Effect of different growth regulators levels and explants types of callogenesis and organogenesis Hypericum perforatum L. under in vitro condition

Document Type : Research Paper

Authors

Abstract

In this study the effect of different levels of plant growth regulators (picloram, 2,4-D, IAA and BAP) and explants type (root, stem and leaf) were examined on callogenesis and organogenesis of st John's wort with factorial experiment design on the basis of completely randomized design with five repeats and five explants. The explants were obtained from 30 days plantlets and transferred to media supplemented with picloram, 2,4-D, IAA (0, 0.5, 1, 2 mgl-1) and BAP (0, 0.4, 0.8 mg l-1). Samples were kept in the growth chamber in the darkness condition at 23°C. After 28 days, the interactions between explants types and hormone levels were investigated. The significant effect at the 1 percent probability was observed between treatment levels of 2, 4-D, picloram, BAP and its interaction (2, 4-D * BAP) for the calluses size and shoot numbers. Also the significant effect at the 1 percent probability was observed between treatment levels of IAA, BAP and its interaction (IAA*BAP) for the calluses size, shoot and root numbers. The highest numbers of shoots (83 shoots) were achieved in the leaf explants treated with 0.4 mgl-1 BAP. The highest callus size (5 mm) was observed in media containing 0.5 mg l-1 picloram and 0.4 mg l-1 BAP and stem explants also greatest number (91 roots) of roots were observed in media supplemented with 2 mgl-1 IAA in the leaf explants.

Keywords


بررسی اثر تنظیم‏کننده‏های رشد و ریزنمونه‏های مختلف برکال­‏زایی و اندام­‏زایی گل ‏راعی در شرایط درون شیشه­ای

 

ابراهیم شرفی1و3، سید مجتبی خیام نکویی2، محمدحسین فتوکیان3، داریوش داودی4، طاهره حسنلو*1

 

1- بخش فیزیولوژی مولکولی، پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی ایران

2- بخش بیوتکنولوژی میکروبی، پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی ایران

3- بخش بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شاهد

4- بخش نانوتکنولوژی، پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی ایران

تاریخ دریافت: 17/4/1391، تاریخ پذیرش: 6/10/1391

 

چکیده

در این پژوهش اثر سطوح مختلف تنظیم‏کننده­های رشد و نوع ریز‏نمونه بر کالوس‏زایی و اندام‏زایی گل‏راعی در یک دوره 28 روزه مورد بررسی قرار گرفت. این ریز­نمونه­ها شامل ریشه، ساقه و برگ بود که از گیاهچه‏های استریل کشت ‏شده در محیط موراشیگ و اسکوگ (MS) تهیه شده و به محیط MS حاوی هورمون‏هایIAA ، پیکلورام، 2,4-D با غلظت (صفر، 5/0، 1، 2 میلی‏گرم بر لیتر) و BAP با غلظت (صفر، 4/0، 8/0 میلی‏گرم ‏برلیتر) در قالب آزمایش فاکتوریل با طرح پایه کاملاﱠ تصادفی با 5 تکرار و 5 ریزنمونه منتقل شده و در تاریکی، در دمای 23 در‏جه سانتی­گراد نگهداری شدند. بین سطوح تیمار‏های پیکلورام٬ BAP تفاوت معنی‏دار در سطح 1 درصد از نظر اندازه کالوس مشاهده‏ شد. بین سطوح تیمار‏های IAA، BAP و همچنین اثر متقابل دو فاکتور تفاوت معنی‏دار در سطح 1 درصد از نظر اندازه کالوس، تعداد شاخه و تعداد ریشه مشاهده‏ شد. بین سطوح تیمار‏های 2,4-D٬ BAP و همچنین اثر متقابل دو فاکتور تفاوت معنی‏دار در سطح 1 درصد از نظر اندازه کالوس و تعداد شاخه مشاهده‏ شد. بیشترین اندازه کالوس در تیمار 5/0 میلی­گرم بر لیتر پیکلورام و 4/0 میلی­گرم بر لیتر BAP (5 میلی­متر) از ریزنمونه ساقه به وجود آمد. بیشترین تعداد شاخه (83 شاخه) از ریز­نمونه برگ در تیمار 4/0 میلی‏گرم بر لیتر BAPبدست آمد. بالاترین تعداد ریشه (91 ریشه) در تیمار 2 میلی­گرم برلیتر IAA در ریزنمونه برگ مشاهده شد.

کلمات کلیدی: به­نژادی گیاه، ریزازدیادی، کشت بافت، گیاه دارویی.

 


مقدمه

گیاهان دارویی از ارزش و اهمیت خاصی در تأمین بهداشت و سلامت جوامع هم به لحاظ درمان و هم پیشگیری از بیماری­ها برخوردار بوده و هستند. این بخش از منابع طبیعی قدمتی هم پای بشر داشته و یکی از مهمترین منابع تأمین غذا و داروی بشر در طول نسل­ها بوده­اند (Gadzovska et al., 2007). گل راعی با نام علمی Hypericum perforatum از خانواده Hypericaceae، از گیاهان دارویی بسیار مهم است که یک منبع متنوع از ترکیبات و فعال کننده­های بیولوژیکی است و منابع هایپرسین از آن­ها مشتق می­شود. گونه­های مختلف این گیاه در بسیاری از کشورها به عنوان عامل شفا­دهنده به کار می­رود و دارای خواص مختلف پزشکی است. جزء گیاهان علفی چند ساله می باشد و به طور قابل توجهی در سراسر جهان رشد می­کند (Cirak et al., 2005). گل راعی به طور سنتی و مدرن برای درمان عارضه‏های عصبی و افسردگی استفاده می‏شود Alali et al., 2004)).

یکی از راهکارهای تولید متابولیت ثانویه در گیاهان دارویی کشت آنها در شرایط کنترل شده آزمایشگاهی می­باشد. کشت بافت روشی مناسب جهت تکثیر آسان برای تولید گیاهان یکسان از نظر ژنتیکی و افزایش میزان ماده موثره می­باشد (Azizi & Omidbeigi, 2002). در شرایط آزمایشگاهی می­توان متابولیت­های با ارزش مورد نظر را در تمام فصول سال و با مقدار و کیفیت دلخواه تولید کرد (Denath et al., 2006). مطالعه واکنش کال­ زایی، شاخه­ زایی و ریشه زایی گل راعی به عنوان تحقیقات بنیادی و پایه به منظور مطالعات بعدی انتقال ژن و تحقیقات بیوتکنولوژی ضروری است (Dias & Ferreira, 2003).

تا­کنون محققان زیادی جنبه­های مختلف کشت بافت گل راعی را مورد بررسی قرار داده­­اند.
Akcamolut (2010) در آزمایش­های خود به این نتیجه رسید که بهترین محیط کشت برای تحریک تولید کالوس از برگ و ساقه­­های گل راعی، محیط کشت MS حاوی یک میلی­­گرم بر لیتر 2,4-D به همراه یک میلی گرم بر لیتر NAA است.

در پژوهشی Carolina et al. (2001) گزارش کردند که بیشترین تولید کالوس در گل راعی از ریز نمونه­های کشت شده در حضور یک میلی­­گرم بر لیتر BA و یک میلی­­گرم بر لیتر2,4-D  در تاریکی بدست آمد و بیشترین تعداد جوانه­های بدست آمده از کالوس در حضور یک میلی­­گرم بر لیتر کینتین و 1/0 میلی­­گرم بر لیتر 2,4-D بود. (2005). Ayan et al گزارش کردند که بیشترین وزن تر کالوس در تیمار حاوی یک میلی­­گرم بر لیتر 2, 4-D و یک میلی­­گرم بر لیتر کینتین بدست آمد و کالوس­های بدست آمده در محیط کشت MS حاوی یک میلی­­گرم بر لیتر BA بیشترین شاخه زایی (19 شاخه در هر کالوس) را داشتند و شاخه­ها در محیط کشت MS حاوی یک میلی­­گرم بر لیتر  IAAریشه دار شدند.

هدف از انجام این آزمایش تعیین بهترین ریزنمونه و ترکیب هورمونی جهت افزایش میزان کالوس تولید شده برای کشت سوسپانسیون سلولی و بررسی اثر سایر القاکننده­ها بر میزان تولید ماده مؤثره در گل­راعی بود.

 

مواد و روش­ها

تهیه، ضد عفونی و کشت بذرها

بذرهای گل­راعی از بانک بذر مرکز تحقیقات گیاهان دارویی دانشگاه شاهد تهیه شد. بذرها به مدت 20 دقیقه در هیپوکلریت سدیم 5 درصد قرار گرفتند و سپس 3 مرتبه با آب مقطر استریل به مدت 12 دقیقه شستشو داده شدند. بذرهای شسته شده در زیر هود استریل به مدت 60 دقیقه قرار گرفتند تا کاملاﱠ خشک شوند. سپس بر روی محیط کشت MS (Murashige &  Skoog, 1962) حاوی 30 گرم ساکارز و 5/7 گرم آگار با pH 7/5 قرار گرفتند. در اتاقک رشد با شرایط نوری 2400 لوکس، دوره نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی در دمای 2 ± 25 سانتی­گراد نگهداری شدند.

استقرار در محیط کشت و انجام آزمایشات

ریز­نمونه­های برگ، ریشه و ساقه از دانه­رست­های 30 روزه جدا شده و به محیط­کشت­های حاوی هورمون انتقال یافتند. هورمون­های مورد استفاده پیکلورام،IAA ،2,4-D  (صفر، 5/0، 1 و 2 میلی‏گرم بر لیتر) وBAP  (صفر، 4/0 و 8/0 میلی‏گرم ‏بر لیتر) بودند. 12 میلی لیتر از هر محیط کشت در 5 تکرار داخل پتری دیش­های شیشه ای با ابعاد 8/1×6 سانتی متر توزیع، و در هر ظرف 5 قطعه از اندام مورد نظر کشت داده شد. نمونه­ها در شرایط تاریکی در دمای 23 درجه سانتی گراد قرار گرفتند. پس از گذشت 28 روز اثر متقابل بین نوع ریز­نمونه و سطوح هورمون‏ها از نظر کالوس زایی و اندام زایی مورد بررسی قرار گرفت.

ارزیابی آماری نتایج

تعداد شاخه، تعداد ریشه و اندازه کالوس در هر محیط کشت مورد بررسی قرار گرفت و داده­های بدست آمده در قالب آزمایش فاکتوریل با طرح پایه کاملاﱠ تصادفی با نرم افزار MSTATC مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند و مقایسه میانگین­ها به روش آزمون دانکن درسطح یک درصد انجام شد.

 

نتایج و بحث

آزمایش اول. در این آزمایش تمام ریز نمونه­ها تشکیل کالوس دادند. نتایج نشان داد که اثر تنظیم کننده­های رشد پیکلورام٬ BAP بر میزان کالوس زایی معنی دار بود (جدول 1). بین سطوح تیمار‏های پیکلورام٬ BAP در ریز نمونه ریشه در سطح 5 درصد و در ریزنمونه ساقه در سطح 1 درصد اثر معنی دار مشاهده شد. همچنین برای اثر متقابل دو فاکتور تفاوت معنی‏داری از نظر اندازه کالوس مشاهده‏ نشد. BAP و پیکلورام به ترتیب با غلظت 4/0 و 5/0 میلی‏گرم بر لیتر بیشترین اثر را بر تولید کالوس داشتند (جدول 2).   

 

جدول1- تجزیه واریانس اثر پیکلورام،2,4-D ، ایندول استیک اسید (صفر،5/0، 1 و 2 میلی‏گرم برلیتر) و بنزیل آمینو پورین (صفر،4/0 و 8/0 میلی‏گرم ‏برلیتر) بر میزان اندازه کالوس، شاخه زایی و ریشه زایی گل راعی در شرایط درون شیشه­ای.

 

 

میانگین مربعات Mean of Squar

 

 

ریز نمونه ریشه Root explants

ریز نمونه ساقه    Stem explant

ریز نمونه برگ Leaf explant

منبع تغییرات

Source of variation

 

درجه آزادی

Degree of freedom

 

اندازه کالوس

(میلی متر)

callus size

(mm)

تعداد ریشه

Number

root

تعداد شاخه

Number

shoot

اندازه کالوس

(میلیمتر)

callus size

(mm)

تعداد ریشه

Number

root

تعداد شاخه

Number

shoot

اندازه کالوس

(میلیمتر)

callus size

(mm)

تعداد ریشه

Number

root

تعداد شاخه

Number

shoot

Picloram

3

**0.219

00.0

00.0

**1.384

00.0

00.0

**0.219

00.0

.436ns

BAP

2

0.220

00.0

00.0

0.069

00.0

00.0

0.220

00.0

0.567 ns

Picloram ×BAP

6

0.147ns

00.0

00.0

0.468ns

00.0

00.0

0.147ns

00.0

1.261ns

Error

36

0.065

00.0

00.0

3.239

00.0

00.0

0.065

00.0

3.203

Samplig Error

144

0.109

00.0

00.0

13.649

00.0

00.0

0.109

00.0

15.965

 

2,4-D

3

00.0

00.0

00.0

20.048**

00.0

30.288**

00.0

00.0

00.0

BAP

3

00.0

00.0

00.0

57.203**

00.0

49. 303**

00.0

00.0

00.0

2,4-D×BAP

6

00.0

00.0

00.0

20.048**

00.0

20.041**

00.0

00.0

00.0

Error

48

00.0

00.0

00.0

0.137

00.0

0.993

00.0

00.0

00.0

Samplig Error

240

00.0

00.0

00.0

0.143

00.0

0.837

00.0

00.0

00.0

IAA

2

10.1**

9.8**

86.2**

15.7**

13**

74.7**

15.2**

19.2**

67.2**

BAP

2

3.6**

63.5**

9.1**

2.8**

46.4**

43.4**

11.4**

144**

89.6**

IAA×BAP

6

8.6**

9.86**

39**

7.3**

6.7**

35.4**

26.6**

19.2**

35.4**

Error

48

0.07

0.63

0.85

0.26

3.18

1.13

0.32

.14

1.01

Samplig Error

240

0.25

0.052

0.92

0.51

0.04

1.36

0.17

0.21

0.92

ns: عدم اختلاف معنی دار، *: معنی دار در سطح 5% ، **: معنی دار در سطح 1%

ns: non Significant,* Significant at the 5% level of probability, ** Significant at the 1% level of probability

 

Table1- ANOVA table for effect of different concentrations of picloram, 2, 4-D, IAA (0, 0.5, 1, 2 mgl-1) and BAP (0, 0.4, 0.8 mg l-1) on callus size, number shoot and number root of H. perforatum under in vitro condition.

 

 

در این آزمایش هر سه ریزنمونه به سمت تشکیل کالوس پیش رفتند، که بسیار مهم است زیرا استفاده از پیکلورام سرعت القای کالوس، سرعت رشد کالوس­ها و اندازه کالوس­ها را افزایش داد. هنگامی که غلظت پیکلورام با BAP تقریبا یکسان بود بیشترین میزان کالوس تولید شد (5 میلی­متر). نتیجه­ای که از این آزمایش بدست آمد، این بود که هیچ گونه ریشه یا شاخه­ای برروی کالوس­ها تشکیل نشد، که می­توان کالوس­ها را برای کشت سلولی به کاربرد.

آزمایش­دوم: در این آزمایش فقط از ریزنمونه ساقه استفاده شد. بین سطوح تیمار‏های 2,4-D٬ BAP و همچنین اثر متقابل دو فاکتور تفاوت معنی‏دار در سطح 1 درصد از نظر اندازه کالوس و میزان شاخه زایی مشاهده‏ شد. نتایج نشان داد که اثر تنظیم کننده­های رشد 2,4-D٬ BAP بر میزان کالوس زایی معنی دار بود (جدول 1). BAP با غلظت 8/0 میلی‏گرم بر لیتر کالوس بیشتر و با غلظت 4/0 میلی‏گرم بر لیتر تعداد شاخه بیشتری تولید کرد (جدول 2). 2,4-D با غلظت 2 میلی‏گرم بر لیتر کالوس بیشتر و با غلظت 5/0 میلی‏گرم تعداد شاخه بیشتری را تولید کرد (جدول 2). بر اساس گزارشات قبلی تولید شاخه از کالوس های گل راعی به وسیله NAA و BA تحریک می­شود Akcamolut,2010)).

در پژوهشی Bezo and Stefunova (2001) استفاده توام از اکسین و سیتوکنین را بهترین شرایط برای باززایی شاخه در گل راعی معرفی و محیط کشت حاوی 1/0 میلی‏گرم بر لیتر IBA به همراه 5 میلی­گرم بر لیترBA  را بهترین محیط کشت برای تولید بیشترین تعداد شاخه (7/7 درصد) بیان کردند. در این تحقیق نشان داده شد که می­توان از 2,4-D وBAP  برای ایجاد شاخه و ریز ازدیادی گل راعی استفاده کرد.

آزمایش­سوم: بین سطوح تیمار‏های IAA٬ BAP و همچنین اثر متقابل دو فاکتور تفاوت معنی‏دار در سطح 1 درصد از نظر اندازه کالوس، تعداد شاخه و تعداد ریشه مشاهده‏ شد. نتایج نشان داد که اثر تنظیم­کننده­های رشد  BAPو IAA برتمامی ویژگی­های (شاخه زایی، کالوس زایی و ریشه زایی) معنی­دار بود (جدول 1). BAP  با غلظت 4/0 یا 8/0 میلی‏گرم بر لیتر و IAA با غلظت 1 یا 2 میلی­گرم برلیتر بیشترین اثر را بر میزان کالوس زایی داشت (جدول 2). نتایج حاصل از آزمایش­های شاخه زایی نشان داد که هر سه ریزنمونه (ریشه، ساقه و برگ) گل­راعی دارای توان شاخه زایی بالایی بوده، بنابراین به راحتی می­تواند از این طریق تکثیر شود. در هر سه ریز نمونه (ریشه، ساقه و برگ) BAP با غلظت 8/0 میلی­گرم بر لیتر تعداد شاخه­ بیشتری تولید کرد (جدول 2). بر اساس گزارش (2007)  Dias et al. بیشترین تعداد شاخه بدست آمده در تیمار5/0 میلی‏گرم بر لیتر BAP و 1/0 میلی­گرم بر لیتر IAA بود. همچنین در گزارشات قبلی نیز بر این نکته تاکید شده بود که استفاده از BAP میزان باز زایی شاخه ها را از ریز­نمونه های برگ افزایش می­دهد (Pertto & Santarem, 2000). شاخه­های تشکیل شده بر روی کالوس با افزایش میزان BAP در محیط افزایش یافت که درنتیجه انتظار تولید بیشتر متابولیت­ها می­رود
 Omidbeigi & Azizi, 2002) ). IAA با غلظت 2 میلی­گرم بر لیتر بیشترین اثر را بر میزان ریشه زایی ریز نمونه های ریشه، ساقه و برگ گل راعی داشت (جدول 2). بر اساس گزارش (2011) Akbes et al.  ، در کشت ریزنمونه برگ، افزودن میزان 5/0 میلی‏گرم بر لیتر IAA بیشترین میزان ریشه زایی را در پی دارد و استفاده از IAA در غلظت­های 1 و 2 میلی­گرم بر لیتر اثر بسیار کمی بر ریشه زایی دارد و حتی از ایجاد ریشه نیز جلوگیری می­کند. اما براساس نتایج پژوهش موجود، هنگامی که از IAA به تنهایی یا در غلظت های 1 و 2 میلی­گرم بر لیتر استفاده شد، بیشترین تعداد ریشه تشکیل شده در هرسه ریز نمونه مشاهده شد.  (1999) Cellarova and Kimakova نشان دادند که IAA وIBA  بیشترین اثر را بر ریشه زایی گل­راعی می­گذارند. سرعت و میزان ریشه زایی به میزانIAA  موجود در محیط کشت وابسته ­است. در پژوهشیAyan et al.  (2005) گزارش کردند که IAA با غلظت 1 میلی­گرم بر لیتر میزان ریشه­دهی شاخه­های گل­راعی را به میزان قابل توجهی افزایش می­دهد، که تایید کننده نتایج پژوهش موجود است. هنگامی که غلظت BAP و IAA در تناسب با یکدیگر باشند، بر روی هر سه ریز نمونه مقدار کالوس بیشتری تشکیل شد.

 

نتیجه­گیری کلی

روش­های نوین و کاربردی کشت سلول و کشت بافت در به­نژادی و ازدیاد گیاهان دارویی این فرصت را فراهم می­کند که بتوان از گیاهان دارویی بهره برداری بیشتری کرد و به مقدار بیشتری از ترکیبات ثانویه ارزشمند دست­یافت. تکنیک کشت بافت و سلول یک فرصت کمیاب برای دخالت در پروفایل شیمیایی و افزایش تولیدات فیتو شیمیایی در اختیار انسان قرار می دهد. در صورتی که تمام شرایط به خوبی پیش رود، می توان دامنه وسیعی از ترکیبات فیتوشیمیایی با ارزش را از کالوس­های تمایز نیافته و سلول­های کشت شده بدست آورد. در این پژوهش سعی شد تا با کاربرد غلظت­های مختلف تنظیم کننده­های رشد و نوع ریز نمونه، بهترین ریز­نمونه و بهترین سطح هورمونی جهت بدست آوردن بیشترین مقدار کالوس برای کاربرد در محیط کشت سوسپانسیون سلولی پیدا شود. تا با کاربرد اثر سایر القا کننده­ها  بتوان  به مقدار بیشتری از ترکیبات ثانویه مفید دست یافت.

 

تشکر و قدردانی

از پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی ایران جهت تأمین هزینه­های پژوهش سپاس­گزاری می­شود.

 

 


جدول2- برهمکنش بین پیکلورام،2,4-D ، ایندول استیک اسید (صفر، 5/0، 1 و 2 میلی‏گرم برلیتر) و بنزیل آمینو پورین (صفر، 4/0 و 8/0 میلی‏گرم ‏برلیتر) بر میزان اندازه کالوس، شاخه زایی و ریشه زایی گل راعی در شرایط درون شیشه­ای.

ریز نمونه برگ

Leaf explant

 

ریز نمونه ساقه

Stem explant

 

 

ریز نمونه ریشه

Root explant

 

تیمار (میلی گرم بر لیتر)

Treatment (mg l-1)

اندازه کالوس

(میلیمتر)

callus size

(mm)

تعداد شاخه

Number

shoot

 

تعداد ریشه

Number

root

 

اندازه کالوس

(میلیمتر)

callus size

(mm)

تعداد شاخه

Number

shoot

 

تعداد ریشه

Number

root

 

 

اندازه کالوس

(میلیمتر)

callus size

(mm)

تعداد شاخه

Number

shoot

تعداد ریشه

Number

root

 

Pic

 

BAP

 

-

-

-

 

-

-

-

 

-

-

-

 

0

0

2a

-

-

 

2a

-

-

 

2.25a

-

-

 

0.5

2.62a

-

-

 

2.50a

-

-

 

2.62a

-

-

 

1

1.93a

-

-

 

2.31a

-

-

 

2a

-

-

 

2

2.69a

-

-

 

2.06a

-

-

 

2.37a

-

-

 

0

0.4

2.56a

-

-

 

2.87a

-

-

 

2.56a

-

-

 

0.5

2.38a

-

-

 

2.50a

-

-

 

2.37a

-

-

 

1

2.16a

-

-

 

2.62a

-

-

 

2.37a

-

-

 

2

2.37a

-

-

 

2.25a

-

-

 

2.25a

-

-

 

0

0.8

2.62a

-

-

 

2.62a

-

-

 

2.25a

-

-

 

0.5

2.28a

-

-

 

2.12a

-

-

 

2.25a

-

-

 

1

2.21a

-

-

 

2.56a

-

-

 

2.37a

-

-

 

2

-

-

-

 

-

1.20b

-

 

-

-

-

 

0

0

-

-

-

 

-

2.32a

-

 

-

-

-

 

0.5

-

-

-

 

-

2.24a

-

 

-

-

-

 

1

-

-

-

 

-

2.04a

-

 

-

-

-

 

2

-

-

-

 

-

2.40a

-

 

-

-

-

 

0

0.4

-

-

-

 

-

2.16a

-

 

-

-

-

 

0.5

-

-

-

 

-

2.20a

-

 

-

-

-

 

1

-

-

-

 

-

2.12a

-

 

-

-

-

 

2

-

-

-

 

-

2.16a

-

 

-

-

-

 

0

0.8

-

-

-

 

-

2.32a

-

 

-

-

-

 

0.5

-

-

-

 

2.40a

-

-

 

-

-

-

 

1

-

-

-

 

2.72a

-

-

 

-

-

-

 

2

-

1.76a

-

 

-

1b

-

 

-

1b

-

 

0

0

-

0.12b

2b

 

-

0.20

1.88c

 

-

-

1.28b

 

0.5

-

0.12b

2.80a

 

-

0.12b

2.32b

 

-

0.12b

1.60b

 

1

-

-

3.52a

 

0.84b

-

2.88a

 

0.38b

-

2.64a

 

2

-

3.32a

-

 

-

2.80a

-

 

-

2.12a

-

 

0

0.4

-

3a

-

 

-

2.64a

-

 

-

1.64a

-

 

0.5

-

3.08a

-

 

-

2.40a

-

 

-

2a

-

 

1

2.40a

0.44b

-

 

1.40a

0.16b

-

 

1.46a

24b.0

-

 

2

-

3.32a

-

 

-

2.84a

-

 

-

2.48a

-

 

0

0.8

-

2.76b

-

 

-

2.48a

-

 

-

2.56a

-

 

0.5

2.28a

0.28c

-

 

1.57a

0.00b

-

 

1.52a

-

-

 

1

-

2.88b

-

 

0.60b

2.68a

-

 

0.33b

1.68a

 

 

2

* درهرستون میانگین­های دارای حروف مشابه از نظر آزمون آماری دانکن در سطح 1% تفاوت معنی داری با یکدیگر ندارند.

*Means in each column with the same letters are not significantly different at 1% level

Table 2 Interaction of different concentrations of picloram, 2, 4-D, IAA (0, 0.5, 1, 2 mgl-1) and BAP (0, 0.4, 0.8 mg l-1) on callus size, number shoot and number root of H. perforatum under in vitro condition.


منابع

Akbas F, Cigdem I, Sureyya N, Pinar K, Davut B (2011). Direct plant regeneration from
in vitro- derived leaf explants Hypericum spectabile , a medicinal plant. Journal of Medicinal Plants Research 11: 2175-2181.

Akcamoluk E (2010). Hight­­­­­­­­­­­­­­­ efficiancy in direct shoot regeneration and hypericin content in embryogenic callus of H. triquetrifolium Turra. African Journal of biotechnology
9: 2229-2239.

Alali F, Tawaha K, Al-Eleimat T (2004). Determination of hypericin content in Hypericum triquetrifolium Tuna. (Hypericaceae) growing wild in Jordan. Natural Product Research 18: 147-151.                                                                                                           

Ayan AK, Cirak C, Kevserolu K, Sokmen A (2005). Effects of expellant types and different concentrations of sucrose and phytoharmones on plant regeneration and hypericin content in Hypericum perforatum L. Turkish Journal of Agriculture 29: 197-204.                                   

Azizi M, Omidbeigi R (2002). The investigation of Hypericum perforatum L .in the
 in vitro condition in production of hypericin and other secondary metabolites. Pajouhesh and sazandegi journal 40: 15-45.

Bezo M, Stefunova V (2001). Indirect regeneration of Hypericum perforatum L. under invitro conditions. Acta Fytotechnica Et Zootechnica 4: 277-279.                                              

Carolina A, Astarita LV, Santarem ER (2001). Organogenese in Hypericum perforatum L. IV Encontro Latino-Americano de BiotechnologinVegetal, Goiania, Resumos, p 81.                                                                                                                                            

Cellarova E, Kimakova k (1999). Morpholeguratory effect of plant growth regulators on Hypericum perforatumL. Seedling. Acta Biotechnology 19: 163-169.                                          

Çirak C, Aksoy HM, Ayan AK, Saglam B, Kevseroglu K (2005). Enhanced hypericin production in Hypericum perforatum and Hypericum pruinatum in Response to Inoculation with Two Fungal Pathogens. Plant protection Science 3: 109–114.

Denath M, Malik CP,  Bisen PS (2006). Micropropagation: a tool for the production of high quality plant –based medicines. Current Pharmaceutical Biotechnology 7: 33-49.                                         

Dias A, Franklin G, Oliveria M (2007). Production of transgenic Hypericum perforatumL. plants via particle bombardment –mediated transformation of novel organogenic cell of novel organogenic cell suspension cultures. PlantScience 172: 1193-1203.

Dias ACP, Ferreira MF (2003). Production of phenolics by in vitro cultures of Hypericum perforatum: a case study, in: A.P. Rauter, M.E. Araujo, F.B. Palma, J. ustino, S.P. Santos (Eds.), Natural Products in the New Millennium: Prospects and Industrial Application, Kluwer Academic Publishers, Dordrechtpp 367–374. 

Gadzovska S, Maury S, Delaunay A, Spasenoski M, Joseph J, Hage`ge D
 (2007). Jasmonic acid elicitation of Hypericum perforatum L. cell suspensions and effects on the production of phenylpropanoids and naphtodianthrones. Plant Cell Tissue Organ Culture 89:1-13.                                                                                                                                       

Murashige T, Skoog F (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures.  Plant Physiology 15: 473-497.

Pertto FR, Santarem ER (2000). Callus formation and plant regeneration form Hypericum perforatumL. leaves. Plant Cell Tissue Organ Culture 67: 107- 113.                                     

                                              


Effect of different growth regulators levels and explants types of callogenesis and organogenesis Hypericum perforatum L. under in vitro condition

 

SharafiE.1,3, Khayymnkyy S.M. 2, FotokianM.H.3, Davoodi D. 4, Hassanloo T.*1

                       

1 Department of Molecular Physiology, Agricultural Biotechnology Research Institute of Iran.

2 Department of Microbial Biotechnology, Agricultural Biotechnology Research Institute of Iran.

3 Department of Agricultural Biotechnology, Shahed University, Tehran, Iran.

4 Department of Nanotechnology, Agricultural Biotechnology Research Institute of Iran.

 

Abstract                                                                                                                                       

In this study the effect of different levels of plant growth regulators (picloram, 2,4-D, IAA and BAP) and explants type (root, stem and leaf) were examined on callogenesis and organogenesis of st John's wort with factorial experiment design on the basis of completely randomized design with five repeats and five explants. The explants were obtained from 30 days plantlets and transferred to media supplemented with picloram, 2,4-D, IAA (0, 0.5, 1, 2 mgl-1) and BAP (0, 0.4, 0.8 mg l-1). Samples were kept in the growth chamber in the darkness condition at 23°C. After 28 days, the interactions between explants types and hormone levels were investigated. The significant effect at the 1 percent probability was observed between treatment levels of 2, 4-D, picloram, BAP and its interaction (2, 4-D * BAP) for the calluses size and shoot numbers. Also the significant effect at the 1 percent probability was observed between treatment levels of IAA, BAP and its interaction (IAA*BAP) for the calluses size, shoot and root numbers. The highest numbers of shoots (83 shoots) were achieved in the leaf explants treated with 0.4 mgl-1 BAP. The highest callus size (5 mm) was observed in media containing 0.5 mg l-1 picloram and 0.4 mg l-1 BAP and stem explants also greatest number (91 roots) of roots were observed in media supplemented with 2 mgl-1 IAA in the leaf explants.

                                               

Key words: Medicinal plant, Micro-propagation, Plant breeding, Tissue culture.

         



*  نویسنده مسئول: طاهره حسنلو                           تلفن: 02632703536                        thasanloo@abrii.ac.ir Email:

* Corresponding author: Hassanloo T.                Tel: 02632703536         Email: thasanloo@abrii.ac.ir

 
Akbas F, Cigdem I, Sureyya N, Pinar K, Davut B (2011). Direct plant regeneration from
in vitro- derived leaf explants Hypericum spectabile , a medicinal plant. Journal of Medicinal Plants Research 11: 2175-2181.
Akcamoluk E (2010). Hight­­­­­­­­­­­­­­­ efficiancy in direct shoot regeneration and hypericin content in embryogenic callus of H. triquetrifolium Turra. African Journal of biotechnology
9: 2229-2239.
Alali F, Tawaha K, Al-Eleimat T (2004). Determination of hypericin content in Hypericum triquetrifolium Tuna. (Hypericaceae) growing wild in Jordan. Natural Product Research 18: 147-151.                                                                                                           
Ayan AK, Cirak C, Kevserolu K, Sokmen A (2005). Effects of expellant types and different concentrations of sucrose and phytoharmones on plant regeneration and hypericin content in Hypericum perforatum L. Turkish Journal of Agriculture 29: 197-204.                                   
Azizi M, Omidbeigi R (2002). The investigation of Hypericum perforatum L .in the
 in vitro condition in production of hypericin and other secondary metabolites. Pajouhesh and sazandegi journal 40: 15-45.
Bezo M, Stefunova V (2001). Indirect regeneration of Hypericum perforatum L. under invitro conditions. Acta Fytotechnica Et Zootechnica 4: 277-279.                                              
Carolina A, Astarita LV, Santarem ER (2001). Organogenese in Hypericum perforatum L. IV Encontro Latino-Americano de BiotechnologinVegetal, Goiania, Resumos, p 81.                                                                                                                                            
Cellarova E, Kimakova k (1999). Morpholeguratory effect of plant growth regulators on Hypericum perforatumL. Seedling. Acta Biotechnology 19: 163-169.                                          
Çirak C, Aksoy HM, Ayan AK, Saglam B, Kevseroglu K (2005). Enhanced hypericin production in Hypericum perforatum and Hypericum pruinatum in Response to Inoculation with Two Fungal Pathogens. Plant protection Science 3: 109–114.
Denath M, Malik CP,  Bisen PS (2006). Micropropagation: a tool for the production of high quality plant –based medicines. Current Pharmaceutical Biotechnology 7: 33-49.                                         
Dias A, Franklin G, Oliveria M (2007). Production of transgenic Hypericum perforatumL. plants via particle bombardment –mediated transformation of novel organogenic cell of novel organogenic cell suspension cultures. PlantScience 172: 1193-1203.
Dias ACP, Ferreira MF (2003). Production of phenolics by in vitro cultures of Hypericum perforatum: a case study, in: A.P. Rauter, M.E. Araujo, F.B. Palma, J. ustino, S.P. Santos (Eds.), Natural Products in the New Millennium: Prospects and Industrial Application, Kluwer Academic Publishers, Dordrechtpp 367–374. 
Gadzovska S, Maury S, Delaunay A, Spasenoski M, Joseph J, Hage`ge D
 (2007). Jasmonic acid elicitation of Hypericum perforatum L. cell suspensions and effects on the production of phenylpropanoids and naphtodianthrones. Plant Cell Tissue Organ Culture 89:1-13.                                                                                                                                       
Murashige T, Skoog F (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures.  Plant Physiology 15: 473-497.
Pertto FR, Santarem ER (2000). Callus formation and plant regeneration form Hypericum perforatumL. leaves. Plant Cell Tissue Organ Culture 67: 107- 113.