Determination of Rhizobium species and heterogeneity of strains causing grapevine crown gall disease by IS50-PCR

تعیین گونه ها و تنوع استرین های ریزوبیوم عامل بیماری گال طوقه مو با IS50-PCR

کیومرث روح رضی¹، حشمت اله رحیمیان*²

1- دانشجوی دکتری بیماری شناسی گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه بوعلی سینا همدان

2- استاد میکروبیولوژی و بیماری های گیاهی، گروه گیاهپزشکی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری

تاریخ دریافت: 24/7/1390، تاریخ پذیرش: 7/5/1391

چکیده

بیماری گال طوقه یکی از مهم ترین بیماری های تاک در اکثر تاکستان های دنیا است ولی خسارت بیماری در مناطقی که آب وهوای سرد دارند شدیدتراست. به منظور بررسی تنوع گونه ها و استرین های ریزوبیوم عامل بیماری، 105 استرین از غده های در حال رشد روی ساقه و طوقه انگور(Vitis vinifera)، در استان های آذربایجان شرقی و غربی در سال های 89-1388 جدا گردید. شناسایی گونه و تنوع استرین ها با مقایسه ویژگی های فنوتیپی ، حضور ژن virD2 ، ژن سنتز پلی گالاکتروناز و نیز انگشت نگاری ژنتیکی حاصل از IS50-PCR با یکدیگر و با استرین های مرجع Rhizobium ارزیابی گردید. ژن virD2 استرین ها با استفاده از جفت آغازگر VirD2A/VirD2C تکثیر گردید که 92 استرین با این آغازگر قطعه 224 جفت نوکلوتیدی را تکثیر کردند. به منظور تفکیک دو گونه R.vitis  و R.radiobacter ژن مولد پلی گالاکتروناز استرین ها با استفاده از جفت آغازگرPGF/PGR تکثیر شد. تعداد 77 استرین که با این آغازگر قطعه 466 جفت نوکلوتیدی را تکثیر کردند به عنوان R.vitis و بقیه R.radiobacter تشخیص داده شدند. در مقایسه نقوش قطعات DNA تکثیرشده در IS50-PCR ، استرین ها در  سطح تشابه 55 درصد در 4 گروه قرار گرفتند، اکثر استرین ها با استرین مرجع R.vitis در یک گروه قرار گرفتند، در سطح تشابه %80 استرین های هر دو گروه تشکیل چندین زیر گروه را دادند که نشان دهنده وجود تنوع زیاد درون گونه ای در جمعیت هر دو گونه می باشد.

واژه های کلیدی: گال طوقه، ریزوبیوم، پلی گالاکتروناز، IS50-PCR

مقدمه

گیاهان دو لپه در بیش از پنجاه خانواده اعم از درختان مثمر و  غیرمثمر،گیاهان زراعی، زینتی و تعدادی از گونه های مهم بازدانه به باکتری عامل بیماری گال یا سرطان طوقه آلوده می شوند. شیوع و گسترش این بیماری در سالهای اخیر باعث زوال و مرگ برخی از درختان میوه به خصوص تاک شده و تهدیدی جدی برای این گونه محصولات تلقی می شود (Agrios, 2005; Burr et al., 1998). R. vitis گونه غالب عامل گال طوقه تاک بوده ولی در حدود 10درصد از موارد عامل، R.radiobacter است (Szegedi & Bottka, 2002; Burr et al., 1998). در پژوهشی Young et al. (2003)  بر اساس توالی 16S rRNA آگروباکتریوم های بیماریزا در گیاهان را متعلق به ریزوبیوم دانسته و نام جنس Agrobacterium  را به جنسRhizobium  تغییر نام دادند. هم اکنون هم نام اگروباکتریوم در بین بیماری شناسان گیاهی و بسیاری از محققین دیگر متداول بوده و بکار گرفته می شود.

وقوع سرطان طوقه انگور در ایران نخستین بار توسط امانی در سال 1345 ازقزوین گزارش گردید (Amani, 1966).  در پی آن آلودگی در چندین استان کشور مشاهده شد. سرطان طوقه انگور در سال 1372 از استان های فارس و کهگیلویه و بویر احمد  گزارش گردید (Ale-Yasin & Banihashemin, 1993). در  سال  1377 باکتری عامل بیماری از تاکستان های کرج و تاکستان جدا و تحت گونه A.vitis شناسایی گردید (Fatehi et al., 1998). در پژوهشی Irani & Ghasemi (2004) عامل گال طوقه و ریشه تاکستان های استان آذربایجان غربی را A.vitis معرفی کردند.

تنوع جمعیت های اگروباکتریوم بدست آمده از گیاهان باغی و زینتی در چند نقطه کشور ارزیابی  و استرین ها از نظر فنوتیپی به سه گروه تقسیم بندی شدند، استرین های به دست آمده از تاک بیشترین شباهت فنوتیپی را به R.radiobacter داشتند و در آزمون BOX-PCR تنوع وسیعی نشان دادند (Salehi et al., 2006).

براساس نتایج بررسی های انجام شده هنوز به روشنی مشخص نیست که گال طوقه انگور در آذربایجان و برخی از استان های دیگر ناشی از کدام گونه ریزوبیوم بوده وسهم دو گونه R.vitis  و R.radiobacter به عنوان عامل بیماری در تاکستان­ها چقدر بوده و جمعیت ها تا چه حد همسان یا متنوع هستند.

با در نظر گرفتن اهمیت و گستردگی محصولات مختلف، از جمله انگور که از حمله این باکتری خسارت  می بینند و با توجه به پیشرفت بیش از بیش عامل بیماری و خسارت قابل توجه ناشی از آن، لازم است جهت تدوین برنامه های مناسب پیشگیری و مدیریت موثرتر بیماری، تنوع عامل آن به طور دقیق شناسایی گردد. پژوهش حاضر در جهت شناسایی گونه یا گونه های ریزوبیوم مولد گال طوقه و ساقه مو و تنوع احتمالی آن ها در استان های آذربایجان شرقی و غربی بر پایه ویژگی های فنوتیپی و ژنوتیپی صورت گرفته است.

مواد و روش ها

نمونه برداری و جداسازی

در سال­های 1390-1389 از تاکستان های مناطق مختلف استان آذربایجان شرقی (شهرستان­های مراغه، جلفا، اهر، مرند، سراب، تبریز، اسکو، آذرشهر، بناب، میانه و عجب شیر) و برخی مناطق استان آذربایجان غربی (شهرستان های میاندوآب و سلماس) بازدید و نمونه هایی از ساقه و طوقه تاک­های دارای گال سفید و به ظاهر در حال رشد برداشته شد. نمونه های تاک در پاکت های کاغذی قرار داده شده و به آزمایشگاه منتقل گردید. نمونه­های گال داخل پتری های استریل حاوی چند قطره آب مقطر استریل به قطعات کوچکتر خرد شده و پس از 30 دقیقه نگهداری در شرایط استریل، یک قطره از سوسپانسیون حاصل روی محیط PDA+CaCO3 (%Potato dextrose agar + CaCO3 5) مخطط شده و تشک ها در دمای  28-25 درجه سلیوس نگهداری شدند (Schadd et al., 2001). پس از گذشت 3-2 روز پرگنه های شبیه به  Agrobacterium(پرگنه های سفید رنگ، محدب با حاشیه صاف) انتخاب گردید. هر استرین به طور جداگانه روی محیط کشت های انتخابی ری ساسر (RS) و دی وان ام (D1M) مخطط گردیدند (Schaad et al., 2001; Roy & Sasser, 1983).

آزمون بیماریزایی

جدایه ها روی محیط نوترینت آگار حاوی سوکروز (NAS)  در دمای 28 درجه سلسیوس کشت داده شدند. بعد از 24 ساعت، با سوزن استریل مقداری از کلنی باکتری­ها برداشته شده و با ایجاد زخم بر روی ساقه جوان گوجه فرنگی (Lycopersicom esculentum Mill.)، آفتابگردان (Helianthus annus L.) و توتون (Nicotiana tabacum L.) مایه زنی گردیدند. گیاهان مایه زنی شده به مدت 4-3 هفته در گلخانه با دمای 28-22 درجه سلسیوس نگهداری شدند (Bouzar et al., 1995; Burr & Katz, 1983).

در نمونه شاهد، قسمتی از ساقه گیاهان مورد آزمایش با سنجاق استریل زخمی شده و بدون مایه زنی در شرایط مشابه نگهداری شد.

آزمونهای بیوشیمیایی، فیزیولوژیکی و تغذیه ای برای شناسایی استرین ها

آزمون های بیوشیمیائی و فیزیولوژیک طبق روش های استاندارد باکتری شناسی (Schaad et al., 2001; Bouzar et al., 1995) انجام شد. استفاده از منابع کربنی با استفاده از محیط پایه آیر و به روش شاد انجام شد، قندها، اسید های آلی و اسیدهای آمینه با روش تندال[1] و برخی با عبور از فیلتر 22/0 میکرومتری سترون و به غلظت نهائی 5/0 تا یک درصد به محیط پایه اضافه شد. نتایج استفاده یا عدم استفاده از منابع کربنی بر اساس مقایسه میزان رشد و تغییر اسیدیته محیط کشت نسبت به شاهد (محیط آیر فاقد منبع کربنی) تا چهار هفته پس از کشت و نگهداری تشتک ها در دمای °C28-25، ارزیابی گردید.

جداسازی DNA ژنومی

جداسازی DNA از سلول های باکتریایی به روش لایز قلیایی انجام شد (Arabi et al., 2002). دو روز پس رشد استرین های باکتری در محیط NA در دمای °C28– 25، در آب مقطر استریل سوسپانسیون شدند. کدری سوسپانسیون ها در 600 نانومتر به 2/0واحد تنظیم و به آنها 1/0 حجم هیدروکسید پتاسیم 10درصد اضافه شد. نمونه ها به مدت دو تا سه دقیقه در آب جوش قرار داده شدند، شفاف شدن سوسپانسیون به عنوان لایز شدن سلول های باکتریایی تلقی گردید، نمونه ها به مدت 5 دقیقه با سرعت 12هزار دور در دقیقه سانتریفیوژ شد، سپس لایه رویی از لوله ها برداشته شده و در دمای 20- درجه سلسیوس نگهداری شد. از این نمونه ها به عنوان DNA الگو در واکنش های زنجیره ای پلی مراز استفاده شد.

تکثیر ژن virD2 استرین ها

واکنش ها به حجم 25 میکرولیتر شامل 5/2 میکرولیتر بافر 10X PCR، 5/2 میلی مولار MgCl₂، 2/0 میلی مولار از مخلوط dNTP، 5/1 میکرولیتر DNA الگو، 5/1 واحد آنزیم تک پلیمراز (شرکت سینا ژن) و 10پیکو مول از جفت آغازگر(5^/- ATG CCC GAT CGA GCT CAA GT -3^/) VirD2Aو  VirD2C (5^/- TCG TCT GGC TGA CTT TCG TCA TAA -3^/) (Hass et al.,  1995) (ساخته شده توسط شرکت Bionner کره جنوبی) انجام شد. از دستگاه ترموسایکلرApplied Biosystems 2720(USA) برای تکثیر DNA استفاده شد.

برنامه زمانی و دمایی شامل مرحله واسرشت سازی اولیه ^°C94 به مدت سه دقیقه، 35 چرخه شامل واسرشت سازی ^°C94 به مدت یک دقیقه اتصال آغازگر به DNA، ^°C50 به مدت 1 دقیقه و گسترش در دمای ^°C72 به مدت 1 دقیقه و در آخر گسترش نهایی در دمای ^°C72 به مدت 10 دقیقه به کار برده شد (Hass et al. 1995).

تکثیر ژن کدکننده آنزیم پلی گالاکتروناز

واکنش ها به حجم 25 میکرولیتر شامل 5/2 میکرولیتر بافر 10X PCR، 5/2 میلی مولار MgCl2، 2/0 میلی مولار از مخلوط dNTP، 5/1 میکرولیتر DNA الگو، 5/1 واحد آنزیم تک پلیمراز (شرکت سیناژن) و 10پیکو مول از جفت آغازگرPGF(5^/- GGG GCA GGA TGC GTT TTT GAG -3^/) PGR (5^/- GAC GGC ACT GGG GCT AAG GAT -3^/) (Szegedi & Bottka, 2002) (ساخته شده توسط شرکت Bionner کره جنوبی) انجام شد. برنامه زمانی و دمایی شامل مرحله واسرشت سازی اولیه ^°C94 به مدت سه دقیقه، 35 چرخه شامل واسرشت سازی ^°C94 به مدت یک دقیقه اتصال آغازگر به DNA، ^°C 54 به مدت 50 ثانیه و گسترش در دمای ^°C72 به مدت 1 دقیقه و در آخر گسترش نهایی در دمای ^°C72 به مدت 10 دقیقه به کار برده شد (Bini et al., 2008).

انگشت نگاریDNA ژنومی  با IS50-PCR

انگشت نگاری  DNAژنومی با روش IS50-PCR (insertion sequence) با استفاده از آغازگر IS50 ('CAGGACGCTACTTGTGT-3'5) طبق روش­های توصیه شده و با کمی تغییر انجام گردید (Weingart & Volksch, 1997). واکنش ها به حجم 25 میکرولیتر شامل 5/2 میکرولیتر PCR buffer 10X، 5/2 میلی مولار MgCl2، 2/0 میلی مولار از مخلوط dNTP، 5/1 میکرولیتر DNA الگو و 5/1 واحد آنزیم تک پلیمراز (شرکت سیناژن) و 10 پیکومول از آغازگر انجام شد. تکثیر با برنامه دمایی 4 دقیقه در^°C94، سپس 35 چرخه ^°C94به مدت 1 دقیقه، دمای اتصال ^°C38به مدت 1 دقیقه و دمای گسترش ^°C72 به مدت 3 دقیقه  انجام شد، طویل شدن نهایی رشته­های DNA به مدت 10دقیقه در ^°C72صورت گرفت. هشت میکرولیتر از محصول PCR با دو میکرولیتر محلول حاوی 15/0 درصد برم فنل بلو و50 درصد گلیسرول در بافر تریس برات ( TBE، 89/  مولار تریس، 89/0 مولار اسید بوریک، 002/0 مولار EDTA، 2/8 ~ pH) مخلوط و در چاهک­های ژل آگارز 5/1% ریخته شده و با بکاربردن همین بافر به عنوان بافر محفظه در اختلاف پتانسیل 90 ولت الکتروفورز گردید. برای تعیین اندازه قطعات از نشانگر 1Kb و 100bp (ساخت شرکت Fermentas) استفاده گردید. ژل با اتیدیوم بروماید (محلول 5/0 میکروگرم در میلی لیتر) رنگ آمیزی و از آن عکسبرداری شد (Ausubel et al., 1992).

تجزیه وتحلیل داده ها

گروه بندی جدایه ها با مقایسه نقوش قطعات DNA در ژل و نمره دهی بر پایه وجود یا عدم وجود قطعات همسان و تعیین ضریب تشابه جاکارد[2] صورت گرفت. دندوگرام با روش مقایسه جفت ها از طریق میانگین های بی وزن[3] (UPGMA) و با استفاده از نرم افزار NTSYS 2.02 ترسیم گردید.

نتایج

جداسازی

از کشت گال های طوقه و ساقه تاک های نمونه برداری شده از مناطق مختلف آذربایجان، 105 استرین با پرگنه های سفید رنگ، محدب و با حاشیه صاف که پس از سه روز از زمان کشت به قطر دو تا سه میلیمترروی محیط  PDA(سیب زمینی-دکستروز-آگار) رسیده بودند به دست آمد. نام استرین ها و مناطق جداسازی آن ها در جدول 1 نوشته شده است. هر استرین به طور جداگانه روی محیط دی وان ام مخطط گردید و استرین های شبه اگروباکتریوم (با کلونی های محدب و متالیک) انتخاب گردید. از بین 105 استرین ها 77 استرین پس از 4 روز از زمان کشت مخطط آنها روی محیط ری ساسر پرگنه های سفید با مرکز قرمز رنگی، که یکی از مشخصه های R.vitis است، را تولید کردند.

بیماریزایی

از بین 105 استرین بدست آمده، 99 استرین (به جزء استرین هایE1 تاE4 ، D1 و D2) قادر به ایجاد گال در گیاهان گوجه فرنگی، آفتابگردان و توتون پس از 4-3 هفته بودند.

تعیین ویژگی های فنوتیپی

همه جدایه ها گرم منفی، کاتالاز و اکسیداز مثبت، متحرک و هوازی بوده و در آزمون­های قلیایی کردن شیر لیتموس،‌ تحمل نمک 2%،‌ هیدرولیز اسکولین و توئین 80 مثبت، ولی در  آزمونهای هیدرولیز نشاسته و ‌ژلاتین و تولید  اندول منفی بودند. جدایه ها براساس خصوصیات مورفولوژیکی، فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی به دو گروه تقسیم شدند: گروه اول که شامل اکثر جدایه­ها بود با جدایه مرجع ICMP (Intern. Collection of Microorganisms from Plants, Auckland, New Zeeland) 10752 R.vitis در یک گروه قرار گرفتند. گروه دوم که از مناطق اهر، مرند، میاندوآب، سلمساس و مراغه به دست آمده بود با جدایه مرجع R.radiobacter ICMP 5856 در یک گروه قرار گرفتند (خصوصیات  فنوتیپی استرین ها در جدول 2 نوشته شده است). بررسی خصوصیات فنوتیپی استرین های بدست آمده از تاکستان های آذربایجان حاکی از دخالت دو گونه R.vitis و R.radiobacter در ایجاد گال طوقه و شاخه های انگور در این استان ها است. بر این اساس تنوع درون گونه ای استرین های گروه یک که با استرین مرجع R.vitis همگروه شدند بیشتر از گروه دو بود.

تکثیر ژن virD2 استرین ها

همه استرین ها به جز استرین های G1 تا G7، E1 تا E4، D1 و D2 و استرین مرجع R.radiobacter ICMP 5785 قادر به تکثیر قطعه 224 جفت نوکلوتیدی از ژن virD2  بودند که حاکی از وجود پلازمید Ti در استرین هایی است که قادر به تکثیر قطعه مورد نظر بودند (شکل1).

جدول1- نام محل و سال جداسازی هریک از استرین های Rhizobium به دست آمده از تاکستان های استان های آذربایجان شرقی و غربی.

Table 1- Source and year of isolation of Rhizobium strains obtained from East and West Azarabayjan vineyards.

جدول2- خصوصیات مورفولوژیک، بیوشیمیائی و تغذیه ای استرین های بدست آمده از تاکستان های آذربایجان.

Table 2-Morphological, biochemical and physiological characteristics of the bacterial strains isolated from vineyards of Azarbayjan.

ادامه جدول 2

+ : همه استرین ها پاسخ مثبت دادند    - : همه استرین های پاسخ منفی دادند      a: درصد استرین هایی که پاسخ مثبت دادند

a = percentage of strains with positive reaction.  .- = negative results with all strains . + = positive results with all strains

شکل1- قطعه224 بازی تکثیر شده از ژن virD2 استرین های آگروباکتریوم عامل گال طوقه مو در ژل اگارز 5/1 درصد رنگ آمیزی شده با اتیدیوم بروماید، M: نشانگر جرم مولکولی bp100.

Figure 1- Electrophoresis of the 224bp fragment of the virD2 gene amplified in PCR

of representative strains of Agrobacterium isolated from galls on grapevine crowns, in 1.5% agarose gel and stained with ethidium bromide, M: 100bp DNA ladder.

تکثیر ژن کدکننده آنزیم پلی گالاکتروناز

با توجه به اینکه استرین های R.vitis تولید آنزیم پلی گالاکتروناز می کنند، لذا برای تفکیک دو گونهR.vitis  و R.radiobacter، ژن کد کننده آنزیم پلی گالاکتروناز استرین ها با استفاده از آغازگر اختصاصی PGF/PGR تکثیر گردید، تعداد  77 استرین که با این آغازگر  قادر به تکثیر باند 466 جفت نوکلوتیدی بودند R.vitis شناسایی شده و بقیه R.radiobacter  تشخیص داده شدند (شکل2).

انگشت نگاری DNA ژنومی با IS50-PCR

براساس آزمون های فیزیولوژیکی، بیوشیمایی و بیماریزایی و همچنین نتایج بدست آمده از تکثیر ژن های virD2 و مولد آنزیم پلی گالاکتروناز، 40 استرین از بین استرین ها به عنوان نماینده انتخاب و DNA ژنومی آنها با IS50-PCR تکثیر گردید (شکل3). تعداد باندهای تکثیر شده با این روش 15 تا 25 باند و محدوده اندازه باندها بین  100 تا 3000 جفت نوکلوتید بود. مقایسه نقوش قطعات DNA تکثیرشده  با IS50-PCR نشان داد که استرین ها در  سطح تشابه 55 درصد در 4 گروه قرار گرفتند (شکل4) با توجه به دندروگرام حاصله اکثر استرین ها ی عامل گال طوقه مو با استرین مرجع R.vitis ICMP 10752 در یک گروه قرار گرفتند و 9 استرین با استرین مرجعICMP 5856  R.radiobacter گروه جداگانه­ای را تشکیل دادند. استرین های مرجع R.rubi ICMP 6428 و R.rhizogenes ICMP5794 هریک در شاخه ای که فاصله زیادی با خوشه های دیگر داشت، قرار گرفتند. در سطح تشابه %80 استرین های هر دو گروه تشکیل چندین زیر گروه را دادند که نشان دهنده وجود تنوع زیاد درون گونه ای در جمعیت هر دو گونه می باشد.

شکل2- قطعه 466 بازی تکثیر شده از ژن مولد پلی گالاکتروناز استرین ها در ژل آگارز 5/1 درصد رنگ آمیزی شده با اتیدیوم بروماید. استرین های Rhizobium vitis(Agrobacterium vitis): F1، Bd2، H3، Marq7، K3، Marq3، S4، SA3، Aj2، E3 و Az2،  استرین های R.radiobacter(A.tumefaciens) :N4، MR1 و K3، M: نشانگر جرم مولکولی bp 100

 Figure 2- 466 bp fragment from the polygalacturonase gene in 1.5 % agarose gel stained with etidium bromide. Rhizobium vitis (Agrobacterium vitis) isolates (Lanes Az2, Marq7, H3, Bd2, E3, F1, AJ2, SA3, and S4). R.radiobacter (A.tumefaciens) (LanesN4, MR1, K3), M: 100bp DNA ladder.

بحث

گال طوقه یکی از مهمترین بیماری های تاک در کشور است که بیشتر در مناطق سردسیر و برف گیر بروز می­نماید (Burr & Katz, 1983,1984)، از این رو تاکستان های استان های آذربایجان شرقی و غربی را می توان جزء مستعدترین مناطق ایران برای وقوع این بیماری به حساب آورد. گال طوقه تاک یکی از اولین بیماری های باکتریایی گزارش شده از ایران به شمار می آید (Amani, 1966 ) در آن زمان بر اساس معدود آزمایش های  فنوتیپی صورت گرفته، از جمله قابلیت مصرف چند منبع کربنی، باکتری عامل بیماری در قزوین  A.tumefaciens(R.radiobacter) شناسایی شد. در برخی از گزارش های بعدی که در زمینه شناسایی بیماری و تعیین باکتری عامل آن صورت گرفته است سهم گونه های مختلف Rhizobium  (Agrobacterium) در ایجاد گال طوقه تاک مشخص  نشده است (Shahabi & Taghavi, 2010; Salehi et al., 2004; Javaheri et al., 2000).

شکل3- نقوش قطعات حاصل از تکثیر DNA جدایه های بدست آمده از تاکستان های آذربایجان و استرین های مرجع در آزمون  IS50-PCR.  1: استرین Marq1، 2: استرین Bd1، 3 : استرین H2، 4: استرین F1، 5: استرین R2، 6 : استرین Aj3، 7: استرین Bd5، 8: استرین SA1، 9: استرین  SA3، 10: استرین R3، 11: استرین Az2، 12: استرین Az4، 13: استرینMR1،14: استرین Marq5، 15: استرین N2، 16: استرین R4، A: استرین  Rhizobium vitis ICMP10752، B: استرین مرجع ICMP5856 R.radiobacter، C:استرین R.rhizogenes ICMP5794، D: استرین R.rubi ICMP6428.

Figure 3- IS50–PCR fingerprints of Agrobacterium strains isolated from vineyards of Azarbayjan and reference strains. Lanes 1:Marq1; 2:Bd1; 3:H2; 4:F1; 5:R2; 6:Aj3; 7:Bd5; 8:SA1; 9:SA3; 10:R3; 11:Az2; 12: Az4; 13:MR1; 14:Marq5; 15:N2; 16:R4; A: Rhizobium vitis ICMP10752; B:R.radiobacter ICMP 5856; C:R.rhizogenes ICMP 5794; D:R.rubi ICMP6428; N:(Negative control);  M:1Kb DNA ladder.

در بررسی هایی R.vitis(A.vitis) به عنوان عامل گال طوقه تاک در استان های فارس، کهگیلویه و بویراحمد و آذربایجان غربی معرفی شده است (Irani & Ghasemi,  2004; Ale-Yasin et al., 1993).

بر اساس نتایج  آزمون های فنوتیپی، حساسیت به انتی بیوتیک ها و خصوصیات بیماری زایی گزارش شد که  32 استرین بدست آمده از گال طوقه تاک در دو منطقه کرج و تاکستان ناهمگون هستند به طوری که  68 درصد استرین ها متعلق به گونه A.vitis(R.vitis) بوده و بقیه استرین­ها،  بیوارهای 1 و 2 Agrobacterium (Rhizobium) هستند (Fatehi et al., 1998). بدین ترتیب مشخص ساختند که در منطقه ای که بیماری برای اولین بار از کشور از آن منطقه (تاکستان قزوین) گزارش شده است، هر دو گونه گالزا وجود داشته ولی گونه غالب عامل بیماری R.vitis است.

شکل 4- دندروگرام الگوی اثر انگشتی استرین های بدست آمده از تاک و استرین های مرجع در آزمون  IS50-PCR . A: استرین Rhizobium vitis ICMP10752، B: استرین ICMP5856 R.radiobacter، C: استرین R.rhizogenes ICMP5794، D:استرینR.rubi ICMP6428

Figure 4- IS50-PCR dendrogram obtained by comparison of strains isolated from grapevine and reference strains. A: Rhizobium vitis ICMP10752; B: R.radiobacter ICMP 5856; C: R.rhizogenes ICMP 5794; D:R.rubi ICMP6428.

در پژوهشی تنوع جمعیت های اگروباکتریوم بدست آمده از گیاهان باغی و زینتی درچند نقطه از کشور  ارزیابی و استرین ها از نظر فنوتیپی به 3 گروه تقسیم بندی شدند و در آزمون BOX-PCR تنوع وسیعی را نشان دادند (Salehi et al., 2004). در این گزارش نیز همانند نتایج بررسی های Javaheri et al. (2000) گونه غالب گالزا در تاک، از جمله در تاکستان های قزوین و کرج R.radiobacter شناسایی گردید. بر اساس گزارش های موجود از نظر تنوع و پراکندگی گونه های باکتری عامل بیماری گال طوقه مو، ناهمگونی گونه  و سهم گونه ها در ایجاد بیماری به طور دقیق مشخص نبوده و تناقض هایی از این نظر دیده می شود، در مجموع بر اساس بیشتر گزارش های منتشر شده به نظر می رسد در اکثر مناطق کشور، بیشترین سهم را گونه R.vitis در ایجاد گال طوقه داشته است (Safdari et al,. 2010; Shahabi & Taghavi, 2010; Salehi et al., 2004; Irani & Ghasemi, 2004; Javaheri et al., 2000; Salahi-Ardakani et al., 2000; Fatehi et al., 1998; Ale-Yasin et al., 1993).

در تحقیق حاضر، با نمونه برداری از گال طوقه و شاخه های تاک در استان های آذربایجان شرقی و غربی  و کشت نمونه ها روی محیط های PDA، D1M و RS، 105 استرین به عنوان ریزوبیوم (اگروباکتریوم) شناسایی شد، 77 استرین پس از 4 روز از زمان کشت روی محیط RS تولید کلنی های سفید با مرکز قرمز رنگ کردند که مشخصه گونه R.vitis(A.vitis) می باشد (Bini et al., 2008; Roy & Sasser, 1983)، لذا کارایی این محیط کشت در تفکیک اولیه گونه ها مناسب تر از دو محیط کشت دیگر تشخیص داده شد، درپژوهش دیگری نیز محیط RS به عنوان مهمترین محیط کشت برای جداسازی و شناسایی گونه های Rhizobium اعلام شده بود (Salahi-Ardakani et al., 2000). در این تحقیق با بکارگیری آزمون های فنوتیپی تا حدی تنوع درون گونه ای استرین ها تعین گردید ولی برای شناسایی دقیق عامل بیماری و بررسی تنوع احتمالی استرین ها از آغازگرهای اختصاصی با توجه به حساسیت بالا و سرعت انجام از واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز (PCR) استفاده شد.

تعداد 92 استرین با استفاده از جفت آغازگر VirD2A/VirD2C قادر به تکثیر قطعه 224 جفت نوکلوتیدی از ژن virD2  بودند که حاکی از وجود پلازمید Ti در استرین هایی است که قادر به تکثیر قطعه مورد نظر بودند، ولی استرین های G1 تا G7 با این که روی گوجه فرنگی گالزا بودند ولی نتوانستند با جفت آغازگر مذکور قطعه 224 جفت نوکلوتیدی را تکثیر کنند، لذا با توجه به نتایج Bini et al. (2008) این جفت پرایمر در همه استرین ها قادر به تکثیر قطعه مورد نظر نیست و برای تکثیر ژن virD2 این گروه از استرین ها باید از جفت آغازگر  VirD2A/VirD2E( Hass et al., 1995) استفاده شود.

در این بررسی پس از انجام IS50-PCR اثر انگشت نگاری استرین ها به دست آمد، آنالیز خوشه ای داده های حاصل با استفاده از روش UPGMA  و ضریب تشابه جاکارد نشان داد که استرین های ریزوبیوم (اگروباکتریوم) به دست آمده از مناطق مختلف استان آدربایجان شرقی و غربی دارای تنوع ژنتیکی هستند. در این بررسی مشخص شد که اثر انگشت ژنتیکی استرین ها با روش IS50-PCR می تواند به عنوان روشی کارا و مفید جهت ارزیابی تنوع ژنتیکی استرین های مختلف ریزوبیوم (اگروباکتریوم) مورد استفاده قرار گیرد. تحقیق حاضر نشانگر وجود تنوع در جمعیت های هر دو گونه Rhizobium در انگور، به ویژه وجود تنوع بیشتر و قابل تقسیم بودن استرین های R.vitis  از نظر زمینه ژنتیکی است. تنوع استرین های R.vitis در تاکستان های آذربایجان شرقی می تواند نشانه سابقه طولانی تر باکتری در این استان و بروز تغییرها یا جهش هایی که به مرور زمان اتفاق افتاده، باشد.