Evaluation of genetic diversity in pomegranate using morphological traits and molecular markers

بررسی تنوع ژنتیکی انار (Punica granatum L.) با استفاده از صفات مورفولوژیک و نشانگرهای مولکولی

طیبه قربانی¹، کیانوش چقامیرزا* ^{2 و 3}، عیسی ارجی⁴

1- دانش آموخته کارشناسی ارشد اصلاح نباتات دانشگاه رازی

2- استادیار اصلاح نباتات دانشگاه رازی

3- گروه پژوهشی بیوتکنولوژی مقاومت به خشکی

4- عضو هیات علمی مرکز تحقیقات کشاورزی استان کرمانشاه   

تاریخ دریافت: 25/7/1390، تاریخ پذیرش: 22/3/1391

چکیده

در این تحقیق به منظور بررسی تنوع ژنتیکی انارهای استان کرمانشاه، تعداد 44 ژنوتیپ انار جمع آوری شده از 6 منطقه در استان کرمانشاه استفاده شد. ژنوتیپ‌ها با استفاده از داده­های حاصل از 48 صفت مورفولوژیک و به روش تجزیه خوشه‌ای گروه­بندی شدند. تنوع ژنتیکی ژنوتیپ‌های انار مورد مطالعه با استفاده از دو نشانگر DNA چند شکل تکثیر شده تصادفی(RAPD) و بین توالی های تکراری ساده (ISSR) نیز ارزیابی گردید. توسط 20 آغازگر RAPD تعداد 183 باند تولید شد که میزان چند شکلی متوسط آنها 37/51 درصد بود. تجزیه خوشه‌ای ژنوتیپ‌ها را بر اساس نشانگرهای مورفولوژیک به چهار گروه و نشانگرهای RAPD به هفت گروه مجزا تقسیم نمود که در برخی موارد با گروه‌بندی مورفولوژیکی انطباق داشت و ضریب کوفنتیک به دست آمده 996/0 بود. در مجموع 114 باند نیز توسط 17 آغازگر ISSR تولید شد که متوسط چند شکلی 71/37  درصد بود. تجزیه خوشه‌ای بر اساس نشانگر ISSR، ژنوتیپ‌ها را به هفت گروه مجزا تقسیم کرد که تا حدودی با گروه‌بندی‌ آنها براساس صفات مورفولوژیک و نشانگرهای RAPD انطباق داشت و مقدار ضریب کوفنتیک 992/0 بود. با بررسی تنوع ژنتیکی ژنوتیپ‌های انار با استفاده از نشانگر‌های RAPD و ISSR ضمن مشخص شدن وضعیت ژنتیکی آن‌ها مشاهده شد‌ که ژنوتیپ‌های متفاوت در گروه‌های جداگانه دسته بندی شده و همچنین ژنوتیپ‌های یک منطقه به گروه‌های مختلفی راه یافتند. نتایج حاصل از این تحقیق حاکی از این بود که استان کرمانشاه دارای ذخایر غنی و تنوع بالای ژنتیکی گیاه انار است که این مسئله می‌تواند به نوعی تاییدی بر نظر دانشمندانی باشد که ایران را خاستگاه و موطن اصلی انار می‌دانند.

واژه‌های کلیدی: تنوع ژنتیکی، انار، نشانگرهای مورفولوژیک، RAPD و ISSR.

مقدمه

انار (Punica granatum L.) با تعداد کروموزوم‌های 16= x2n=2 و مقدار دگرگشنی 55 درصد، بومی ایران و رشته کوه‌های هیمالیا در شمال هندوستان است که از دوران باستان در نواحی مدیترانه‌ای آسیا، آفریقا و اروپا کشت می­شده است (Morton, 1987). ایران دارای غنی‌ترین‌ ذخایر ژنتیکی انار در جهان می‌باشد که به طور عمده در مناطق کویری از جمله استان‌های یزد، مرکزی، سیستان و بلوچستان، خراسان جنوبی و در منطقه غرب در استان کرمانشاه مورد کشت و کار قرار می‌گیرد. ایران مرکز تنوع انار و به احتمال زیاد مرکز پیدایش آن نیز می‌باشد (Sarkhosh et al., 2006). لازمه تعیین وضعیت ذخایر ژنتیکی و تشخیص شرایط گیاهان مبنی بر رو به انقراض بودن یا نبودن آنها، بررسی تنوع ژنتیکی گیاهان در نواحی مختلف می‌باشد. یکی از روش‌های بررسی تنوع ژنتیکی استفاده از خصوصیات ظاهری و مورفولوژیکی گیاه می‌باشد، اما مهمترین و بهترین ابزار بررسی تنوع ژنتیکی و تعیین روابط خویشاوندی و فیلوژنی استفاده از نشانگرهای DNA می‌باشد (Cheghamirza, 2004). یکی از  پرکاربردترین نشانگرهای DNA، نشانگر [1]RAPD  می‌باشد که برای تجزیه ساختار ژنتیکی جمعیت‌ها به‌ویژه جمعیت‌هایی که مطالعات زیادی بر روی آنها انجام نگرفته، بکار می‌رود. این نشانگر دارای کاربرد بسیار گسترده ای در زیست شناسی مولکولی گیاهی می‌باشد (Cheghamirza et al., 2002). یکی دیگر از نشانگرهای DNA،  نشانگر [2]ISSR است که با استفاده از آغازگرهای نیمه اختیاری شامل واحد‌های تکراری از توالی بازهای DNA  می‌باشند، به دست می‌آید. توارث این نشانگر به صورت غالب - مغلوبی است و در مطالعات تاکسونومیکی و فیلوژنتیکی کاربرد وسیعی دارد (Cheghamirza, 2004).

در بررسی تنوع ژنتیکی برخی از ژنوتیپ‌های انار با استفاده از تجزیه کلاستر بر اساس شش صفت مورفولوژیک ، ژنوتیپ‌ها در دو گروه اصلی شیرین ها یا کم اسید ها و ترش و ملس ها یا پر اسید ها قرار گرفتند. هریک از این گروه ها نیز به دو زیر گروه شامل ژنوتیپ‌های دانه درشت و دانه متوسط تا کوچک تقسیم بندی شدند (Zamani, 1990). اغلب ژنوتیپ‌های انار موجود در ایران بر اساس نام محلی و خصوصیات مورفولوژیک جمع آوری و در کلکسیون انار مرکز تحقیقات کشاورزی یزد کشت شد.(Behzadi Shahrbabaki, 1998)  برای اولین بار به منظور بررسی تنوع ژنتیکی ژنوتیپ‌های انار در ایران با استفاده از نشانگرهای RAPD  تعداد 28 ژنوتیپ انار مورد بررسی قرار گرفت. نتایج حاصل از ماتریس تشابه نشان داد که کمترین شباهت (2/29%) مربوط به دو ژنوتیپ دم ابروتی و پوست سیاه یزدی می‌باشد. در دندروگرام حاصله در حد تشابه 72 درصد، 22 ژنوتیپ در 5 گروه جای گرفتند و 6 ژنوتیپ باقیمانده هر کدام یک گروه مستقل را تشکیل دادند (Talebi Badaf et al., 2003). در مطالعه­ا‌ی تنوع ژنتیکی تعدادی از ژنوتیپ‌های انار به کمک نشانگرهای RAPD ارزیابی شد و دامنه‌ی تغییرات ضریب تشابه ژنتیکی در بین ژنوتیپ‌ها از 30% تا 80% متفاوت بود (Zamani et al., 2006). بررسی روابط ژنتیکی برخی از ارقام انار ایران با استفاده از نشانگر AFLP، نشان داد که علی‌رغم سطح چندشکلی پایین در ارقام مورد ارزیابی، تفاوت‌هایی دراندازه قطعات AFLPمورد ارزیابی وجود دارد.(Rahimi, 2003)  در بررسی تنوع ژنتیکی 6 توده بومی انار در چین، مشخص شد که درصد چند شکلی از 5/62% تا 11/86% متغیر است. این توده‌های بومی انار تفاوت معنی‌داری از نظر تنوع ژنتیکی نشان دادند (Yuan et al., 2007). در بررسی تنوع ژنتیکی انار در تونس مشخص شد که در میان ژرم پلاسم انارهای این منطقه تفاوت ژنتیکی و فنوتیپی معنی‌داری از نظر صفاتی چون اندازه ی میوه، رنگ و ویژگی‌های آب میوه وجود دارد.(Mars et al., 1999)  در مطالعه‌ ای، پلی مورفیسم میان برخی ژنوتیپ‌های انار ایرانی به کمک نشانگر RAPD بررسی شد، بالاترین و پائین ترین مشابهت بین ژنوتیپ‌ها به ترتیب 89/0و 29/0 گزارش شد (Sarkhosh et al., 2006).  با توجه به گستره کشت و کار انار در مناطق مختلف استان کرمانشاه، بررسی تنوع موجود در ذخایر ژنتیکی انار در این استان می تواند از اهمیت بالایی برخوردار باشد. لذا هدف تحقیق حاضر مطالعه ی تنوع ژنتیکی انار از مناطق مختلف استان کرمانشاه به کمک نشانگرهای مورفولوژیک و مولکولی بود.

مواد و روش‌ها

مواد گیاهی

به منظور ارزیابی تنوع ژنتیکی انار، 44 ژنوتیپ از شش منطقه در استان کرمانشاه جمع آوری گردید (جدول 1).

اندازه‌گیری صفات مورفولوژیک

حالت‌های تظاهری 48 صفت مورفولوژیک مربوط به ویژگی‌های درختی، برگ، گل و میوه با توجه به دستورالعمل ملی آزمون های تمایز، یکنواختی و پایداری در انار که توسط کمیته فنی ثبت ارقام گیاهی (Meidani et al., 2008) ارایه شده است، امتیاز دهی و مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.

مطالعات مولکولی

به منظور بررسی تنوع ژنتیکی در سطح مولکول DNA  از 20 آغازگر RAPD و 17 آغازگر ISSR استفاده شد (جدول 2).

با توجه به درختی بودن نمونه‌ها و بالا بودن میزان مواد بازدارنده، برای استخراج DNA از نمونه‌های برگی از روش ورابی و همکاران (Vroh Bi et al., 1996) استفاده شد. 

جدول 1- ژنوتیپ‌های انار جمع آوری شده به تفکیک مناطق مختلف.

Table 1- Collected pomegranate genotypes sorted by different regions.

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز طبق روش ویلیامز و همکاران (1990) با حجم مخلوط واکنش  25 میکرولیتر شامل MgCl₂( 2/3 میلی مولار)، dNTP(10Mm) (5/0 میکرومول)، Primer (5/2 میکرومول)،Taq DNA Polymerase (یک واحد)، DNA (30 نانوگرم) در دستگاه ترموسایکلر CORBETT Research  انجام گرفت. برای تفکیک باندهای تکثیر شده DNA، الکتروفورز ژل آگارز 2/1 درصد در بافر TAE 1X با ولتاژ 80  ولت به مدت یک ساعت انجام شد.

تجزیه و تحلیل داده‌ها

تجزیه و تحلیل داده‌های مورفولوژیکی شامل تجزیه خوشه‌ای و تجزیه به مؤلفه‌های اصلی با استفاده از نرم افزارver: 2.0  NTSYS انجام گرفت. همچنین برای تجزیه تابع تشخیص نرم افزار SPSS  مورد استفاده قرار گرفت. برای به دست آوردن داده‌های مولکولی، پس از انجام واکنش زنجیره‌ای پلیمراز با آغازگرهای RAPD و ISSR ، حضور و عدم حضور هر نوار با اعداد 1 و 0 برای تمامی نمونه‌ها تعیین شد. برای به دست آوردن دندروگرام از نرم افزار MVSP ver: 3.131 و برای تجزیه به مؤلفه‌های اصلی از نرم افزار NTSYS استفاده شد. جهت انجام تجزیه واریانس ژنتیکی نرم افزار  Genealex و برای تابع تشخیص نرم افزار 16.0 SPSS  مورد استفاده قرار گرفت.

جدول 2- فهرست آغازگرهای RAPD و ISSR مورد استفاده در تحقیق حاضر

Table 2 - List of RAPD and ISSR primers used in current research

* Pyrimidine, ** Purine

نتایج و بحث

تجزیه و تحلیل داده‌های مورفولوژیک

تجزیه خوشه‌ای

نتایج حاصل از تجزیه خوشه‌ای داده‌ها با استفاده از روش Ward و ضریب تشابه جاکارد نشان داد که ژنوتیپ‌ها بر اساس صفات مورد بررسی در فاصله اقلیدسی 10 در چهار گروه مجزا قرار می‌گیرند (شکل 1). گروه اول شامل سه نمونه از منطقه گلین گیلان غرب و یک نمونه از منطقه اناره گیلان غرب بود. این نمونه‌ها از نظر صفات تیپ درخت، رنگ حبه، جنسیت گل (تک جنسی یا دو جنسی بودن) و نسبت طول دمبرگ به رگبرگ میانی مشابه و همگی از منطقه گرم گیلانغرب بودند. گروه دوم شامل پنج نمونه از منطقه گره بان و چهار نمونه از منطقه ریجاب بود. این نمونه‌ها از نظر صفات تیپ درخت، رنگ حبه، نسبت طول خامه به پرچم و نسبت طول دمبرگ به رگبرگ میانی مشابه و مربوط به مناطق معتدل بودند. هفده نمونه گروه سوم شامل پنج نمونه از منطقه گره بان، یک نمونه از شهرستان پاوه، دو نمونه از منطقه اناره و پنج نمونه از منطقه پیران (سرپل ذهاب)، یک نمونه از منطقه ریجاب و سه نمونه از منطقه گلین بود. البته نمونه های متعلق به این گروه مربوط به مناطق متفاوت آب و هوایی بودند که از نظر صفات سطح چوب، وجود خار، موقعیت گل، محل تشکیل گل، نسبت طول خامه به پرچم و رنگ دانه با هم مشابه بودند. چهارده نمونه‌ی گروه چهارم شامل سیزده نمونه از شهرستان پاوه و یک نمونه از منطقه گلین بود، که از نظر ویژگی‌های تیپ درخت، رنگ دمبرگ، جنسیت گل و زمان رسیدن یکسان بودند. قرار گرفتن نمونه‌ها در این چهار گروه جداگانه نشان داد که انارهای این مناطق از نظر مورفولوژیکی با هم متفاوتند. بر اساس نتایج به دست آمده دسته بندی ژنتیکی مورفولوژیکی نمونه‌های مورد مطالعه با تقسیم بندی جغرافیایی آن‌ها تطابق چندانی نداشت که می‌تواند نشان دهنده عدم تاثیر شرایط محیطی بر صفات مورفولوژیک مورد بررسی یا انتقال ژنوتیپ‌ها از منطقه‌ای به منطقه‌ی دیگر باشد. البته نمونه‌های مربوط به منطقه پاوه اکثرا در یک گروه قرار گرفتند به عبارت دیگر در این منطقه طبقه‌بندی ژنتیکی مورفولوژیکی نمونه‌ها با طبقه‌بندی جغرافیایی تا حدود زیادی تطابق نشان داد. در گزارش هایی جهت گروهبندی 24 ژنوتیپ انار از منطقه ساوه(Zamani, 1990)  و برای دسته بندی نمودن 138 ژنوتیپ گردوی مناطق مختلف کشور (Hagh Jooyan et al., 2005) از روش تجزیه خوشه ای و تابع تشخیص استفاده نموده اند. برای کاهش داده‌ها جهت شفاف سازی روابط بین دو یا تعداد بیشتری خصوصیت و شکستن واریانس کل خصوصیات اصلی به تعداد محدودی از مؤلفه‌های جدید غیر وابسته، تجزیه به مولفه‌های اصلی داده ها بر اساس ماتریس واریانس کوواریانس انجام گرفت. بر اساس محور اول و دوم حاصل از تجزیه به مؤلفه‌های اصلی، پراکندگی ژنوتیپ‌ها مورد بررسی قرار گرفت که اولین مؤلفه 46/15 و مؤلفه دوم 06/10 درصد از تغییرات کل را توجیه نمودند. با توجه به این نمودار ژنوتیپ‌ها به 5 گروه تقسیم شدند (شکل 2).

    C A S E      0         5        10        15        20        25

  Label     Num  +---------+---------+---------+---------+---------+

  G3         23   ─┬─┐

  G6         26   ─┘ ├─────────────────────┐

  G2         22   ─┬─┘                     │

  A3         30   ─┘                       ├─────┐

  H6          6   ─┬─┐                     │     │

  H7          7   ─┘ ├─────────┐           │     │

  K4         19   ───┘         ├───────────┘     │

  H3          3   ───┬─────────┤                 │

  H4          4   ───┘         │                 │

  H5          5   ─┬───┐       │                 │

  K5         20   ─┘   ├───────┘                 │

  K2         17   ─┬───┘                         ├─────────────────┐

  K3         18   ─┘                             │                 │

  S1         11   ─┬─┐                           │                 │

  K1         16   ─┘ ├───┐                       │                 │

  G4         24   ───┘   │                       │                 │

  G1         21   ─┐     ├─────────┐             │                 │

  A1         28   ─┼───┐ │         │             │                 │

  S4         14   ─┘   ├─┘         │             │                 │

  S2         12   ─┐   │           │             │                 │

  G5         25   ─┼───┘           ├─────────────┘                 │

  S3         13   ─┘               │                               │

  H9          9   ───┬───────┐     │                               │

  S5         15   ───┘       │     │                               │

  H1          1   ─┬─┐       ├─────┘                               │

  P12        42   ─┘ ├───┐   │                                     │

  A2         29   ───┘   ├─┐ │                                     │

  H2          2   ─────┬─┘ ├─┘                                     │

  H8          8   ─────┘   │                                       │

  H10        10   ─────────┘                                       │

  P9         39   ─┬─────┐                                         │

  P11        41   ─┘     │                                         │

  P8         38   ─┬─┐   ├─────────┐                               │

  P10        40   ─┘ │   │         │                               │

  P2         32   ───┼───┘         │                               │

  P7         37   ───┘             │                               │

  P6         36   ─┬───┐           ├───────────────────────────────┘

  P13        43   ─┘   ├─┐         │

  P4         34   ─┬───┘ │         │

  P14        44   ─┘     ├─┐       │

  G7         27   ───┬─┐ │ │       │

  P1         31   ───┘ ├─┘ ├───────┘

  P3         33   ─────┘   │

  P5         35   ─────────┘

شکل 1- دندروگرام حاصل از تجزیه خوشه‌ای 44 ژنوتیپ ‌انار بر اساس صفات مورفولوژیک مورد بررسی با استفاده از روش Ward.

Figure 1 - Dendrogram generated by cluster analysis using of 44 pomegranate genotypes based on studies morphological traits using the Ward method.

طبق نتایج بدست آمده اغلب نمونه‌های پاوه در دو گروه جدا از سایر نمونه‌ها جای گرفته‌اند و نمونه P12 که در تجزیه خوشه‌ای جدا از دیگر نمونه‌های پاوه قرار گرفته بود در این تجزیه نیز جدا از دیگر نمونه‌های پاوه در یک گروه جدا و پرت قرار داشت. نمونه H4 از هرسین در یک گروه جداگانه قرار گرفته که در تجزیه خوشه‌ای به همراه برخی نمونه‌های H و K در یک گروه بود. همچنین نمونه‌های H8، H9 و H10 در یک گروه قرار گرفتند که این نتایج با نتایج حاصل از تجزیه خوشه‌ای نسبتا مطابقت داشت. سایر نمونه‌ها نیز در یک گروه بزرگتر قرار گرفتند که در تجزیه خوشه‌ای نیز اغلب در گروه‌های نزدیک به هم جای داشتند.

شکل 2- نمودار پراکنش دو بعدی ژنوتیپ‌ها با استفاده از صفات مورفولوژیک بر اساس ماتریس واریانس کوواریانس.

Figure 2 - Diagram of two-dimensional distribution of genotypes using morphological characters based on the variance covariance matrix.

نتایج حاصل از داده های مولکولی

نتایج حاصل از نشانگر RAPD

نتایج حاصل از 20 آغازگر RAPD مورد استفاده به طور خلاصه در جدول 3 آورده شده است. در مجموع 183 باند توسط این نشانگر تولید شد که از بین آنها تعداد 94 (37/51 درصد) چند شکلی نشان دادند. اندازه باندها بین 300 تا 3500 جفت باز متغیر بود. تعداد باندها در هر آغازگر از 5 تا 12 باند متغیر بود (شکل 3). درصد چند شکلی برای هر آغازگر بین 20% مربوط به آغازگر UBC28 و OPC15 تا 5/87 % مربوط به آغازگر E10 بود. متوسط تعداد کل باندها و متوسط باندهای چند شکل برای هر آغازگر به ترتیب 15/9 و 7/4 بود. به منظور بررسی محتوای اطلاعاتی چند شکلی نشانگرها از پارامترهایی مانند قدرت تفکیک، شاخص مارکری، درصد چندشکلی، نسبت چند شکلی مؤثر و محتوای اطلاعاتی چند شکلی استفاده شد (جدول 3). در رابطه با RAPD، بالاترین شاخص مارکری 52/1 و مربوط به آغازگر U17، بیشترین نسبت چند شکلی مؤثر 4/6 به‌دست آمد که مربوط به آغازگر‌های OPC07 و U17 بود. بیشترین قدرت تفکیک 46/21 و مربوط به آغازگر OPC10 و بالاترین محتوای اطلاعاتی پلی مورفیسم 28/0 به دست آمد که مربوط به آغازگر T19 بود. این نتایج نشان دهنده کارایی این آغازگرها در بررسی تنوع ژنتیکی نمونه های مورد مطالعه می باشد.

نتایج حاصل از تجزیه خوشه‌ای بر اساس نشانگر RAPD

نتایج حاصل از تجزیه خوشه‌ای بر اساس ضریب تشابه جاکارد ژنوتیپ ها را به 7 گروه تقسیم نمود (شکل 4). جهت تعیین تعداد مطلوب خوشه از روش تجزیه واریانس مولکولی استفاده شد (جدول 4). ضریب کوفنتیک برای ضریب تشابه جاکارد 996/0 بود که برازش خوب بین دندروگرام و ماتریس شباهت اصلی را نشان می دهد. گروه‌بندی مورفولوژیک و گروه‌بندی بر اساس نشانگر RAPD در اغلب موارد با هم تطابق نشان دادند. بطوریکه گروه اول شامل ژنوتیپ‌های S2، S3، S5 و G5 است که با گروه‌بندی مورفولوژیکی مطابقت داشت. البته در برخی موارد نیز تفاوت‌هایی دیده شد بعنوان مثال گروه دوم بر خلاف گروه‌بندی مورفولوژیکی است و شامل A2 و G2 می‌باشد. که می‌تواند مربوط به تاثیر شرایط متفاوت اقلیمی بر صفات ظاهری ژنوتیپ‌ها باشد، در حالی‌که نشانگر RAPD تحت تاثیر محیط قرار نمی گیردJustus et al., 2004; Newton and Groham, 1994)). از طرفی نشانگر RAPD نسبت به صفات مورفولوژیک اطلاعات بیشتری از ژنوم در اختیار قرار می‌دهد به همین دلیل تعداد گروه‌ها و شاید دقت گروه‌بندی آن بیشتر باشد (Wen et al., 2004). این نتایج با آزمون منتل تایید گردید که در این آزمون میزان همبستگی پیرسون بین ماتریس‌ ضریب تشابه جاکارد حاصل از نشانگر RAPD و ماتریس‌ حاصل از داده‌های مورفولوژیک بررسی شد. همبستگی به دست آمده بسیار معنی دار بود (149/0-  r=) که دلالت بر وجود همبستگی بین ماتریس ضرایب تشابه حاصل از نشانگرهای RAPD و داده‌های مورفولوژیک دارد، البته میزان ضریب همبستگی در آزمون منتل در اغلب موارد حتی در زمانیکه بسیار معنی دار هم باشد کوچک است و بندرت مقدار آن منفی است (Mantel, 1967). در بررسی تعداد 102 رقم زیتون با استفاده از 45 نشانگر RAPD (Besnard et al.,2001) و در مطالعه تعداد 40 رقم زیتون با استفاده از 34 نشانگر RAPD (Sanez-cortes et al., 2001)، وجود همبستگی معنی دار بین اطلاعات به دست آمده از نشانگرهای مولکولی و مورفولوژیک را گزارش نمودند.

جدول 3- خصوصیات آغازگرهایRAPD مورد استفاده در ژنوتیپ های انار.

 Table 3 - Characteristics of RAPD primers used in Pomegranate genotypes.

شکل 3- الگوی باندی نشانگر RAPD در 44 نمونه انار مربوط به آغازگر A7.

Figure 3 - Band patterns of RAPD markers in 44 samples of pomegranate using primer A7.

شکل 4- دندروگرام حاصل از نشانگر RAPD بر اساس ضریب تشابه جاکارد برای 44 ژنوتیپ انار.

 Figure 4 - Dendrogram of RAPD markers based on Jaccard's similarity coefficient for 44 genotypes of pomegranate.

جدول 4- تجزیه واریانس مولکولی بر اساس دندروگرام حاصل از نشانگر RAPD در 44 ژنوتیپ انار.

 Table 4 - Analysis of molecular variance based dendrogram of RAPD markers for 44 genotypes of pomegranate.

سطح احتمال < 01/0 (Probability level<0.01)؛ ^*F استاندارد (^*Standard F)

نتایج حاصل از نشانگر ISSR

از تعداد 20 آغازگر ISSR مورد استفاده، 17 آغازگر چندشکلی نشان دادند. نتایج حاصل از هر آغازگر به طور خلاصه در جدول 5 نشان داده شده است. در مجموع 114 باند توسط این نشانگر تولید شد که از بین آنها تعداد 43 باند با اندازه بین 300 تا 2200 جفت باز چند شکل بود. تعداد باندها در هر آغازگر از 3 تا 11 باند متغیر بود (شکل 5). درصد چند شکلی برای هر آغازگر بین 20% مربوط به آغازگرهای UBC820 و UBC873 تا 67% مربوط به آغازگرهای UBC880،  UBC856 و UBC825 و به طور متوسط 71/37% بود. متوسط تعداد کل باندها و متوسط باندهای چند شکل برای هر آغازگر به ترتیب 7/5 و 53/2 بود. در میان نشانگرهای ISSR  بیشترین درصد چند شکلی مربوط به آغازگر UBC880، UBC856 و UBC825 به مقدار 67/66 درصد بود. بالاترین شاخص مارکری 59/0 و مربوط به آغازگر UBC880، بیشترین نسبت چند شکلی مؤثر 67/2 به‌دست آمد که مربوط به آغازگر UBC880 و UBC825 بود. بیشترین قدرت تفکیک 16/21 و مربوط به آغازگر  UBC807و بالاترین محتوای اطلاعاتی پلی مورفیسم 22/0 به دست آمد که مربوط به آغازگر  UBC880بود (جدول 5). با توجه به نتایج به دست آمده در این مطالعه نشانگر RAPD چند شکلی بیشتر و محتوای اطلاعاتی بالاتری را نسبت به نشانگر ISSR نشان داد.

نتایج حاصل از تجزیه خوشه‌ای بر اساس نشانگر ISSR

نتایج حاصل از تجزیه خوشه‌ای بر اساس ضریب تشابه جاکارد ژنوتیپ ها را به 7 گروه تقسیم نمود (شکل 6). جهت تعیین تعداد مطلوب خوشه از روش تجزیه واریانس مولکولی استفاده شد (جدول 6). ضریب کوفنتیک برای ضریب تشابه 992/0 بود که نشان دهنده برازش خوب بین دندروگرام و ماتریس شباهت اصلی می‌باشد. گروه‌بندی بر اساس نشانگر ISSR با گروه‌بندی توسط نشانگر RAPD تا حدود اندکی با هم تطابق نشان دادند که این شاید به دلیل تکثیر مناطق متفاوتی از ژنوم انار توسط روشهای RAPD و ISSR باشد. تفاوت‌های موجود در نتایج به‌دست آمده هم چنین می‌تواند به دلیل کم بودن تعداد نشانگرهای ISSR پلی‌مورف و عدم توانایی این نشانگر در تولید قطعات از نواحی متفاوت ژنومی نمونه‌های مورد مطالعه انار باشد. آزمون منتل نتایج به دست آمده را تایید می نماید که در این آزمون میزان همبستگی پیرسون بین  ماتریس‌های ضریب تشابه جاکارد حاصل از نشانگرهای RAPD و ISSR بررسی گردید. همبستگی به دست آمده بسیار معنی دار بود (471/0  r=) که دلالت بر وجود همبستگی بین نتایج حاصل از نشانگرها دارد. در نتیجه می‌توان گفت که هر دو نشانگر نتایج یکسانی را نشان داده‌اند یا به عبارت دیگر ارزیابی مشابهی از روابط ژنتیکی توسط هر دو گروه نشانگر آشکار شده است. در بررسی گوناگونی ژنتیکی 20 نمونه مختلف نارون اصفهان با استفاده از 10 آغازگر RAPD و 16 آغازگر ISSR، اعلام شد که هر دو نشانگر نتایج یکسانی را نشان داده‌اند (Seid Tabatabaei et al., 2007). همچنین میزان همبستگی پیرسون بین ماتریس‌ ضریب تشابه جاکارد حاصل از نشانگر ISSR و ماتریس حاصل از داده‌های مورفولوژیک بسیار معنی دار بود (086/0- r=) که نشان دهنده ی وجود همبستگی بین الگوی تنوع نشان داده شده توسط نشانگر  ISSRو داده‌های مورفولوژیک می باشد. در گزارشی تنوع ژنتیکی توده‌های بومی نخود زراعی با استفاده از نشانگرهای RAPD و ISSR و صفات مورفولوژیک بررسی شد و با انجام آزمون منتل نتیجه مشابهی حاصل گشت (Fazeli, 2008).

جدول 5- خصوصیات آغازگرهایISSR  مورد استفاده در ژنوتیپ های انار.

Table 5 - Characteristics of ISSR primers used in pomegranate genotypes.

شکل 5- الگوی باندی نشانگر ISSR در 44 نمونه انار مربوط به آغازگر UBC807.

Figure 5 - The band pattern of ISSR primers in 44 samples of pomegranate using primer UBC807.

شکل 6- دندروگرام حاصل از نشانگر ISSR بر اساس ضریب تشابه جاکارد برای 44 ژنوتیپ انار.

Figure 6 - dendrogram derived from ISSR markers based on Jaccard's similarity coefficient for 44 genotypes of pomegranate.

نتیجه گیری

بررسی خصوصیات مورفولوژیکی گیاه انار و گروهبندی 44 ژنوتیپ با استفاده از داده‌های به دست آمده از این خصوصیات و بدون هیچ اطلاعی از خصوصیات ژنتیکی انجام شد. در این آزمایش مشاهده شد که ژنوتیپ‌های یک منطقه در گروه‌های مختلفی جای گرفتند که ناشی از تفاوت ژنوتیپ‌های درون هر منطقه است و یا اینکه در ایجاد کلکسیون‌ها و یا در هنگام جابجایی ژنوتیپ‌ها ممکن است اختلاط و یا اشتباه بوجود آمده باشد. بعلاوه نتایج نشان داد که نشانگر RAPD بدلیل محتوای اطلاعاتی نسبتا بالا (14/0PIC=) برای گروه‌بندی ژنوتیپ‌های انار یک تکنیک موثر و مفید است. نتیجه بدست آمده با نتایج Zamani et al. (2006) مطابقت داشت. بررسی تنوع ژنتیکی ژنوتیپ‌های انار با استفاده از نشانگر‌های RAPD و ISSR وضعیت ژنتیکی آن‌ها را مشخص کرد. بطوری‌که ژنوتیپ‌های متفاوت را در گروه‌های جداگانه قرار داد.

جدول 6- تجزیه واریانس مولکولی بر اساس دندروگرام حاصل از نشانگر ISSR برای 44 ژنوتیپ انار.

Table 6 - Analysis of molecular variance dendrogram based on ISSR markers for 44 genotypes of pomegranate.

سطح احتمال < 01/0 (Probability level<0.01)

به دلیل اینکه بررسی صفات مورفولوژیک در سطح وسیعی (ویژگی‌های درختی، برگ، گل و میوه) انجام شد و با توجه به اینکه نشانگرهای مولکولی استفاده شده کل ژنوم را پوشش داده و چند شکلی را در کل ژنوم بررسی می کنند (Justus et al., 2004) ، همبستگی میان نشانگرهای مولکولی و صفات مورفولوژیک معنی‌دار بود. با توجه به نتایج می‌توان گفت که نام گذاری ژنوتیپ‌های انار که از قدیم الایام کشت و کار می‌شده است با تاکید بر خصوصیات کمی و کیفی میوه بوده است و در انتقال ژنوتیپ‌ها از یک منطقه به منطقه دیگر هم همین موضوع مورد توجه بوده است. در نتیجه باید در جمع آوری ژنوتیپ‌ها و احداث کلکسیون‌های انار دقت کافی اعمال گردد. در مجموع تکنیک‌های RAPD و ISSR  جهت شناسایی ژنوتیپ‌های انار مفید به نظر می‌رسند. نتایج حاصل از این تحقیق حاکی از این بود که استان کرمانشاه دارای ذخایر غنی و تنوع بالای ژنتیکی گیاه انار است که می‌توان با بررسی‌های بیشتر به ثبت این ژنوتیپ‌ها در کلکسیون انار اقدام نمود. در تحقیق حاضر آشکار شدن چند شکلی قابل قبول بین ژنوتیپ‌های انار، می‌تواند به نوعی تایید کننده نظر دانشمندانی باشد که ایران را خاستگاه و موطن اصلی انار می‌دانند (Zamani et al., 2006).