Assessment of Gene Expression Pattern of Rubisco and some physiological characteristics under Cold Stress Condition in Chickpea

ارزیابی الگوی بیان ژن روبیسکو و برخی صفات فیزیولوژیک تحت تنش سرما در گیاه نخود

سیده صنم کاظمی شاهاندشتی¹، رضا معالی امیری*²، حسن زینالی²، سیده­ساناز رمضانپور³، محسن مهدیه⁴، سید عباس طباطبایی فر⁵

1 و 2 دانشجوی کارشناسی ارشد، دانشیاران پردیس کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه تهران

3 دانشیار گروه اصلاح نباتات و بیوتکنولوژی دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان

4 محقق موسسه تحقیقات دیم مراغه

5 آموزشکده کشاورزی رضوان کرمان

تاریخ دریافت: 24/03/1391، تاریخ پذیرش: 05/07/1391

چکیده

گیاهان در فرآیند سازگاری به کمک تنظیم بیان ژن­ها و متابولیسم سلولی به دماهای پایین پاسخ می­دهند. در این پژوهش، میزان رونوشت ژن روبیسکو به عنوان آنزیم مهم دخیل در فتوسنتز و تولید انرژی، میزان پراکسیداسیون چربیهای غشا به عنوان شاخص خسارت سلولی و میزان پرولین به عنوان یکی از سازوکار­های حفاظت سلولی در شرایط دمایی معمولی (23 درجه سانتی گراد)، سرماسازگاری (10 درجه سانتی گراد)، تنش سرما (4 درجه سانتی گراد) و دوره بهبودی (23 درجه سانتی گراد) در نخود کابلی جم ارزیابی شد. نتایج حاکی از تفاوت معنی دار صفات مطالعه شده در تیمارهای آزمایش بود. افزایش بیان ژن روبیسکو که با خسارت کمتر و میزان پرولین بیشتر غشاء همراه بود اهمیت روبیسکو را به عنوان یکی از ژن­های موثر در فرآیند پاسخ سلولی نشان داد. در دوره بهبودی بیان ژن افزایش معنی­دار نشان داده و میزان خسارت غشایی کاهش یافت که حاکی از نجات سلول­های گیاه تحت سرما و استقرار نوعی سازگاری جدید در نخود است.  به طور کلی نتایج این مطالعه نشان داد که پایداری بیان ژن­ روبیسکو با حفاظت کننده­های سلولی و خسارت غشایی در ارتباط بوده و می­تواند به عنوان یکی از فرآیندهای دخیل در ساز و کارهای تحمل محسوب شود.

کلمات کلیدی: بیان ژن، پراکسیداسیون چربی­ها، تنش سرما، سازگاری، روبیسکو.

مقدمه

تنش سرما به عنوان یکی از مهمترین تنش­های محیطی سبب کاهش عملکرد گیاهان و حتی مرگ آن­ها می­شود (Jun-jie et al., 2009). غشای پلاسمایی به عنوان اولین بخش سلول که به تنش سرما پاسخ می­دهد، ساختاری دینامیک بوده که از بسیاری از واکنش­های بیوشیمیایی و بیوفیزیکی حمایت می ­کند. یکی از اثرات عمده تنش سرما بر غشا، پراکسیداسیون چربی­های غشایی است که در اثر ایجاد مالون دی آلدهید[1](MDA) به عنوان محصول نهایی پراکسیداسیون اسیدهای چرب غیراشباع به وجود می­آید (Campos et al., 2003). بدین ترتیب با تغییر در ساختار غشاء و پروتئین­ها و افزایش مواد محلول سمی، نفوذپذیری و انعطاف­­پذیری غشا افزایش یافته و خروج یون­ها از غشا و در نتیجه ایجاد خسارت به گیاهان تسریع می­شود (Bowers 1994). بنابراین اندازه گیری شاخص­های خسارت به غشا یکی از معیارهای مطالعه پاسخ های گیاه به تنش سرما می­باشد (Heidarvand et al., 2011). در طبیعت القای تحمل به سرما با استقرار تدریجی گیاه در دماهای پایین غیریخبندان ایجاد می­شود، فرآیندی که سرماسازگاری[2]، نامیده می­شود (Thomashow., 1999). سرما­سازگاری از طریق تغییرات متعدد در بیان ژن، کاهش یا توقف رشد، تغییر در ترکیب لیپیدی غشا، تغییر در ترکیب محلول­های سازگار و افزایش آنتی­اکسیدان های سلولی انجام می­شود (Nayyar et al., 2005).  

گیاه نخود (Cicer Arietinum L.) به عنوان دومین لگوم خوراکی کشور، دارای تنوع مورفولوژیکی بالا، اما تنوع ژنتیکی ضعیف، حساس به سرما بوده و تحت تنش سرما تولید آن محدود می­شود. سنجش میزان اثر عوامل مختلف در تحمل به تنش­های غیر زنده از روش­های متعددی از جمله اندازه­گیری سطوح رونویسی ژن‌ها و روش­های فیزیولوژیکی انجام می گیرد. بنابر این یافتن رابطه­ بین پاسخ­های مختلف گیاه در سطوح ژنتیکی و فیزیولوژیکی حائز اهمیت بوده و به ارزیابی بهتر گیاه و همچنین درک بعضی از ساز وکار­های تحت تاثیر تنش و تغییرات متابولیکی گیاه کمک می­کند.

یکی از آنزیم­های مهم در فعالیت فتوسنتزی گیاه، روبیسکو است که در حدود 50 درصد پروتئین های برگی را شامل می­شود. این پروتئین از زیر واحدهای بزرگ و کوچک تشکیل شده که به ترتیب بوسیله ژنوم کلروپلاست و هسته سنتز می­شوند. مطالعات در گیاهان دیگر نشان داده که تنش­های محیطی اثرات سوء بر فعالیت آنزیم روبیسکو داشته که به صورت کاهش سنتز یا فعالیت زیر واحدها، تخریب آن­ها و در نهایت کاهش فتوسنتز تظاهر می­یابد(Moreno et al., 2008). et al   (1999) Leport  گزارش نمودند که 80-50 درصد کاهش در عملکرد در اثر محدودیت در فتوسنتز است. تنش سرما با آسیب به غشاء‌های کلروپلاستی می‌تواند بیشترین خسارت را به فتوسنتز و راندمان تولید گیاه وارد سازد (Kingston-Smith et al., 1997). بنابراین بررسی روند تغییرات بیان ژن روبیسکو تحت تیمارهای کنترل، سرما سازگاری و تنش سرما احتمالا بیانگر بخشی از پاسخ های سلولی می­تواند باشد. پرولین[3] از جمله محلول­های سازگار، نیز به عنوان یکی از مکانیسم های حفاظت عمومی در سلول های گیاهی عمل می کند. تجمع پرولین منجر به افزایش اسملیته سلول شده و فشار لازم برای توسعه بافت سلولی[4] را فراهم می­آورد. در نتیجه یکپارچگی غشا برای جلوگیری از تجریه پروتئین­ها، تحت تنش اسمزی یا دهیدراسیون که به طور غیر مستقیم از تنش شوری، گرما و سرما به وجود می­آیند، حفظ می­شود. پرولین همچنین از ساختار و فعالیت­های پروتئینی محافظت کرده و نقش کلیدی در حفاظت از فعالیت فتوسنتزی دارد.

به طور سنتی نخود در مناطق مدیترانه‌ای و ایران به صورت بهاره کشت می‌شود. کشت بهاره اغلب با تنش‌های خشکی و گرمایی آخر فصل مواجه ‌شده که تولید را کم و بی ثبات می‌کند (Deokar et al., 2011) ، به طوری که هر ساله حدود 15-14 درصد خسارت محصول به دلیل افزایش دمای آخر فصل و کاهش رطوبت خاک و نیز کاهش بارش‌ها در مناطق مدیترانه‌ای رخ می‌دهد (Berger et al., 2007). به نظر می­رسد کشت زمستانه نخود، می تواند بخشی از این مشکلات را حل ­نموده اما نیاز به بهبود تحمل به تنش سرما در این گیاه احساس می­شود. در این پژوهش، میزان بیان ژن روبیسکو در سطح RNA و همچنین برخی پاسخ های فیزیولوژیکی گیاه نخود از جمله مقدار خسارت وارده به غشا و میزان پرولین در فواصل زمانی اعمال تیمار سرمایی در نخود جم ارزیابی شد.

مواد و روش­ها

در این پژوهش از نخود کابلی جم استفاده شد. بذور با وایتکس ده درصد به مدت ده دقیقه ضد عفونی شده و پس از شستشو با آب مقطر بر روی کاغذ صافی در پتری دیش با رطوبت لازم قرار گرفت. پتری‌دیش‌ها در شرایط بدون نور و دمای  23 درجه سانتی­گراد قرار گرفتند (Kaur et al., 2008) و پس از جوانه زنی، گیاهچه‌ها به گلدان ها انتقال یافت. گلدان‌ها در اتاقک‌ رشد با نور 200 میکرومول بر انیشتن و شرایط نوری 16 ساعت روز و 8 ساعت شب و دمای 23 درجه سانتی­گراد و رطوبت نسبی 75 درصد قرار داده شد. نمونه گیری از برگ گیاهچه‌های سه هفته‌ای انجام شد. گیاهچه‌های دو تا سه هفته‌ای به دو قسمت تقسیم شدند بخشی از آنها در دمای 23 درجه سانتی­گراد و شرایط فوق الذکر نگهداری شده و بخشی دیگر به دمای 10 درجه سانتی­گراد جهت سرما سازگاری انتقال یافت. به منظور سرماسازگاری، گیاهچه‌ها پنج روز در این دما نگهداری شدند. سپس، گیاهچه‌ها به دمای چهار درجه سانتی­گراد به مدت سه روز انتقال یافتند. بعد از اتمام دوره تنش و جهت بررسی فرآیند بهبود [5]، گیاهچه‌ها به دمای 23 درجه سانتی­گراد انتقال یافتند. نمونه­گیری از گیاهچه‌ها در روزهای اول و پنجم سرماسازگاری، روز دوم تنش و روز دوم دوره بهبودی انجام شد. میزان اکسیداسیون گیاهچه­ها براساس تجمع مالون دی آلدهید برگ با استفاده از تیوبار­بیتوریک اسید تعیین شد (Heath and Packer., 1968). 250 میلی گرم نمونه برگی از بخش میانی ساقه در دو میلی لیتر بافر استخراج (TCA یک درصد) هموژنه شده و به مدت پانزده دقیقه در سانتریفیوژ با سرعت  g13000 قرار داده شد. یک میلی لیتر از محلول فوقانی به دست آمده با دو میلی لیتر محلول تیوبار بیتوریک اسید حاوی اسید تری کلرواستیک ( TBAپنج درصد وTCA بیست درصد) مخلوط و در حمام آب جوش (95 درجه سانتی گراد) به مدت 30 دقیقه قرار داده شد. پس از سانتریفوژ با سرعت  g10000 به مدت ده دقیقه، چگالی[6] نمونه در طول موج 532 نانومتر در دستگاه اسپکتروفتومتر (Shimadzoon160) تعیین شد. غلظت مالون دی آلدهید براساس فرمول محاسبه شد که D همان چگالی و E ضریب تمایز مولار (مول/سانتی‌متر 105×56/1) می­باشد (Zhirov et al., 1982; Maali-Amiri et al., 2007 ).

سنجش مقدار پرولین نیز به روش اسپکتروفتومتری و در دمای  ºC1± 25 با استفاده از روش بیتس (1973) اندازه گیری شد. به 5/0 گرم نمونه گیاهی تازه 10 میلی لیتر اسید سولفوسالیسیلیک 3 درصد اضافه شد و به طور یکنواخت کوبیده شد و به تیوب 15 میلی­لیتری منتقل شد. تیوب­های حاوی نمونه  20 دقیقه با سرعت 4000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد، سپس 2 میلی لیتر از عصاره به تیوب های جدید منتقل و 2 میلی لیتر اسید ناین هیدرین(برای تهیه اسید ناین هیدرین[7] 25/1 گرم پودر اسید ناین هیدرین در 30 میلی­لیتر اسید استیک گلایسل حل شد و سپس 20 میلی­لیتر اسید فسفریک 6 مولار آماده شده، به آن اضافه شد.) و 2 میلی لیتر اسید استیک گلایسال به آن اضافه و محلول ورتکس شد. هم­زمان مقدار 2 میلی لیتر از استانداردهای 0 و 4، 8، 12، 16، 20  میلی­گرم در ­لیتر پرولین را درون تیوبهای جدید ریخته و 2 میلی لیتر اسید ناین هیدرین و 2 میلی لیتر اسید استیک گلایسال به آن اضافه و محلول ورتکس شد. تمام نمونه­ها در حمام آب گرم[8] به مدت یک ساعت حرارت داده شد و سپس نمونه­ها بر روی یخ قرار داده شد تا کاملا سرد شود. 4 میلی لیتر تولوئن به محلول اضافه نموده و به مدت 20  ثانیه با ورتکس به هم زده شد. میزان پرولین به کمک دستگاه اسپکتروفتومتر و در طول موج 520 نانومتر قرائت شد. داده های آزمایش با استفاده از نرم افزار SPSS 19.0 بر اساس آزمون t مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفته و میانگین ها با استفاده از آزمون دانکن مقایسه شدند.

استخراج RNA و ساخت cDNA

80 میلی گرم از بافت مورد نظر (برگ گیاه) که با کمک هاون چینی استریل به خوبی در نیتروژن مایع کوبیده شده بودند برای استخراج RNA کل به روش بایوزول[9] استفاده شد. غلظت RNA­ پس از هر استخراج، با استفاده از دستگاه نانودراپ و در طول موج 260 نانومتر تعیین گردید. مقدار کل RNA بر حسب میکروگرم در میکرولیتر محاسبه شد. همچنین جهت تعیین کیفیت RNA نیز مقدار 5 میکروگرم از هر نمونه روی ژل یک درصد آگارز، الکتروفورز شد تا نسبت به کیفیت بالای آن اطمینان حاصل شود. پس از اطمینان از کیفیت RNA و مشاهده باندهای مربوط به RNA ریبوزومی s18 و s 28 تیمار آنزیمی DNase بر اساس روش پیشنهادی شرکت فرمنتاز[10]برای تمامی نمونه­ها اعمال شد. دو میکروگرم  RNA، یک میکرولیتر بافر، یک واحد (u) آنزیم DNaseI و 10 واحد آنزیم (u)RNase inhibitor مخلوط شدند و به مدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی­گراد قرار گرفتند. سپس یک میکرولیتر EDTA به تیوب­ها اضافه شد و به مدت10 دقیقه در دمای 65 درجه سانتی گراد قرار داده شدند. تیوب­ها جهت نگهداری، در دمای80- درجه سانتی گراد قرار داده شدند. برای ساخت cDNA، از روش پیشنهادی شرکت فرمنتاز برای تمامی نمونه­ها استفاده شد. اولین رشته­ی cDNA با کمک آغازگر الیگو دی­تی[11] (18-20 نوکلئوتید) ساخته شد. مقدار 5 میکرو­لیتر از RNA­ ای که با DNase تیمار شده بود، همراه با 5/0 میکروگرم آغازگر الیگودی تی (18-20 نوکلئوتید) مخلوط شد و حجم محلول با استفاده از آب DEPC به 11 میکرولیتر رسانده شد. مخلوط حاصل به مدت 5 دقیقه در دمای 70 درجه سانتی­گراد قرار داده شد و پس از آن به سرعت روی یخ، سرد گردید. سپس 4 میکرولیتر بافر واکنش و 2 میکرولیتر دی­اکسی­نوکلئوتری­فسفات[12] با غلظت 10 میکرومول و 20 واحد آنزیم RNase inhibitor به هر تیوب افزوده شد و حجم محلول با آب  DEPC به 19 میکرولیتر رسانده شد و به مدت 5 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی گراد قرار داده شد. بعد از آن 200 واحد (u) آنزیم  Revert Aid M-Mulv به محلول فوق اضافه شده و پس از مخلوط نمودن به مدت یک ساعت در دمای 42 درجه سانتی گراد قرار داده شد. سپس به منظور غیر فعال نمودن واکنش، تیوب ها به مدت 10 دقیقه در دمای 70 درجه سانتی­گراد قرار گرفتند. برای تایید سنتز  cDNAاز روش RT-PCR و الکتروفورز روی ژل  در درصد آگارز استفاده شد.

طراحی آغازگر برای کمیت سنجی با واکنش زنجیره­ای پلیمراز[13]

طراحی آغازگر برای ژن­ روبیسکو[14] و ژن خانه دار اَکتین[15]  با استفاده از  نرم افزار پرایمر3 انجام شد. توالی آغازگر ژن اختصاصی و ژن خانه دار در جدول 1 ارائه شده است.

انجام روش[16]QRT-PCR

در این پژوهش از دستگاه  iQ5شرکت بایورد[17] و کیت حاوی رنگ فلورسنت SYBR BioPars (دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان) برای ارزیابی کمی استفاده گردید. 20 میکرولیتر مخلوط واکنش شامل 10 میکرولیتر مخلوط SYBR BioPars، یک میکرولیتر از هریک از آغازگرهای اختصاصی پیشرو و پسرو با غلظت 10 میکرومول، 3 میکرولیتر آب مقطر استریل و 5 میکرولیتر نمونه cDNA مورد بررسی بود. برای هر واکنش سه تکرار تکنیکی و دو تکرار بیولوژیکی در نظر گرفته شد. پس از آماده نمودن مخلوط واکنش، پلیت مورد نظر به دستگاه iQ5 منتقل گردید و با شرایط زیر واکنش زنجیره­ای پلیمراز انجام شد: 2 دقیقه در دمای 94 درجه سانتی‌گراد و 35 تکرار با چرخه‌های 10 ثانیه در دمای 95 درجه سانتی‌گراد، 10 ثانیه در دمای 58 درجه سانتی‌گراد (دمای Tm آغازگر) و 10 ثانیه در دمای 72 درجه سانتی گراد. بیان نسبی ژن­ها با روش ^–ΔΔCT2 محاسبه شد. به این صورت که هر تیمار با گیاهان کنترل مربوط به زمان خود مقایسه گردید. جهت تجزیه­ی داده­ها از نرم افزار [18]REST  استفاده شد.

نتایج و بحث

ژنوتیپ جم در مرحله­ی گیاهچه­ای‌ تحت دمای 10 درجه­ سانتی­گراد قرار گرفت. دمای 10 درجه سانتی­گراد مطابق با تحقیق گذشته (Habibpour et al., 2012) در مطالعه­ پاسخ گیاهچه­های نخود به دمای سازگاری انتخاب شد. نتایج آزمایش نشان داد که مقایسه پاسخ های فیزیولوژیکی و مولکولی گیاه نخود روش کارآمدی در بررسی برخی سازوکار­های دفاعی تحت تنش سرما محسوب می­شود. آزمون مقایسه میانگین داده­های پراکسیداسیون غشا (MDA)، اختلاف معنی­داری بین تیمارهای دمایی نشان داد که بیانگر تنوع بالقوه پاسخ­های گیاه تحت این شرایط بود (شکل 1).

جدول 1- توالی و خصوصیات آغازگر  ژن روبیسکو و اَکتین.

Table 1-the characteristics and sequences of rubisco and actin genes.

شکل 1- شاخص پراکسیداسیون چربیهای غشایی (MDA)در گیاهچه­های نخود تحت تیمارهای کنترل (CP)، اولین روز سرماسازگاری 10 درجه سانتی­گراد (FDAP)، پنجمین روز سرماسازگاری ( LDAP )، تنش سرمای 4 درجه سانتی­گراد (CSP) و فاز بهبودی (RP).

Figure 1- membrane lipid peroxidation index of chickpea seedlings in different thermal treatments, first day of acclimation phase 10˚C (FDAP), fifth day of acclimation phase (LDAP), cold stress phase (CSP) and recovery phase (RP).

انتقال گیاهچه­ها از دمای 23 درجه سانتی گراد به دمای 10 درجه سانتی­گراد در روز اول تغییر قابل توجهی را در میزان MDA ایجاد نکرد، اما در روز پنجم افزایش نشان داد. به طور کلی میزان کم پراکسیداسیون غشاء در سلولهای برگ یکی از عوامل مهم تحمل گیاه به تنش­ سرما محسوب می­شود (Maali-Amiri et al., 2007; Deryabin et al., 2005). تیمار دمایی 4 درجه سانتی­گراد در گیاه سازگار شده سبب کاهش میزان MDA شد که اهمیت سرما سازگاری در گیاه را تایید کرد. در فاز بهبودی نیز نتایج حاکی از کاهش میزان MDA در سطح سلول بود که بیانگر بهبود پاسخ­های گیاه در جهت مقابله با تنش سرمایی است. نتایج بررسی تغییرات پرولین نیز حاکی از آن بود که گیاه نخود سیستم دفاعی خود را در مقابله با تنش سرما فعال کرده است. بررسی تغییرات مشاهده شده در پرولین رابطه جالبی با نتایج MDA نشان داد به طوری که در روز اول سرماسازگاری میزان پرولین کاهش یافت وقتی که میزان پراکسیداسیون غشا تغییر معنی داری نداشت. به نظر می­رسد عدم حضور گونه های اکسیژن فعال اگرچه دمای محیط رشد به پایین­تر از شرایط نرمال رسیده است، سبب تغییر متابولیت­های سلولی در جهت کاهش فعالیت حفاظتی و دفاعی عمل می­کند. نتایج بیان ژن روبیسکو در ادامه این نتیجه را تایید می­کند. در روز پنجم سازگاری با افزایش MDA میزان پرولین نیز افزایش می­یابد. بنابراین با افزایش میزان گونه های اکسیژن فعال که به افزایش میزان  MDA منجر می­شود سلول مسیرهای متعدد دفاعی حفاظتی خود را فعال می­کند که به نظر می­رسد یکی از آن ها پرولین باشد (شکل 2). چنین روند معقولی در تیمارهای دیگر دمایی نیز ادامه پیدا کرد. تیمار دمایی 4 درجه سانتی­گراد در گیاهان سازگار شده سبب کاهشMDA  و کاهش میزان پرولین شد. این موضوع تایید کننده نتایج به دست آمده در تحقیقاتet al.  Kaur (2011) بوده و نشان داد پرولین به عنوان یکی از مکانیسم­های دفاعی نخود تحت تنش­های سرما عمل می­کند. در فاز بهبودی نیز با کاهش میزان MDA سطح پرولین نیز به سطح کنترل نزدیک می شود. نکته جالب این تحقیق آن است که میزان پرولین در سراسر آزمایش، از سطح آن در تیمار شاهد افزایش نیافت. بنابراین به نظر می­رسد که تغییر میزان پرولین بیشتر در درجه تحمل به تنش سرما دخالت دارد و به عنوان یکی از مکانیسم­های تحمل ایفای نقش می­کند. پژوهش ها نشان داده که تحت تنش­های سرما، خشکی و شوری فعالیت آنزیم روبیسکو در گیاهان کاهش می­یابد (Hashimoto and Komatsu, 2007). در مطالعه حاضر، القا تیمارهای دمایی سبب تغییر بیان ژن روبیسکو شد. تجزیه­ی داده­ها با کمک نرم افزار REST نشان داد که بیان ژن روبیسکو در فواصل زمانی پس از قرار گیری در دمای 10 درجه­ی سانتی‌گراد اختلاف معنی داری با تیمار کنترل در شرایط بدون تنش (23 درجه سانتی­گراد) نشان داده است به طوری که میزان نسبی بیان ژن تا حدود 9 برابر افزایش یافت (شکل 3). به نظر می­رسد با شروع دوره سرما سازگاری، گیاه در جهت مقابله با دمای پایین سعی در تولید انرژی بیشتر و افزایش فعالیت در جهت مهار اثرات سوء دمای پایین است. یعنی گیاه تنش دمای پایین را درک کرده و پاسخ­های متعدد در سطوح مولکولی و فیزیولوژیکی را آغاز کرده است (Sukumaran and Weiser., 1972; Nazari et al., 2011).

شکل 2- تغییرات میزان پرولین آزاد سلول گیاهی نخود تحت تیمارهای کنترل (CP)، اولین روز سرماسازگاری 10 درجه سانتی­گراد (FDAP)، پنجمین روز سرماسازگاری ( LDAP )، تنش سرمای 4 درجه سانتی­گراد (CSP) و فاز بهبودی (RP).

Figure 2- changes of chickpea cells free proline content in different thermal treatments, first day of acclimation phase 10˚C (FDAP), fifth day of acclimation phase (LDAP), cold stress phase (CSP) and recovery phase (RP).

بررسی تغییرات مشاهده شده در تیمارهای دمایی این تحقیق رابطه جالبی بین بیان ژن روبیسکو و MDA نشان داد. عدم تغییر معنی دار در میزان پراکسیداسیون لیپیدی در روز نخست سرما سازگاری به معنای عدم خسارت تلقی ­شد یعنی القاء دمای پایین از یک طرف و عدم افزایش میزان پراکسیداسیون لیپیدی از طرف دیگر سبب افزایش فعالیت فتوسنتزی گیاه شد. اما با طولانی شدن دوره سرماسازگاری میزان MDA در سلول افزایش یافت که این افزایش منجر به کاهش فعالیت ژن­های فتوسنتزی شد. همچنین تغییر کمی پاسخ­های فیزیولوژیکی و مولکولی در فواصل زمانی استقرار در تیمارهای آزمایش، مدت زمان تنش را به عنوان عنصر کلیدی در مطالعه تحمل به تنش تعیین کرد. مطالعات گذشته نشان می­دهد که افزایش گونه های اکسیژن فعال سبب القا اثرات سوء مستقیم و غیر مستقیم بر زیر واحدهای روبیسکو می شود (Marin-Navarro and Moreno 2006; Yan 2006).  

شکل 3- سطوح نسبی رونوشت ژن روبیسکو در گیاهچه­های نخود تحت تیمارهای کنترل (CP)، اولین روز سرماسازگاری در دمای 10 درجه سانتی­گراد (FDAP)، پنجمین روز سرماسازگاری ( LDAP )، تنش سرمای 4 درجه سانتی­گراد (CSP) و فاز بهبودی (RP).

Figure 3- Quantitative levels of rubisco gene expression in chickpea seedlings in different thermal treatments, first day of acclimation phase 10˚C (FDAP), fifth day of acclimation phase (LDAP), cold stress phase (CSP) and recovery phase (RP).

بنابراین، به نظر می­رسد القاء دمای پایین سبب تنظیم منفی فعالیت روبیسکو در سطح رونویسی شده و سلول با کاهش فعالیت فتوسنتزی، به افزایش فعالیت های دفاعی در جهت مهار پراکسیداسیون لیپیدی اقدام کرده است. کاهش معنی دار میزان MDA در دوره دمایی چهار درجه سانتی گراد موید این مسئله بود. بنابراین به نظر می رسد دوره سرماسازگاری ایجاد نوعی سازگاری سلولی در جهت مقابله با سرما در این آزمایش کرده است. این وضعیت با توجه به کاهش میزان پراکسیداسیون سلولی در فاز بهبودی و افزایش  میزان بیان ژن روبیسکو قابل بررسی بود. پژوهش­ها نشان داده دمای چهار درجه، دمای LT₅₀ در نخود محسوب می­شود (Nayyar et al., 2005). دوره سرماسازگاری حتی با کاهش موقت میزان فتوسنتز سبب پایداری سلول و مهار گونه های اکسیژن فعال شده است که بیانگر درک گیاه از بهبود شرایط و همکاری فاکتورهای مختلف سلولی در بازگشت گیاه به شرایط قبل از تنش می­باشد. نتایج نشان می­دهد که گیاه نخود با گذراندن دوره سرماسازگاری، همان شرایطی که معمولا در طبیعت رخ می­دهد احتمالا قادر به تحمل دماهای پایین (در این آزمایش،4 درجه سانتی گراد) می­باشد. بنابراین به نظر می­رسد که گیاه نخود در مناطقی از کشور که فاقد زمستان­های خیلی سرد هستند، کشت شود. مطالعات قبلی نشان داد که کشت پاییزه یا زمستانه نخود، احتمالا با افزایش دوره رشد رویشی و امکان استفاده از رطوبت خاک و یا نزولات آسمانی سبب افزایش عملکرد حتی تا دو برابر شود (Habibpour et al., 2012). در اثبات این مسئله بایستی سازوکار­های فیزیولوژیکی، بیوشیمیایی و مولکولی تحمل به سرما در نخود در جزئیات بیشتر بررسی شود.

سپاسگزاری

هزینه این پژوهش از محل اعتبار طرح 91000942 صندوق حمایت از پژوهشگران کشور تامین شده که مولفین کمال تشکر و قدردانی دارند.