Identification of Rice Aromatic Compounds by Solid Phase Micro-Extraction method in GC-MS and Mapping their Controlling QTLs using Microsatellite Marker

Document Type : Research Paper

Authors

Abstract

Increasing demand for aromatic rice causes their higher price and attracted plant breeder's attention to recognize rice aroma-controlling genes. Highly linked markers with the genes controlling important agronomic traits help to make phenotypic selection, more efficient, effective, reliable and cost-effective compare to the more conventional plant breeding methods. The aim of conducting this research was identification of volatile compounds in rice and mapping their controlling QTLs using SSR markers. The harvested seed of 139 single F2 plants of cross between Mousa-Tarom and 304 were grown in 2010. Volatile compounds extraction, separation and identification of seed samples; harvested from each F2:3 families; was conducted using the sensitive and efficient method of solid phase micro-extraction in gas chromatography coupled to a mass spectrometry apparatus. Alkane compounds of tetradecane, pentadecane, hexadeane and heptadecane were the general identified compounds. The identified QTLs controlling volatile compounds were located on chromosomes 1, 4, 6, 11, and 12. The chromosome number 4 included most of the volatile controlling loci. Out of 14 identified loci, 12 showed different situations of partial, complete or over dominance effects. Heptadecane compound showed the lowest heritability and tetradecane showed more than 50% heritability. Ultimately, in this study, several QTLs having less than 5.4 centiMorgan distances to the marker; the optimal recommended distance between the marker and QTL for selection; were identified.

Keywords


شناسایی ترکیبات عطری برنج با روش ریزاستخراج فاز جامد در کروماتوگرافی گازی توأم با طیف­سنج جرمی و مکان­یابی جایگاه­های ژنی کنترل­کننده آنها با بکارگیری نشانگر ریزماهواره

 

رضا امیری­فهلیانی*1، محمود خدامباشی2،  علیرضا غیاثوند3

 

1 استادیار گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی،  دانشگاه یاسوج و دانشجوی دکتری سابق دانشگاه شهرکرد

2 دانشیار گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شهرکرد

3 استاد گروه شیمی، دانشکده علوم، دانشگاه لرستان

 

تاریخ دریافت: 10/09/1390، تاریخ پذیرش: 24/08/1391

چکیده

تقاضای بیشتر برای برنج­های عطری، قیمت بالاتر آنها را درپی داشته و توجه به­نژادگران گیاهی را به شناسایی ژن­های کنترل­کننده عطر برنج جلب کرده است. نشانگرهای شدیداً پیوسته با ژن­های مهم کنترل­کننده صفات زراعی، عمل گزینش فنوتیپی را سودمندتر، مؤثرتر، واقعی­تر و اقتصادی­تر از روش­های معمول به­نژادی گیاهی ­می­نمایند. این تحقیق به منظور شناسایی ترکیبات فرّار در برنج و مکان­یابی ژن­های کنترل­کننده آنها با استفاده از نشانگرهای ریزماهواره انجام شد. از تلاقی رقم موسی­طارم و 304، 139 تک بوته 2F در سال 87-1386 بصورت مجزا بذرگیری و برای کشت مورد استفاده قرار گرفتند. استخراج، جداسازی و شناسایی ترکیبات فرّار نمونه­های بذری خانواده‌های F2:3 با استفاده از روش حساس و کارآمد ریزاستخراج فاز جامد در کروماتوگرافی گازی توأم با طیف­سنج جرمی انجام شد. ترکیب­های آلکانی تترادکان، پنتا­دکان، هگزادکان و هپتادکان از ترکیبات عمده شناسایی شده بودند. کروموزوم­های 1، 4، 6، 11 و 12 حامل جایگاه­های کنترل­کننده ترکیب­های فرّار بودند. کروموزوم­ 4 بیشترین جایگاه را در بر داشت. از 14 جایگاه شناسایی شده، 12 جایگاه حالاتی از غالبیت نسبی، غالبیت کامل و یا فوق غالبیت را نشان دادند. ترکیب هپتادکان کمترین توارث­پذیری و ترکیب تترادکان بیش از 50 % توارث­پذیری نشان داد. در پایان، در این تحقیق چندین جایگاه کنترل کننده ترکیبات عطری با فاصله 5/4 سانتی­مورگان با نشانگر؛ فاصله مطلوب پیشنهاد شده بین نشانگر و QTL، برای گزینش؛ شناسایی شد.

واژه­های کلیدی: برنج، ترکیبات عطری، QTL، مکان­­یابی ژن، روش SPME- GC- MS.


مقدمه

بعد از عملکرد، کیفیت دانه دومین هدف مهم به­نژادی برنج (Oryza sativa L.) در نظر گرفته می­شود. عطر نه تنها یکی از مهمترین ویژگی­های خوب برای تعیین کیفیت برنج می­باشد، بلکه برنج­های عطری ارزش غذایی بهتر و اسیدهای آمینه لیزین، فنیل­آلانین، لوسین و متیونین بیشتری در مقایسه با انواع بدون عطر دارند (Sun et al., 2008). برنج­های عطری، مدتی طولانی است که عمومیت پیدا کرده­ و تقاضای بیشتر، قیمت بالاتر آن را در پی داشته است. این وضعیت، توجه به­نژادگران برنج را جهت شناسایی ژن­های کنترل­کننده عطر برانگیخته است (Bounphanousay et al., 2008).

ارزیابی واقعی عطر و گزینش با استفاده از روش­های سنتی بهبود کیفیت برای به­نژادگران، به دلیل نبود گروه­های فنوتیپی مجزا در نتاج، حساسیت و تکرارپذیری پایین و خسته­کننده بودن روش­های آزمون کیفیت، مشکل است (Bullard & Holguin, 1977). فنون متفاوتی برای ارزیابی و شناخت عطر شامل: جویدن نیمه یک دانه منفرد و یا تعدادی دانه از تک بوته­ها، حرارت دادن بافت برگی در آب و بررسی عطر حاصل از حل کردن برگ در محلول پتاسیم هیدروکسید (Garland et al., 2000; Wilkie et al., 2004)، واکنش­های بافتی- شیمیایی (Nadaf et al., 2006)، روش ارزیابی بویایی عطر متصاعد شده از دانه­های پخته یا خام برنج (Jezussek et al., 2002; Wilkie et al., 2004)، و ارزیابی ترکیبات فرّار با استفاده از کروماتوگرافی گازی[1] و یا کروماتوگرافی گازی جفت شده با طیف­سنج جرمی[2] (GC- MS) (Mahatheeranont et al., 2001; Ghiasvand et al., 2007)، معرفی و استفاده شده­اند.

اگرچه روش­های جویدن، حرارت دادن بافت برگی در آب و بررسی عطر حاصل از حل کردن برگ در محلول پتاسیم هیدروکسید ، واکنش­های بافتی- شیمیایی، و روش ارزیابی بویایی مفید می­باشند، ولی نمی­توانند عاری از اشتباه باشند و بدون ابهام ژنوتیپ گیاه را بر اساس عطر تعیین کنند (Yanjun et al., 2001). بنابراین استفاده از روش GC- MS، روشی مناسب برای ارزیابی و سنجش ترکیبات فرّار و عطری می­باشد (Ghiasvand et al., 2006). از طرفی روش­های قدیمی استخراج و جداسازی عطر، طعم و بو مانند استخراج مایع – مایع (LLE) وقت­گیر، چند مرحله­ای و گرانقیمت بوده و علاوه بر استفاده از حلال­های سمی خطرناک و مضر برای محیط زیست، خطراتی نیز برای آزمایشگر ایجاد می­کنند. بهترین جایگزین این شیوه های کلاسیک، روش­های کم حلال[3] و عاری از حلال[4] هستند. ریز استخراج فاز جامد[5]، یک روش کارآمد، حساس و ارزان عاری از حلال است که با استفاده از کمترین مقدار نمونه (در حد چند میلی­گرم) و باکمترین دستکاری فیزیکی و شیمیایی در بافت نمونه (افزودن کمی آب به چند دانه برنج سالم) استخراج و اندازه­گیری ترکیبات عطری را انجام می­دهد. جفت شدن تکنیک جدید SPME با GC- MS (با حساسیت و دقت اندازه­گیری بسیار بالا)، کارآیی این روش را در جداسازی و اندازه­گیری ترکیبات فرّار چندین برابر نموده و در سالهای اخیر، روش SPME- GC- MS  کاربردهای گسترده­ای در استخراج و اندازه­گیری انواع ترکیبات غذایی، داروئی و آلاینده­ها پیدا کرده­است (Ghiasvand et al., 2007).

ترکیبات متعددی با مقادیر کم در عطر برنج­های خام یا نپخته و یا حتی در برگ­های این گیاه در مراحل پایانی رشد، دخالت دارند (Bounphanousay et al., 2008; Srivong et al., 2008). ترکیبات فرّاری چون 2- استیل- 1- پیرولین[6] (AP)، لیمونین، پنتادکان، هگزادکان، هپتادکان، دودکان و هگزانول در برنج پخته شده گزارش شده­اند (Singh et al., 2000). اثر سفید کردن برنج نیز بر عطر آن ارزیابی شده و مشخص شده است که لایه­های سطح بیرونی برنج نقش مهمی را در تشکیل عطر ایفا می­کنند (Bullard & Holguin, 1977).

تنوع ژنتیکی صفات کمّی، مانند بسیاری از خصوصیات مهم زراعی از قبیل عملکرد، کیفیت و برخی از شکل­های مقاومت به بیماری (Collard et al., 2005)، به وسیله تعداد زیادی ژن کنترل می­شوند که از تفکیک تعداد زیادی QTL، که هرکدام بخشی از تنوع کلی را توجیه می­کنند و تظاهر آنها توسط اثرات متقابل با دیگر ژن­ها و محیط تغییر می­کند، حاصل می­شود (Mackay, 2001). منطقه­ای از ژنوم که شامل ژن­های مربوط به یک صفت کمّی خاص می­باشد، به عنوان مکان­ ژنی کنترل­کننده­ صفت کمّی (QTL) شناخته می­شود. ایجاد نقشه­های پیوستگی و انجام تجزیه QTL برای شناسایی نواحی ژنومی مرتبط با صفات، مکان­یابی یا نقشه­یابی QTL گفته می­شود (McCouch & Doerge, 1995; Paterson, 1996). اطلاع یافتن از مکان ژن­ها در کروموزوم، می­تواند در تشخیص آثار پیوستگی و پلیوتروپی آنها که مورد توجه خاص به­نژادگران می­باشد، کمک مؤثری داشته باشد. تعیین QTLها این امکان را فراهم می­سازد که به بررسی آثار افزایشی و غالبیت مکان­های ژنی به صورت منفرد، و همچنین اثرات متقابل ژن­ها پرداخته و احتمالاً نوع عمل ژن و نوع اثر متقابل را در بعضی از موارد شناسایی نمود (Kearsey, 1998).

تعداد ژن­های کنترل­کننده صفتِ (صفات) هدف و موقعیت ژنومی آنها، توزیع اثرات ژنتیکی و وجود اثرات متقابل ژنتیکی، توارث­پذیری صفت، تعداد ژن­های در حال تفرق در جمعیت مورد بررسی، نوع و اندازۀ جمعیت مورد بررسی، تراکم و پوشش نشانگرها در نقشه پیوستگی، روش­های آماری و سطح معنی­داری مورد استفاده برای نقشه­یابی QTL، ازجمله عوامل اثرگذار بر قدرت مکان­یابی QTL می­باشند (Liu, 2002; Collard et al., 2005).

با توسعه نشانگرهای DNA، پیشرفت قابل ملاحظه­­ای در توصیف صفات کمّی و گزینش QTLها آغاز شد (Collard et al., 2005). نشانگرهای مولکولی که شدیداً با ژن­های مهم زراعی پیوستگی دارند، ممکن است به عنوان ابزاری برای گزینش به کمک نشانگر[7] در به­نژادی گیاهان استفاده شوند (Kearsey & Pooni, 1996; Ribaut & Hoisington, 1998)، به نحوی که در مقایسه با روش­های معمول گزینش فنوتیپی، سودمندتر، مؤثرتر، مطمئن­تر و اقتصادی­تر باشند (Collard et al., 2005).

نشانگرهای مبتنی بر واکنش زنجیره­ای پلی­مراز[8] از قبیل ریزماهواره­ها[9] (McCouch et al., 2002)، نقش مهم و مؤثری در مکان­یابی ژن­ها و گزینش به کمک نشانگرها دارند. ریزماهواره­ها یا توالی­های ساده تکراری[10] (SSRها) شدیداً چندشکلی نشان می­دهند و علاوه بر این، هم­بارز بودن و قابلیت تکرار آنها، این نشانگرها را برای ترسیم نقشه ژنومی و به همین نحو برای مطالعات ژنتیکی جمعیت، مناسب ساخته است (McCouch et al., 1997; Dayanandan et al., 1998).

مطالعه ژنتیک کیفیت برنج با استفاده از نشانگرهای مولکولی، در مجموعه­های ژنوتیپی متفاوتی صورت گرفته است (Ahn et al., 1992; Lorieux et al., 1996; Sun et al., 2008). یک ژن مغلوب بزرگ­اثر کنترل­کننده عطر، بر روی کروموزوم 8 برنج عطری آمریکایی به نام دلّا (Ahn et al., 1992)، رقم بنگلادشی به نام سرجارم­خی (Yano et al., 1992) و رقم فیلیپینی به نام آزوسنا (Lorieux et al., 1996) با استفاده از تکنولوژی آر­اف­ال­پی (RFLP) و رپید (RAPD)، مکان­یابی شده است. دو ژن مغلوب کنترل کنندة عطر در رقم هندی تی3، بر روی کروموزوم­های 5 و 9 گزارش شده­اند (Yanjun et al., 2001). برای صفت عطر، ژن fgr نزدیک ناحیه سانترومری کروموزوم 8 مکان­یابی شده است (Ahn et al., 1992; Bradbury et al., 2005; Lang & Buu, 2008 ) که سطح AP را تعیین می­کند (Lorieux et al., 1996) و با فاصله 5/4 سانتی مورگان، با نشانگر آر­اف­ال­پی به نام 28RG کاملاً پیوستگی نشان می­دهد. AP یکی از مهمترین ترکیبات عطری برنج می­باشد (Grimm et al., 2001). همچنین دو QTL برای عطر، یکی بر کروموزوم 4 و دیگری بر کروموزوم 12 گزارش شده­است (Garland et al., 2000). چند شکلی معنی­داری را در ناحیه کدکننده (fgr) ژنوتیپ­های عطری برنج نسبت به انواع بدون عطر و با وضعیت مشابهی برای ژن badh2 گزارش کرده­اند (Bradbury et al., 2005). ژن badh2 (کد کننده بتائین آلدهاید هیدروژناز2)، کنترل­کننده عطر، بر روی بازوی بلند کروموزوم 8  برنج قرار دارد (Srivong et al., 2008; Kovach et al., 2009). این ژن برای غربال ژنوتیپ­های عطری در نتاج در حال تفرق برنج قابل استفاده بوده­است (Bradbury et al., 2005; Srivong et al., 2008; Lang & Buu, 2008; Kovach et al., 2009).

هدف از اجرای این تحقیق شناسایی ترکیبات فرّار و عطری با استفاده از روش جدید ریزاستخراج فاز جامد با استفاده از دستگاه کروماتوگرافی گازی توأم با طیف­سنج جرمی در برنج و مکان­یابی ژن­های (QTLهای) کنترل کننده ترکیبات شناسایی شده با استفاده از نشانگرهای ریزماهواره بود.

 

مواد و روش­ها

تک بوته­های 2F حاصل از تلاقی رقم موسی­طارم و 304 در سال 1386 به صورت مجزا بذرگیری و برای کشت فامیل­های­ 2:3F به همراه والدین در سال 1387 مورد استفاده قرار گرفتند. تهیه خزانه در اردیبهشت 1387 در شرایط گلخانه­ای و در ظروف پلاستیکی در دانشگاه شهرکرد صورت گرفت و در مرحله 5 برگی، انتقال نشاءها به زمین اصلی واقع در دشت خانمیرزا در فاصله 35 کیلومتری لردگان صورت گرفت. در مرحله پنجه­زنی، از تمامی بوته­های موجود برای هر کرت آزمایشی (هر خانواده) نمونه­های برگی گرفته شده و استخراج DNA با استفاده از روش تغییر یافته CTAB انجام شد (Amiri-Fahliani et al., 2011). کمیت و کیفیت DNA استخراج شده با استفاده از الکتروفورز ژل آگارز 8/0درصد و دستگاه اسپکتروفتومتر (اپندورف، آلمان) صورت گرفت. هشتاد و یک جفت آغازگر بر اساس نقشه­های SSR ارائه شده در آدرس اینترنتی (www.gramene.org/microsat/RM_primers) و چهار جفت آغازگر بر اساس گزارشات ارائه شده برای ترکیبات عطری انتخاب گردیدند (Amiri-Fahlaini, 2010). فاصله آغازگرهای انتخاب شده بر روی هر کروموزوم بین 15 تا 20 سانتی­مورگان متغیر بود. واکنش زنجیره­ای پلی­مراز در میکروتیوب­های 2/0 میلی لیتری و با حجم واکنش 20 میکرولیتر انجام گرفت (Amiri et al., 2011).

از فیبرهای فلزی سوپرالاستیک SPME با پوشش سه تایی PDMS/CAR/DVB و یک نگهدارنده دستی فیبر (ساخت شرکت Supelco آمریکا) و ظرف­های شیشه­ای سیلانه شده مخصوص SPME با درب­های آلومینیومی و سپتوم مرکب تفلون- سیلیکون، برای استخراج ترکیبات عطری از نمونه‌های برنج استفاده گردید. دستگاه کروماتوگرافی شیمادزو مدل 17آ[11] با ستون دی­بی-5[12] (95% فنیل، و 5% پلی دای متیل سیلوکسان) مجهز به آشکارساز جرمی شیمادزو MS- QP5050، جهت جداسازی و شناسایی ترکیبات فرّار نمونه­های بذری برنج مورد استفاده قرار گرفت. استخراج، جداسازی و شناسایی ترکیبات فرّار با استفاده از روش ارائه شده توسط غیاثوند و همکاران (2007) و به روش SPME- GC- MS در دانشگاه لرستان انجام شد. نمونه­ها پس از آماده سازی به مدت 15 دقیقه در دمای oC50، تحت امواج مافوق صوت قرار داده ­شدند. سپس فیبر تجاری مورد نظر، به مدت 30 دقیقه جهت جذب در فضای فوقانی ظرف قرار داده شد. عمل واجذب به مدت 2 دقیقه در محل تزریق با دمای oC260 انجام شد. برنامه دمایی ستون از °C40 شروع شده و با سرعت oC4 بر دقیقه به °C200 رسید. پس از آن با سرعت oC35  بر دقیقه به oC270 رسید و در این دما به مدت 3  دقیقه نگه­داشته شد. دمای آشکارساز در طول جداسازی، oC260 بود. شناسایی ترکیبات با استفاده از مقایسه دو پارامتر زمان بازداری (حاصل از کروماتوگرام­ها) و شاخص بازداری (محاسبه شده از تزریق ترکیبات آلکان نرمال همولوگ به ستون در شرایط نمونه) با مقادیر استاندارد موجود در متون علمی و همچنین بررسی طیف­های جرمی و مقایسه آنها با طیف­های جرمی استاندارد ذخیره شده در کتابخانه نرم­افزاری 229Willey سیستم GC- MS صورت گرفت.

تجزیه QTL با استفاده از نرم افزار کارتوگرافر[13] (Wang et al., 2007) انجام شد. بررسی QTLها با استفاده از روش نقشه­یابی فاصله­ای مرکب[14] با سرعت پیمایش 5/0 سانتی­مورگان و اندازه پنجره 10 سانتی­مورگان و تعداد 5 نشانگر به عنوان کنترل[15] (هم­عامل) صورت گرفت. آستانه معنی­داری (LOD) مورد استفاده برای انتخاب QTLها برای تمامی صفات، مقدار 3 در نظر گرفته شد.

 

نتایج و بحث

با مقایسه ترکیب­های شناسایی شده با اطلاعات کتابخانه نرم­افزار مورد استفاده، مشخص شد که ترکیب­های آلکانی تترادکان، پنتا­دکان، هگزادکان و هپتادکان جزئی از ترکیب­های شیمیایی موجود در برنج هستند. این ترکیب­ها توسط دیگر محققین نیز گزارش شده است (Widjaja et al., 1996; Singh et al., 2000). نتایج حاصل از تجزیه QTL مربوط به ترکیب­های شیمیایی در جدول 1 گزارش شده است. نتایج نشان دادند که کروموزوم­های 1، 4، 6، 11 و 12 حامل جایگاه کنترل کننده ترکیب­های فرّار شناسایی شده بوده و کروموزوم­ 4 بیشترین جایگاه کنترل کننده ترکیب­های مذبور را در بر داشت. دیگر محققین وجود یک ژن کنترل کننده (fgr) یا آغازگرهای مرتبط با آن بر کروموزوم شماره 8 (Ahn et al., 1992; Lorieux et al., 1996; Cordeiro et al., 2002) و همچنین دو QTL برای عطر، یکی بر کروموزوم 4 و دیگری بر کروموزوم 12 را (Garland et al., 2000) گزارش داده­اند. اگرچه بیشترین جایگاه­های کنترل کننده ترکیب­های مورد بررسی بر روی کروموزوم­ 4 بود، ولی هیچگونه هم­پوشانی جایگاه با در نظر گرفتن موقعیت آنها برای ترکیب­های شناسایی شده، مشاهده نشد (جدول 1). اطلاعات حاصله نشان دهنده این مطلب است که بخشی از ژن­های کنترل کننده عطر بر روی کروموزوم 4 برنج قرار داشته و از طرفی ترکیبات عطری، از چند اثری یک مکان ژنی منشاء نشده­اند.

نکته قابل توجه جایگاه­های کنترل­کننده ترکیب­ها، نحوه عمل جایگاه­ها با توجه به نسبت غالبیت آنها بود. از 14 جایگاه شناسایی شده، 12 جایگاه دارای حالاتی از غالبیت  نسبی، غالبیت  کامل و یا فوق غالبیت بودند. بنابراین با توجه به عمل غالبیت جایگاه­های ژنی کنترل­کننده ترکیب­های عطری شناسایی شده، این ترکیب­ها توارث­پذیر بوده ولی امکان تثبیت را ندارند. علت عدم تثبت چنین ترکیب­هایی به ماهیت خودگشن بودن گیاه برنج برمی­گردد. یکی از دلایل مشاهده اثرات فوق غالبیت ژنی صفات کمّی، پراکندگی[16] ژن‌های کنترل­کننده ویژگی­های مورد بررسی در والدین مربوط به تلاقی می­باشد. بر اساس این نتایج می­توان امیدوار بود که با انتخاب درست والدین در دورگ­گیری، نتاج هیبریدی را ایجاد و معرفی کرد که دارای عطر بیشتری بوده و برای بروز عطر، هم از اثرات افزایشی و هم از اثرات غالبیت ژن­ها استفاده کرد. این امیدواری بخصوص با توجه به تجاری شدن استفاده از برنج هیبرید در بسیاری از کشورها از بیشتر از پیش خواهد بود.

با مراجعه به جدول 1 و تکیه بر سهم واریانس توجیه شده توسط جایگاه­های کنترل­کننده، مشاهده شد که ترکیب هپتادکان دارای کمترین میزان توارث­پذیری شناسایی شده (مجموع سهم واریانس جایگاه­های کنترل کننده هپتادکان) بود. ترکیب تترادکان بیشتر از 50 % توارث­پذیری داشت. جایگاه­های دارای اثرات افزایشی، نشان از توارث­پذیری و قابلیت تثبیت آن جایگاه­ها را دارد.

یکی از مهم­ترین ترکیبی که برای عطر برنج معرفی و مورد بررسی قرار گرفته است، ترکیب AP2 می‌باشد (Grimm et al., 2001)، که در این تحقیق مورد شناسایی واقع نشد. کروموزوم­های 4 و 12 که در این تحقیق برخی جایگاه­های QTL را بر خود جای دادند، قبلاً نیز به عنوان کروموزوم­های حامل ژنهای ترکیب­های عطری و بدون معرفی ترکیب عطری خاص گزارش شده­اند (Garland et al., 2000). جایگاه­های شناسایی شده بر اساس روش مک­کوچ و همکاران (1997) نام­گذاری و در جدول2 ارائه شده است.

در پایان می­توان گفت: تجزیه QTL و یافتن جایگاه­های کنترل کنندة ویژگی­های مورد بررسی نه تنها برای ویژگی­های کمّی بلکه برای ویژگی­های کیفی که در مراحل پایانی رشد گیاه تظاهر می­یابند نیز کاملاَ مفید می­باشد. با یافتن چنین جایگاه­هایی می­توان بدون نیاز به انتظار کشیدن در بروز صفات مذبور در انتهای دوره رشد، عمل گزینش را در مراحل ابتدایی رشد انجام داد. از طرفی ترکیبات عطری که جهت شناسایی دقیق آنها لازم است از دستگاه­های ویژه­ای استفاده شود و بنابراین هزینه ارزیابی آنها زیاد می­باشد نیز می­توانند مورد تجزیه QTL قرار گیرند. در چنین وضعیتی و در صورت پیدا کردن نشانگرهایی مرتبط با این ترکیبات، تجزیه QTL ­ می­تواند در کاهش هزینه­های بعدی در برنامه­های به­نژادی بسیار مؤثر واقع شود.

گزینش صفات در نسل­های در حال تفرق با کمک نشانگرهای مولکولی در دستیابی هرچه سریع­تر و دقیق­تر به اهداف به­نژادی، و احتمالاً تسریع در حذف ژن­های نامطلوب پیوسته با ژن­های مطلوب، مؤثر واقع ­می­شود. در این آزمایش از نشانگر SSR استفاده شد که با توجه به اختصاصی بودن این نشانگر و گستردگی یکنواخت آنها در طول کروموزوم از قابلیت تکرار پذیری بسیار بالایی برخوردار است.

فاصله مطلوب بین نشانگر و QTL برای انتخاب به کمک نشانگر نیز بر اساس گزارشات متفاوت، فاصله­های کمتر از 5/4 سانتی­مورگان پیشنهاد شده است که در این آزمایش چندین جایگاه با چنین فاصله­ای با نشانگر، شناسایی شده است.

 

سپاسگزاری

نویسندگان مقاله از دانشگاه شهرکرد بخاطر تأمین بخشی از اعتبار لازم جهت اجرای این تحقیق نهایت سپاسگزاری را تقدیم می­دارند. نویسنده اول همچنین از خانم دکتر مریم حسینی عضو هیأت علمی مرکز تحقیقات برنج کشور، آقای محمد برزویی کارشناس ارشد شیمی تجزیه دانشگاه لرستان، آقایان دکتر علی آرمینیان دانش­آموخته و مهندس سید صادق موسوی­فرد دانشجوی دکتری دانشگاه شهرکرد، بخاطر همیاری­های بی­دریغشان صمیمانه قدردانی می­نماید.

 



جدول 1- نتایج حاصل از تجزیه QTL ترکیب­های فرّار و معطر با استفاده از روش نقشه­یابی فاصله­ای مرکب.

Table 1- QTL results for volatile compounds using composite interval mapping method.

نام ترکیب

Compound

کروموزوم

دربرگیرنده

Carrier chromosome

آغازگر نزدیک

به QTL

Adjacent primer to QTL

موقعیت

آغازگر

Primer position

موقعیت QTL

بر کروموزوم

QTL position on chromosome

اثر افزایشی

QTL

QTL additive effect

اثر غالبیت

QTL

QTL dominance effect

نسبت

غالبیت

Dominance ratio

عمل††QTL

QTL Action

سهم واریانس

QTL (%)

QTL proportion (%)

مقدار LOD

LOD value

تترادکان

Tetradecane

1

RM11347

99.5

101.61

0.1434

0.4121

2.87

OD

0.45

4.0

4

RM16355

7.4

9.01

-1.4194

0.3994

0.28

PD

18.20

4.5

12

RM27511

9.2

4.51

-1.4171

0.4738

0.33

PD

17.82

3.8

12

RM28097

62.9

61.81

-1.4171

0.4735

0.33

PD

17.82

11.8

پنتادکان

Pentadecane

4

RM16355

7.4

10.01

-2.6732

0.7588

0.28

PD

17.78

8.8

6

RM19359

8.7

11.51

-0.6735

-0.3065

0.46

PD

2.24

7.5

11

RM26063

8.7

5.01

3.1375

-0.7844

0.25

PD

20.36

10.1

هگزادکان

Hexadecane

1

RM11109

82.1

78.71

-0.8452

-0.0338

0.04

A

5.89

4.9

4

RM16937

72.7

68.21

-1.5573

0.6865

0.44

PD

10.62

4.1

12

RM27782

26.7

34.01

-1.5556

0.6874

0.44

PD

10.60

4.2

12

RM28097

62.9

66.31

-1.8901

0.6686

0.35

PD

12.72

3.2

هپتادکان

Heptadecane

1

RM11347

99.5

99.11

-0.1992

0.5100

2.56

OD

0.43

4.7

4

RM16589

40.6

39.71

0.2918

0.0348

0.12

A

0.87

8.3

6

RM8270

26.5

26.31

-0.3248

-0.1131

0.35

PD

0.99

9.8

موقعیت بر حسب سانتی­مورگان از ابتدای بازوی کوتاه کروموزم، و ††  نسبت کمتر از 0.2 افزایشی (A0.21 تا 0.8 غالبیت ناقص (PD0.81 تا 1.2 غالبیت کامل (D)، و بیشتر از 1.2 فوق غالبیت (OD).

 

 

 


جدول 2- نام پیشنهادی برای جایگاه­های شناسایی شده مربوط به ترکیب­های شیمیایی.

Table 2- Proposed name for identified QTLs corresponding to chemical compounds.

نام ترکیب

compound

کروموزوم  دربرگیرنده

Carrier chromosome

موقعیت QTL بر کروموزوم

QTL position on chromosome

نام پیشنهادی QTL

QTL proposed name

تترادکان

Tetradecane

1

101.61

qTTRDC-1

4

9.01

qTTRDC-4

12

4.51

qTTRDC-12-1

12

61.81

qTTRDC-12-2

پنتادکان

Pentadecane

4

10.01

qPNTDC-4

6

11.51

qPNTDC-6

11

5.01

qPNTDC-11

هگزادکان

Hexadecane

1

78.71

qHXDC-1

4

68.21

qHXDC-4

12

34.01

qHXDC-12-1

12

66.31

qHXDC-12-2

هپتادکان

Heptadecane

1

99.11

qHPTDC-1

4

39.71

qHPTDC-4

6

26.31

qHPTDC-6

 

 

 

 

 


منابع

Ahn SN, Bollich CN, Tanksley SD (1992). RFLP tagging of a gene for aroma in rice. Theoretical and Applied Genetics 84: 825-828.

Amiri- Fahliani R (2010). Study of some agronomic traits and aromatic compounds in rice (Oryza sativa L.) and mapping their controlling genes using microsatellite markers. Ph.D. Thesis. Shar-e-Kord University, Shahr-e-Kord, Iran.

Amiri- Fahliani R, khodambashi M, Houshmand S, Arzani A, Sorkheh K (2011). Heritability for some agronomic characters of rice (Oryza sativa L.) and their linked microsatellites identification. Turkish Journal of Agriculture and Forestry 35: 481-490.

Bounphanousay C, Jaisil P, Sanitchon J, Fitzgerald M, Sackville Hamilton NR (2008). Chemical and molecular characterization of fragrance in black glutinous rice from Lao PDR. Asian Journal of Plant Science 7: 1-7.

Bradbury LMT, Fitzgerald TL, Henry RJ, Jin Q, Waters DLE (2005). The gene for fragrance in rice. Plant Biotechnology Journal 3: 363-370.

Bullard RW, Holguin G (1977). Volatile components of unprocessed rice (Oryza sativa). Journal of Agriculture and Food Chemistry 25: 99.

Collard BCY, Jahufer MZZ, Brouwer JB, Pang ECK (2005). An introduction to markers, quantitative trait loci (QTL) mapping and marker-assisted selection for crop improvement: The basic concepts. Euphytica 142: 169-196.

Cordeiro GM, Mandy JC, Robert JH, Russell FR (2002). Identification of microsatellite markers for fragrance in rice by analysis of the rice genome sequence. Molecular Breeding 9:245-250.

Dayanandan S, Rajora OP, Bawa KS (1998). Isolation and characterization of microsatellites in trembling aspen (Populus tremuloides). Theoretical and Applied Genetics 96: 950-956.

Garland S, Lewin L, Blakeney A, Reinke R, Henry R (2000). PCR-based molecular markers for the fragrance gene in rice (Oryza sativa L.). Theoretical and Applied Genetics 101: 364-371.

Ghiasvand AR, Hosseinzadeh S, Pawliszyn J (2006). New cold-fiber headspace solid-phase microextraction device for quantitative extraction of polycyclic aromatic hydrocarbons in sediment.  Journal of Chromatography A 1124: 35–42.

Ghiasvand AR, Setkova L, Pawliszyn J (2007). Determination of flavour profile in Iranian fragrant rice samples using cold-fiber SPME–GC–TOF–MS. Flavour and Fragrance Journal 22: 377-391.

Grimm CC, Bergman C, Delgado JT, Bryant R (2001). Screening for 2-acetyl-1-pyrroline in the headspace of rice using SPME/GC–MS. Journal of Agricultural and Food Chemistry 49: 245-249.

Jezussek MB, Juliano O, Schieberle P (2002).  Comparison of Key Aroma Compounds in Cooked Brown Rice Varieties Based on Aroma Extract Dilution Analyses. Journal of Agricultural and Food Chemistry 50:1101-1105.

Kearsey MJ (1998). The principles of QTL analysis (a minimal mathematics approach). Journal of Experimental botany 327:1619-1623.

Kearsey MJ, Pooni HS (1996). The Genetical Analysis of Quantitative Traits. 1st ed, Chapman & Hall, Great Britain at the Alden Press, UK.

Kovach MJ, Calingacion MN, Fitzgerald MA, McCouch SR (2009). The origin and evaluation of fragrance in rice (Oryza sativa L.). PNAS 106: 14444-14449.

Liu BH (2002). Statistical Genomics: Linkage, Mapping and QTL Analysis. 2nd ed. CRC Press, Boca Raton, Florida.

Lorieux M, Petrov M, Huang N, Guiderdoni E, Ghesquiere A (1996). Aroma in rice: genetic analysis of a quantitative trait. Theoretical and Applied Genetics 93: 1145-1151.

Mackay TFC (2001). The genetic architecture of quantitative traits. Annual Review of Genetics 35: 303-39.

Mahatheeranont S, Keawsa-ard S, Dumri K (2001). Quantification of the Rice Aroma Compound, 2-Acetyl-1-pyrroline, in Uncooked Khao Dawk Mali 105 Brown Rice. Journal of Agricultural and Food Chemistry 49: 773-779.

McCouch SR, Doerge RW (1995). QTL mapping in rice. Trends in Genetics 11: 482-487.

McCouch SR, Chen X, Panaud O, Temnykh S, Xu Y, Cho YG, Huang N, Ishii T, Blair M (1997). Microsatellite marker development, mapping and applications in rice genetics and breeding. Plant Molecular Biology 35:89-99.

McCouch SR, Teytelman L, Xu Y, Lobos KB, Clare K, Walton M, Fu B, Maghirang R, Li Zh, Xing Y, Zhang Q, Kono I, Yano M, Fjellstrom R, DeClerck G, Schneider D, Cartinhour S, Ware D, Stein L (2002). Development and Mapping of 2240 New SSR Markers for Rice (Oryza sativa L.). DNA Research 9: 199-207.

Nadaf AB, Krishnan S, Wakte KV (2006). Histochemical and biochemical analysis of major aroma compound (2-acetyl-1-pyrroline) in basmati and other scented rice (Oryza sativa L.). Current Science 91: 1533-1536.

Paterson AH (1996). Making genetic maps. In: Paterson AH (Ed.), Genome Mapping in Plants, RG Landes Company, San Diego, California; Academic Press, Texas. pp. 23-39.

Ribaut JM, Hoisington D (1998). Marker-assisted selection: New tools and strategies. Trends in Plant Science 3:236–239.

Singh RK, Singh US, Khush GS (2000). Aromatic rice. Oxford and IBH publishing Co. PVT. Ltd., New Delhi.

Srivong P, Wangsomnuk P, Pongdontri P (2008). Characterization of fragrant gene and enzymatic activity of betaine aldehyde dehydrogease in aromatic and nonaromatic Thai rice cultivars. KKU Science Journal 36: 290-301.

Sun SX, Gao FY, Lu XJ, Wu XJ, Wang XD, Ren GJ, Luo H (2008). Genetic analysis and gene fine mapping of aroma in rice (Oryza sativa L. Cyperales, Poaceae). Genetics and Molecular Biology 31: 532-538.

Lang NT, Buu BC (2008). Development of PCR-based markers for aroma (fgr) gene in rice (Oryza sativa L.). Omonrice 16: 16-23.

Wang S, Basten CJ, Gaffney P, Zeng ZB (2007). Windows QTL Cartographer. Department of statistics, North Carolina State University, Raleigh, NC.

Widjaja RI, Craske JD, Wootton M (1996). Comparative studies on volatile components of non-fragrant and fragrant rices. Journal of the Science of Food and Agriculture 70: 151-161.

Wilkie K, Wootton M, Paton JE (2004). Sensory testing of Australian fragrant, imported fragrant and non-fragrant rice aroma. International Journal of Food Properties 7: 27-36.

Yanjun D, Tsuzuki E, Terao H (2001). Trisomic genetic analysis of aroma in three Japanese native rice varieties (Oryza sativa L.). Euphytica 117: 191-196.

Yano M, Shimosaka E, Saito A, Nakagahra M (1992). Linkage analysis of a gene for scent in indica rice variety, Surjamkhi, using restriction fragment length polymorphism markers. Japanese Journal of Breeding 41: 338-339.

 

Identification of Rice Aromatic Compounds by Solid Phase Micro-Extraction method in GC-MS and Mapping their Controlling QTLs using Microsatellite Marker

 

Amiri-Fahliani R.*1, Khodambashi M.2, Ghiasvand A.R.3

 

1 Assistant Prof. of Agronomy & Plant Breeding Department, Faculty of Agriculture, Yasouj University, and former PhD Student of ShahreKord University

2 Associate Prof. of Agronomy & Plant Breeding Department, Faculty of Agriculture, ShahreKord University

3 Professor of Chemistry Department, Faculty of Science, Lorestan University

 

Abstract

Increasing demand for aromatic rice causes their higher price and attracted plant breeder's attention to recognize rice aroma-controlling genes. Highly linked markers with the genes controlling important agronomic traits help to make phenotypic selection, more efficient, effective, reliable and cost-effective compare to the more conventional plant breeding methods. The aim of conducting this research was identification of volatile compounds in rice and mapping their controlling QTLs using SSR markers. The harvested seed of 139 single F2 plants of cross between Mousa-Tarom and 304 were grown in 2010. Volatile compounds extraction, separation and identification of seed samples; harvested from each F2:3 families; was conducted using the sensitive and efficient method of solid phase micro-extraction in gas chromatography coupled to a mass spectrometry apparatus. Alkane compounds of tetradecane, pentadecane, hexadeane and heptadecane were the general identified compounds. The identified QTLs controlling volatile compounds were located on chromosomes 1, 4, 6, 11, and 12. The chromosome number 4 included most of the volatile controlling loci. Out of 14 identified loci, 12 showed different situations of partial, complete or over dominance effects. Heptadecane compound showed the lowest heritability and tetradecane showed more than 50% heritability. Ultimately, in this study, several QTLs having less than 5.4 centiMorgan distances to the marker; the optimal recommended distance between the marker and QTL for selection; were identified.

 

Keywords: Rice, Aromatic compounds, QTL, Gene mapping, SPME- GC- MS method.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



*  نویسنده مسئول: رضا امیری­فهلیانی                              تلفن: 2214840- 0741                            Email: amiri720@yahoo.com

[1] Gas chromatography

[2] Mass spectrometry

[3] Solvent- Less

[4] Solvent- Free

[5] Solid phase micro- extraction (SPME)

[6]Acetyl Pyrroline

[7] Marker assisted selection

[8] Polymerase chain reaction (PCR)

[9] Microsatellite

[10] Simple sequence repeats

[11] Shimadzu 17A

[12] DB-5

[13] Windows QTL Cartographer V 2.5

[14] Composite interval mapping (CIM)

[15] Cofactor

[16] Dispersion

* Corresponding Author: Amiri-Fahliani R.                Tel: 0741-2224840                     Email: amiri720@yahoo.com

 

 
Ahn SN, Bollich CN, Tanksley SD (1992). RFLP tagging of a gene for aroma in rice. Theoretical and Applied Genetics 84: 825-828.
Amiri- Fahliani R (2010). Study of some agronomic traits and aromatic compounds in rice (Oryza sativa L.) and mapping their controlling genes using microsatellite markers. Ph.D. Thesis. Shar-e-Kord University, Shahr-e-Kord, Iran.
Amiri- Fahliani R, khodambashi M, Houshmand S, Arzani A, Sorkheh K (2011). Heritability for some agronomic characters of rice (Oryza sativa L.) and their linked microsatellites identification. Turkish Journal of Agriculture and Forestry 35: 481-490.
Bounphanousay C, Jaisil P, Sanitchon J, Fitzgerald M, Sackville Hamilton NR (2008). Chemical and molecular characterization of fragrance in black glutinous rice from Lao PDR. Asian Journal of Plant Science 7: 1-7.
Bradbury LMT, Fitzgerald TL, Henry RJ, Jin Q, Waters DLE (2005). The gene for fragrance in rice. Plant Biotechnology Journal 3: 363-370.
Bullard RW, Holguin G (1977). Volatile components of unprocessed rice (Oryza sativa). Journal of Agriculture and Food Chemistry 25: 99.
Collard BCY, Jahufer MZZ, Brouwer JB, Pang ECK (2005). An introduction to markers, quantitative trait loci (QTL) mapping and marker-assisted selection for crop improvement: The basic concepts. Euphytica 142: 169-196.
Cordeiro GM, Mandy JC, Robert JH, Russell FR (2002). Identification of microsatellite markers for fragrance in rice by analysis of the rice genome sequence. Molecular Breeding 9:245-250.
Dayanandan S, Rajora OP, Bawa KS (1998). Isolation and characterization of microsatellites in trembling aspen (Populus tremuloides). Theoretical and Applied Genetics 96: 950-956.
Garland S, Lewin L, Blakeney A, Reinke R, Henry R (2000). PCR-based molecular markers for the fragrance gene in rice (Oryza sativa L.). Theoretical and Applied Genetics 101: 364-371.
Ghiasvand AR, Hosseinzadeh S, Pawliszyn J (2006). New cold-fiber headspace solid-phase microextraction device for quantitative extraction of polycyclic aromatic hydrocarbons in sediment.  Journal of Chromatography A 1124: 35–42.
Ghiasvand AR, Setkova L, Pawliszyn J (2007). Determination of flavour profile in Iranian fragrant rice samples using cold-fiber SPME–GC–TOF–MS. Flavour and Fragrance Journal 22: 377-391.
Grimm CC, Bergman C, Delgado JT, Bryant R (2001). Screening for 2-acetyl-1-pyrroline in the headspace of rice using SPME/GC–MS. Journal of Agricultural and Food Chemistry 49: 245-249.
Jezussek MB, Juliano O, Schieberle P (2002).  Comparison of Key Aroma Compounds in Cooked Brown Rice Varieties Based on Aroma Extract Dilution Analyses. Journal of Agricultural and Food Chemistry 50:1101-1105.
Kearsey MJ (1998). The principles of QTL analysis (a minimal mathematics approach). Journal of Experimental botany 327:1619-1623.
Kearsey MJ, Pooni HS (1996). The Genetical Analysis of Quantitative Traits. 1st ed, Chapman & Hall, Great Britain at the Alden Press, UK.
Kovach MJ, Calingacion MN, Fitzgerald MA, McCouch SR (2009). The origin and evaluation of fragrance in rice (Oryza sativa L.). PNAS 106: 14444-14449.
Liu BH (2002). Statistical Genomics: Linkage, Mapping and QTL Analysis. 2nd ed. CRC Press, Boca Raton, Florida.
Lorieux M, Petrov M, Huang N, Guiderdoni E, Ghesquiere A (1996). Aroma in rice: genetic analysis of a quantitative trait. Theoretical and Applied Genetics 93: 1145-1151.
Mackay TFC (2001). The genetic architecture of quantitative traits. Annual Review of Genetics 35: 303-39.
Mahatheeranont S, Keawsa-ard S, Dumri K (2001). Quantification of the Rice Aroma Compound, 2-Acetyl-1-pyrroline, in Uncooked Khao Dawk Mali 105 Brown Rice. Journal of Agricultural and Food Chemistry 49: 773-779.
McCouch SR, Doerge RW (1995). QTL mapping in rice. Trends in Genetics 11: 482-487.
McCouch SR, Chen X, Panaud O, Temnykh S, Xu Y, Cho YG, Huang N, Ishii T, Blair M (1997). Microsatellite marker development, mapping and applications in rice genetics and breeding. Plant Molecular Biology 35:89-99.
McCouch SR, Teytelman L, Xu Y, Lobos KB, Clare K, Walton M, Fu B, Maghirang R, Li Zh, Xing Y, Zhang Q, Kono I, Yano M, Fjellstrom R, DeClerck G, Schneider D, Cartinhour S, Ware D, Stein L (2002). Development and Mapping of 2240 New SSR Markers for Rice (Oryza sativa L.). DNA Research 9: 199-207.
Nadaf AB, Krishnan S, Wakte KV (2006). Histochemical and biochemical analysis of major aroma compound (2-acetyl-1-pyrroline) in basmati and other scented rice (Oryza sativa L.). Current Science 91: 1533-1536.
Paterson AH (1996). Making genetic maps. In: Paterson AH (Ed.), Genome Mapping in Plants, RG Landes Company, San Diego, California; Academic Press, Texas. pp. 23-39.
Ribaut JM, Hoisington D (1998). Marker-assisted selection: New tools and strategies. Trends in Plant Science 3:236–239.
Singh RK, Singh US, Khush GS (2000). Aromatic rice. Oxford and IBH publishing Co. PVT. Ltd., New Delhi.
Srivong P, Wangsomnuk P, Pongdontri P (2008). Characterization of fragrant gene and enzymatic activity of betaine aldehyde dehydrogease in aromatic and nonaromatic Thai rice cultivars. KKU Science Journal 36: 290-301.
Sun SX, Gao FY, Lu XJ, Wu XJ, Wang XD, Ren GJ, Luo H (2008). Genetic analysis and gene fine mapping of aroma in rice (Oryza sativa L. Cyperales, Poaceae). Genetics and Molecular Biology 31: 532-538.
Lang NT, Buu BC (2008). Development of PCR-based markers for aroma (fgr) gene in rice (Oryza sativa L.). Omonrice 16: 16-23.
Wang S, Basten CJ, Gaffney P, Zeng ZB (2007). Windows QTL Cartographer. Department of statistics, North Carolina State University, Raleigh, NC.
Widjaja RI, Craske JD, Wootton M (1996). Comparative studies on volatile components of non-fragrant and fragrant rices. Journal of the Science of Food and Agriculture 70: 151-161.
Wilkie K, Wootton M, Paton JE (2004). Sensory testing of Australian fragrant, imported fragrant and non-fragrant rice aroma. International Journal of Food Properties 7: 27-36.
Yanjun D, Tsuzuki E, Terao H (2001). Trisomic genetic analysis of aroma in three Japanese native rice varieties (Oryza sativa L.). Euphytica 117: 191-196.
Yano M, Shimosaka E, Saito A, Nakagahra M (1992). Linkage analysis of a gene for scent in indica rice variety, Surjamkhi, using restriction fragment length polymorphism markers. Japanese Journal of Breeding 41: 338-339.