کاربردها، عوامل و ژن‌های دخیل در جنین‌زایی رویشی گیاهان

نرگس مجتهدی¹*، پریسا کوباز¹، سولماز خسروی²

¹ عضو هیات علمی (مربی) پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی، کرج.

² کارشناس پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی، منطقه شمال و شمال غرب ایران، تبریز.

تاریخ دریافت: 3/10/1390، تاریخ پذیرش: 29/7/1391

چکیده

علیرغم توسعه روز افزون بیوتکنولوژی و مهندسی ژنتیک در سالیان اخیر و استفاده از جنین‌زایی رویشی به عنوان یکی از کاربردی‌ترین تکنیک‌ها جهت ریزازدیادی و باززایی گیاهان، تاکنون در این زمینه، مطالعات جامع و کاربردی در داخل کشور انجام نشده است. در این مقاله، اصطلاحات مورد استفاده، مراحل القا و تکوین جنین‌زایی رویشی در شرایط درون شیشه‌ای شامل مراحل گلبولی، قلبی شکل و اژدری در دولپه‌ای‌ها، مراحل کروی، شاخی و لپه‌ای شکل در تک‌لپه‌ای‌ها و مراحل جنین زایی در بازدانگان عوامل و فاکتورهای دخیل همچون عوامل وابسته به گونه، رقم، نقش تنظیم کننده های رشد گیاهی، شرایط فیزیولوژیک گیاهان مادری و کاربردهای جنین‌زایی اعم از تولید گیاهان با سطوح پلوئیدی متفاوت و ایجاد گیاهان تراریخته، همچنین تغییر در بیان ژن به خصوص در دوره جنین‌زایی، نشانگرهای مولکولی، بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی مرتبط با استعداد سلول‌های جنین‌زا شامل ایزوزیم‌ها، نشانگرهای مولکولی و تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی مورد بحث و بررسی قرار گرفته است.

کلمات کلیدی: جنین‌زایی رویشی، القا، فاکتورهای فیزیولوژی، تنظیم کننده‌های رشد گیاهی.

مقدمه

اندام‌زایی و جنین‌زایی رویشی دو مکانیزم متفاوت است که طی آن از ریزنمونه گیاهی، یک گیاه کامل باززا می‌شود. به طور کلی، در مورد اول، شاخه‌ها و ریشه‌ها به ترتیب در پاسخ به شرایط محیطی مناسب (بسته به نوع و غلظت تنظیم‌کننده‌های موجود در محیط کشت) تشکیل می‌شوند. این نوع از تکوین با وجود ارتباط آوندی بین بافت مادری و بخش باززا شده مشخص می‌شود (Terzi and Lo Schiavo, 1990). اما، جنین‌زایی رویشی فرآیندی است که بوسیله آن سلول‌های رویشی دیپلوئید یا هاپلوئید به ساختارهایی که مشابه جنین‌های زایشی هستند، تکوین می یابند. این فرآیند، مانند تشکیل ساختارهای دو قطبی فاقد هرگونه ارتباط آوندی با بافت مادری است. جنین‌زایی رویشی از طریق یک سری مراحل اختصاصی منظم بدون ترکیب گامت‌ها ایجاد می‌شود (Emons, 1994; Raemakers et al., 1995). ویژگی برجسته جنین‌زایی رویشی، رشد دائمی آن می‌باشد که در نتیجه عدم حضور بازدارنده‌های رشد، ایجاد می‌شود (Faure et al., 1998). در یک ریزنمونه، هر دو فرآیند اندام‌زایی و جنین‌زایی رویشی مشاهده شده است (He et al., 1990) ولی دو فرآیند مذکور از لایه‌های بافتی مشخص یا سلول‌های ویژه‌ای از ریزنمونه منشاء گرفته است (Osternack et al., 1999). مثال‌های متعددی در مورد جنین‌زایی رویشی در شرایط آزاد (in vivo) در بافت‌های زایشی مثل سلول‌های سینرژید و بافت خورش و همچنین در بافت‌های رویشی مانند سلول‌های تخمدان (آپومیکسی) و سلول‌های حاشیه برگ، گزارش شده است (Merkle et al., 1995; Sharma and Thorpe, 1995).

اولین تعاریف جنین‌زایی رویشی توسطSteward  و همکارانش در سال 1958 و Reinert در سال 1959 با کار بر روی هویج، ارائه شد (Steward et al., 1958; Reinert, 1959). Krikorian و Simola در سال 1999 اعلام کردند که پیشگام اولیه تحقیق بر روی پدیده جنین‌زایی رویشی، Harry Waris بوده است که بر روی گیاه Oenanthe aquatica از خانواده چتریان تحقیق نموده است (Krikorian and Simola,1999). تحقیقات اولیه بسیار اهمیت دارند، چرا که پیش‌بینی Haberlandt  مبنی بر اینکه جنین‌ها می‌توانند از سلول‌های مجزا در شرایط کشت (فرضیه توتی‌پتانسی[1]) بوجود آیند را تایید می‌کند (Höxtermann, 1997). از آن زمان تاکنون، تعداد گونه‌های گیاهی که می‌توان از آنها جنین رویشی بدست آورد، افزایش یافته است. این پدیده حداقل در 200 گیاه نهاندانه و بازدانه به ثبت رسیده است (Raemakers et al., 1995). اگرچه برخی از گونه‌ها بسته به منشاء کشت‌ و نوع باززایی، نسبت به بقیه گیاهان سخت‌تر پاسخ می‌دهند (Rao, 1996).

یافتن شرایط مناسب به منظور القاء جنین‌زایی رویشی در گونه‌ها و ارقام مختلف از جمله بررسی تاثیر شرایط و محیط‌های مختلف کشت و نوع و سطوح تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی، هنوز بر اساس آزمون و خطا است(Henry et al., 1994) . هرچند، نقش ژنوتیپ و شرایط فیزیولوژیکی گیاه در این فرایند، بندرت مطالعه شده است و این امر موجب ایجاد محدودیت در کشت بافت گیاهان به مدت طولانی، توسعه روش‌های الحاق پروتوپلاست و انتقال ژن برای اصلاح گیاهان تک‌لپه‌ای شده است ((Henry et al., 1994. بیشتر موفقیت‌های کسب شده در زمینه درک فرآیندهای باززایی گیاه از طریق جنین‌زایی رویشی بوسیله گونه‌های گیاهی مدل بدست آمده است هرچند انتقال این فن‌آوری به گونه‌های زراعی عمده بسیار مشکل و کند می‌باشد (Vasil, 1987). القاء موفق جنین‌های رویشی و بدنبال آن احیاء گیاهان زنده از آنها در بسیاری از گونه‌ها کارآمد نیست (Merkle et al., 1995). البته در سالیان اخیر در بعضی گونه‌های گیاهی سرسخت[2] همچونPinus kesiya, Pinus patula  وPinus roxburghii با استفاده از مریستم‌های انتهایی شاخه‌ها، جنین‌های رویشی تولید شده است.(Malabadi et al., 2004; Malabadi and Nataraja, 2006; Malabadi and Van Staden, 2003, 2005). همچنین، محققین از ریزنمونه‌های برگی درختان صد ساله Quercus robur جنین‌زایی رویشی غیرمستقیم تولید کرده‌اند و موفق به تشکیل یک گیاه کامل نیز شده‌اند (Corredoira et al., 2006). قابلیت درک فرآیندهای درگیر در القاء و بیان جنین‌زایی رویشی در گونه‌های متفاوت، تعداد ژنوتیپ های توانا در باززایی با این روش را افزایش می‌دهد.

کاربردهای جنین‌زایی رویشی

یکی از اساسی‌ترین کاربردهای جنین‌زایی رویشی، استفاده از این روش در درک رویدادهای اولیه در جنین‌زایی زایشی گیاهان عالی می‌باشد. شاید دلیل پیشرفت محدود در زمینه وقایع تکوینی در جنین گیاهان، کوچک بودن جنین‌های زایشی در گیاهان عالی است که در بین بافت مادری نظیر گل یا میوه‌های نابالغ رشد می‌کنند. همچنین، جمع‌آوری جنین کافی برای بررسی‌های مورفولوژیکی، بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی که در ابتدای فرآیند رشد اتفاق می‌افتند، بسیار مشکل است. جنین‌های رویشی یک مدل مناسب برای غلبه بر چنین مشکلاتی هستند(De Jong et al., 1993; Zimmerman, 1993). تکثیر انبوه گیاهان با استفاده از ریزنمونه‌های جنین‌زا، جذابـترین کاربرد اقتصادی جنین‌زایی رویشی است (Merkle et al., 1995). جنین‌زایی رویشی دارای فواید بسیاری در مقایسه با اندام‌زایی است:

1) کشت تعداد زیادی از واحدهای تکثیر[3] شونده به عنوان مثال 60000 تا 35/1 میلیون جنین رویشی در هر لیتر محیط کشت.

2) امکان تولید جنین بیشتر با کار کمتر.

3) قابلیت منشاء گرفتن جنین رویشی از یک سلول واحد جهت ایجاد کشت‌های یکنواخت[4] .

4)  گیاهان بدست آمده از جنین‌های رویشی نسبت به گیاهان حاصل از اندام‌زایی قابلیت تغییر کمتری دارند  درنتیجه پایدارترند .( Merkle et al., 1995; Osuga et al., 1999)

جنین‌های رویشی نسبت به جهش ژن‌های مورد نیاز برای تکامل، تحمل کمتری دارند، در حالی‌که مریستم‌های رویشی نسبت به جهش‌ها و تغییرات محیطی تحمل بیشتری دارند که این امر پایداری بیشتر گیاهان حاصل از جنین زایی نسبت به گیاهان حاصل از اندام زایی را توجیه می کند (Merkle et al., 1995).

کاربرد دیگر جنین‌های رویشی در تولید گیاهان با سطوح پلوئیدی متفاوت یعنی ایجاد جنین‌های هاپلوئید به وسیله کشت بساک و افزایش تریپلوئیدی از آندوسپرم                      می‌باشد (Merkle et al., 1995). ثابت شده است که کشت‌های جنینی، منابع خوبی از پروتوپلاست‌های باززا، در خانواده گندمیان و گونه‌های درختان جنگلی را فراهم می‌کنند. امروزه انتقال ژن به سلول‌های جنینی گیاه با روش اصلاح سنتی رقابت می‌کند و ابزاری ضروری برای اصلاح محصولات زراعی به شمار می‌رود. یکی از مهمترین شروط برای تکثیر گیاهان در شرایط درون شیشه‌ای، قابلیت رشد سلول‌های رویشی در محیط رشد استریل و باززایی گیاهان زنده در این محیط‌‌ها می‌باشد. بنابراین جنین‌زایی رویشی بهترین روش به منظور ایجاد گیاهان تراریخته                                                 است (Litz and Gray, 1995; Vicient and Martinez, 1998). جنین‌زایی ثانویه که حداقل در 80 گونه گزارش شده است، پتانسیل بالایی برای تولید متابولیت‌های جنینی مانند لیپیدها و پروتئین‌های ذخیره‌ای دانه فراهم می‌کند (Raemakers et al., 1995). اگرچه، به دلیل هزینه بالای استخراج از این طریق که بیش از هزینه استخراج از بذرهای طبیعی است، این فن‌آوری همچنان تجاری نشده است (Namdeo et al., 2007)، اما با استفاده از گیاهان تراریخته و تکنولوژی بیوراکتورها امکان تکثیر و نهایتا استخراج داروها، واکسن‌ها و بعضی از پروتئین‌ها با هزینه کمتر فراهم شده است (Yesil-Celiktas et al., 2010). به نظر می‌رسد که تکامل جنینی سلول‌های رویشی به کاربرد ترکیبات شیمیایی خارجی بیش از رشد یک گیاه کامل یا حتی تولید کشت‌های پینه‌ای، حساس باشد. این امر امکان استفاده از غربالگری درون شیشه‌ای و شناسایی ژنوتیپ‌های گیاهی مقاوم به فاکتورهای خاص نظیر سمیت آلومینیوم یا سموم تولید شده توسط پاتوژن‌ها را فراهم می‌کند (Merkle et al.,1995).

مراحل تکوین جنین‌زایی رویشی

تکامل جنین‌زایی رویشی به دو مرحله اساسی تقسیم شده است:

- مرحله‌ اول که در آن سلول رویشی تمایز یافته، مستعد شده و به صورت سلول‌های جنینی تکثیر می‌شود. این مرحله توسط Komamine و همکاران، فاز صفر (1992)، توسط Rao (1996) مرحله تعیین[5] و توسط Dodeman  و Ducreux (1997) مرحله القاء نامیده شد. این مرحله، هیچ گونه فاز مشابهی در جنین‌زایی زایشی ندارد (Emons, 1994).

- مرحله دوم که سلول جنینی، توانایی جنینی خود را نشان داده و به جنین‌های رویشی تمایز می‌یابد.

این دو مرحله از یکدیگر مستقلند و بوسیله فاکتورهای مختلفی تحت تاثیر قرار می‌گیرند. در این مرور، کلمه القاء برای مرحله اول و کلمه بیان برای مرحله دوم انتخاب شده است. اصطلاح سلول جنینی محدود به سلول‌هایی است که گذر از حالت رویشی (غیر جنینی) به مرحله بعد را کامل کرده‌اند. در این مرحله، هیچ محرک خارجی دیگر همچون تنظیم‌کننده‌های رشد که برای مرحله اول ضروری بودند، به کار برده نمی‌شود(Komamine et al., 1992; De Jong et al., 1993) . سلول‌هایی که به این مرحله رسیده‌اند و قبلا شروع به جنین‌زایی کرده‌اند اما هنوز نیاز به محرک خارجی دارند، به عنوان سلول‌های مستعد شناخته می‌شوند(Mordhorst et al., 1997) .

القاء جنین‌زایی رویشی

 به نظر می‌رسد، القاء رشد جنینی در کشت‌های سلولی هویج، به دو صورت اتفاق می‌افتد. این حالت در بسیاری از گونه‌ها نیز رخ می‌دهد:

1) به طور مستقیم از یک بافت بالغ نظیر برگ، قطعه‌ای از ساقه، جنین زایشی، پروتوپلاست یا میکروسپورها (سلول‌هایی که به نظر می‌رسد قبلا برای تکامل جنینی، در نظر گرفته شده‌اند، فقط به شرایطی برای بیان نیاز دارند).

2) به طور غیر مستقیم از یک مرحله حد واسط پینه ای یا سوسپانسیون سلولی (در این موارد از یک محیط پیچیده‌تر باید استفاده کرد که شامل فاکتورهای اضافی برای القای تمایززدایی و آغازش دوباره از تقسیم سلولی سلول‌های تمایز یافته پیشین، قبل از بیان جنین‌زایی                 است) (Emons, 1994). پس از القای جنین‌زایی به صورت مستقیم و غیرمستقیم، به نظر می‌رسد که هیچگونه اختلاف اساسی بین جنین‌زایی مستقیم و غیرمستقیم وجود ندارد. مشخص شده است که در تعداد زیادی از سیستم‌هایی که جنین‌زایی به صورت غیرمستقیم اتفاق می‌افتد، پینه جنین‌زا از جنین‌های جوان (توده‌های پیش‌جنینی یا جنین‌های پیش گلبولی زایشی) ایجاد می‌شود و تکوین بیشتر آن به طول مدت کاربرد محرک‌های القایی بستگی دارد (Emons, 1994). اگر طول مدت کاربرد محرک‌های القایی کوتاه باشد، جنین‌زایی مستقیم و در صورت طولانی بودن، جنین‌زایی به روش غیرمستقیم انجام خواهد شد. در مورد گیاه مدل هویج، سلول‌های مستعد مجزا، خوشه‌های سلولی جنین‌زا در مجاورت اکسین تشکیل دادند (Komamine et al., 1992). به نظر می‌رسد که این سلول‌های مجزا برای جنین‌زایی، از پیش تعیین شده‌اند. در طول این مرحله، خوشه‌های سلولی در زمان حذف اکسین توانایی تکوین به صورت جنین رویشی را                                        می‌یابند (Nomura and Komamine, 1985; Komamine et al., 1992). سلول‌های جنینی منحصر به فرد بوده و از لحاظ ظاهری شبیه سلول‌های مریستمی (اندازه کوچک‌تر، دارای شکل منظم، هسته و هستک متراکم‌تر و بزرگ‌تر و سیتوپلاسم متراکم‌تر) هستند ( Carman, 1990).

بیان جنین‌زایی رویشی

زمانی که مرحله القای جنین‌زایی کامل شد، الگوی جنین‌زایی برای تمام اشکال جنینی اعم از رویشی و زایشی یکسان است (Mordhorst et al., 1997). بنابراین جنین‌های زایشی و رویشی، سیر تکوینی مشابهی شامل مراحل گلبولی، قلبی شکل و اژدری (شکل 1) را در دولپه‌ای‌ها و مراحل کروی، شاخی و لپه‌ای شکل[6] را در تک‌لپه‌ای‌ها (شکل2) طی                                                  می‌کنند (Gray et al., 1995; Toonen and De Vries, 1996). این تفاوت‌های شکلی به دلیل تکامل خاص هریک از دو گروه عمده گیاهی است به‌طوری‌که جنین تک‌لپه‌ای‌ها یک ‌لپه منفرد ایجاد کرده و به مرحله قلبی شکل نمی‌رسند(Kaplan and Cooke, 1997). نوع دیگری از تکوین جنینی در مخروطیان شامل سه مرحله گلبولی، لپه‌ای اولیه و جنین‌های لپه‌ای موخر (شکل3) می‌باشد .(Dong and Dunstan, 2000)

یک مرحله رشدی میانه، بین مرحله کروی و قلبی شکل به عنوان جنین دوکی ‌شکل در دولپه‌ای‌ها معرفی شده است. اگرچه در مطالعات اولیه، جنین‌های قلبی و اژدری به عنوان مراحل جداگانه در تکوین جنین تعریف شده بودند، اما تشخیص بین آنها، بیشتر بر اساس تفاوت در اندازه می‌باشد (Schiavone and Cooke, 1985). در مدل‌های ارائه شده، مرحله 1 (اولین مرحله در بیان جنین‌زایی رویشی) با انتقال خوشه‌های سلولی به محیط فاقد اکسین القاء می‌شود. در طی این مرحله، خوشه‌های سلولی به آرامی تکثیر شده و ظاهرا هیچ تمایزی ندارند. پس از این مرحله، تقسیم سریع سلولی در نواحی خاصی از خوشه‌های سلولی اتفاق افتاده که منجر به تشکیل جنین‌های گلبولی می‌شود (مرحله 2). در مرحله بعدی (مرحله 3)، گیاهچه‌ها از جنین‌های گلبولی، قلبی و اژدری ایجاد می‌شوند (Komamine et al., 1992). بیان جنین‌زایی رویشی بوسیله فاکتورهای متعددی وابسته به گونه، رقم ، شرایط فیزیولوژیک گیاهان مادری و ... تحت تاثیر قرار می‌گیرد. اگرچه، رایج‌ترین روش جنین‌زایی، افزایش و کاهش غلظت اکسین (بیشتر 2و4- دی‌کلروفنوکسی استیک اسید)[7] در محیط کشت القاء کننده است.

شکل 1- جنین‌های رویشی در کلزا Brassica napus L. در مراحل الف) گلبولی ب) مرحله قلبی ج) مرحله اژدری (Valizade et al., 2003).

Table 1- Brassica napus somatic embryogenesis stages: a) globular, b)heart shape, c)torpedo shape.

شکل 2- جنین‌های رویشی سوسن در مراحل الف) گلبولی ب) مرحله شاخی ج) مرحله لپه‌ای شکل (Khosravi et al., 2007).

Table 2- Lilium somatic embryogenesis stages: a) globular, b) scultelar, c) coleopetilar stages.

شکل 3- جنین‌های رویشی Pinus roxburghii در مراحل الف)گلبولی و لپه‌ای اولیه ب) مرحله لپه‌ای موخر (Ravindra et al., 2006).

Table 3-Somatic embryogenesis stages of Pinus roxburghii: a) globular and coleopetilar b) late coleopetilar stages.

فاکتورهای وابسته به استعداد جنین‌زایی

القاء جنین‌زایی رویشی‌ می‌تواند خودبخودی بوده و به تیمارهای پیچیده و طولانی نیاز نداشته باشد. سلول‌های ریزنمونه غیرجنینی قابلیت القاء جنینی را دارند. این کار با روش‌های مختلفی از جمله: استفاده از تنظیم‌کننده‌های رشدگیاهی، تنش pH، تنش گرما و تیمار با مواد شیمیایی مختلف انجام می‌شود. هرچند که هنوز مشخص نیست کدام یک از تغییرات شیمیایی منجر به تبدیل تعداد معدودی از سلول‌های رویشی یک ریزنمونه به سلول جنینی                                           می‌شوند .(Toonen and DeVries, 1996)

فاکتورهای ساختاری

پیدایش قطبیت در جنین‌ها به عنوان اولین مرحله در جنین‌زایی مد نظر قرار                          می‌گیرد (Warren Wilson and Waren Wilson, 1993). به عنوان مثال در هویج و یونجه، اولین تقسیم سلولی، ایجاد دو سلول نامتقارن از لحاظ اندازه است (Dudits et al., 1991) و در هویج، تنها سلول دختری کوچک‌تر تبدیل به جنین خواهد شد (De Jong et al., 1993). تاثیر قطبیت در جنین‌زایی و باززایی مستقیم در دو گونه از سوسن نیز گزارش شده است (Khosravi et al., 2007; Mojtahedi et al., 2010).

در بیشتر گونه‌هایی که ظرفیت جنین‌زایی دارند، تقسیم نامتقارن به طور مستقیم جنین ایجاد نمی‌کند، بلکه باعث ایجاد توده‌های پیش جنینی[8] می‌شود که در آن تنها تعداد اندکی از سلول‌ها می‌توانند به جنین تبدیل شوند (Komamine et al., 1992; Nuti Ronchi and Giorgetti, 1995). بقیه سلول‌های پیش جنینی احتمالا در طی فرآیند مرگ برنامه‌ریزی شده سلولی حذف می‌شوند. این پدیده در گیاه صنوبر نروژی[9] مشاهده شده است (Filonova et al., 2000).

از طرفی، ضرروت جهت گیری تقسیم سلول اولیه (در جنین زایی رویشی و زایشی) برای ایجاد قطبیت در سلول تخم بررسی شده است. مطالعات گسترده در این زمینه روی 19 خانواده گیاهان دولپه ای نشان داده است برخلاف اولین تقسیم مورد انتظار ( تقسیم عرضی)، این تقسیم می‍تواند بصورت طولی، مورب یا متغیر نیز انجام پذیرد. لذا، اولین تقسیم نامتقارن برای جنین‌زایی رویشی یا زایشی تنها شرط ضروری نیست و توزیع نامتقارن اجزای درون سلولی در مراحل اولیه جنین‌زایی بسیار مهم می‌باشد. همچنین، فاکتورهای ساختاری دیگری وجود دارند که می‌توانند بر القای سلول‌های پیش جنینی موثر باشند از جمله ساختار میکروتوبول‌ها، دیواره سلولی و اندازه سلول که به نظر می‌رسد نقش مهمی در جنین‌زایی رویشی ایفا می‌کنند(Toonen and De Vries, 1996) . مطالعات نشان داده است که یک آنتی‌ژن بر روی دیواره سلولی سلول‌های جنینی وجود دارد که موجب تقسیم نامتقارن این سلول‌ها می‌گردد. یکی از سلول‌های دختری حاوی آنتی‌‌ژنی است که با آنتی‌بادی JIM8  شناسایی می‌شود و دیگری فاقد آنتی‌ژن است و سلول‌های عاری از آنتی‌ژن در نهایت جنین‌های رویشی را تشکیل می‌دهند (McCabe et al., 1997).

نکته مهم دیگر، ضرورت وجود سلول‌هایی است که به منظور القای جنین‌زایی، در معرض جدایی فیزیکی قرار می‌گیرند. این مساله در مورد جنین‌های رویشی مشاهده می‌شود که در محیط کشت‌های سوسپانسیونی بوجود آمده‌اند. این جداسازی فیزیکی منجر به درجات متفاوتی از جداسازی فیزیولوژیکی (فقدان پلاسمودسماتا بین سلول‌های مجاور، قطع تداوم سیمپلاستی و کاهش اتصال الکتریکی[10]) می‌‌شود (Warren Wilson and Warren Wilson, 1993).

فاکتورهای فیزیولوژیکی

اگرچه تنظیم‌کننده‌های رشد نقش مهمی را در القای جنین‌زایی رویشی بازی می‌کنند، فاکتورهای متعدد دیگری وجود دارند که تمایل یک بافت ویژه برای القای جنین‌زایی رویشی را تحت تاثیر قرار می‌دهند. محدوده تیمارهای ممکن برای القاء نشان می‌دهد که تنها یک مولکول مسؤول القاء کنندگی نیست (Toonen and De Vries, 1996).

مثال‌هایی از فاکتورهای دیگری که باعث تبدیل یک سلول رویشی به سلولی با قابلیت تشکیل ساختارهای جنینی می‌شوند عبارتند از:

- تغییر منبع کربن در کشت‌های سوسپانسیونی از ساکارز به گلیسرول درCitrus  (Gavish et al., 1991; Jimenez  and Guevara, 1996)

- تغییرات غلظت آمونیوم و pH در محیط کشت هویج (Smith and Krikorian, 1989, 1990)

- کیفیت نور در (Torne et al.,2001) Araujia sericifera

- شوک دمایی در میکروسپورهای (Pechan and Keller,1988) Brassica

- پیش تیمار گیاهان مادری و مدت زمان واکشت (Morocz et al.,1990; Mojtahedi et al., 2000)

- پیش تیمار ریزنمونه‌های اولیه تحت تنش خشکی فیزیولوژیک (You et al., 2007)

جزئیات بیشتر در مورد برخی از فاکتورها در مقالات دیگر ارائه شده است (Tulecke, 1987; Harada 1999).

تراکم کشت سوسپانسیون سلولی عامل دیگری است که جنین‌زایی رویشی را تحت تاثیر قرار می‌دهد. با وجود آن که تراکم بالایی از سلول‌ها (10⁵ سلول در هر میلی‌متر) برای تشکیل خوشه‌های سلولی جنینی از سلول‌های واحد مورد نیاز است(Nomura and Komamine, 1985)  تراکم کمتری از سلول (10⁴´2 سلول در هر میلی‌متر) برای رشد جنین از سلول‌های رویشی ترجیح داده می‌شود (Fujimura and Komamine, 1979). این مساله ممکن است به تراوش پروتئین‌ها یا دیگر فاکتورهای سلولی به داخل محیط کشت مرتبط باشد. در واقع پروتئین‌های ترشحی (خارج سلولی) یا ساختمانی (درون سلولی) نقش بسیار مهمی را در القای جنین‌زایی رویشی بازی می‌کنند (De Vries et al., 1988a,b; Gavish et al., 1991, 1992). افزودن پروتئین‌های آرابینوگالاکتان[11] که از محیط‌های کشت جنین‌زایی و دانه‌های خشک هویج جدا شده‌اند، قادر به تحریک تشکیل توده‌های پیش‌جنینی، حتی در لاین‌های سلولی غیر‌جنینی هویج می‌باشند. پروتئین‌های مشابه، اما جدا شده از محیط کشت لاین‌های غیر جنین‌زا، تاثیر منفی بر تشکیل توده‌های پیش‌جنینی دارند (De Jong et al., 1993). مطالعات نشان داده است که سلول‌های مستعد برای جنین‌زائی، به پیام‌های محلول از دیگر سلول‌ها نیاز دارند که تصور می‌شود این پیام، یک پروتئین آرابینوگالاکتان است(McCabe et al., 1997) . ساز و کار اثر پروتئین‌های ترشحی بر جنین‌زایی هنوز مشخص نشده است اما به نظر می‌رسد که این پروتئین‌ها روی پلی‌مرهای دیواره سلولی                          موثرند (Van Holst et al., 1981).

مطالعات نشان داده است که کشت همزمان جنین‌های رویشی هویج و سوسپانسیون سلولی Arabidopsis thaliana در محیط کشت فاقد تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی موجب تکوین جنین‌های رویشی تا مرحله گلبولی می‌شود (Meijer et al., 1999). علاوه بر این، مطالعات نشان داده است که جنین‌زایی رویشی در کشت‌های سلولی هویج، زمانی‌که تراکم سلول‌ها بسیار بالا است، توسط عامل محدود کننده‌ای به نام 4-هیدروکسی بنزیل الکل، به شدت                                                         محدود می‌شود (Kobayashi et al., 2000). به نظر می‌رسد که اختلاف در محتوای قند و نشاسته پینه‌های جنین‌زا و غیر جنین‌زای Medicago arborea خصوصیت مهمی است که با استفاده از آن می‌توان پینه های جنین‌زا و غیر جنین‌زا را از یکدیگر تشخیص داد. پینه‌های جنین‌زا حاوی قند بیشتر و نشاسته کمتر در مقایسه با پینه‌های غیر جنین‌زا هستند (Martin et al., 2000).

بیان ژن

شکل گیری مستقیم یا غیر مستقیم گیاه با تغییر در بیان برخی ژن‍‍ها به خصوص در دوره جنین‌زایی انجام می‌شود. به عنوان مثال یک ژن کد کننده گیرنده پروتئین کیناز به عنوان یک گیرنده کیناز در جنین زایی رویشی (SERK) هویج شناسایی شده است(Schmidt et al., 1997) . در آرابیدوپسیس، پنج خانواده از فامیل ژنی SERK شناسایی شده‍اند (AtSERK1-5) به طوریکه بیان ژن SERK1 که در طی جنین زایی رویشی در پینه‍ های مستعد جنین زایی بیان می شود تا چهار برابر افزایش می یابد (Hecht et al., 2001). در ذرت نیز دو ژن مرتبط با جنین زایی ZmSERK1  و ZmSERK 2 شناسایی شده است (Baudino et al., 2001). LEC1 ژن دیگر شناسایی شده در آرابیدوپسیس است که بیان آن در طی جنین زایی زایشی افزایش می‍‍یاید (Lotan et al., 1998).

- تخمین تعداد RNA های متفاوت در دانه‌های در حال تشکیل.

- بررسی انتشار فضایی و زمانی انواع ویژه‌ای از RNA.

- جداسازی و تعیین خصوصیت ژن‌هایی که پروتئین‌های فراوان دانه به ویژه پروتئین‌های ذخیره‌ای دانه را کد می‌کنند.

- تعیین توالی‌های تنظیمی پروتئین‌های متصل به DNA trans- acting) و (cis- acting که بیان ژن‌های خاص دانه را تنظیم می‌کنند(Meinke, 1995) .

هرچند اساس مطالعات مولکولی در جنینی‌زایی رویشی، بر پایه مقایسه ژن‌ها و پروتئین‌های در حال بیان در سلول‌های جنینی و غیر جنینی در مراحل مختلف می‌باشد (Rao, 1996)، مطالعات بیان ژن در طی مراحل مختلف فرآیند جنین‌زایی رویشی، نشان داده است که ژن‌های بسیار محدودی در این وقایع نقش دارند(Henry et al., 1994; Dong and Dunstan, 2000; Dodeman and Ducreux, 1996; Schrader et al., 1997) و تغییر در الگوی پروتئین، غالبا در مرحله پس از رونویسی[12] و در سطح mRNA تنظیم می‌شود (Komamine et al., 1992; Wilde et al., 1995). مطالعات نشان داده که تغییر در سطوح هورمونی در بافت‌های کشت شده، ممکن است ساخت بعضی از پروتئین‌های دخیل در جنین‌زایی رویشی را تغییر دهد(Dodeman and Ducreux, 1996) .  دو ژن از هیپوکتیل‌های القاء شده هویج که با غلظت‌های بالای 2,4-D به مدت دو ساعت تیمار شده بودند، جدا شده‌ است. این دو ژن باعث آغاز جنین‌زایی رویشی مستقیم از ریزنمونه‌ها می‌شوند(Kitamiya et al., 2000) . کشت‌های سلولی هویج، به عنوان پینه‌های سازماندهی نشده در مجاورت 2,4-D، برای مطالعه ژنتیکی در طی بیان جنین‌زایی رویشی استفاده شده‌اند.

بیشتر ژن‌های بیان شده در طول جنین‌زایی رویشی به ژن‌های تاخیری افزاینده جنین [13] تعلق دارند. عملکرد پیشنهادی برای این خانواده ژنی، حفاظت ساختارهای سلولی در جنین‌های بالغ در طول خشکیدگی بذر[14]و جلوگیری از جوانه‌زنی پیش از موعد جنین‌های زایشی در طول دوره رشد بذر است(Wilde et al., 1995; Dong and Dunstan, 2000) . بیان چند ژن در جنین‌های رویشی هویج باعث کد شدن پروتئین‌های خارج سلولی ترشحی می‌شوداز جمله:

- EP1 که دارای تشابه[15] با گلیکوپروتئین‌های جایگاه S در Brassica می‌باشد، در پینه‌های غیر جنینی وجود دارد ولی در جنین‌های رویشی مشاهده نمی‌شود.

- ژن دیگری که پروتئین ناقل چربی را تولید می‌کند (EP2)  به عنوان یک نشانگر مفید برای تمایز سلول‌های اپیدرمی در طی دوره جنین‌زایی محسوب می‌شود. نقش دقیق این پروتئین‌های خارج سلولی همچنان نامشخص است اما به نظر می‌رسد که در تنظیم، توسعه سلول و حفظ ساختارهای بیوفیزیکی برای ریخت‌زایی، مورد نیاز هستند.

- گلیکوپروتئین ترشحی EP3 موجب حفظ موتان‌های حساس به دما در هویج(ts11)  در عبور از مرحله کروی به مرحله قلبی شکل در جنین‌زایی رویشی می‌شود (Meinke, 1995; Sugiyama, 2000).

- دسته دیگری از ژن‌ها که در کشت‌های سوسپانسیون سلولی هویج تنظیم می‌شوند، از ژن‌های Dc8, J4e, ECP31 و Dc3 تشکیل شده‌اند و در طی مراحل مختلف رشد جنین در گروه‌های سلولی مختلف از جمله توده‌های پیش جنینی و جنین‌ها بیان می‌شوند (Wilde et al., 1995).

تحقیقات آینده در زمینه زیست‌شناسی مولکولی گیاهان نباید بر اساس جداسازی و شناسایی تعداد زیادی از ژن‌های بیان شده در طی تکامل جنین‌های گیاهی متمرکز گردد بلکه باید اهمیت این ژن‌ها بواسطه اتفاقاتی که به دلیل غیر فعال شدن آنها ایجاد می‌شود، نمایش داده شود. غیر فعال شدن ژن‌ها بوسیله ایجاد گیاهان تراریخته حاوی سازه بی‌معنی[16] یا ایجاد موتان‌های حاوی ژن‌های غیرعملگر[17]، انجام می‌شود (Meinke, 1995). به دلایل مختلف، تمامی ژن‌ها به روش ایجاد موتان‌های حاوی ژن‌های غیرعملگر، شناسایی نمی‌شوند. ازجمله:

         بعضی از ژن‌هایی که در ژنوم دو برابر[18] می‌شوند.

         ژن‌هایی که برای مراحل اولیه گامت‌زایی مورد نیاز می‌باشند.

         ژن‌هایی که دارای عملکردهای غیرضروری بوده و در موقعیت‌های خاصی قابل شناسایی هستند.

لذا، قدرت علم ژنتیک تنها در شناسایی هر واحد نسخه‌برداری در ژنوم خلاصه نشده و توانایی تمرکز بر ژن‌‌هایی که به منظور رشد و تمایز به شکل طبیعی بیان می‌شوند را فراهم می‌کند.(Meinke, 1995)  دسته‌های مختلفی از موتان‌های جنینی به منظور درک اتفاقات مراحل جنین‌زایی رویشی در گیاهان شناسایی شده‌اند:

- موتان‌هایی که در مراحل اولیه تقسیم سلولی و ریخت‌زایی دارای نقص می‌باشند.

- دسته‌ای که در جمع‌آوری رنگدانه‌ها و مواد ذخیره‌ای در طی بلوغ جنینی دچار اشکال هستند.

- گروهی از موتان‌ها که در مرحله ایجاد خواب و جوانه‌زنی مشکل دارند.

تعداد زیادی از این موتان‌ها دارای نقص در ژن‌های خانه‌دار[19] هستند که نقش اساسی در تکوین جنین دارند. موتان‌های جنینی در جایگاه‌های اولیه عملکرد ژن‌ها نیز متفاوتند. نقص اولیه در موتان‌های جنینی به بافت آندوسپرم محدود می‌شود. نتیجه غیر مستقیم این نقص، اشکال در تشکیل آندوسپرم، تغییر در تکامل جنین در این موتان‌ها است. بیشتر این موتان‌های غیر عملگر به وسیله موتاژن‌های شیمیایی، اشعه ایکس، عناصر جابجاشونده[20] یا T-DNA مربوط به Agrobacteruim tumifaciens ایجاد می‌شوند (Meinke, 1995).

نشانگرهای مولکولی

تحقیق در مورد نشانگرهای جنین‌زایی، یکی از جنبه‌های مهم اصلاح مدرن محسوب                                      می‌شود (Schel et al., 1994). نشانگرهای متعدد مولکولی، بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی مرتبط با استعداد سلول‌های جنین‌زا گزارش شده‌اند که شامل ایزوزیم‌ها، نشانگرهای مولکولی و تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی می‌شوند.

ایزوزیم‌ها، ابزار بسیار مفیدی برای درک بهتر مکانیزم‌های پایه تمایز سلولی و رشد گیاهی می‌باشند. ایزوزیم‌ها، علاوه بر استفاده به عنوان نشانگرهایی در مراحل انتهایی رشد (اندام‌زایی یا جوانه‌زنی بذر)، به عنوان نشانگرهایی برای مراحل ابتدایی رشد گیاه (آغاز جنین‌زایی) نیز استفاده شده‌اند. روش کشت بافت به خصوص جنین‌زایی رویشی به دلیل فراهم نمودن مواد گیاهی کافی در مرحله رویشی مورد نظر، امکان کاربرد آنالیز ایزوزیمی را برای مراحل جنین‌زایی رویشی فراهم می‌کند. به عنوان مثال، محققین دریافته‌اند که سیستم استراز برای شناسایی جنین‌زایی در پینه جو قبل از ایجاد جنین‌های رویشی بسیار حساس است (Coppens and Dewitte, 1990). همچنین در هویج، دو سیستم ایزوزیمی استراز به طور مجزا در سلول‌های جنینی و غیرجنینی بیان می‌شود (Chibbar et al., 1988). تحقیقات در مورد گیاه Dactylis glomerata نشان داده است که یک ایزوزیم استراز اسیدی (36 کیلودالتون با نقطه ایزوالکتریک 8/3) تنها در کشت‌های سوسپانسیونی جنینی یافت شده است. همچنین الگوی اسید فسفاتازی، تفاوت‌های کمی بین کشت‌های پینه جنین‌زا و غیرجنین‌زا در قهوه، نشان می‌دهد (Menendez- Yuffa and Garcia, 1996). مرور کاملی از کاربرد ایزوزیم‌ها به عنوان نشانگرهای بیوشیمیایی در جنین‌زایی رویشی منتشر شده است (Schel et al., 1994). تعدادی ژن‌های کاندید[21]، به عنوان نشانگرهای مولکولی برای سلول‌های مستعد منفرد، وجود دارند (Schmidt et al., 1997). یکی از این ژن‌ها، ژن گیرنده جنین‌زایی رویشی شبه‌ کیناز (SERK) می‌باشد که در سوسپانسیون سلولی مستعد در تشکیل جنین‌های رویشی  Daucus و Dactylis، نقش دارد (Schmidt et al., 1997; Somleva et al., 2000).

تغییر بیان پروتئین‌های ذخیره‌ای دانه در طی مراحل مختلف جنین‌زایی رویشی، می‌تواند به عنوان نشانگری جهت تعیین مرحله جنین‌زایی رویشی استفاده شود. چنانچه نتایج مطالعه بر روی Pisum sativum نشان داد که تولید پروتئین‌های ذخیره‌ای در جنین‌های رویشی کمتر از بذور خشک بالغ است (Griga et al.,2007). مطالعه با استفاده از الکتروفورز دو بعدی در پینه‌های جنین‌زا و غیرجنین‌زای Vitis vinifera نشان داد که پنج خانواده پروتئینی مستقل بین پینه‌های جنین‌زا و غیرجنین‌زا، تفاوت معنی‌دار نشان می‌دهند و از جنبه عملکردی، 26% در فرآیندهای متابولیسمی سلولی، 19% در پردازش پروتئین‌ها، 16% در تکثیر سلولی، 16% در پاسخ به تنش و 3% در انتقال پیام نقش دارند. نتایج این مطالعه، امکان شناسایی پروتئین‌های دخیل در جنین‌زایی رویشی و ژن‌های موثر در فرآیند تمایززدایی و القاء جنین‌های رویشی را فراهم می‌نماید(Marsoni et al., 2008).

برداشت نهایی

به طور خلاصه می‌توان نتایج را به صورت ذیل دسته‌بندی نمود:

- جنین‌زایی رویشی ابزار ارزشمندی برای دستیابی به محدوده وسیعی از اهداف بیوشیمی پایه تا مطالعات فیزیولوژیکی و مورفولوژیکی به منظور توسعه روش‌هایی با کاربرد عملی می‌باشد. یکی از اساسی‌ترین کاربردهای جنین‌زایی رویشی، استفاده از این روش در درک رویدادهای اولیه در جنین‌زایی زایشی گیاهان عالی می‌باشد. کاربرد دیگر جنین‌های رویشی در تولید گیاهان با سطوح پلوئیدی متفاوت یعنی ایجاد جنین‌های هاپلوئید به وسیله کشت بساک و افزایش تریپلوئیدی از آندوسپرم می‌باشد. جنین‌زایی رویشی بهترین روش به منظور ایجاد گیاهان تراریخته می‌باشد و پتانسیل بالایی برای تولید متابولیت‌های جنینی مانند لیپیدها و پروتئین‌های ذخیره‌ای دانه فراهم می‌کند.

- جنین‌زایی رویشی دارای فواید بسیاری در مقایسه با اندام‌زایی است، از جمله: کشت تعداد زیادی از واحدهای تکثیرشونده، امکان تولید بیشتر جنین با کار کمتر، قابلیت منشاء گرفتن جنین رویشی از یک سلول واحد جهت ایجاد کشت‌های یکنواخت، پایداری بیشتر گیاهان بدست آمده از جنین‌های رویشی نسبت به گیاهان حاصل از اندام‌زایی و تحمل کمتر جنین‌های رویشی نسبت به جهش ژن‌های مورد نیاز برای تکامل در مقایسه با مریستم‌های رویشی.

- فاکتورهای متعددی وابسته به گونه، رقم، شرایط فیزیولوژیک گیاهان مادری و ...، بیان جنین‌زایی رویشی را تحت تاثیر قرار می‌دهند اما زمانی که مرحله القای جنین‌زایی کامل شد، الگوی جنین‌زایی برای تمام اشکال جنینی اعم از رویشی و زایشی یکسان است. فاکتورهای ساختاری دیگر موثر بر القای سلول‌های پیش جنینی شامل ساختار میکروتوبول‌ها، دیواره سلولی و اندازه سلول می‌باشد.

- جنین‌های زایشی و رویشی، سیر تکامل مشابهی شامل مراحل گلبولی، قلبی شکل و اژدری را در دولپه‌ای‌ها و مراحل کروی، شاخی و لپه‌ای شکل را در تک‌لپه‌ای‌ها طی می‌کنند. این تفاوت‌های شکلی به دلیل تکامل خاص هریک از دو گروه عمده گیاهی است به‌ طوری ‌که جنین تک‌لپه‌ای‌ها یک ‌لپه منفرد ایجاد کرده و به مرحله قلبی شکل نمی‌رسد. نوع دیگری از تکوین جنینی در مخروطیان شامل سه مرحله گلبولی، لپه‌ای اولیه و جنین‌های لپه‌ای موخر می‌باشد. پیدایش قطبیت در جنین‌ها به عنوان اولین مرحله در جنین‌زایی مد نظر قرار می‌گیرد.

- تکوین و تمایز گیاه به طور مستقیم یا غیر مستقیم توسط تغییر در بیان ژن به خصوص در دوره جنین‌زایی انجام می‌شود. تحقیق در مورد نشانگرهای جنین‌زایی، یکی از جنبه‌های مهم اصلاح مدرن است. نشانگرهای مولکولی، بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی متعددی مرتبط با استعداد سلول‌های جنین‌زا، گزارش شده‌اند که شامل ایزوزیم‌ها، نشانگرهای مولکولی و تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی می‌شوند.