ارزیابی مزرعه ای و ملکولی  مقاومت گندم های ایرانی به فوزاریوم سنبله گندم

نیازعلی سپهوند¹ *، فرزاد حیدری²، عبدالحسین طوطیایی³، میترا سراج­آذری³، جواد مظفری¹

¹ اعضای هیأت علمی پژوهشی مؤسسه تحقیقات اصلاح و تهیه نهال و بذر

² دانش آموخته دانشگاه آزاد اسلامی، واحد کرج

³ عضو هیأت علمی پیشین مؤسسه تحقیقات اصلاح و تهیه نهال و بذر

چکیده

بیماری فوزاریومی‌ سنبله گندم یکی از بیماری­های مهم گندم در ایران است که در استان‌های مازندران، گلستان، اردبیل (مغان) و فارس از اهمیت بالایی برخوردار است. مهمترین عامل این بیماری قارچ Fusarium graminearum می‌باشد. ارزیابی اولیه، 3350 نمونه از گندم­های نان بانک ژن گیاهی ملی ایران نسبت به فوزاریوم سنبله، تعدادی از آنها مقاومت نشان داند. بیست و دو نمونه مقاوم به همراه یک شاهد مقاوم و یک شاهد حساس، در پاییز 1381 در قالب طرح بلوک های کامل تصادفی با سه تکرار در ایستگاه تحقیقات کشاورزی قراخیل ساری ارزیابی پیشرفته شدند. برای ارزیابی مقاومت به پنج جدایه قارچ فوزاریم که بیماری­زایی شدیدتری داشتند، در پنج مرحله مایه زنی افشانه­ای پیش از غروب آفتاب با غلظت 10⁴×3 ماکروکنیدی در میلی لیتر انجام شد. صفات مهم زراعی یاداشت برداری شدند. برای ارزیابی مقاومت نمونه ها در سه مرحله 10، 14 و 18 روز پس از آلودگی، شاخص آلودگی سنبله، شدت بیماری و درصد آلودگی دانه برای نمونه­ها تعیین شد. سطح زیر منحنی پیشرفت آلودگی (AUPDC) محاسبه شد. نتایج نشان داد که تعدادی از نمونه‌ها در مقایسه با شاهد مقاوم از مقاومت مطلوبی برخوردار بودند. با گروهبندی (کلاستر بندی) نمونه­ها نیز در یک گروه قرار گرفتند. برای به دست آوردن نشانگر‌های SSR Simple Sequence Repeats)) پیوسته با مقاومت در نمونه­ها، از ده جفت آغازگر استفاده شد. نتایج به دست آمده آزمایشگاهی نشان داد که نمونه‌های ذکر شده دارای تک باند اختصاصی مقاومت به بیماری بوده و آغازگرهای GWM234، GWM340 و GWM251 با بهینه سازی شرایط آزمایش و تعداد نمونه­های بیشتر می­توانند نمونه‌های مقاوم را از حساس تفکیک کنند.

واژه­های کلیدی: فوزاریوم سنبله، گندم­های ایران، ، نشانگر SSR، ارزیابی ملکولی

مقدمه

با توجه به افزایش رشد جمعیت و نیاز به تأمین امنیت غذایی، افزایش تولید در واحد سطح محصولات زراعی می‌تواند به عنوان یک راهبرد اساسی در حل مشکل تامین غذا به شمار آید. در میان گیاهان زراعی، گندم با دارا بودن مواد غذایی باارزش مانند انواع پروتئین ها، ویتامین ها و مواد معدنی، حدود 25% کالری غذایی مردم جهان را تأمین می‌نماید (Salunkhe et al., 1985).

با توجه به محدودیت‌های افزایش سطح زیرکشت گندم و پایین بودن میانگین عملکرد گندم در کشور افزایش عملکرد می‌تواند یکی از راه ‌کارهای عملی برای پاسخگویی به نیازهای کشور باشد. از عواملی که باعث کاهش عملکرد در واحد سطح می‌گردند، می‌توان به تنش­های غیر زیستی و تنش­های زیستی مانند آفات و بیماری ها اشاره نمود. یکی از تنش­های زنده، بیماری بلایت فوزاریومی‌سنبله گندم یا FHB[1] که عموماً تحت عنوان اسکب[2]نامیده می‌شود،  یکی از بیماری های مخرب در مناطق گرم و مرطوب کشت گندم در جهان می‌باشد .(Bai and Shaner, 1994) بیماری فوزاریومی سنبله یکی از بیماری های مهم گندم در استان های مازندران، گلستان، زنجان، فارس و اردبیل (دشت مغان) به شمار می‌رود
(Malihipoor et al., 2000). در چند سال گذشته به علت وجود منابع آلودگی، کشت ارقام حساس به بیماری و مهیا بودن شرایط جوی در مناطق شمالی کشور، خسارت ناشی از این بیماری بسیار چشمگیر بوده است (Malihipoor et al., 2000; Golzar, 1989; Foroutan et al., 1993 ).

روش‌های متداول اصلاح نباتات مبتنی بر انتخاب گیاهان در مزرعه یا شرایط محیط کنترل شده بر اساس فنوتیپ می‌باشد، اما در کنار روش های متداول، تکنیک های جدید مولکولی این امکان را فراهم می‌سازد که انتخاب مستقیماً در سطح DNA (ژنوتیپ) انجام گیرد و بنابراین باعث افزایش دقت بیشتر گزینش، صرفه‌جویی در زمان و احتمالاً ارزیابی‌های پرهزینه می­گردد (Buerstmayer et al., 2002).

هدف از این پژوهش مشخص نمودن ژنوتیپ­های مقاوم و متحمل گندم ایرانی به بیماری فوزاریوم سنبله گندم به نحو پیشرفته در بین نمونه­هایی بود که از پیش به صورت مشاهده ای ارزیابی و انتخاب شده‌اند و همچنین امکان دستیابی به نشانگرهای مولکولی چند شکلی توالی تکراری ساده[3]  که مرتبط با مقاومت به بیماری فوزاریوم سنبله درگندم های مورد ارزیابی بود. استفاده و بهره گیری از ذخایر توارثی داخلی از برنامه‌های اساسی و پایه‌های محکم  کشاورزی پایدار هرکشور محسوب می‌شود. از آنجا که ایران از کشورهای غنی از نظر ذخایر توارثی تعدادی از محصولات مهم از جمله گندم است، ارزیابی اولیه و پیشرفته ذخایر ارزشمند گندم در ارتباط با اهداف اصلاحی این محصول که بر طرف کننده مشکلات تولید است بایستی نسبت به ارقام و تلاقی­های وارداتی در اولویت قرار گیرد. از سال 81-1376 با روش‌های ارزیابی حدود 3350 نمونه گندم از ذخایر موجود در بانک ژن در منطقه مساعد اپیدمی‌FHB در ایستگاه قراخیل مازندران، 55 نمونه به عنوان نمونه های مقاوم غربال شدند (Totiaei, 2003)،‌ در حالی که تاکنون ارقام مقاوم به FHB در بین گندم های ایرانی شناسایی نشده است. دستیابی به چنین نمونه یا نمونه‌هایی گامی‌ مهم و نوین برای پیشگیری از این بیماری خواهد بود. از سوی دیگر، بهره گیری از بیوتکنولوژی در تحقیقات و به ویژه ارزیابی‌های پیشرفته به عنوان یک ضرورت برای کشاورزی کاملاً محسوس است. تلاش در جهت دستیابی به نشانگرهای اطلاعاتی[4] و سرانجام پیدا کردن نشانگر مولکولی پیوسته با مقاومت حرکتی نوین در برنامه‌های پایه­ای اصلاح نباتات به حساب می‌آید.

مواد و روش­ها

مواد گیاهی

 با بررسی مقاومت توده‌های انتخابی گندم­های موجود در بانک ژن گیاهی ملی ایران به بیماری فوزاریوم سنبله گندم، از سال
81-1376 ارزیابی مشاهده ای حدود 3350 نمونه گندم از ذخایر موجود در بانک ژن در منطقه مساعد اپیدمی طبیعی در ایستگاه قراخیل مازندران 55  نمونه به عنوان مقاوم غربال شده و مشخص گردیدند. ‌در خلال آزمایش های بیماری­های گندم از میان توده­های ارزیابی شده از کلکسیون گندم موجود در بانک ژن گیاهی ملی ایران، 22 توده یکنواخت و رقم با شاهد حساس فلات و شاهد مقاوم SUMAI3 گزینش شدند (جدول 1). توده‌های شناسایی شده در مزرعه آزمایشی ایستگاه قراخیل ساری، مرکزتحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی مازندران که برای ارزیابی، شرایط بسیار مطلوبی برای شیوع بیماری دارد ارزیابی شدند (شکل 1). توده‌های مورد ارزیابی با شاهدهای حساس و مقاوم در دهم آذرماه سال 1381 در قالب طرح بلوک­های کامل تصادفی با سه تکرار کشت شدند. هر واحد آزمایشی شامل سه خط دو متری بود. بذور به عمق کاشت 5 سانتی‌متر و در ردیف­های با فاصلة 30 سانتی‌متر از همدیگر کاشته شدند. عملیات کود پاشی به نسبت 90 کیلوگرم در هکتار اوره، 23 کیلوگرم در هکتار پتاس و 14 کیلوگرم در هکتار فسفر صورت گرفت. کنترل علف‌های هرز به صورت مکانیکی و شیمیایی به دفعات لازم در انتهای مرحله پنجه‌دهی به بعد انجام شد.

شکل 1- توده های کشت شده برای ارزیابی مقاومت به فوزاریوم سنبله گندم در ایستگاه تحقیقات کشاورزی قراخیل ساری.

Figure 1- Accessions cultivated for resistance evaluation to wheat Fusarium head blight in research station of Gharakhil, Sari.

جدول 1- توده‌های گندم مورد ارزیابی پیشرفته مقاومت به فوزاریوم سنبله و شماره ثبت آنها در بانک ژن گیاهی ملی ایران در ایستگاه قراخیل ساری.

Table 1- Accessions cultivated for resistance evaluation to wheat Fusarium head blight in Gharakhil research station, Sari. Their origin and accession number in National Plant Gene Bank ofIran is shown.    

ویژگی جدایه های قارچ فوزاریوم 

پنج جدایه قارچ فوزاریوم
Fusarium graminearum مورد استفاده در این پژوهش از واحد بیماری­های بخش تحقیقات غلات، مؤسسه تحقیقات اصلاح و تهیه نهال و بذر تهیه شد (جدول 2).

جدول 2- مشخصات جدایه های فوزاریوم، رقم گندم میزبان  و محل جمع آوری آنها (Alizadeh et al., 1998).

   Table 1- Fusarium isolates characteristics; their wheat host cultivar, the area of

   collection and the sample no. (Alizadeh et al., 1998).

 جدایه های بالا در بین 50 نمونه مبتلا به بیماری که 30 نمونه از مناطق مختلف گرگان، مازندران، جیرفت و بندر عباس جمع آوری و مورد شناسایی قرار گرفتند و 20 جدایه دیگر قبلا" در واحد بیماری­ها بخش تحقیقات غلات شناسایی شده بودند، بر اساس شدت بیماریزایی انتخاب شدند  (Alizadeh et al., 1998). قارچ عامل بیماری از سنبله­های گندم آلوده ارقام مختلف گندم با استفاده از محیط کشت PDA  جداسازی شد. پس از جدا سازی، خالص سازی جدایه ها با روش تک اسپور و با استفاده از تکنیک مخطط کردن روی محیط آب و آگار 2% انجام شد. تشخیص جدایه­ها با استفاده از کلیدهای تشخیص گونه­های فوزاریوم (Nelson et al., 1983) انجام شد. 

تهیه مایه تلقیح، آلودگی مصنوعی و ارزیابی بیماری

برای تهیه مایه تلقیح از روش وگنر استفاده شد (Wegener, 1992). در این روش در ارلن‌های به حجم 250 میلی­لیتر مقدار 5/2 گرم کاه گندم به اضافه 5/2 گرم کاه جو آسیاب شده به همراه 125 میلی­لیتر آب مقطر ریخته شده و در اتوکلاو استریل شدند، عمل استریل کردن سه مرتبه تکرار گردید. قطعه کوچکی به قطر حدود 5-3 میلی متر از میسلیوم‌های جدایه مورد نظر به همراه محیط کشت برداشته شده و در داخل ارلن­ها ریخته شد. سپس ارلن‌ها در دمای 30-25 درجه سانتی گراد روی شیکر دورانی گذاشته شد. پس از گذشت حدود 96 ساعت اسپورهای فراوانی از جدایه مورد نظر به دست آمد. مایه تلقیح تهیه و در دمای 4 درجه سانتی­گراد تا زمان استفاده نگهداری شد. غلظت سوسپانسیون کنید‌ی به 10⁴×5 اسپور در هر میلی‌لیتر تنظیم گردید. اندازه‌گیری قدرت تهاجم مایه تلقیح طبق روش لمن و همکاران (Lemmens et al., 1993) در آغاز و پایان دوره آلودگی نشان داد که توانایی تهاجم در طول دوره آلودگی ثابت بوده است. در خرداد 1382 آلودگی مصنوعی در زمانی که بیش از 50 درصد گیاهان هر کرت به مرحله گلدهی رسیده بودند، انجام شد و پس از دو روز دوباره تکرار شد. آلودگی توسط یک دستگاه سمپاشی موتوری پشتی و افشانه کردن 50 میلی‌لیتر از سوسپانسیون کنیدی یک روز در میان و در هنگام عصر، پیش از غروب آفتاب انجام شد. سیستم مه‌پاش رطوبت مورد نیاز را به مدت 20 ساعت پس از آلودگی فراهم نمود. در همان سال درصد پیشرفت بیماری، توسط شاخصی بر مبنای صفر درصد (بدون بیماری) تا 100 درصد (آلودگی کامل) 10، 14 و 18 روز پس از آلودگی ارزیابی شد.

درصد آلودگی سنبله

اگرچه محاسبه درصد آلودگی سنبله به تنهایی نشان دهنده سطح مقاومت یا حساسیت ژنوتیپ مورد نظر نیست ولی شدت اپیدمی‌را نشان می‌دهد. برای تعیین این پارامتر از هر کرت 50 خوشه را به طور تصادفی انتخاب و تعداد خوشه‌های آلوده را شمارش و درصد آن را نسبت به کل خوشه‌ها (50 عدد) محاسبه نمودیم. دو روش برای ارزیابی در مزرعه وجود دارد. الف) اندازه‌گیری به روش مرکز تحقیقات بین­المللی گندم و ذرت (سیمیت) (Ireta and Gilchrist., 1994). ب) روش تغییر یافته ژاپنی در مزرعه (Wilcoxon, et al., 1992).

روشی که در این پژوهش مورد استفاده قرار گرفت در حقیقت تلفیقی از روش‌های یاد شده است که در آن شاخص بیماری از فرمول زیر مورد محاسبه قرار می‌گیرد. البته در این محاسبه 50 خوشه استفاده گردید.

         عدد 5 نشانه حداکثر تیپ آلودگی بوده و تقسیم سطح آلودگی هر تیمار بر حاصلضرب 50×5  درصد آلودگی سنبلچه یا شاخص بیماری  DIX[5] را نشان می­دهد که در آن: تیپ آلودگی 1= 20% خوشه آلوده، تیپ آلودگی 2= 40% خوشه آلوده تیپ آلودگی 3= 60% خوشه آ‌لوده،  و تیپ آلودگی 4= 80% خوشه آلوده است.

ارزیابی نمونه­ها با نشانگرهای مولکولی

بذور نمونه‌ها در گلدان‌هایی به قطر 20 سانتی‌متر کشت و در گلخانه بانک ژن گیاهی ملی ‌ایران در دمای 2±20 درجه سانتی گراد مورد مراقبت قرار گرفتند. برگ های جوان گیاهچه­های هر نمونه پس از 3 هفته برداشت و برای استخراج DNA استفاده شدند. استخراج DNA از برگ های جوان به روش CTAB تغییر یافته صورت گرفت. تهیه محلول های لازم و مراحل استخراج DNA به روش (Saghai maroof et al., 1994) انجام شد. کیفیت و کمیت DNA با استفاده از دستگاه های اسپکتروفتومتری اندازه‌گیری شد. به این ترتیپ که میزان جذب نور در طول موج های 280 و260 نانومتر اندازه‌گیری و از نسبت 280/260 برای بررسی کیفیت DNA استفاده شد. واکنش زنجیره‌ای پلی مراز (PCR) با استفاده از دستگاه BioRad در حجم واکنش 25 میکرولیتر صورت گرفت. برنامه‌ریزی دستگاه با توجه به تفاوت دمای اتصال آغازگر صورت گرفت. ده سیکل اول حرارتی به صورت کاهش نزولی حرارت[6] برنامه‌ریزی گردید(Don et al., 1999). آغازگرهای مورد استفاده در این پژوهش پس از بررسی‌ روی تحقیقات انجام شده و پایگاه‌های اطلاعاتی گندم انتخاب و میزان چند شکلی آنها بر اساس مقالات Roder  و همکاران (1998) و Plasche  و همکاران (1996) انجام شد (جدول 3). نمونه های PCR شده به همراه یک نشانگر پلکانی (Lader VIII) که به نسبت 8:2 با بافر مخلوط و نمونه های مورد نظر در چاهک های ژل آگارز 2 درصد در بافر TAE بارگذاری  شد. قطر ژل مورد استفاده در این سیستم 6/0 سانتیمتر بود که با توجه به ابعاد بدنه اصلی دستگاه ابعاد ژل (30×25 سانتی متری) توان جریان برق 85-80 وات انتخاب شد و رنگ‌آمیزی ژل با اتیدیوم بروماید انجام گرفت.

تجزیه آماری داده‌ها

تجزیه واریانس داد­ه­های صفات کمی با استفاده از نرم افزار  SPSS و برای گروهبندی نمونه­ها  بر اساس روش UPGMA[7]  از برنامه Winboot  استفاده شد. برای مطالعه روابط بین توده‌ها و پارامتر‌های آن، تمام ژنوتیپ‌های مورد مطالعه به صورت یک توده منفرد مورد استفاده و تجزیه و تحلیل قرار گرفتند.

نتایج  و بحث

ارزیابی مزرعه‌ای

در آزمایش های مزرعه ای، 8 صفت که احتمال همبستگی آنها با بیماری اسکب وجود داشت از میان صفات موجود در دستورالعمل ارزیابی صفات موجود در گندم (IPGRI) و همچنین بر اساس نتایج پژوهش­های مرتبط، ارزیابی و یادداشت برداری شدند. نتایج تجزیه واریانس صفات مورد ارزیابی در جدول 6 نشان داده شده است.

جدول 3- لیست آغازگرهای مورد استفاده در آزمون PCR، توالی، تعداد تکرار توالی ساده و دمای اتصال آنها.

Table 3- Applied primers for PCR multiplication, their sequence, the number of simple sequence repeats and annealing temperature.

میانگین 6 صفت تفاوت خیلی معنی‌داری (در سطح 1% ) نشان ‌دادند. صفات خوشه­های آلوده، سنبلچه های آلوده و  بذور آلوده از صفاتی هستند که اختلاف خیلی معنی­داری داشتند. این صفات که مرتبط با واکنش نمونه­ها در برابر قارچ فوزاریوم هستند نشان دهنده اختلاف در حساسیت و مقاومت نمونه­ها و مؤثر بودن این صفات در ارزیابی است. در بین صفات یادداشت برداری شده تراکم خوشه و تعداد روزهای به خوشه رفتن در بین نمونه ها، اختلاف معنی داری نداشتند. صفات وزن هزار دانه، وضعیت ریشک و ارتفاع بوته از صفاتی بودند که در این تحقیق اختلاف خیلی معنی داری نشان دادند.

مقایسه اجزای مقاومت در آزمایش مزرعه

دوره کمون بیماری

تنوع برای دوره کمون در گندم نسبت به تمام نژادهای مختلف قارچ فوزاریم گزارش شده است و صفتی قابل اندازه‌گیری در مزرعه و گلخانه برای گیاه کامل می‌باشد. مرحله رشد گیاه و سن برگ‌ها می‌توانند در تنوع این صفت نقش مهمی‌داشته باشد. طولانی ترین دوره کمون در برگ پرچم می‌باشد و به ترتیب قرار گرفتن برگ ها از بالا به پایین ساقه، این دوره کاهش می‌یابد. نتایج ارزیابی نشان داد که رقم Sumai#3 کمترین درصد آلودگی را در بین ارقام و توده­ها دارد و توده‌هایKC6667 ، KC2131، KC6430 و KC6246 کمترین میزان آلودگی را در هر مرحله از اسپورپاشی از خود نشان دادند (جدول 4). بر اساس آزمایش های Miedaner و همکاران (1998) نمونه های مقاوم دارای میزان آلودگی کمتر بوده و با داشتن ژنهای مقاوم، از آلودگی سریع میزبان جلوگیری می‌کنند. ژنوتیپ‌های یاد شده که کمترین میزان آلودگی را نشان دادند، می­توان جزء نمونه­های مقاوم نسبت به بیماری فوزاریومی ‌سنبله گندم محسوب کرد. بررسی سطح زیر منحنی پیشرفت آلودگی در مزرعه در سه نوبت اسپور پاشی و ارزیابی  نشان داد که پیشرفت آلودگی نمونه­های فوق سطح زیر منحنی کمی داشته و  نسبت به بیماری مقاوم بودند (جدول 5) و با نتیجه درصد آلودگی سنبله مطابقت داشت. توسط Mesterhazy (1989) بازده ژنوتیپ گندم در مراحل مختلف و مکان‌های مختلف بررسی و نشان داد که میزان سرعت رشد بیماری روی یک رقم، علاوه بر نوع رقم و مراحل مختلف رشدی، تحت شرایط محیطی به ویژه دما و رطوبت و طول روز قرار می‌گیرد.

براساس نتایج  می‌توان گفت که علاوه بر شاهد حساس فلات از نظر سرعت رشد آلودگی، توده‌های KC6349،KC6390  و  KC6158  جزء حساس­ترین ژنوتیپ‌های مورد ارزیابی بودند (جدول 4)، زیرا پس از گذشت سه نوبت اسپورپاشی و ارزیابی، بیشترین درصد آلودگی را به خود اختصاص دادند. این نتایج با یافته های به دست آمده برای سطح زیر منحنی پیشرفت آلودگی در مزرعه در سه دوره ارزیابی (جدول 5)  نیز همخوانی دارد و اهمیت انجام ارزیابی پیشرفته را پس از ارزیابی مشاهده­ای نشان می­دهد.

تیپ آلودگی

تیپ آلودگی، نتیجه نهایی اثر متقابل میزبان و  عامل بیماری است و معمولاً تیپ آلودگی صفر مصون و تیپ آلودگی 5 آلودگی کامل و حساسیت گیاه می‌باشد. با توجه به نتایج به دست آمده (جدول 4) در  بررسی مقاومت به بیماری اسکب در ژنوتیپ‌های انتخابی از نمونه های مورد ارزیابی، درمرحله گیاه کامل: 25 درصد از توده ها دارای تیپ آلودگی 5، 5/12 درصد از نمونه ها دارای تیپ آلودگی 4، 3/33 درصد دارای تیپ آلودگی 3، 3/8 درصد تیپ آلودگی 2 و بقیه یعنی 8/20 درصد دارای تیپ آلودگی 1 بودند که نمونه­های مقاوم در این گروه قرار داشتند.

نتایج تجزیه خوشه‌ای برای صفات  زراعی

به منظور اندازه گیری و تعیین فواصل ژنتیکی و نیز الگو پذیری تنوع در اجزاء مقاومت به فوزاریوم سنبله گندم، از روش تجزیه خوشه‌ای استفاده شد. برای برآورد فاصله ژنتیکی ژنوتیپ­ها از ضریب اقلیدسی استفاده شد. هر چه فاصله ژنتیکی بین دو دسته بیشتر باشد آن دو دسته از هم دورترند. در این آزمایش بر اساس شدت بیماری سطح زیر منحنی گسترش بیماری (جدول 5) که خود تحت تاثیر آلودگی و دوره نهان و درصد آلودگی خوشچه و دانه قرار دارند، در دسته­ها و خوشه‌های مختلف قرار گرفتند. هنگامی‌ که فاصله کوفنتیک[8] روی عدد 10 قرار گیرد در مرحله اول 4 گروه ایجاد گردید که در این گروه ها نمونه­های مشابه با یکدیگر قرار داشتند ولی در عین حال نمونه­های مقاوم و حساس در گروه­های متمایز قرار نگرفتند. در این بررسی، تمایز گروه­ها در فاصله کوفنتیک 9 صورت گرفت که موجب گروه‌بندی ارقام در پنج گروه جدید، با ویژگی های درون گروهی مشابه و بین گروهی متفاوت از نظر واکنش به قارچ عامل بیماری گردید. در خوشه اول هفت ژنوتیپ، در خوشه دوم پنج ژنوتیپ، در خوشه سوم چهار ژنوتیپ و در خوشه چهارم نیز چهار ژنوتیپ و در خوشه پنجم چهار نمونه قرار گرفت. با توجه به دندروگرام (شکل 2)، ارقام گروه یک و دو نسبت به گروه‌های دیگر شباهت بیشتری با هم دارند در عین حال این گروهبندی نیز تفکیک و تمایز خوبی را در بین نمونه ها نشان می دهد. با توجه به شکل دندروگرام، تود‌ه‌های مقاوم و نیز مقاوم از نظر سرعت رشد بیماری در مزرعه، همگی در یک دسته قرار گرفته‌اند و می‌توان مواد آزمایشی مقاوم را برای انجام آزمایش‌های بعدی و برنامه­های اصلاحی از بین این توده‌ها انتخاب نمود.

نتایج آزمایش­های مولکولی

استفاده از نشانگر‌های مولکولی به دلیل ماهیت ویژه آنها می‌تواند در هر مرحله‌ای از رشد و بدون تخریب کامل بافت های مفید گیاه صورت گیرد. تحقیقات گسترده ای با این هدف و با کاربرد نشانگر‌های مختلف: آیزوزایم، RAPD، AFLP و SSR در گونه­های متعدد انجام شده است. در مورد برخی گونه‌های گیاهی، مشخص شده است که نشانگرهای ریزماهواره تنوع بیشتری در مقایسه با سایر نشانگر‌های مولکولی نشان می‌دهند
(Roder et al., 1998; Hang et al., 2002) . به علاوه، روشن شده است که ریزماهواره­ها در ارتباط با آن بخش از ژنوم‌ها می‌باشند که نواحی کم نسخه نامیده می‌شوند
(Morgante et al., 2002). این نشانگرها به عنوان ابزاری توانمند جهت تمایز ژنوتیپ‌ها از یکدیگر و مطالعه تنوع ژنومیکسی در ژرم پلاسم شناخته شده‌اند
(Donini et al., 1999; Chebotal et al;., 2001). درمقایسه­ای که توسط Jones و همکاران (1998)، بین سه نشانگر RAPD، AFLP و SSR از نظر قابلیت اعتماد و تکرارپذیری نتایج انجام دادند  مشخص نمودند که نشانگر‌های SSR بالاترین تکرار پذیری را در میان نشانگر‌های دیگر به خود اختصاص می‌دهند. در این آزمایش برای تمایز بهتر چند شکلی قطعات ریزماهواره با توجه به این که ژل آگارز 2% استفاده شد، بنابراین توانایی تفکیک در حد قابل قبولی بوده است (شکل 3). انتخاب آغازگرهای مورد استفاده در این پژوهش پس از بررسی‌های گوناگون روی پژوهش های انجام شده و پایگاه‌های اطلاعاتی گندم و در نهایت با توجه به میزان چند شکلی آنها بر اساس مقالات Roder و همکاران (1998) انجام شد. تجزیه و تحلیل استفاده از تعداد 10 جفت آغازگر مربوط به نشانگر ریز ماهواره روی نمونه های مورد بررسی، نتایج متفاوتی را نشان داد. نشانگر GWM18 در تمام نمونه­ها باند در چهار اندازه متفاوت تولید کرد که 13 نمونه دارای باند یکسان از نظر اندازه بودند. البته نشانگر GWM577 نیز باندهایی مشابه نشانگر پیشین تولید کرد، اگرچه از نظر توالی و تعداد بازهای تکرارهای ساده تفاوت دارند و نشانگر GWM18  باند کمی بزرگتر تولید می کند، به نظر می رسد که در بازهای غیر تکراری تفاوت داشته که آن اختلاف را جبران می کند (جدول 3). این دو نشانگر ریز ماهواره در ارتباط با تمایز بین نمونه های مقاوم و حساس در این پژوهش اطلاعات مفیدی ندادند. نشانگر GWM120 در عین تولید باند در همه نمونه ها در 19 نمونه باند با اندازه یکسان تولید کرد. فرآیند تکثیر در 5 نمونه دیگر دو نوع باند با اندازه های متفاوت بود که اطلاعات مفیدی در مورد مقاومت و حساسیت به دست نیامد. نشانگر GWM219 در همه نمونه ها تولید باند نمود که اندازه آن در تعداد 20 نمونه مساوی بود. باند تولیدی در 4 نمونه دیگر که متفاوت از نمونه های یاد شده بودند اندازه باند نیز یکسان بود که این نمونه­ها در یک گروه مقاوم و یا حساس نبودند. با نشانگر GWM234 در یک نمونه تولید باند نشد و در سایر نمونه ها تولید باند کرد که 16 نمونه دارای باند مشابه که شاهد حساس نیز جزء این گروه است و 7 نمونه نیز دارای باند یکسان و بزرگتر از باند نمونه های قبلی است و شاهد مقاوم نیز در این گروه قرار دارد (شکل 3). نشانگر ریز ماهواره GWM251  نیز فقط در یک نمونه فرآورده در واکنش چند زنجیره ای تولید نکرد. البته این نشانگر از نظر نحوه تمایز نمونه ها مانند نشانگر قبلی است ولی از نظر تعداد بازهای توالی تکرار ساده این نشانگر bp16 کوچکتر از نشانگر قبلی است. نشانگر GWM340 در تعداد 23 نمونه تولید باند کرد. باندهای به دست آمده به دو اندازه مختلف تولید و نمونه ها را تفکیک نمود که 6 نمونه و شاهد مقاوم دارای باند بزرگتر از باند تولید شده 17 نمونه دیگر بود. البته نتایج تجزیه و تحلیل فرآورده حاصل از سه نشانگر ریز ماهواره GWM234، GWM251 و GWM340 که فرآورده­های متفاوت از نظر اندازه داشتند می توانند اطلاعات مفیدی را ارائه دهند. البته برای استفاده از این نشانگرها برای تمایز نمونه های مقاوم و حساس نیاز به آزمایش های بیشتری از نظر ارزیابی فنوتیپی و ژنوتیپی به ویژه تعداد نمونه های زیادتر و نسل های در حال تفرق است.         

استفاده از نشانگر GWM389 در تمام نمونه ها تولید باند کرد، البته این فرآورده­ها در تمام نمونه­ها یکسان و هیچ تفاوتی از نظر اندازه نداشتند. بنابراین، استفاده از این نشانگر اطلاعات مفیدی در تمایز بین نمونه را ارائه نمی دهد. نشانگر ریزماهواره GWM400 برای تمام نمونه ها تولید باند نمود و باندها از نظر اندازه دو نوع بودند و هر 12 نمونه یک نوع باند تولید کردند، ولی در عین حال شاهدهای مقاوم و حساس تفاوتی نشان ندادند.

جدول 4-  نتایج ارزیابی مقاومت به فوزاریم سنبله توده های گندم بر اساس تیپ آلودگی و درصد آلودگی سنبله.

Table 4- The evaluation results of accessions cultivated for resistance to wheat Fusarium head blight on the basis of infected Rachis percent and Infection type in Gharakhil research station, Sari.

نشانگر GWM408 در 23 نمونه تولید 4 نوع باند با اندازه متفاوت نمود. این نشانگر اگرچه از نظر تنوع، باندهای گوناگون و متمایزی تولید کرد ولی در مورد تمایز نمونه­های حساس و مقاوم در این تحقیق زیاد مفید نبود. استفاده از نشانگر­هایSSR  نشان داد که نمونه های مورد آزمایش دارای تنوع خوبی بوده و منابع ارزشمندی برای استفاده در اصلاح گندم در کشور وجود دارد. طی تحقیقی Roder و همکاران (1998) با استفاده از 230 آغازگر موفق به شناسایی 279 مکان ژنی شدند که از میان 214 جایگاه ریز ماهواره به عنوان نشانگر‌های مفید شناسایی گردیدند.

جدول 5 - سطح زیر منحنی پیشرفت آلودگی گندم­های مورد ارزیابی در مزرعه در سه زمان مختلف 10 (T1) ، 14 (T2) و 18 روز  (T3)پس از افشانه کردن جدایه­های مختلف فوزاریوم.

Table 5- AUPDC of wheat accessions evaluated in the field in 3 periods of 10 (T1), 14 (T2) and 18 (T3) days after spraying of different isolates of Fusarium.

مقایسه سطوح تنوع بین تحقیقات مختلف مشکل است زیرا هم تعداد الل‌های شناسایی شده در هر جایگاه، میزان تنوع ژنتیکی نمونه­ها و هم به تعداد ژنوتیپ های مورد بررسی در تحقیق بستگی دارد. با این حال آغازگر‌های انتخاب شده علاوه بر نشان دادن تنوع آللی در تحقیق Roder و همکاران (1998) در تحقیق با ژنوتیپ های مورد بررسی و تعداد مشابه نشانگر ریز ماهواره می‌توان نتایج تحقیقات مختلف را مورد مقایسه قرار داد  که در این آزمایش نیز نتایج مفیدی از نظر تنوع و وابستگی نشانگر به مقاومت و حساسیت ژنوتیپ­ها به دست آمد.

شکل 2 - تجزیه خوشه‌ای برای صفات اندازه‌گیری شده در مزرعه.

Figure 2- Cluster analysis of wheat for different traits evaluated in the field.

جدول 6- تجزیه واریانس گندم‌های  مورد ارزیابی برای صفات بررسی شده در مزرعه.

^ns اختلاف غیر معنی دار و ** اختلاف خیلی معنی دار (در سطح 1درصد)  

       Table 6. Analysis of variance evaluated wheat accessions for different traits in the field of Gharakhil station, Sari.