Amplification of Filia, a Bovine GC Rich Gene, by Optimization of Primer Design

تکثیر ژن فیلیای گاوی غنی از GC به کمک بهینه سازی طراحی آغازگر

آزاده زحمت­کش*¹، سعید انصاری مهیاری²، مرتضی دلیری جوپاری³، حمیدرضا رحمانی⁴، ابوالفضل شیرازی⁵

¹دانشجوی دکتری گروه علوم دامی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه صنعتی اصفهان.

 ²استادیار گروه علوم دامی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه صنعتی اصفهان.

³ استادیار گروه زیست­فناوری دامی، پژوهشکده زیست­فناوری کشاورزی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست­فناوری، تهران.

⁴استاد گروه علوم دامی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه صنعتی اصفهان.

⁵استاد پژوهشکده بیوتکنولوژی تولیدمثل، پژوهشگاه فناوری‌های نوین علوم زیستی جهاد دانشگاهی- ابن‌سینا، دانشگاه شهید بهشتی، تهران.

تاریخ دریافت: 20/12/1392، تاریخ پذیرش: 06/12/1393

چکیده

فیلیا ژنی با اثرات مادری است و اختلال در کارکرد آن در موش منجر به کاهش باروری، و در انسان باعث سقط جنین می­گردد. بررسی توالی رونوشت فیلیا در گاو در NCBI نشان می­دهد که نسبت به اورتولوگ انسان و موش دارای درصد GC بالاتری است. این امر منجر به اختلال در تکثیر ژن در طی سیکل تکثیر PCR می­گردد. مطالعه­ی حاضر به­منظور بررسی امکان تکثیر بخشی از رونوشت فیلیای گاوی با درصد بالای GC با بهینه سازی در طراحی آغازگر به اجرا درآمد. آغازگرها برای دو قطعه­ی 443 و 230 جفت بازی از ژن مذکور طراحی شد به­صورتی که فقط برای قطعه­ی اول، دو شرط دمای ذوب بالا و اختلاف اندک دمای ذوب آغازگرها در نظر گرفته شد. بررسی بیوانفورماتیک از نظر وضعیت GC و ساختارهای ثانویه­ی احتمالی این قطعات صورت گرفت. استخراج RNA از تخمک­های جداشده از تخمدان­های گاوی انجام گرفت. پس از واکنش رونویسی معکوس، واکنش PCR با دماهای اتصال مختلف به صورت دو و سه­مرحله­ای صورت گرفت. نتایج نشان داد که قطعه­ی 443 جفت بازی دارای یک جزیره­ی CpG و درصد GC بیشتر و قابلیت تشکیل ساختارهای ثانویه­ی پیچیده­تری نسبت به قطعه­ی 230 جفت بازی است. با این وجود تنها قطعه­ی 443 جفت بازی که دارای آغازگرهای با ویژگی­های موردنظر بود، با باند مشخصی تکثیر گردید. نتایج نشان داد اختلاف اندک دمای ذوب آغازگرها، بالا بودن دمای اتصال آن­ها و دومرحله­ای شدن واکنش می­تواند در تکثیر اختصاصی توالی­های غنی از GC مؤثر باشد.

واژه­های کلیدی: ژن فیلیای گاو؛ درصد GC؛ جزیره­ی CpG؛ ساختار ثانویه؛ دمای اتصال.

مقدمه

بررسی ژنتیکی در موش منجر به شناسایی چندین ژن با اثرات مادری گردید که از آن­ها می­توان به ­فیلیا اشاره کرد. فیلیا در موش توسط یک ژن تک کپی با سه اگزون در کروموزوم 9 کد می­شود. پروتئین آن دارای ده تکرار از یک توالی 23 اسید­آمینه­ای است که در نزدیکی انتهای کربوکسیل آن قرار دارد (Ohsugi et al., 2008). بیان این ژن منحصراً در تخمک در حال رشد و رویان موش و نیز انسان شناسایی و گزارش شده است. ژن خاموش­شده­ی فیلیا در موش منجر به کاهش تعداد فرزندان به نصف حالت طبیعی یا هتروزیگوت می­گردد. عدم حضور فیلیا باعث تأخیر در روند چرخه­ی سلولی و اختلال در تکامل پیش از لانه­گزینی می­شود. جهش­هایی در ژن فیلیای انسانی شناسایی شده است که بر سقط جنین­های مکرر مؤثر است (Zheng & Dean, 2009; Parry et al., 2011). رونوشت فیلیای گاو (XM_002690018.2) با ارتولوگ آن در موش (NM_025890.3) 71 درصد و در انسان (NM_001017361.2) 75 درصد نوکلئوتید مشابه دارد (NCBI-BLASTn). اگرچه امروزه PCR بطور رایج برای تکثیر توالی­های نوکلئوتیدی مورد استفاده قرار می­گیرد (Gibbs, 1990)، اما این روش نمی­تواند رشته­های دارای درصدهای بالای GC (>55) را به­سادگی تکثیر نماید (Varadaraj & Skinner, 1994). به­عبارت دیگر تکثیر قطعات غنی از GC در PCR به علت شکل­گیری ساختارهای ثانویه مانند ساختارهای سنجاق­سری یا حلقوی در رشته­ی الگو، همواره با مشکلات زیادی همراه بوده است (McDowell et al., 1998). روش­های متعددی برای غلبه بر این مشکلات پیشنهاد شده است. استفاده از تکنیک­های Touch-Down PCR، Hot-Start PCR، Slow-Down PCR، و یا بکارگیری هیدروکسید سدیم برای دناتوره کردن رشته­ی الگو و همچنین بتائین و دی متیل سولفوکساید (DMSO) برای افزایش زمان اتصال آنزیم پلی­مراز به رشته­ی الگو، از روش­های پیشنهاد شده می­باشند (Agarwal & Perl, 1993; Bachmann et al., 2003; Sahdev et al., 2007; Frey et al., 2008; Sepahvand et al, 2009; Jensen et al., 2010). بخش اساسی یک تکثیر موفق در PCR، آغازگرهای واکنش هستند و طراحی دقیق آن­ها از لحاظ تشکیل ساختارهای سنجاق­سری و یا تشکیل دوپلکس با خود و یا دایمر با آغازگر دیگر ضروری است (Chavali et al., 2005). در بسیاری از آزمایشات تکثیر قطعات غنی از GC، مشکلاتی همچون دمای ذوب (T_m) بسیار پایین ، اختلاف بسیار زیاد دمای ذوب آغازگرها (ΔT_m) و درنتیجه اتصالات ناقص آغازگرها به رشته­ی الگو به چشم می­خورد که از دلایل اصلی عدم موفقیت تکثیر قطعات غنی از GC است. یکی از راهکارهایی که برای این مشکل پیشنهاد شده، افزایش دمای ذوب آغازگرها به بالای 80 درجه سانتیگراد و کاهش اختلاف دمای ذوب آغازگرها به کمتر از 1 درجه سانتیگراد می­باشد (Li et al., 2011). از آنجا که ژن فیلیا در انسان و موش بر نرخ باروری مؤثر است، بررسی توالی آن در گاو جهت مطالعه­ی اثر آن بر تولیدمثل گاوهای ماده مفید خواهد بود. میزان GC توالی رونوشت فیلیا در انسان (NM_001017361.2)، موش (NM_025890.3) و توالی پیش­بینی شده­ی آن در گاو (XM_002690018.2) به­ترتیب برابر 4/56، 9/57 و 72 درصد در برنامه­ی تحت وب GC Calculator محاسبه شده است. بالا بودن درصد GC در ارتولوگ گاوی مشکلاتی را در واکنش PCR به­همراه خواهد داشت. تحقیقات نشان داده است که جایگاه های موجود روی کروموزوم ها مسئول تغییرات در صفات مهم اقتصادی هستند (Kharrati koopaei & Mohammadabadi, 2013) و در سال‌های اخیر زیست‌شناسی ملکولی تحولی شگرف در تحقیقات بوم‌شناسی پدید آورده است. لذا، هدف از این مطالعه تکثیر بخشی از ژن (رونوشت) فیلیای گاوی با درصد بالای GC به کمک بهینه­سازی نحوه­ی طراحی آغازگر و مراحل PCR می­باشد.

مواد و روش­ها

تحقیق حاضر در گروه زیست­فناوری دامی در پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست­فناوری تهران انجام گرفت. مواد شیمیایی عموماً از شرکت سیگما (آلمان) تهیه گردید و سایر موارد نیز در متن مشخص شده است. بر اساس توالی کل ژنوم گاو (Zimin et al., 2009) و تکامل گونه­ای خانواده­ی ژنی Khdc1/Dppa5/Filia/Ooep در پستانداران رحم­دار[1] (Pierre et al., 2007)، توالی ژن فیلیای گاو در پایگاه داده­های NCBI بر روی کروموزوم 9 آن واقع شده است. آغازگرهای واکنش بر اساس توالی mRNA پیش­بینی­شده­ی فیلیا (XM_002690018.2) با نرم­افزار Oligo5 طراحی گردید. یک جفت آغازگر برای تکثیر یک قطعه­ی 443 جفت بازی (باز 83+ تا 525+) با دو ویژگی T_m بالاتر از80 درجه سانتیگراد و ΔT_m کمتر از یک درجه سانتیگراد در نظر گرفته شد. یک جفت آغازگر دیگر نیز بدون ویژگی­های ذکر­شده برای تکثیر یک قطعه­ی 230 جفت بازی (باز 1+ تا 230+) طراحی شد. توالی آغازگرها و سایر اطلاعات مربوط به آن­ها در جدول 1 آمده است. برای بررسی دقیق­تر وضعیت GC قطعات مورد تکثیر، دو توالی 443 و 230 جفت بازی در برنامه­ی تحت وب CpG Plot (Rice et al., 2000) به فرمت فاستا وارد شد و نتایج مربوط به درصد GC در قسمت­های مختلف توالی و احتمال وجود جزایر CpG در توالی­ها به صورت نمودار ترسیم گردید. همچنین به­کمک برنامه­ی تحت وب Mfold (Zuker, 2003)، میزان شکل­گیری ساختارهای ثانویه­ی احتمالی در هر دو توالی مورد بررسی قرار گرفت. تخمدان­ها به­صورت تصادفی از گاوهای نژاد هلشتاین از کشتارگاه راک واقع در کرج جمع­آوری و در مدت یک تا دو ساعت در محلول نرمال سالین با دمای 35-30 درجه سانتیگراد به آزمایشگاه منتقل شد. سپس فولیکول­های دو تا هشت میلی­متری آسپیره گردیده و تخمک­های دارای سیتوپلاسم یکپارچه به­کمک پیپت در زیر میکروسکوپ نوری جداسازی شد و به­ترتیب در قطره های 200 میکرولیتری محیط های TCM (سه قطره) (Invitrogen, USA) و PBS (دو قطره) مورد شستشو قرار گرفت. تخمک­ها پس از جدا کردن سلول­های کومولوس به کمک روش فیزیکی (یک تا دو دقیقه ورتکس) در گروه­های 50-40 تایی تا زمان استخراج RNA به 70- درجه سانتیگراد منتقل گردید. استخراج­ها به کمک کیت  (Germany) Qiagen RNeasy® Plus Micro  براساس دستور کار شرکت سازنده انجام گرفت.

جدول 1- توالی آغازگرهای ژن فیلیا و اطلاعات مربوط به آن­ها.

Table 1- Filia gene primers᾿ sequences and their related information.

RT-PCR

مقدار 20 نانوگرم RNA­ استخراج­شده در واکنش رونویسی معکوس به­کمک کیت Revert Aid^TM First Strand cDNA Synthesis (Thermo-Scientific, USA) شامل یک میکرولیتر آغازگر رندوم هگزامر 100 میکرومولار، یک میکرولیتر آنزیم رونوشت­بردار معکوس 200 واحد در میکرولیتر، یک میکرولیتر ممانعت­کننده­ی فعالیت RNase 20 واحد در میکرولیتر، دو میکرولیتر dNTP 10 میلی­مولار و چهار میکرولیتر بافر واکنشX 5 در حجم واکنش 20 میکرولیتر به­مدت یک ساعت در دمای 42 درجه سانتیگراد تبدیل به cDNA شد. در واکنش PCR از آغازگرهای ژن خانه­دار (کنترل) Histone H2a (رفت: 5ʹ-ctggacgtggcaaacaagg-3ʹ، برگشت: 5ʹ-gcgggatgatacgggtctt-3ʹ) برای تکثیر قطعه­ی 240 جفت بازی جهت بررسی صحت واکنش رونویسی معکوس استفاده شد. شرایط واکنش برای ژن­های فیلیا و Histone H2a در جدول 2 آورده شده است. آغازگرهای اول فیلیا که با در نظر گرفتن دوشرط T_m بالا و ΔT_m کم طراحی شده بودند، در واکنشی دومرحله­ای برای تکثیر قطعه­ی 443 جفت بازی مورد استفاده قرار گرفتند، به این صورت که دمای اتصال آغازگرها با دمای بسط یا تکثیر یکسان (72 درجه سانتیگراد) و به­صورت کلی به­مدت یک دقیقه در نظر گرفته شد. همچنین واکنش دیگری به­کمک این آغازگرها به­صورت معمول سه­مرحله­ای با دمای اتصال 65 درجه سانتیگراد انجام گرفت. آغازگرهای دوم نیز در سه دمای اتصال مختلف در واکنش معمول سه­مرحله­ای برای تکثیر قطعه­ی 230 جفت بازی مورداستفاده قرار گرفتند. واکنش­ها در حجم 25 میکرولیتر با 5/2 میکرولیتر بافر X PCR10، یک میکرولیتر dNTP 10 میلی­مولار، 5/1 میکرولیتر MgCl₂ 50 میلی­مولار، 5/1 میکرولیتر از هر آغازگر 10 پیکومول در میکرولیتر و 3/0 میکرولیتر آنزیم Taq پلی­مراز پنج واحد در میکرولیتر (همگی خریداری شده از شرکت Fermentas, EU) در دستگاه ترموسایکلر Techne (England) انجام شد. محصولات واکنش در ژل آگارز 2/1% الکتروفورز شد و پس از بررسی فرابنفش در دستگاه ژل­داک، نتایج به­صورت عکس ثبت گردید.

نتایج و بحث                                                           

برنامه­ی CpG Plot احتمال وجود یک جزیره­ی CpG را در توالی 443 جفت بازی نشان داد (باز 132+ تا 467+). همچنین مشخص گردید که در بخش­هایی از هر دو توالی 443 و 230 جفت بازی، میزان GC بالاتر از 60 درصد است و طول این ناحیه برای توالی 443 جفت بازی بیشتر است (شکل 1- الف و ب).

جدول 2- شرایط واکنش برای آغازهای اول و دوم ژن فیلیا و آغازگرهای ژن Histone H2a.

Table 2- PCR condition for Filia first and second primers and Histone H2a primers.

درصد بالای GC احتمال شکل­گیری ساختارهای ثانویه و ایجاد اختلال در تکثیر در واکنش PCR را افزایش می­دهد. نتایج برنامه­ی Mfold نشان داد که احتمال شکل­گیری 35 ساختار ثانویه برای قطعه­ی 443 جفت بازی و 13 ساختار ثانویه برای قطعه­ی 230 جفت بازی وجود دارد که مقاوم­ترین آن­ها به­ترتیب برای قطعه­های 443 و 230 جفت بازی دارای انرژی (ΔG) برابر با 66/93- (شکل 2-الف) و 37/46- (شکل 2-ب) کیلوکالری بر مول می­باشند. این ساختارها در صورت شکل­گیری در شرایط واکنش PCR، در عملکرد آنزیم پلی­مراز و نیز اتصال آغازگرها به رشته­ی الگو تداخل ایجاد می­کنند. بنابراین برای بهبود تکثیر نیاز به بهینه­سازی شرایط واکنش است. واکنش PCR ژن کنترل Histone H2a به تکثیر قطعه­ی 240 جفت بازی انجامید که به­صورت یک باند کاملا مشخص در ژل قابل مشاهده است (شکل 3). تکثیر آن نشان­دهنده­ی این است که واکنش رونویسی معکوس و سنتز cDNA از RNA استخراج­شده به­درستی صورت گرفته است. واکنش PCR به­کمک جفت آغازگر اول ژن فیلیا منجر به تکثیر باند کاملا مشخصی از قطعه­ی 443 جفت بازی در هر دو واکنش دو و سه مرحله­ای گردید، ولی در واکنشی که به­کمک آغازگرهای دوم صورت گرفت، در هیچ­کدام از دماهای اتصال تکثیر مشخصی صورت نگرفت و تنها باند بسیار ضعیفی در دمای اتصال 47 درجه سانتیگراد حاصل شد (شکل 3). در واکنش سه­مرحله­ای با آغازگرهای اول، کشیدگی بیشتر و نیز یک باند کوچکتر در ناحیه­ی بین 300 و 400 جفت باز مشاهده شد. بررسی بلاست آغازگر (NCBI-Primer-BLAST) در ژنوم گاو علاوه بر قطعه­ی 443 جفت بازی در ژن فیلیا، قطعه­ی دیگری نیز با طول 371 جفت باز در همین ژن نشان می­دهد. دلیل تکثیر آن در واکنش سه مرحله­ای در مقایسه با واکنش دومرحله­ای را می­توان به افزایش زمان اتصال آغازگر و کاهش دمای آن از 72 درجه سانتیگراد به 65 درجه سانتیگراد نسبت داد. بنابراین با توجه به واکنش دومرحله­ای تکثیر قطعه­ی 443 جفت بازی می­توان گفت کاهش زمان اتصال آغازگر در مورد توالی­های غنی از GC در رشته­ی الگو، تکثیر اختصاصی و بهتر قطعه­ی مورد­نظر را با باند اسمیر کمتر تضمین می­کند. در مطالعه­ای که بر روی توالی غنی از GC انسانی انجام شده نیز این مطلب اثبات شده است (Mamedov et al., 2008).

شکل 1-  نتیجه برنامه­ی CpG Plot برای دو قطعه­ی 443 (الف) و 230 (ب) جفت بازی. پیش­فرض­های ارزیابی: نسبت مجموع G و C مشاهده­شده به CpG موردانتظار> 6/0، درصد C+G > 50، طول جزیره­ی CpG > 200 جفت باز.

Figure 1- CpG plot results for 443 (a) and 230 (b) bp fragments. Evaluation defaults: Observed/Expected ratio > 0.60, Percent C + Percent G > 50.00, Length > 200.

شکل2- نتیجه­ی برنامه­ی Mfold. مقاوم­ترین ساختارهای ثانویه­ی احتمالی برای دو قطعه­ی 443 (الف) و 230 (ب) جفت بازی با ΔG به­ترتیب برابر با 66/93- و 37/46- کیلوکالری بر مول.

Figure 2- Mfold results. The most stable possible secondary structures for 443 (a) and 230 (b) bp fragments with ΔG of -93.66 and 46.37 kcal/mol respectively.

شکل 3- واکنش PCR ژن­های فیلیا و Histon H2a. به ترتیب از راست: نشانگر اندازه یک کیلوبازی، قطعه­ی 443 جفت بازی فیلیا (واکنش دومرحله­ای)، قطعه­ی 443 جفت بازی فیلیا (واکنش سه­مرحله­ای)، قطعه­ی 240 جفت بازی Histon H2a، نشانگر اندازه 100 جفت بازی، قطعه­ی 230 جفت بازی فیلیا (دمای اتصال 47 درجه سانتیگراد)، توالی 230 جفت بازی فیلیا (دمای اتصال 50 درجه سانتیگراد، عدم تکثیر)، توالی 230 جفت بازی فیلیا (دمای اتصال 55 درجه سانتیگراد، عدم تکثیر).

Figure 3- PCR amplification results for Filia and Histon H2a genes. Right to left: 1 kb DNA ladder, Filia 443 bp fragment (2-stage reaction), Filia 443 bp fragment (3-stage reaction), Filia 230 bp fragment (annealing temperature: 47 ̊C), Filia 230 bp sequence (annealing temperature: 50 ̊C, no amplification), Filia 230 bp sequence (annealing temperature: 55 ̊C, no amplification).

به­طور کلی علت تکثیر نامناسب توالی­های غنی از GC اختلال در واسرشت­سازی، اتصال آغازگر و بسط این قطعات است. روش­های متعددی از جمله افزودن ترکیبات آلی و کاربرد پلی­مرازهای قوی در واکنش برای چیره شدن بر این مشکل و کاهش ثبات دورشته­ی DNA الگو طراحی شده است. هرچند عملکرد این ترکیبات غیرقابل پیش­بینی است و حتی با وجود این ترکیبات، تکثیر توالی­های غنی از GC در بسیاری از موارد ناموفق است (Sahdev et al., 2007). توالی­هایی که دارای نوکلئوتیدهای تکراری G هستند، به­دلیل افزایش پیوندهای هیدروژنی بین گوانین­های همسایه، ساختارهای ثانویه­ی پیچیده­ی درون رشته­ای و بین رشته­ای ایجاد می­کنند (Gellert et al., 1962). پدیده­ی مذکور در PCR با حضور باندهای کوتاه­تر در ژل آگارز مشخص می­شود. این قطعات تکثیری کوتاه­شده نتیجه­ی وجود ساختارهای سنجاق­سری در رشته­ی الگو می­باشد که منجر به توقف کارکرد پلی­مراز می­گردد (Sahdev et al., 2007). در بسیاری از مقالات به کاربرد ترکیباتی همچون بتائین، DMSO، اتیلن­گلایکول و 2،1- پروپاندیول جهت تسهیل جداسازی دو رشته­ی DNA از طریق تغییر خواص ذوب (T_m) آن اشاره شده است (Dutton et al., 1993; Zhang et al., 2009; Seifi et al., 2012). همه­ی این ترکیبات از طریق کاهش T_m عمل می­کنند (Spink et al., 2007; Zhang et al., 2009) درحالی­که در این آزمایش بدون نیاز به این ترکیبات و با افزایش T_m و در نظر گرفتن شرایط مربوط به  ΔT_mو نحوه­ی تکثیر، نتیجه­ی مطلوب حاصل گردید. همچنین پلی­مرازهای قدرتمندی مانند Taq Gold، LA Taq و Hot-Start Taq، در برخی موارد استفاده شده است (Henke et al., 1997). چنین روش­هایی که نیاز به افزودن ترکیبات بهبود­دهنده­ی تکثیر دارند هزینه­بر هستند در صورتی­که با طراحی دقیق­تر آغازگرها و تنظیم شرایط واکنش می­توان بدون صرف هزینه به­هدف موردنظر دست یافت. در مطالعه­ی حاضر به­کمک طراحی ویژه­ی آغازگر و انجام واکنش PCR به­صورت دومرحله­ای و تنها با آنزیم Taq پلی­مراز، تکثیر ناحیه­ی غنی از GC ژن فیلیا ممکن گردید. در این طراحی، هیچ­کدام از ویژگی­های مربوط به طول آغازگرها، درصد GC آن­ها و ساختارهای ثانویه­ی آن­ها (دوپلکس، هترودایمر، سنجاق­سری) در نظر گرفته نشد. با این حال تکثیر قطعه­ی موردنظر با ضخامت باند مطلوبی صورت گرفت که نشان­دهنده­ی مؤثر بودن نحوه­ی طراحی آغازگر است و افزایش دمای اتصال و دومرحله­ای شدن واکنش نیز به بهبود تکثیر کمک کرده است. سه مشکل اصلی در تکثیر توالی­های دارای درصد بالای GC در پروتکل­های معمول سه­مرحله­ای عبارت است از واسرشت­سازی ضعیف در دمای 94 درجه سانتیگراد، دسترسی ضعیف آغازگرها به رشته­ی الگو به دلیل شکل­گیری ساختارهای ثانویه و بسط و تکثیر ضعیف به دلیل وجود این ساختارها (Dutton et al., 1993). در نظر گرفتن دمای واسرشت­سازی 96 درجه سانتیگراد در تکثیر قطعه­ی 443 جفت بازی در هر دو واکنش دو و سه­مرحله­ای، با کمک به جدا شدن بهتر دو رشته­ی الگو و جلوگیری از اتصال مجدد می­تواند در بهبود تکثیر مؤثر بوده باشد.

جفت آغازگری که برای قطعه­ی 230 جفت بازی طراحی شده بود T_m بسیار کمتر از 80 درجه سانتیگراد داشت و T_mΔ آن نیز بیشتر از 1 درجه سانتیگراد بود. حتی GΔ  تشکیل دوپلکس و هترودایمر آن­ها نیز به­طور نسبی از جفت آغازگر قطعه­ی 443 جفت بازی کمتر بود. با این­وجود قادر به تکثیر مناسب قطعه­ی موردنظر در هیچ­کدام از دماهای اتصال نشد. قطعه­ی 230 جفت بازی با درصد GC برابر 6/59 درصد، با توجه به نتیجه­ی برنامه­ی CpG Plot به­عنوان یک توالی بسیار غنی از GC (یا جزیره­ی CpG) در نظر گرفته نمی­شود. ولی عدم تکثیر آن را در واکنش معمول PCR می­توان به درصد بالای GC (>60) در برخی نواحی آن نسبت داد که شکل­گیری ساختارهای ثانویه را در این مناطق ممکن می­کند. بنابراین برای بررسی توالی ها از نظر میزان GC، علاوه بر تعیین درصد GC قطعه به­صورت کلی، تعیین وضعیت GC و امکان شکل­گیری ساختارهای ثانویه­ی ناشی از پیوندهای هیدروژنی به­صورت منطقه­ای نیز در توالی مورد­نظر بسیار مهم است.

با توجه به نتایج بیوانفورماتیک مشخص شد که قطعه­ی 443 جفت بازی درصد GC بیشتر و قابلیت تشکیل ساختارهای ثانویه­ی بیشتر و پیچیده­تری نسبت به قطعه­ی 230 جفت بازی دارد. همچنین احتمال وجود جزیره­ی CpG تنها در قطعه­ی 443 جفت بازی وجود دارد. این نتایج نیز نشان می­دهد که تکثیر قطعه­ی 443 جفت بازی نسبت به 230 جفت بازی در واکنش PCR مشکل­تر خواهد بود، در حالی که در مطالعه­ی حاضر با بهینه­سازی طراحی آغازگر به­راحتی تکثیر این قطعه صورت گرفت. بیشتر ژن­های خانه­دار، ژن­های سرکوب­کننده­ی تومور و 40 درصد ژن­های اختصاصی بافتی دارای جزایر CpG در محدوده­ی شروع رونویسی و یا ناحیه­ی اگزونی هستند (Larsen et al., 1992) که باعث می­شود توالی­های DNA کمتر برای تکثیر در دسترس قرار گیرند. در ژنوم یوکاریوت­ها 90-60 درصد نوکلئوتیدهای CpG متیله هستند. این متیلاسیون شامل جزایر CpG نمی­شود. نوکلئوتیدهای CpG درون این جزایر اساسا غیرمتیله هستند و در ژن­های فعال حضور دارند (Singal & Ginder, 1999; Clark & Melki, 2002; Hubé et al., 2003). جزیره­ی CpG شناسایی شده، ناحیه­ی پس از نقطه­ی آغاز ترجمه و بخش اگزونی ژن فیلیا را در بر می­گیرد. این امر نشان­دهنده­ی اهمیت ژن فیلیا به­عنوان یک ژن فعال اختصاصی تخمک در گاو است. همچنین نشان داده شده است جزایر CpG در ژن­های اختصاصی بافتی که به­صورت محدودتری بیان می­شوند، همانند ژن­های با بیان گسترده الزاما در ناحیه­ی شروع رونویسی قرار نگرفته­اند بلکه ناحیه­ی اگزونی ژن­ها را در بر گرفته­اند (Larsen et al., 1992).

نتیجه­گیری

در مطالعه­ی حاضر برای اولین­بار تکثیر بخشی از mRNA غنی از GC فیلیا به­کمک بهینه­سازی طراحی آغازگر و واکنش دومرحله­ای به­صورت اختصاصی ممکن گردید. آغازگرهای فیلیا در این مطالعه برای توالی­هایی طراحی شده بود که باهم همپوشانی داشتند، ولی تنها آغازگرهایی که دو ویژگی ΔT_m کمتر از یک درجه سانتیگراد و T_mبالا ودر نتیجه دمای اتصال بالا را داشتند عملکرد مؤثر نشان دادند. دمای بالای اتصال و دومرحله­ای شدن واکنش باعث تکثیر بهتر و اختصاصی­تر قطعه­ی غنی از GC و نیز جزیره­ی CpG شد. امکان تکثیر ژن فیلیای گاو می­تواند به عنوان ژنی با تأثیر احتمالی بر نرخ باروری ماده­گاوها برای مطالعات اصلاحی آینده همانند بررسی چندشکلی، بیان ژن در شرایط مختلف، و تعیین ارتباط با صفات تولیدمثلی مفید واقع شود.

سپاسگزاری

از دانشگاه صنعتی اصفهان برای تأمین هزینه­های پژوهشی این تحقیق، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست­فناوری به­دلیل تأمین وسایل و تجهیزات موردنیاز و دکتر مهدی شمس­آرا و آقای سعید انصاری مجد برای راهنمایی­های ارزنده­شان صمیمانه سپاسگزاری می­شود.