalents were calculated by dividing IC50 of galic acid for ABTS•inhibition to IC50 of tested antioxidant for inhibition of ABTS• radical.
پراکسید هیدروژن با وجود این که، رادیکال آزاد نیست، توسط واکنشهای فنتون و هابر-وایز به رادیکال هیدروکسیل (از خطرناکترین رادیکالهای آزاد) تبدیل میشود (Fenton,1894; Haber and Weiss, 1934). بنابراین مهار پراکسید هیدروژن جهت کنترل تنش اکسیدی امری لازم به نظر میرسد.
با توجه به (شکل 3)، اثر غلظتهای گوناگون نانوامولسیون صمغ زدو- اسانس آویشن بر بیان ژن NOX در سطح پنج درصد معنی دار بود. بیان ژن NOX در غلظت 25 میکروگرم در میلیلیتر روندی افزایشی داشته و در غلظت 50 به حداکثر خود رسیده است. از غلظت 100 بیان کاهش یافته تا جایی که در غلظتهای 150 و 200 بیان ژن به کمتر از حالت قبل از تیمار رسید.
جدول 3- غلظتموثر نانوامولسیون صمغ زدو، صمغ زدو-اسانس آویشن شیرازی در مهار رادیکالهای پراکسیدهیدروژن.
Table 3- Effective concentration of zedo gum, zedo- Zataria multiflora essential oil (ZMEO) nanoemulsion for inhibition of hydrogen peroxide radicals.
|
پارامترهای آنتی اکسیدان Antioxidan parameters |
صمغ زدو Zedo |
صمغ زدو-اسانس آویشن شیرازی Zedo-ZMEO |
|
|
IC50 (µg/mL) |
- |
70 ± 5 |
|
|
شاخص آنتی اکسیدانی Antioxidant index |
- |
14.5 ±2.7 |
|
|
معادل گالیک اسید Galic acid equivalent (µg/µg) |
- |
0.114 ± 0.009 |
|
دادهها به صورت میانگین ± انحراف معیار با حداقل سه تکرار مستقل بیان شده اند. (IC50)، غلظتی از نانوامولسیون است که 50 % رادیکالهای پراکسید هیدروژن را مهار میکند. شاخص آنتی اکسیدان با تقسیم 1000 به IC50 محاسبه میشود. اکیوالان (معادل) گالیک اسید از طریق تقسیم IC50 مهار رادیکال پراکسید هیدروژن مربوط به گالیک اسید بر IC50مهار رادیکال پراکسید هیدروژن مربوط به آنتی اکسیدان آزمایش شده محاسبه میشود.
Data represent mean ± standard deviation from at least three sets of independent repeats. (IC50), The concentrations of nanoemulsion that were inhibited 50% hydrogen peroxide radicals. Antioxidant index was calculated by dividing 1000 to IC50. Galic acids equivalents were calculated by dividing IC50 of galic acid for hydrogen peroxide inhibition to IC50 of tested antioxidant for inhibition of hydrogen peroxide.
شکل 3- تاثیر غلظتهایمختلف (0، 25، 100، 150 و 200 میکروگرم در میلیلیتر) نانوامولسیون صمغ زدو- اسانس آویشن شیرازی بر بیان ژن NOX.
Figure 3- Effect of different concentrations (0, 25, 100, 150 and 200 µg/ml) of zedo- ZMO nanoemulsion on expression of NOX gene.
با توجه به نتایج، تاثیر نانوامولسیون صمغ زدو- اسانس آویشن بر بیان ژن NOX امری وابسته به غلظت است. جهت تعیین چگونگی تاثیر نانوامولسیون صمغ زدو- اسانس آویشن بر ژنهای خانواده NOX در ابتدا باید به چگونگی تنظیم ژنهای این خانواده توجه کرد. بر همکنش میان ژنهای NOX و مولکولهای پیام رسان، جهت فعال سازی این ژنها به دو روش وابسته به فسفریلاسیون و مستقل از فسفریلاسیون که هر دو با همکاری یکدیگر در تنظیم فعالیت ژن NOX در گیاه موثر هستند صورت میپذیرد (Mersmann et al., 2010). افزایش بیان ژن NOX در غلظتهای کم نانوامولسیون صمغ زدو-اسانس آویشن شیرازی را میتوان به تیمول (از مهمترین اجزای تشکیل دهنده اسانس) نسبت داد. تیمول در غلظتهای اندک با تاثیر بر افزایش نفوذ پذیری غشای سلولی به یون کلسیم، آزاد سازی کلسیم از فسفولیپاز C و کانالهای کلسیم موجب افزایش محتوای کلسیم درون سلولی میشود. کلسیم با فعال سازی پروتئینهای کیناز وابسته به کلسیم CDPKs (calcium-dependent protein kinases) و CBL (Calcineurin B-like) و کالمودولین CaM (calmodulin) ژن NOX را به صورت مستقیم فسفریله و فعال میکند و یا با اتصال مستقیم به صورت مستقل از فسفریلاسیون به EF-Hand در انتهای آمین ژن NOX، در افزایش بیان ژن دخیل است (Mersmann et al., 2010). کاهش بیان ژن در غلظتهای 100، 150 و 200 را میتوان به چند دلیل دانست. از طرفی مواد فعال گیاهی مانند تیمول و کارواکرول دارای نقشی دو گانه هستند، به این صورت که این ترکیبات در غلظتهای پایین اثرات مفید دارویی و در غلظتهای بالاتر اثرات سمی از خود نشان میدهند. آنها با تخریب غشای سلولی از فعالیت آنزیم NOX جلوگیری میکنند. ترکیبات فنولی گیاهان دارویی در غلظتهای بالا اکسید شده و تولید رادیکالهای فنوکسیل میکنند. این رادیکالها مانند سایر گونههای فعال اکسیژن و نیتروژن دارای اثرات سمی هستند (Mersmann et al., 2010). از طرف دیگر پروموتر ژن NOX دارای عناصر پاسخ دهنده به بسیاری از هورمونها از جمله اتیلن، آبسزیک اسید و سالسیلیک اسید است. این کاهش بیان میتواند به دلیل تاثیر پراکسید هیدروژن تولیدی و تجمع یافته، بر روی هورمونهای گیاهی از جمله آبسیزیک اسید، به منظور کاهش بیان آنزیم و جلوگیری از تنش اکسیدی و پیامدهای آن صورت پذیرد (Belkadhi et al., 2015).
از آنجا که گونههای فعال اکسیژن به ویژه پراکسید هیدروژن (به دلیل اندازه کوچک و قدرت انتشار بالا) در سلول مانند شمشیری دو لبه در غلظتهای پایین مانند مولکولهای پیام رسان در فرایندهای رشدی، ایمنی و در غلظتهای بالا در آسیب به ماکرو مولکولهای سلولی موثر هستند، کنترل آنها امری ضروری به نظر میرسد. نتایج نشان میدهند که نانوامولسیونهای صمغ زدو- اسانس آویشن شیرازی با ترکیبات مونوترپن حلقوی (تیمول و کارواکرول)، دارای خواص بالقوه جهت مهار رادیکالهای آزاد (ABTS، پراکسیدهیدروژن) هستند، همچنین توانایی تغییر بیان ژن NOX را در غلظتهای متفاوت دارند. در نتیجه ما میتوانیم از آن به عنوان آنتیاکسیدانی طبیعی جهت مهار تنش اکسیدی بهره جوییم. با این حال، تعیین غلطت مناسب و موثر نانوامولسیون صمغ زدو-اسانس آویشن جهت کنترل تنشهای اکسیدی، نیازمند بررسی تاثیر این نانوامولسیون بر آنزیمهای سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز، پراکسیدازها (آسکوربات پراکسیداز، گلوتاتیون پراکسیداز و...) که در تولید و مهار گونههای فعال اکسیژن دخیل هستند میباشد.
منابع
Belkadhi A, De Haro A, Obregon S, Chaibi W, Djebali W (2015). Positive effects of salicylic acid pretreatment on the composition of flax plastidial membrane lipids under cadmium stress. Environmental Science and Pollution Research 22: 1457-1467.
Berger RG (2007). Flavours and Fragrances: Chemistry, Bioprocessing and Sustainability. Springer Science & Business Media, Berlin, Germany.
El Asbahani A, Miladi K, Badri W, Sala M, Addi EA, Casabianca H, El Mousadik A, Hartmann D, Jilale A, Renaud FN, Elaissari A (2015). Essential oils: from extraction to encapsulation. International Journal of Pharmaceutics 483: 220-243.
Fenton HJH (1894). LXXIII. -Oxidation of tartaric acid in presence of iron. Journal of the Chemical Society, Transactions 65: 899-910.
Haber F, Weiss J (1934). The catalytic decomposition of hydrogen peroxide by iron salts. Proc. R. Soc. Lond. A 147: 332-351.
Huang CC, Wang HF, Chen CH, Chen YJ, Yih KH (2010). A study of four antioxidant activities and major chemical component analyses of twenty-five commonly used essential oils. Journal of Cosmetic Science 62: 393-404.
Huang S, Tsai Y, Chen C (2011). Effects of wheat fiber, oat fiber, and inulin on sensory and physico-chemical properties of chinese-style sausages. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences 24: 875-880.
Karimian P, Kavoosi G, Saharkhiz MJ (2012). Antioxidant, nitric oxide scavenging and malondialdehyde scavenging activities of essential oils from different chemotypes of Zataria multiflora. Natural product research 26: 2144-2147.
Katalinic V, Milos M, Kulisic T, Jukic M (2006). Screening of 70 medicinal plant extracts for antioxidant capacity and total phenols. Food Chemistry 94: 550-557.
Kavoosi G, Rabiei F (2015). Zataria multiflora, chemical and biological diversity in the essential oil. Journal of Essential Oil Research 27: 428-436.
Kavoosi G, Teixeira da Silva JA, Saharkhiz MJ (2012). Inhibitory effects of Zataria multiflora essential oil and its main components on nitric oxide and hydrogen peroxide production in lipopolysaccharide stimulated macrophages. Journal of Pharmacy and Pharmacology 64: 1491-1500.
Lee SJ, Umano K, Shibamoto T, Lee KG (2005). Identification of volatitle components in basil (Ocimum basilicum L.) and thyme leaves (Thymus vulgaris L.) and their antioxidant properties. Food Chemistry 91: 131 –137.
Livak KJ, Schmittgen TD (2001). Analysis of relative gene expression data using real Time Quantitative PCR and the 2-ΔΔCTmethod. Methods 25: 402-408.
Marinova D, Ribarova F, Atanassova M (2005). Total phenolics and total flavonoids in Bulgarian fruits and vegetables. Journal of the University of Chemical Technology and Metallurgy 40: 255-260.
Mersmann S, Bourdais G, Rietz S, Robatzek S (2010). Ethylene signaling regulates accumulation of the FLS2 receptor and is required for the oxidative burst contributing to plant immunity. Plant Physiology 154: 391-400.
Nawkar GM, Maibam P, Park JH, Sahi VP, Lee SY, Kang CH (2013). UV-induced cell death in plants. International Journal of Molecular Sciences 14: 1608-1628.
Persin Z, Stana-Kleinschek K, Foster TJ, Van Dam JE, Boeriu CG, Navard P (2011). Challenges and opportunities in polysaccharides research and technology: The EPNOE views for the next decade in the areas of materials, food and health care. Carbohydrate Polymers 84: 22-32.
Re R, Pellegrini N, Proteggente A, Pannala A, Yang M, Evans C (1999). Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Radical Biology and Medicine 26: 1231-1237.
Sagi M, Fluhr R (2006). Production of reactive oxygen species by plant NADPH oxidases. Plant Physiology 141: 336-340.
Teoh KT, Requesens DV, Devaiah SP, Johnson D, Huang X, Howard JA, Hood EE (2013). Transcriptome analysis of embryo maturation in maize. BMC Plant Biology 13: 19-24.
Zagorchev L, Seal CE, Kranner I, Odjakova M (2013). A central role for thiols in plant tolerance to abiotic stress. International Journal of Molecular Sciences 14: 7405-7432.
Effect of zedo gum - Zataria multiflora essential oil nanoemulsion in the inhibition of free radical intercellular and expression of the NAD(P)H oxidase gene in wheat
Sohrabi F.1*, Kavoosi Gh.R.2
1M.Sc. Student, Institute of Biotechnology, Faculty of Agriculture, Shiraz University, Shiraz, Iran.
2Associate Professor, Institute of Biotechnology, Faculty of Agriculture, Shiraz University, Shiraz, Iran.
Abstract
The production of reactive oxygen species, such as hydrogen peroxide is inevitable in aerobic metabolism. Since, these compounds are effective at different concentration in a variety of processes in the cell and their excessive production lead to oxidative stresses, Therefore, their concentration must be controlled. In this study, Zataria multiflora essential oil with abundant phenolic compounds (thymol, carvacrol), and zedo gum polymers were used to encapsulate nanoemulsion production. The effect of zedo gum - Zataria multiflora essential oil nanoemulsion were investigated in the inhibition of ABTS (2,2-azinobis-3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonic acid), hydrogen peroxide free radicals intercellular and expression of the (NOX:NAD(P)H oxidase) gene with accession number AY561153 (the largest producer of reactive oxygen species). Nanoemulsion with 88 mg/gr phenol content showed a high ability to inhibit the free radical ABTS and hydrogen peroxide. On the other hand, at concentration of 25 and 50 µg/ml increased the expression of NOX and at concentration of 100, 150 and 200 µg/ml decreased it. Our results showed that, different concentration of nanoemulsion have different effect on reactive oxygen species and, therefore, they have the ability to control oxidative stresses.
Keywords: Reactive oxygen species, Zataria multiflora, zedo gum, NAD(P)H oxidase gene.
)
