Investigation of genetic diversity of Barley and Virginia tobacco varieties using Amplified Fragment Length Polymorphism

Document Type : Research Paper

Authors

Abstract

Considering the economic importance of tobacco and its role as a model plant in molecular researches, in the present study, 50 tobacco genotypes from Barley and Virginia group were evaluated. In order to determine of genotype, 21 primer combinations of AFLP were used. According to the results, out of 480 total numbers of bands with average of 17.76 bands for each combination, 373 bands showed polymorphic pattern. Due to high polymorphic percentage of used marker (77.45%), it can be expected to consider, this marker as a powerful tool for assessment of genetic diversity in tobacco breeding programs. Investigation of Jaccard’s genetic coefficients revealed Badisher Burley E, Pennbel69, R9 and Coker 176 had the highest genetic distances than the others. Therefore, it seems the genotypes to be useful for breeding programs including hybridization and developing of segregating mapping population. The results of AMOVA showed 4% of the total genetic variation was estimated between two groups of Barley and Virginia flu-cured and 96% was related to within groups. Also diversity statistic revealed primer combinations of E060-M160, E070-M140, E070-M150, E070-M160, E080-M150, E080-M160, E100-M140 and E100-M150 were the most powerful markers in the evaluation and identifying of relationships among tobacco genotypes that can be considered in the other related studies.  
 

Keywords


بررسی تنوع ژنتیکی ارقام توتون دسته بارلی و ویرجینیا با استفاده از چند شکلی طولی قطعات تکثیری

 

احمدرضا دادرس1، حسین صبوری2، قاسم محمدی­نژاد*3،  عاطفه صبوری4، مرداویج شعاعی دیلمی5

 

1- دانشجوی سابق کارشناسی ارشد، بخش زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی دانشگاه شهید باهنر کرمان.

2- عضو هیات علمی گروه تولیدات گیاهی، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه گنبد کاووس.

3- عضو هیات علمی بخش زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی دانشگاه شهید باهنر کرمان.

4- عضو هیات علمی گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی دانشگاه گیلان.

5- پژوهشگر بخش اصلاح نباتات مرکز تحقیقات توتون رشت.

تاریخ دریافت: 5/5/1391، تاریخ پذیرش: 18/7/1391

چکیده

با توجه به اهمیت توتون از نظر اقتصادی و نقش آن به عنوان یک گیاه مدل در پژوهش­های مولکولی در پژوهش حاضر به بررسی میزان شباهت­ ژنتیکی 50 ژنوتیپ توتون از دو دسته بارلی و ویرجینیا پرداخته شد. به منظور تعیین ژنوتیپ از 21 ترکیب آغازگری نشانگر AFLP استفاده شد. از تعداد کل 480 نوار ایجاد شده، با تعداد متوسط 76/17 نوار در هر ترکیب، 373 نوار چندشکل بودند. با توجه به میانگین درصد چندشکلی بالا (45/77 درصد) می­توان انتظار داشت بتوان برای شناسایی تنوع ژنتیکی موجود در ارقام از این نشانگر به عنوان ابزاری قدرتمند در برنامه­های اصلاحی توتون استفاده نمود. بررسی ضرایب ژنتیکی جاکارد نشان داد ژنوتیپ­های Badisher Burley E، Pennbel69، R9 و Coker 176 واجد بالاترین فاصله ژنتیکی از بقیه ژنوتیپ­ها هستند. لذا، به نظر می­رسد بتوانند در برنامه­های اصلاحی از جمله هیبریداسیون و تشکیل جمعیت­های در حال تفرق برای مکان­یابی QTL ارزشمند باشند. نتایج تجزیه واریانس مولکولی نیز 4 درصد از کل تنوع ژنتیکی موجود در بین ژنوتیپ­ها را تنوع بین دو دسته بارلی و ویرجینیای گرمخانه­ای برآورد نمود و 96 درصد از تنوع موجود را در درون دسته­ها نشان داد. همچنین بررسی آماره­های تنوع ژنتیکی نشان داد ترکیبات آغازگری E060-M160، E070-M140، E070-M150 و E070-M160، E080-M160، E080-M150، E100-M140 و E100-M150 درکل به عنوان قدرتمندترین نشانگرها از بین کل ترکیبات آغازگری در ارزیابی و تشخیص روابط بین ژنوتیپ­های توتون مورد مطالعه هستند و می­توانند در سایر پژوهش­های توتون مورد توجه قرار گیرند.

کلمات کلیدی: تجزیه واریانس مولکولی، تنوع ژنتیکی، توتون، AFLP.


مقدمه

توتون (Nicotiana tabacum L.) از تیره سولاناسه (Solanaceae) گیاهی است یکساله و علفی که به منظور برداشت برگ­هایش کشت    می­شود. در ایران کشت توتون برای اولین بار در سال 1292 در گیلان انجام گردید. توتون از نظر اقتصادی یکی از مهمترین گیاهان غیرخوراکی در دنیاست به­طوری­که طبق آخرین گزارش فائو عملکرد توتون به طور متوسط در کل دنیا به 17838 هکتوگرم در هکتار رسیده است
(FAO, 2010). توتون نقش بسیار مهمی در اقتصاد کشاورزی کشورهای تولید کننده دارد به­طوری­که درآمد حاصل از فرآورده­های مختلف آن، میزان قابل توجهی از درآمد این کشورها را تشکیـــل می­دهد. بنابرگزارش شرکت جهانی توتون، در سال 2007، تقریباً 4916 میلیون کیلوگرم توتون در سراسر جهان تولید شده است (ULTCI, 2008). گیاه توتون از جنبه­های بسیاری یک گیاه مهم ژنتیکی به حساب می­آید و در چند دهه گذشته به عنوان یکی از مهمترین سیستم­های مدل در بیوتکنولوژی و مهندسی ژنتیک بوده و در بیــان ژن­های انتقال یافته یک گیاه استراتژیک محسوب می­شود. به دلیل اهمیت اقتصادی و ارزش توتون در پژوهش­های بیولوژیکی، مطالعات متعددی جهت آگاهی از منشأ تکاملی، تنوع ژنتیکی و روابط خویشاوندی ژنتیکی آن صورت گرفتــه است (Ren and Timko, 2001). بنابراین، بالابردن کمی و کیـفی این محصول از جایـگاه ویــژه­ای برای به­نژادگران برخوردار است.

در اصلاح نباتات تنوع ژنتیکی از ملزومات اصلاح گیاه است که از تکامل طبیعی نشات گرفته و مهمترین جزء در پایداری نظام­های بیولوژیکی است. به طور حتم اطلاع از محتوی و سطح تنوع ژنتیکی منابع گیاهی هر محصول مهمترین گام در جهت برآورد اهداف اصلاحی می­باشد  .(Abd Mishahni and Shahnejat Bushehri, 1997) بر این اساس امروزه توجه به تنوع ژنتیکی باقیمانده در خزانه های ژنتیکی ژرم پلاسم گونه­های زراعی که در برنامه­های اصلاحی مورد استفاده قرار می­گیرند همچنان رو به افزایش است. به طور کلی می­توان اذعان داشت شناخت خویشاوندی­های ژنتیکی به منظور مدیریت ژرم­پلاسم، حفظ و نگهداری آن، انگشت نگاری­های ژنتیکی،گزینش ژنوتیپ­ها، تهیه نقشه­های ژنتیکی، تعیین مکان و جداسازی ژن­ها و همچنین شناسایی والدین مطلوب جهت تولید واریته­های هیبرید و در نهایت تدوین برنامه­های به­نژادی از اهمیـت به ســزایی برخوردار است (Fufa, et al., 2005). از سوی دیگر افزایش تقاضا و نیازمندی­های مصرف کننده بعلاوه تأکید بر روی تولید سریع ارقام جدید، اصلاح­گران را ناگزیر به استفاده از راهکارهای مولکولی به همراه روش­های اصلاح سنتی، به عنوان مکمل این روش­ها می­نماید (Moon et al. ,2009). در طول دو دهه اخیر پیشرفت­های چشم­گیر در زمینه اصلاح­نباتات مولکولی مخصوصاًً فناوری نشانگرهای DNA، ابـزارهای جدیدی را برای بالا بردن کــارایی روش­های اصلاحی فراهم نموده­اند. ارزیابی تنوع ژنتیکی در ارقام توتون نیز به­ویژه با استفاده از نشانگرهای مولکولی همانند سایر گیاهان در بهبود و اصلاح طولانی مدت این گیاه بسیار حائز اهمیت می­باشد. تنوع ژنتیکی را می­توان با فناوری نشانگرهای DNA، که بررسی مستقیم ژنوم بدون متأثر شدن از محیط را امکان پذیر می­سازد بررسی کرد .(Doveri et al., 2008) از مرسوم­ترین نشانگرهای DNA می­توان RFLP، RAPD، AFLP، ریزماهواره­ها و ISSR را نام برد et al., 2008)  .(Muthusamy

نشانگر AFLP (Amplified fragment length polymorphism) یا چندشکلی طولی قطعات تکثیری از جمله مهمترین نشانگرهای DNA است که با استفاده از این روش به طور همزمان حدود 50-10 ناحیه ژنومی با اندازه تقریبی 500-80 جفت باز تکثیر می­شود و دارای تکرار پذیری بالایی است (Guo et al., 2005). این نشانگر یکی از انواع نشانگرهای مبتنی بر PCR است که ترکیبی از RFLP  و RAPD بوده و شامل هضم DNA ژنومی با آنزیم های برشی خاص و اتصال سازگارسازهای چند نوکلئوتیدی کوتاه به انتهای قطعات برش یافته و سپس تکثیر قطعات ایجاد شده با کمک PCR می­باشد. این روش تفاوت در مکان های برشی را آشکار می­کند و حساسیت بسیار زیادی در آشکار سازی چند شکلی در سراسر ژنوم دارد و بدلیل قابلیت تکرار پذیری بالا بر RAPD برتری دارد. همچنین بدلیل عدم نیاز به اطلاعات اولیه در مورد ژنوم مورد مطالعه و نیز سرعت و درجه اطمینان بالا، امروزه بطور وسیعی برای تهیه نشانگرهای چند شکل استفاده می شود (Farsi and Zolala,  2003). در مطالعه­ای که با استفاده از نشانگرهایRAPD  وAFLP برای بررسی تنوع ژنتیکی بین 28 رقم توتون گرمخانه­ای در مرکز پرورش و اصلاح نژاد توتون درجنوب چین صورت گرفت، تعداد 78 نوار RAPD و 154 نوار AFLP از ارزیابی به دست آمد. تجـزیه خوشه­ای به روش UPGMA ارقام را به سه خوشه اصلی گروه­بندی کرد که ارقام هر خوشه از لحاظ شجره­ مشابه بودند (Zhang et al., 2008).

در پژوهش دیگری تنوع ژنتیکی 19 رقم توتون در تایلند با استفاده از نشانگر AFLP، مورد بررسی قرار گرفت. در مطالعه مذکور سه ترکیب آغازگری از بین 32 ترکیب برای بررسی درجمعیت مذکور انتخاب شدند که از بین 139 نوار  قابل امتیاز دهی، 103 نوار (1/74%) چند شکل بودند. در مطالعه آنها مطابقت قابل توجهی بین منشاء ارقام و گروه­بندی حاصل از ارزیابی ژنتیکی AFLP وجود داشت به طوری­که ارقام بومی شباهت ژنتیکی بالایی نشان دادند (Denduangboripant et al., 2010). همچنین تنوع ژنتیکی 28 رقم توتون با استفاده از نشانگر AFLP، در مرکز پرورش و اصلاح نژاد توتون، در استان یوننان در جنوب غربی چین مورد مطالعه قرار گرفت. در این پژوهش با استفاده از 10 ترکیب آغازگری، 154 نوار چند شکل از 561 نوار شناسایی شد و متوسط تعداد نوار چند شکل برای هر جفت آغازگر، 4/15برآورد شد. در این بررسی گروه­بندی ارقام و شناسایی ارقام از لحاظ خویشاوندی به عنوان یکی ابزارهای مؤثر برای حفاظت از ژرم پلاسم عنوان شد
(Liu et al., 2009). با توجه به اهمیت توتون به عنوان یک محصول اقتصادی مهم و نقش نشانگرهای مولکولی به­ویژه AFLP در بررسی تنوع ژنتیکی، پژوهش حاضر با هدف تعیین میزان شباهت و تنوع موجود بین ژنوتیپ­های توتون طراحی گردید تا بدین­وسیله قدرتمندترین ترکیبات آغازگری در تعیین میزان تمایز بین ژنوتیپ­ها مشخص گردند.

 

مواد و روشها

مواد گیاهی

اسامی و منشاء 50 ژنوتیپ توتون که در این پژوهش مورد مطالعه قرار گرفتند در جدول 1 آورده شده است. تعداد 17 ژنوتیپ از دسته بارلی و تعداد 33 ژنوتیپ از دسته ویرجینیای گرمخانه­ای انتخاب شد. بذور ژنوتیپ­های مذکور از مرکز تحقیقات توتون رشت تهیه شد و سپس در آزمایشگاه ژنتیک دانشگاه گنبد کاووس به صورت خزانه شناور کشت گردید. خزانه شناور از دو بخش اصلی بستر آبی[1] و بستر شناور[2] تشکیل یافته است. بستر آبی شامل محـلول غذایی حاوی قـارچ­کش بوده که در داخل حوضچه­ای به ارتفاع حدود 20 سانتی­متر و ابعاد دلخواه قرار داشت. بستر شناور شامل سینی­های استیروفومی حفره دار حاوی بستر کشت و بذر بود. در این پژوهش از نسبت 70% پرلیت و 30% کود دامی پوسیده شده به عنوان بستر کشت استفاده شد  .(Hartley et al., 2001) پس از رشد کافی گیاهچه­ها (درمرحله 4 تا 5 برگی)، نمونه­های برگی تهیه شد و بدنبال آن استخراج DNA به روش CTAB   (Saghai Maroof et al., 1994)تغییر یافته (Sabouri et al., 2009) انجام شد. سپس DNA استخراج شده بر روی ژل آگارز 8/0 درصد به همراه فاژ لامبدا جهت تعیین کمیت و کیفیت برده شد.

 

تجزیه AFLP

روشAFLP مطابق روش وس و همکاران (Vos et al. , 1995) انجام شد. پانصد نانوگرم از DNA ژنومی با پنج واحد از آنزیم های محدودگر EcoRI و MseI به مدت سه ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد  مورد هضم قرار گرفتند. در ادامه سازگارسازهای EcoRI و MseI به مدت دوساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد و یک ساعت در دمای 20 درجه سانتیگراد به انتهای DNA برش یافته متصل شدند. سپس در مرحله بعد نمونه­های حاصل از مرحله قبل به نسبت 5:1 رقیق شدند و با آغازگرهای EcoRI و MseI واجد یک نوکلئوتید انتخابی در انتهای'3 با توالی­های زیر مورد تکثیر پیش انتخابی قرار گرفتند.

آغازگر  Mse1:

5’-GATGAGTCCTGAGTAAA-3’

آغازگر EcoR1:

5’-GACTGCGTACCAATTCA- 3’

چرخه­های حرارتی در این مرحله به تعداد 30 بار و با برنامه 94 درجه سانتیگراد به مدت 30 ثانیه، 60 درجه سانتیگراد به مدت 30 ثانیه، 72 درجه سانتیگراد به مدت 60 ثانیه بود. سپس محصولات حاصل از تکثیر پیش انتخابی به نسبت 5:1 رقیق شده و با 21 ترکیب آغازگری دارای 2 نوکلئوتید انتخابی علاوه بر یک نوکلئوتید اضافه شده در مرحله پیش تکثیر در انتهای '3، تحت چرخه حرارتی Touch down شامل سه مرحله دمایی مختلف تکثیر شدند. فراورده­های واکنش زنجیره­ای پلیمراز با استفاده از الکتروفورز ژل پلی­اکریل­آمید واسرشته­ساز شش درصد تفکیک و با روش نیترات نقره رنگ آمیزی شدند. امتیازدهی نوارها  به صورت صفر و یک به ترتیب برای عدم حضور و حضور نوار باندی انجام گرفت.

 

 

 

تجزیه­های آماری

پس از تشکیل ماتریس صفر و یک و انتقال آن به نرم­افزار­ GGT، تشکیل ماتریس فاصله ژنتیکی جاکارد، تجزیه خوشه­ای امکان­پذیر شد. با در نظر گرفتن دو دسته توتون بارلی و ویرجینیای گرمـخانه­ای به عنوان دو جمعیت، تجزیه واریانس مولکولی با استفاده از برنامه GenAlEx 6.41  انجام شد و سرانجام برای برآورد آماره­های تنوع ژنتیکی نیز از نرم­افزار 32 PopGene و Excel استفاده شد. محتوای اطلاعات چندشکلی (PIC) نیز مطابق رابطه PICi= 2 fi(1-fi) برآورد شد. در این رابطه PICi، PIC نشانگر i ام، fi   فراوانی قطعه نشانگر iام هنگام وجود و (1-fi) فراوانی قطعه نشانگر i ام در حالت عدم وجود نوار است این رابطه برای نشانگرهای غالب مثل  AFLP پیشنهاد شده است (Roldain-Ruiz, 2000). سایر آماره­ها شامل درصد چندشکلی، ضریب تنوع ژنتیکی نی، تعداد الل مؤثر و آماره تنوع ژنتیکی برای تمایز جمعیت­ها (GST) با استفاده از نرم­افزار 32 PopGene محاسبه شد. در این نرم­افزار آماره [3]GST بر اساس رابطه زیر محاسبه گردید.

GST=

در این رابطه، HT، HS و DST بترتیب تنوع ژنتیکی کل، میانگین وزنی تنوع ژنتیکی درون جمعیت و تنوع ژنتیکی بین جمعیت­ها
می­باشد(Nei, 1973) .


جدول 1- اسامی ژنوتیپ­ها همراه با منشاء آنها بر طبق Sisson (2002). هفده ژنوتیپ اول از دسته بارلی و بقیه از دسته ویرجینیای گرمخانه­ای می­باشند.

Table 1- The genotypes names and their origin according to Sisson (2002). The first 17 genotypes belonged to Barley  group and rest to Virginia flue-cured group.

ردیف

No.

ژنوتیپ

Genotype

منشاء

Origin

ردیف

No.

ژنوتیپ

Genotype

منشاء

Origin

1

Burley whites

آلمان (Germany)

26

MC.I

کانادا (Canada)

2

Burley b.5

آلمان (Germany)

27

Deliot

بلژیک(Belgium)

3

Burley pr-144

آمریکا (USA)

28

Virginia American

آمریکا (USA)

4

Burley Ree103

آمریکا (USA)

29

Virgin RP37

سوییس (Switzerland)

5

Burley semparant

آمریکا (USA)

30

Hicks 55

آمریکا (USA)

6

Burlina

آمریکا (USA)

31

Hicks Broad Leaf

برزیل (Brazil)

7

Badisher Burley E

زیمباوه (Zimbabwe)

32

Virgina Bright 88

آمریکا (USA)

8

Banket A1

فرانسه (France)

33

Virginia Ree 488

آفریقای­جنوبی(South Africa)

9

BB16A

آمریکا (USA)

34

NOD 8

آفریقای­جنوبی(South Africa)

10

Burley 151

برزیل (Brazil)

35

TL 33

آفریقای­جنوبی(South Africa)

11

Burley7

برزیل (Brazil)

36

NR 23

آفریقای­جنوبی(South Africa)

12

Burley 7022

آمریکا (USA)

37

Virginia RP.37

آلمان (Germany)

13

Burley A1

آمریکا (USA)

38

Pereg R.2-228

آلمان (Germany)

14

Burley BB163

آمریکا (USA)

39

Holandisher

سوییس (Switzerland)

15

Burley Barsoma

آمریکا (USA)

40

Montcalm Brum

آمریکا (USA)

16

Burley Bursanica

آلمان (Germany)

41

Pfatzer

آمریکا (USA)

17

Burley Kreuzing

آلمان (Germany)

42

Pennbel69

کانادا (Canada)

18

Pereg234

آلمان (Germany)

43

Parfum-ditalie

کانادا (Canada)

19

Perega

آفریقای­جنوبی(SouthAfrica)

44

Rosecan Nela

ایتالیا (Italy)

20

Coker411

آمریکا (USA)

45

TRUMPF

لهستان (Poland)

21

Bel 71-501

آمریکا (USA)

46

RXT

آمریکا (USA)

22

Bel 61-12

آمریکا (USA)

47

GA.955

آمریکا (USA)

23

Bel 61-9

آلمان (Germany)

48

Coker176

بریتانیا (Great Britain)

24

K.E1

آفریقای­جنوبی(SouthAfrica)

49

Golden gift

آمریکا (USA)

25

R9

ژاپن (Japan)

50

Tite1(R30.N2)

ایران (Iran)

 

 

 

جدول 2- ترکیبات آغازگری استفاده شده در تجزیه AFLP.

Table 2- Primer combinations used for AFLP analysis

 

آغازگرهای EcoRI

EcoRI Primers

 

آغازگرهایMseI

MseI Primers

نام

Name

DNA توالی

DNA Sequence

نام

Name

DNA توالی

DNA Sequence

E060

GACTGCGTACCAATTCAAG

M140

GATGAGTCCTGAGTAAAAC

E070

GACTGCGTACCAATTCAAT

M150

GATGAGTCCTGAGTAAAGA

E080

GACTGCGTACCAATTCACG

M160

GATGAGTCCTGAGTAAAGT

E090

GACTGCGTACCAATTCACT

 

 

E100

GACTGCGTACCAATTCAGT

 

 

E110

GACTGCGTACCAATTCATC

 

 

E120

GACTGCGTACCAATTCATT

 

 

 


نتایج و بحث

بررسی آماره­های تنوع ژنتیکی

ترکیبات آغازگری بکار رفته در جمعیت با 50 ژنوتیپ توتون در کل با 21 ترکیب آغازگری بکاررفته 480 نوار ایجاد نمود که تعداد 373 نوار چندشکل بودند. دامنه اندازه نوارها بین 100 تا bp700 بود. تعداد نوارهای چندشکل در ترکیبات آغازگری از 10 نوار در E120-M140 و E070-M140 تا 27 نوار چند شکل در E080-M150 متغیر بودند و متوسط تعداد نوارهای چندشکل 76/17 تخمین زده شد. نرخ چندشکلی در بین ترکیبات در پژوهش حاضر از 63/52 تا 59/92 درصد متغیر بود و میانگین درصد چندشکلی حدود 45/77 درصد برآورد گردید و می­توان اینگونه نتیجه­گیری نمود که روش AFLP یک ابزار قدرتمند و ارزشمند در برنامه­های اصلاحی توتون می­باشد چون دسترسی به نرخ بالایی از چندشکلی، ارزیابی کارا و سودمندی را در بررسی­های مربوط به تنوع ژنتیکی به دست می­دهد (Zhang et al., 2006).  

در سایر مطالعات مربوط به توتون با استفاده از نشانگر AFLP برآوردهای مختلفی حاصل گردید. در پژوهشی که بر روی 46 رقم با استفاده از نشانگر AFLP صورت گرفت 92 نوار چندشکل به ازای هر ترکیب آغازگری شناسایی شد (Ren & Timko, 2001) و مطالعه­ای دیگر بر روی 19 رقم توتون به طور متوسط 34 نوار چندشکل به ازای هر ترکیب آغازگری مشاهده شد (Denduangboripant et al., 2010). همچنین درصد پایین­تری از چندشکلی در پژوهشی دیگر گزارش شد که به طور میانگین 4/15 نوار و 45/27 درصد چندشکلی و در بررسی بر روی 28 ژنوتیپ توتون بود (Zhang et al., 2008).   

برآورد ضریب تنوع ژنتیکی نی، شاخص محتوای اطلاعات چند شکلی، تعداد الل مؤثر برای هر ترکیب آغازگری در جمعیت اول، دوم و کل جمعیت به تفکیک، در جدول 3 ارائه شده است. همچنین بالاترین مقادیر ضریب تنوع ژنتیکی نئی و تعداد الل مؤثر در کل جمعیت به ترکیبات آغازگری E060-M160، E070-M140، E070-M150، E070-M160، E080-M160 و E100-M140 و در دسته ویرجینیای گرمخانه­ای به ترکیبات E070-M140، E070-M150، E070-M160، E080-M150، E080-M160 و E100-M150 اختصاص داشتند. در دسته بارلی نیز ترکیبات  E060-M160 و E070-M160، E090-M140 و E100-M140 بالاترین مقادیر ضریب تنوع ژنتیکی نی و تعداد الل مؤثر را به خود اختصاص دادند.  از لحاظ درصد چندشکلی نیز بالاترین مقدار 59/92 درصد بود که به ترکیب آغازگری E070-M150 اختصاص داشت.

 

تجزیه خوشه­ای

تجزیه خوشه­ای بر اساس روش UPGMA و فاصله ژنتیکی جاکارد انجام شد و درخت حاصل در شکل 1 نشان داده شده است. در این شکل فاصله ژنوتیپ­ها نیز درج شده­اند. همچنین زیر نام ژنوتیپ­های دسته بارلی خط کشیده است. نتایج این تجزیه گویای این واقعیت است که با استفاده از اطلاعات حاصل از ترکیب­های آغازگری AFLP بکار رفته در این تحقیق، اگرچه بسیاری از ژنوتیپ­های بارلی­ یا ویرجینیای گرمخانه­ای در گروه­های کوچک نزدیک بهم قرار گرفتند اما ژنوتیپ­های دسته بارلی به طور کامل و شفاف از ژنوتیپ­های دسته ویرجینیای گرمخانه­ای تفکیک نشدند. البته از آنجایی­که ژنوتیپ­های دسته بارلی و دسته ژنوتیپ­های ویرجینیای گرمخانه­ای هر دو از توتون­های تیپ غربی می­باشد و از لحاظ پاره­ای از خصوصیات مشابه هم می­باشند، چنین نتیجه­ای دور از انتظار نیست. البته باید خاطر نشان نمود در برخی از مطالعات مربوط به بررسی میزان کارایی نشانگرها و گروهبندی و تفکیک دسته­های مختلف توتون، نشانگرهایی مانند AFLP و RAPD قادر بودند تا حدی این تفکیک را عملی سازد (Denduangboripant et al., 2010; Siva Raju et al., 2008; Sarala & Rao, 2008). به نظر می­رسد اندازه نمونه و نوع نمونه­های مورد بررسی به طوری­که نمونه­ها بتوانند نماینده خالص (بدون اختـلاط) و واقـعی از هر دستـه یا گـروه باشند می­تواند نقش مهمی در تفکیک دسته­ها داشته باشد. بهرحال بررسی­های بیشتری با تعداد بیشتری ژنوتیپ نیاز است تا بتوان به یک نتیجه­گیری نهایی رسید.

 

 جدول 3– آماره­های تنوع ژنتیکی برای 21 ترکیب آغازگری بررسی شده بر روی دو جمعیت توتون بارلی و ویرجینیای گرمخانه­ای.

Table 3- Diversity statistic for evaluated 21 AFLP primer combinations on two population of Barley and Virginia flue cured.

 

کل جمعیت (Total population)

 

 

 

دسته بارلی (Barley group)

دسته ویرجینیای گرمخانه­ای

Virginia flue cured group

ترکیب آغازگری

primer combinations

نوارهای چندشکل

Poly.Bands

کل  نوارها Total Bands

درصد چند شکلی

Poly. Percentage

محتوای اطلاعات چندشکلی PIC

تعداد الل مؤثر

Effective Allele number

ضریب
تنوع نی

Nei’s gene diversity

آماره تنوع ژنتیکی GST

محتوای اطلاعات چندشکلی PIC

ضریب تنوع نی

Nei’s gene diversity

تعداد الل مؤثر

Effective Allele number

محتوای اطلاعات چندشکلی PIC

ضریب
تنوع نی

Nei’s gene diversity

تعداد الل مؤثر

Effective Allele number

E060-M140

17

22

77.27

0.20

1.75

0.41

0.024

0.15

0.40

1.68

0.24

0.40

1.75

E060-M150

16

22

72.73

0.09

1.71

0.40

0.023

0.15

0.35

1.66

0.07

0.41

1.74

E060-M160

13

18

72.22

0.21

1.90

0.46

0.012

0.22

0.47

1.89

0.21

0.45

1.88

E070-M140

10

12

83.33

0.44

1.90

0.47

0.064

0.50

0.42

1.74

0.39

0.47

1.90

E070-M150

25

27

92.59

0.40

1.89

0.47

0.046

0.34

0.43

1.78

0.21

0.47

1.88

E070-M160

17

22

77.27

0.22

1.93

0.48

0.041

0.38

0.47

1.89

0.40

0.46

1.85

E080-M140

24

28

85.71

0.30

1.77

0.42

0.024

0.39

0.44

1.81

0.25

0.39

1.72

E080-M150

27

36

75.00

0.27

1.86

0.46

0.013

0.26

0.44

1.82

0.28

0.46

1.87

E080-M160

21

25

84.00

0.23

1.89

0.47

0.039

0.27

0.43

1.78

0.20

0.47

1.90

E090-M140

14

20

70.00

0.36

1.84

0.45

0.023

0.39

0.47

1.89

0.30

0.43

1.78

E090-M150

17

25

68.00

0.37

1.70

0.39

0.017

0.41

0.43

1.77

0.34

0.36

1.65

E090-M160

16

19

84.21

0.20

1.66

0.38

0.030

0.14

0.33

1.57

0.22

0.38

1.67

E100-M140

17

21

80.95

0.34

1.86

0.46

0.031

0.40

0.46

1.88

0.30

0.44

1.81

E100-M150

23

28

82.14

0.22

1.84

0.45

0.042

0.29

0.38

1.70

0.19

0.46

1.88

E100-M160

14

17

82.35

0.29

1.80

0.44

0.028

0.26

0.37

1.67

0.35

0.45

1.83

E110-M140

21

23

91.30

0.21

1.67

0.38

0.018

0.21

0.34

1.58

0.22

0.39

1.70

E110-M150

18

21

85.71

0.11

1.80

0.44

0.026

0.20

0.40

1.71

0.08

0.44

1.84

E110-M160

24

28

85.71

0.16

1.48

0.31

0.024

0.19

0.29

1.49

0.15

0.30

1.48

E120-M140

10

19

52.63

0.31

1.65

0.37

0.013

0.35

0.41

1.73

0.28

0.34

1.60

E120-M150

14

23

60.87

0.29

1.71

0.40

0.041

0.23

0.31

1.55

0.32

0.42

1.73

E120-M160

15

24

62.50

0.19

1.72

0.40

0.022

0.15

0.40

1.70

0.21

0.39

1.71

Totalکل

373

480

1626.53

5.43

37.33

8.92

0.032

5.85

8.43

36.28

5.20

8.77

37.16

میانگین

17.76

22.86

77.45

0.26

1.78

0.42

0.63

0.28

0.40

1.73

0.25

0.42

1.77

 

با توجه به تجزیه خوشه­ای انجام شده، از دسته بارلی ژنوتیپ­های Barley b.5 و103  Barley Ree در فاصله ادغام 01/0، Burlina، Barley BB163 و Barley Barsoma در فاصله ادغام 03/0، Barley semparent، Barley7 و Banket A1 در فاصله 02/0 ادغام شده و به یک خوشه تعلق یافتند. در حقیقت ژنوتیپ­­های هر کدام از این گروه­های کوچک بیشترین شباهت را به یکدیگر داشتند. از دسته ویرجینیای گرمخانه­ای نیز ژنوتیپ­های Virginia American، TRUMPF و RXT در فاصله ادغام 01/0، Perega، Hicks Broad Leaf، K.E1 و Pfatzer در فاصله ادغام 03/0،  GA.955، Virginia RP-37، MC.I، Virginia Bright 88، Parfum-ditalie  و Montealm Brum در فاصله ادغام 02/0، Virginia Ree 488 و NOD 8 در فاصله ادغام 05/0 ، R9، NR 23، Rosecan Nela، Hicks 55 و Virginia RP37  در فاصله ادغام 04/0، Golden gift، Pennbel 69 و Coker 176 در فاصله ادغام 04/0 و  TL 33، Holandisher و Pereg R.2-288 در گروهک­هایی قرار گرفتند که از لحاظ ژنتیکی شباهت قابل توجهی به هم داشتند. بر اساس این تجزیه ژنوتیپ­های Badisher Burley E، Pennbel69، R9 و Coker 176 ژنوتیپ­های بودند که بالاترین فاصله ژنتیکی را از بقیه ژنوتیپ­ها نشان دادند (شکل 1). از سوی دیگر ماتریس فاصله ژنتیکی جاکارد نیز نتایج مفیدی را در بر داشت. این ماتریس نشان داد بالاترین مقادیر فاصله ژنتیکی بین جفت ژنوتیپ­ها به فاصله ژنتیکی بین ژنوتیپ­های مذکور با سایر ژنوتیپ­ها اختصاص دارد. شناسایی ژنوتیپ­هایی که از لحاظ ژنتیکی و فنوتیپی بیشترین فاصله را از هم داشته باشند در برنامه­های اصلاحی از جمله هیبریداسیون و مکان­یابی QTLهای کنترل کننده صفات کمی نقش اساسی دارد. با استفاده از این ژنوتیپ­هایی می­توان جمعیت­های مکان­یابی با تفرق بالا در افراد را توسعه داد که امکان مکان­یابی QTLهای کوچک اثر نیز امکان­پذیر گردد (Collard et al., 2005).

 

تجزیه واریانس مولکولی و بررسی تنوع ژنتیکی بین و درون دو جمعیت

با در نظر گرفتن دو جمعیت بترتیب شامل دسته توتون­های بارلی با 17 ژنوتیپ و دسته توتون­های ویرجینیای گرمخانه­ای با 33 ژنوتیپ، تجزیه واریانس مولکولی انجام گرفت. درصد تنوع ژنتیکی موجود در بین دو جمعیت تنها 4 درصد از کل تنوع ژنتیکی را به خود اختصاص داد و 96 درصد مربوط به تنوع درون جمعیتی بود (جدول 4). وجود تنوع ژنتیکی زیاد در درون جمعیت نشان­دهنده وجود تفاوت­های ژنتیکی زیاد افراد درون جمعیت از لحاظ مکان­های ژنی تکثیر یافته است و این گــویای ناهمـگنی درون جمعیـت می­باشد. به طور کلی ناهمگنی زیاد در درون جمعیت می­تواند دلایل زیادی ازجمله ماهیت چند پلوئیدی، دگرگشنی، تلاقی­های مختلف بین ارقام، اختلاط فیزیکی بذور و غیره داشته باشد. در اینجا می­توان دلیل بالا بودن تنوع در درون جمعیت بارلی و ویرجینیای گرمخانه­ی را احتمالاً به انجام تلاقی­ بین ارقام از گروه­های مختلف، اختلاط بذور هنگام تکثیر، یا اندازه کوچک جمعیت­های مورد مطالعه و یا بزرگ بودن ژنوم توتون و کافی نبودن ترکیبات آغازگری برای پوشش کامل ژنوم و در نتیجه عدم ارزیابی کامل ژنوتیپ­ها از لحاظ تنوع ژنتیکی در کل ژنوم نسبت داد. میزان شباهت ژنتیکی جاکارد در بین ژنوتیپ­ها از 16/0 تا 64/0 متغیر بود که نشاندهنده شباهت پایین ژنوتیپ­ها در داخل هر کدام از گروه­ها بود (ماتریس اعداد نشان داده نشده است).

همچنین شاخص GST نیز به عنوان شاخص تمایز جمعیت­ها در مجموع مکان­های ژنی مورد ارزیابی، محاسبه شد (جدول 3). این شاخص نشان می­دهد که دو جمعیت­ از لحاظ مکان­های تکثیر شده توسط ترکیب­های آغازگری AFLP مورد بررسی، پایین است. از بین 21 ترکیب آغازگری بکاررفته بالاترین تمایز در ترکیب E070-M140 مشاهده شد که برابر با 06/0 بود. در واقع از کل تنوع ژنتیکی موجود از لحاظ این ترکیب آغازگری، 6 درصد مربوط به تنوع بین دو جمعیت و 94 درصد مربوط به تنوع درون جمعیت می­شود. از لحاظ سایر ترکیبات آغازگری، تنوع ژنتیکی برآورد شده بین دو جمعیت کمتر بودند. لذا این ترکیب آغازگری نسبت به سایر ترکیبات تنوع بین دو جمعیت را بهتر نشان داد. مقدار متوسط Gst برابر با 032/0 برآورد گردید که نشاندهنده مقدار تنوع ژنتیکی بسیار بالایی است که در درون ژنوتیپ­های هر دسته­ وجود دارد. در پژوهشی وسیع در دانشگاه کارولینای شمالی، 702 ژنوتیپ توتون با منشاء کشورهای مختلف دنیا با استفاده از 72 نشانگر ریزماهواره مورد بررسی قرار گرفتند. در کل 1031 الل با میانگین 7/14 الل برای هر نشانگر شناسایی شد. بسیاری از ژنوتیپ­هایی که منشاء جغرافیایی یکسانی داشتند در گروه­های یکسانی قرار گرفتند با این حال تنوع درون جمعیتی در تجزیه واریانس مولکولی 18/92 درصد برآورد گردید که به نوبه خود مقدار تنوع قابل توجهی است (Moon et al., 2009). در پژوهش دیگری 51 ژنوتیپ توتون از دسته ویرجینیای گرمخانه­ای با استفاده از AFLP به دو گروه اصلی با منشاء آمریکایی و چینی تفکیک شدند. و تجزیه واریانس مولکولی داده­های آنها ضمن برآورد شاخص تثبیت[4] برابر با 167/0، نشان داد 76/55 درصد از کل واریانس ژنتیکی موجود به تنوع بین دو منشاء و 24/44 درصد به تنوع درون ژنوتیپ­های هر منطقه جغرافیایی بر می­گردد (Zhang et al., 2006).

 

 

 

شکل 1- درخت دایره­ای حاصل از تجزیه خوشه­ای به روش UPGMA با استفاده از ضریب جاکارد. زیر نام ژنوتیپ­های بارلی خط کشیده شده است.

Figure 1- Circular tree of cluster analysis using Compelete linkage method and Jaccard’s coefficient. The name of Barley genotypes has been underlined.

 

جدول 4- نتایج تجزیه واریانس مولکولی بر روی دو جمعیت بارلی و ویرجینیای گرمخانه­ای

Table – Result of AMOVA for two population of Barley and Virginia flue cured .

درصد تنوع

Percentage of variation

اجزاء واریانس

Variance component

مجموع مربعات

Sum of squares

درجه آزادی

df

منابع تغییر

S.V

4

2.62

128.97

1

بین جمعیت­ها

Between populations

96

70.17

3368.21

48

درون جمعیت­ها

Within population

 

72.79

3497.18

49

کل

Total

 

 

منابع

Abd Mishahni C, Shahnejat Bushehri AA (1997). Advanced plant breeding (Conventional), Vol. 1.Tehran university publications. Iran.

Collard BCY, Jahufer MZZ, Brouwer JB, Pang ECK (2005). An introduction to markers, quantitative trait loci (QTL) mapping and marker-assisted selection for crop improvement: the basic concepts. Euphytica. 142: 169-196.

Denduangboripant J, Piteekan T, Nantharat M (2010). Genetic polymorphism between tobacco cultivar-groups revealed by amplified fragment length polymorphism analysis. Journal of Agricultural Science. 2(2): 41-48.

Doveri S, Sabino Gil F, Diaz A, Reale S, Busconi M, da Camara Machado A, Martin A, Fogher C, Donini P, Lee D (2008). Standardization of a set of microsatellite markers for use in cultivar identification studies in olive (Olea europaea L.). Science Horticulture. (Amsterdam) 116: 367-373.

FAO (2010). Food Agriculture Organization statistics on line. Available at: http://faostat.fao.org/site/567/DesktopDefault.aspx?PageID=567#ancor.

Farsi M, Zolala J (2003). Introduction to plant biotechnology. (Translated). Mashhad Ferdowsi university press.

Fufa HP, Baenizger S, Beecher BS, Dweikat I, Graybosch RA and Eskridge KM (2005). Comparison of phenotypic and molecular marker-based classifications of hard red winter wheat cultivars. Euphytica. 145: 133-146.

Guo YP, Saukel, J Mittermayr R, Ehrendorfer F (2005). AFLP analysis demonstrates genetic divergence hybridization, and multiple polyploidizations in the evolution of Achilla (Asteraceae-Anthemideae). New Phytol. 166: 273-290.

Hartley MD, Smith WD, Spears JF, Fisher LR. Schultheis. JR (2001). Response of flue-cured cultivars NC 71 and NC 72 to seed priming: II. Influence on transplant production under variable float system environments. Tobacco Science. 45: 11-14.

Liu XZ, He, CH, Yang YM, Zhang, HY (2009). Genetic Diversity among Flue-cured Tobacco Cultivars on the Basis of AFLP Markers. Czech J. Genet. Plant Breeding 45(4): 155-159.

Moon HS, Nifong JM, Nicholson JS, Heineman A, Lion K, van der Hoeven  R, Hayes AJ, Lewis RS (2009). Microsatellite-based analysis of tobacco (Nicotiana tabacum L.) genetic resources. Crop Science 49: 1-11.

Muthusamy S, Kanagarajan S, Ponnusamy S (2008). Efficiency of RAPD and ISSR markers system in accessing genetic variation of rice bean (Vigna umbellata) landraces. Electronic Journal of Biotechnology 11(3): 1-10.

Nei M (1973). Analysis of gene diversity in subdivided populations. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 70: 3321-3323.

Ren N, Timko MP (2001). AFLP analysis of genetic polymorphism and evolutionary relationships among cultivated and wild Nicotiana species. Genome 44: 559-571.

Roldain-Ruiz I, Calsyn E, Gilliand TJ, Coll R, van Eijk MJT, De Loose M (2000). Estimating genetic conformity between related ryegrass (Lolium) varieties, 2. AFLP characterization. Molecular Breeding, 6: 593-602.

 Sabouri H, Rezai A, Moumeni A, Kavousi M, Katuzi M, Sabouri A (2009). QTLs Mapping of Physiological Traits Related to Salt Tolerance at Young Seedling Rice (Oryza sativa L.). Biologia Plantarum 53(4): 657-662.

Saghai Maroof, MA, Biyashev RM, Yang, GP, Zhang Q, Allard RW (1994). Extraordinarily polymorphic microsatillate DNA in barely species diversity, choromosomal location, and population dynamics, Proceeding of the National Academy of Sciences. USA. 91: 5466-5570.

Sarala K, Rao RVS (2008). Genetic diversity in Indian FCV and Burley tobacco cultivars. Journal of Genetics. 87: 159-163.

Siva Raju K, Madhav MS, Sharma RK, Murthy TGK, Mohapatra T (2008). Genetic polymorphism of Indian tobacco types as revealed by amplified fragment length polymorphism. Current Science 94: 633-639.

Universal Leaf Tobacco Company, Inc. (2008). Supply & demand report. Available at http://www.universalcorp.com/Reports/ReportFrameset.asp?ID=31201&Menu=Tob (verified 13 Oct. 2008). Universal Leaf Tobacco Co., Richmond, VA.

Vos P, Hogers R, Bleeker M, Reijans M, Lee TVD, Hornes M, Frijters A, Pot J, Peleman J, Kuiper M, Zabeau M (1995). AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research. 23: 4407-4414.

Zhang HY, Liu XZ, He CS,  Yang YM (2008). Genetic Diversity among Flue-cured Tobacco Cultivars Based on RAPD and AFLP Markers. Brazilian Archives of Biology and Technology. 51: 1097-1101.

Zhang HY, Liu XZ, Li TS, Yang YM (2006). Genetic diversity among flue-cured tobacco (Nicotiana tabacum L.) revealed by amplified fragment length polymorphism. Botanical Studies 47: 223-229.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Investigation of genetic diversity of Barley and Virginia tobacco varieties using Amplified Fragment Length Polymorphism

 

Dadras A.R.1, Sabouri H.2, Mohammadi-Nejad G.3, Sabouri A. 4,  Shoaei Deilami M.5

 

1. MSc Student Dep. Agronomy and Plant Breeding, College of Agriculture, Shahid Bahonar University of Kerman.

2. Assist. Prof. Department of Plant Production, Collage of Agriculture Sciences and Natural Resources, Gonbad Kavous University.

3. Assist. Prof. Department of Agronomy and Plant Breeding, College of Agriculture, Shahid Bahonar University of Kerman.

4. Assist. Prof. Department of Agronomy and Plant Breeding, Faculty of Agricultural Sciences, University of Guilan.

5. Researcher Dep of Plant Breeding Tobacco Research Center, Rasht.

 

 

Abstract

Considering the economic importance of tobacco and its role as a model plant in molecular researches, in the present study, 50 tobacco genotypes from Barley and Virginia group were evaluated. In order to determine of genotype, 21 primer combinations of AFLP were used. According to the results, out of 480 total numbers of bands with average of 17.76 bands for each combination, 373 bands showed polymorphic pattern. Due to high polymorphic percentage of used marker (77.45%), it can be expected to consider, this marker as a powerful tool for assessment of genetic diversity in tobacco breeding programs. Investigation of Jaccard’s genetic coefficients revealed Badisher Burley E, Pennbel69, R9 and Coker 176 had the highest genetic distances than the others. Therefore, it seems the genotypes to be useful for breeding programs including hybridization and developing of segregating mapping population. The results of AMOVA showed 4% of the total genetic variation was estimated between two groups of Barley and Virginia flu-cured and 96% was related to within groups. Also diversity statistic revealed primer combinations of E060-M160, E070-M140, E070-M150, E070-M160, E080-M150, E080-M160, E100-M140 and E100-M150 were the most powerful markers in the evaluation and identifying of relationships among tobacco genotypes that can be considered in the other related studies.  

 

Keywords: AFLP, AMOVA, Genetic diversity, Tobacco.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



* نویسنده مسئول: قاسم محمدی نژاد                        تلفن: 09133415937                            Email: Mohammadinejad@uk.ac.ir   

[1] . Water bed

[2] .  Float bed

[3] . Genetic diversity statistics

[4]. Fixation index (Fst)

Abd Mishahni C, Shahnejat Bushehri AA (1997). Advanced plant breeding (Conventional), Vol. 1.Tehran university publications. Iran.
Collard BCY, Jahufer MZZ, Brouwer JB, Pang ECK (2005). An introduction to markers, quantitative trait loci (QTL) mapping and marker-assisted selection for crop improvement: the basic concepts. Euphytica. 142: 169-196.
Denduangboripant J, Piteekan T, Nantharat M (2010). Genetic polymorphism between tobacco cultivar-groups revealed by amplified fragment length polymorphism analysis. Journal of Agricultural Science. 2(2): 41-48.
Doveri S, Sabino Gil F, Diaz A, Reale S, Busconi M, da Camara Machado A, Martin A, Fogher C, Donini P, Lee D (2008). Standardization of a set of microsatellite markers for use in cultivar identification studies in olive (Olea europaea L.). Science Horticulture. (Amsterdam) 116: 367-373.
FAO (2010). Food Agriculture Organization statistics on line. Available at: http://faostat.fao.org/site/567/DesktopDefault.aspx?PageID=567#ancor.
Farsi M, Zolala J (2003). Introduction to plant biotechnology. (Translated). Mashhad Ferdowsi university press.
Fufa HP, Baenizger S, Beecher BS, Dweikat I, Graybosch RA and Eskridge KM (2005). Comparison of phenotypic and molecular marker-based classifications of hard red winter wheat cultivars. Euphytica. 145: 133-146.
Guo YP, Saukel, J Mittermayr R, Ehrendorfer F (2005). AFLP analysis demonstrates genetic divergence hybridization, and multiple polyploidizations in the evolution of Achilla (Asteraceae-Anthemideae). New Phytol. 166: 273-290.
Hartley MD, Smith WD, Spears JF, Fisher LR. Schultheis. JR (2001). Response of flue-cured cultivars NC 71 and NC 72 to seed priming: II. Influence on transplant production under variable float system environments. Tobacco Science. 45: 11-14.
Liu XZ, He, CH, Yang YM, Zhang, HY (2009). Genetic Diversity among Flue-cured Tobacco Cultivars on the Basis of AFLP Markers. Czech J. Genet. Plant Breeding 45(4): 155-159.
Moon HS, Nifong JM, Nicholson JS, Heineman A, Lion K, van der Hoeven  R, Hayes AJ, Lewis RS (2009). Microsatellite-based analysis of tobacco (Nicotiana tabacum L.) genetic resources. Crop Science 49: 1-11.
Muthusamy S, Kanagarajan S, Ponnusamy S (2008). Efficiency of RAPD and ISSR markers system in accessing genetic variation of rice bean (Vigna umbellata) landraces. Electronic Journal of Biotechnology 11(3): 1-10.
Nei M (1973). Analysis of gene diversity in subdivided populations. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 70: 3321-3323.
Ren N, Timko MP (2001). AFLP analysis of genetic polymorphism and evolutionary relationships among cultivated and wild Nicotiana species. Genome 44: 559-571.
Roldain-Ruiz I, Calsyn E, Gilliand TJ, Coll R, van Eijk MJT, De Loose M (2000). Estimating genetic conformity between related ryegrass (Lolium) varieties, 2. AFLP characterization. Molecular Breeding, 6: 593-602.
 Sabouri H, Rezai A, Moumeni A, Kavousi M, Katuzi M, Sabouri A (2009). QTLs Mapping of Physiological Traits Related to Salt Tolerance at Young Seedling Rice (Oryza sativa L.). Biologia Plantarum 53(4): 657-662.
Saghai Maroof, MA, Biyashev RM, Yang, GP, Zhang Q, Allard RW (1994). Extraordinarily polymorphic microsatillate DNA in barely species diversity, choromosomal location, and population dynamics, Proceeding of the National Academy of Sciences. USA. 91: 5466-5570.
Sarala K, Rao RVS (2008). Genetic diversity in Indian FCV and Burley tobacco cultivars. Journal of Genetics. 87: 159-163.
Siva Raju K, Madhav MS, Sharma RK, Murthy TGK, Mohapatra T (2008). Genetic polymorphism of Indian tobacco types as revealed by amplified fragment length polymorphism. Current Science 94: 633-639.
Universal Leaf Tobacco Company, Inc. (2008). Supply & demand report. Available at http://www.universalcorp.com/Reports/ReportFrameset.asp?ID=31201&Menu=Tob (verified 13 Oct. 2008). Universal Leaf Tobacco Co., Richmond, VA.
Vos P, Hogers R, Bleeker M, Reijans M, Lee TVD, Hornes M, Frijters A, Pot J, Peleman J, Kuiper M, Zabeau M (1995). AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research. 23: 4407-4414.
Zhang HY, Liu XZ, He CS,  Yang YM (2008). Genetic Diversity among Flue-cured Tobacco Cultivars Based on RAPD and AFLP Markers. Brazilian Archives of Biology and Technology. 51: 1097-1101.
Zhang HY, Liu XZ, Li TS, Yang YM (2006). Genetic diversity among flue-cured tobacco (Nicotiana tabacum L.) revealed by amplified fragment length polymorphism. Botanical Studies 47: 223-229.