The Survey of Genetic Diversity & Population Structure Analysis of Iranian Sweet Pomegranate (Punica granatum L.) Germplasm Using SSR Markers

Document Type : Research Paper

Authors

Abstract

The pomegranate (Punica granatum L.) is native horticultural plants of Iran which have been cultivated from ancient times for its economic, ornamental and medicinal properties globally. Now Iran is one of the largest manufacturers and exporters of pomegranate in the world. Although the number of Punica species is very low, but there is a high morphological diversity have been observed within the existing varieties and genotypes in country. Therefore, the use of appropriate markers in order to separate the rich pomegranate germplasm of country is necessary. In this study, six out of 50 microsatellite markers (SSR) were polymorphic on 194 samples of the sweet pomegranate germplasm. Total numbers of observed alleles were 24, the number of alleles per locus have ranged between 2 to 8. Average polymorphism information content and heterozygosity of these primers were 0.746 and 0.778 respectively, have proved strong nature of microsatellite markers in genetic diversity studies. In order to assess of genetic relationships and population structure, Cluster analysis was performed by methods UPGMA and NJ with MEGA4 software, structure analysis model-based Bayesian by STRUCTURE2.3 software and principal coordinate analysis (PCoA) with NTSYS software. Results of all mentioned methods have shown that cultivars and genotypes are generally clustered independently from their geographical origin and their proposed denomination suggesting that severe admixture in studied samples. Survey of our study indicated that there is a high genetic diversity among of sweet pomegranate germplasm in Iran that this result can be used for purpose of breeding.

Keywords


بررسی تنوع ژنتیکی و تجزیه ساختار جمعیت ژرم­پلاسم انار شیرین ایران با استفاده از نشانگرهای SSR

 

سیده مهسا موسوی درازمحله­1، مهرشاد زین­العابدینی*2، محسن مردی3، سید حسن مرعشی4، سعید ملک­زاده5، مهربانو کاظمی6، طه رودبار شجاعی6، مهدی زهراوی7

1 کارشناس ارشد گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه فردوسی مشهد

2،3،6 استادیار و دانشیار و کارشناس بخش تحقیقات ژنومیکس، پژوهشکده­بیوتکنولوژی کشاورزی ایران

4،5 دانشیار و استادیار گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه فردوسی مشهد

7 استادیار بانک ژن ایران، موسسه تحقیقات اصلاح و تهیه نهال و بذر- کرج

تاریخ دریافت: 20/10/1390، تاریخ پذیرش: 21/01/1392

چکیده

ایران یکی از بزرگترین تولید‌کنندگان و صادر‌کنندگان انار در دنیاست. هرچند تعداد گونه‌های جنس Punica بسیار کم است، تنوع مورفولوژیک بسیار بالایی در داخل ارقام و ژنوتیپ­های موجود در کشور مشاهده می‌شود. لذا بمنظور تفکیک ژرم­پلاسم غنی انار موجود در کشور، استفاده از نشانگرهای مناسب ضروری است. بهمین منظور در این مطالعه، 6 نشانگر چند شکل از میان 50 آغازگر ریزماهواره مورد بررسی، بر روی 194 نمونه موجود در ژرم­پلاسم انار شیرین مورد آزمایش قرار گرفتند. در مجموع تعداد 24 آلل­ مشاهده گردید که تعداد آن در هر مکان ژنی در دامنه­ای بین 2 تا 8 آلل قرار داشت. میانگین محتوای اطلاعات چندشکلی این آغازگرها 746/0 و میانگین ناخالصی 778/0 بدست آمد که ماهیت قوی نشانگرهای ریزماهواره را در بررسی روابط و تنوع ژنتیکی اثبات می­کند. تجزیه خوشه­بندیبا روش­های UPGMA و NJ٬ نرم افزار MEGA4 و تجزیه ساختار با روش Bayesian نرم افزار STRUCTURE2.3 و تجزیه به مختصات اصلی (PCoA) با نرم افزار NTSYS، بمنظور بررسی روابط ژنتیکی و ساختار جمعیت نمونه­ها انجام شد. بررسی نتایج تمامی روش­های ذکر شده نشان داد که طبقه­بندی ارقام و ژنوتیپ­های مورد مطالعه مستقل از منشا جغرافیایی و نام گذاری پیشنهادیشان می­باشد که این امر اختلاط شدید در ژرم­پلاسم انار شیرین موجود را اثبات می­نماید. بررسی مطالعه انجام شده وجود تنوع ژنتیکی بالایی را در ژرم­پلاسم انار شیرین ایران اثبات می­کند که می­تواند برای اهداف اصلاحی مورد توجه قرار گیرد.

واژه کلیدی: انار، تنوع ژنتیکی، ساختار، نشانگر ریزماهواره.

 

مقدمه

انار درخت یا درختچه­ای است پر شاخ و برگ با شاخه­های نامنظم، کم و بیش خاردار و پاجوش­های زیاد که در مناطق سردسیری و نیمه گرمسیری به صورت خزان کننده و در نواحی گرمسیری به صورت همیشه سبز می­باشد. انار از زمان­های قدیم در ایران کشت و کار می­شده است. بر طبق نظریه دکاندول و بنابر شواهد موجود، انار بومی ایران و کشورهای هم­جوار می­باشد و به طور طبیعی، به تدریج در مناطق آسیای مرکزی تا هیمالیا، خاورمیانه، آسیای صغیر و حوزه مدیترانه گسترش یافته است. در حال حاضر انار از نظر گیاه ­شناسی کوچکترین خانواده گیاهی است که دارای یک جنس به نام پونیکا Punica و دو گونه به نام­های گراناتومPunica granatum (انارهای معمولی وخوراکی) و پروتو پونیکا Protopunica (انارهای غیرخوراکی) می­باشد (Pirseyedi et al., 2010). ارقام مختلف انار از نظر خصوصیات مورفولوژیکی تفاوت های زیادی با یکدیگر دارند و تصور بر این است که این تفاوت ها، ناشی از اثر عوامل محیطى است. علیرغم وجود تعداد زیادى رقم و ژنوتیپ انار در ایران، مدارک مستدلی مبنی بر علل وجود چنین تنوعی وجود ندارد. البته، احتمال مى رود که تفاوت هاى ژنتیکى عامل بروز تفاوت هاى مورفولوژیکی باشد که در این زمینه، تاکنون تحقیق جامعی صورت نگرفته است. شناسایی، جمع آوری و تشکیل کلکسیون اولیه انار در کشور از سال 1344 آغاز شد و درحال حاضر، بخش اعظمی از تنوع ژنتیکی انار متشکل از 760 ژنوتیپ اهلی، وحشی و زینتی، از مناطق مختلف کشور شناسایی وجمع آوری شده و در کلکسیون ذخایر توارثی یزد، نگهداری می شود. البته، تعداد 540 ژنوتیپ نیز در کلکسیون ساوه وجود دارد که آنها نیز ازکلکسیون یزد انتخاب و به ساوه منتقل گردیده است (, 1998  Behzadi shahrebabaki). شناخت تنوع ژرم­پلاسمی و روابط ژنتیکی بین مواد اصلاحی، امری مهم در اجرای موفق برنامه­های اصلاحی است، همچنین بررسی تنوع ژنتیکی درون ژرم­پلاسم­ها، بمنظور طبقه­بندی قابل اعتماد ژنوتیپ­ها می­تواند شناسایی ژنوتیپ­هایی را که برای هدف­های اصلاحی خاص ­قابلیت بکارگیری دارند تسهیل نماید (Pazouki et al., 2010; Salehi et al., 2009). پیشرفتهای ایجاد شده در زمینه نشانگرهای مولکولی، در غلبه بر بسیاری از مشکلات موجود در زمینه طبقه­بندی و حفاظت ذخایر ژنتیکی گیاهی مفید بوده است و امروزه طیف وسیعی از نشانگرهای مبتنی بر واکنش زنجیره­ای پلیمراز نظیر DAF، RAPD، AFLP و SSR برای انجام مطالعات تنوع ژنتیکی بکار گرفته می­شوند. در سال­های اخیر گرایش به استفاده از ریزماهواره­ها بدلیل مزایایی نظیر توانایی بالا در نشان دادن چندشکلی، توارث همبارز، فراوانی نسبی در ژنوم و تکرار پذیری بالا، بطور قابل ملاحظه­ای رو به افزایش می­باشد به طوری که فقط در فاصله سال­های 2000- 1995، بالغ بر 8000 ریزماهواره شناسایی و جداسازی شدند (Zane et al., 2002). مهمترین کاربردهای ریزماهواره­ها، مطالعه تنوع ژنتیکی، مطالعه فیلوژنی و تکاملی، تهیه نقشه ژنومی و نشانگری، همسانه کردن ژنی و نقشه­یابی ژنتیکی، پژوهش­های اکولوژیکی و تکامل جمعیت­ها، انتخاب نشانگر همراه با صفت مورد نظر، خالص­سازی مواد ژنتیکی و انجام مطالعات سیتوژنتیکی است. اخیرا نیز گزارشاتی از جداسازی ریزماهواره­ها از انار و استفاده از آنها در ارزیابی سطح تنوع ژنتیکی ژنوتیپ­های متعلق به ایران (Pirseyedi et al., 2010)، ایتالیا، اسپانیا و ترکیه (Curro et al., 2010) و تونس (Hasnaoui et al., 2010) ارائه شده است. علی­رغم مطالعات گوناگون انجام شده در زمینه تنوع ژنتیکی انار با نشانگرهای مختلف، تاکنون مطالعه­ای بر پایه نشانگرهای ریزماهواره بر روی ژرم پلاسم غنی انار شیرین ایران صورت نگرفته است. در این پژوهش برای اولین بار تنوع ژنتیکی و تجزیه ساختار جمعیت ژرم­پلاسم انار شیرین ایران با استفاده از نشانگرهای SSR مورد ارزیابی قرار گرفت.

 

مواد و روش­ها

مواد گیاهی: در این تحقیق 194 ژنوتیپ انار شیرین موجود در کلکسیون انار ایران (یزد) مورد مطالعه قرار گرفت (جدول 1). تجزیه­های مولکولی: استخراج  DNA ژنومی با استفاده از کیت GMO DNA Extraction (BioNEER)، از برگ گیاه صورت گرفت. کمیت و کیفیت DNA استخراج شده با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر نانودراپ (Nano Drop ND-1000) و ژل آگارز اندازه­گیری شد. واکنش زنجیره­ای پلیمراز با استفاده از 50 نشانگر ریزماهواره انجام شد که از این تعداد 6 آغازگر الگوی باندی چند شکل ایجاد کردند. لازم به ذکر است که سایر آغازگرهای بکار رفته، الگوهای باندی مونومورف یا پیچیده ایجاد کردند. مشخصات آغازگرهای چندشکل SSR در جدول 2 نشان داده شده است (Pirseyedi et al., 2010). اجزای واکنش 10 میکرولیتری عبارت بود از 2 میکرولیتر DNA ژنومی، 05/0میکرولیتر آغازگر رفت (10 نانوگرم) و 15/0 میکرولیتر از آغازگر برگشت (10 نانوگرم) نشاندار شده با مواد فلوئورسنت IRD700، 9/0 میکرولیتر MgCl2 (25 میلی­مولار)، 1 میکرولیتر بافر (10 برابر)، 5/0 میکرولیتر مخلوط نوکلئوتیدی (40 میلی­مولار)، 12/0 میکرولیتر Taq پلیمراز (5 واحد در میکرولیتر) و 28/5 میکرولیتر آب مقطر دو بار تقطیر شده، که با برنامه تاچ داون طبق چرخه­های زیر تکثیر شدند. برنامه اول به مدت 5 دقیقه در دمای 95 درجه سانتی­گراد جهت شروع واسرشت‌ سازی DNA انجام گرفت. برنامة دوم در 10 چرخه شامل 30 ثانیه در 95 درجه سانتی­گراد، 30 ثانیه در 63 درجه سانتی­گراد و 1 دقیقه در 72 درجه سانتی­گراد و برنامه سوم در 25 چرخه بصورت 30 ثانیه در 95 درجه سانتی­گراد، 30 ثانیه در 55 درجه سانتی­گراد و 1دقیقه در 72 درجه سانتی­گراد انجام گرفت. برنامة چهارم به مدت 5 دقیقه در 72 درجه سانتی­گراد جهت تکمیل بسط DNA انجام گرفت. تفکیک قطعات با استفاده از ژل پلی آکریل آمید و توسط دستگاه                                  DNA Analyzer 4300 (LI-COR) انجام گرفت. تجزیه­های آماری: باندهای مشاهده شده بر اساس حضور (1) یا عدم حضور (0)، امتیازبندی شدند. تجزیه داده­ها با استفاده از روش­های تجزیه خوشه­بندی بر مبنای فاصله، با روش UPGMA و NJ نرم افزار MEGA4 (Tamura et al., 2007) و روش تجزیه خوشه­ای بر مبنای مدل، با روش Bayesian نرم افزار STRUCTURE 2.3 (Pritchard et al., 2000) و تجزیه به مختصات اصلی (PCoA) )نرم افزار (NTSYSpc 2.02e انجام گرفتند. همچنین برای به دست آوردن محتوای اطلاعات چند شکلی و میزان ناخالصی از نرم افزار v.3.25 PowerMarker استفاده شد.

 

نتایج و بحث

در این تحقیق پس از بکارگیری 50 نشانگر ریزماهواره، 6 نشانگر چندشکل بر روی 194 ژنوتیپ انار شیرین مورد ارزیابی قرار گرفتند. آغازگرهای بکار رفته در مجموع 24 باند چند شکل ایجاد نمودند که در محدوده 305-145 جفت بازی قرار داشتند. تمامی آغازگرهای مورد استفاده دارای چند شکلی در میان ژنوتیپ­های مورد مطالعه بودند. میانگین محتوای اطلاعات چندشکلی این آغازگرها 746/0 و میانگین ناخالصی 778/0 بود که نشان دهنده کارا بودن نشانگرهای ریزماهواره در آشکارسازی چندشکلی می­باشد. سایر اطلاعات بدست آمده از این آغازگرها در جدول 2 ارائه شده است. بالا بودن مقادیرPIC و هتروزیگوسیتی بدست آمده در این تحقیق در مقایسه با مطالعات مشابه (Hasnaoui et al., 2010; Pirseyedi et al., 2010; Curro et al., 2010)، ممکن است به دلیل تعداد زیاد ژنوتیپ­های مورد ارزیابی در این مطالعه باشد و کارایی نشانگرهای ذکر شده را برای بررسی تنوع ژنتیکی انار اثبات می­کند.

برای گروه‌بندی ژرم­پلاسم انار شیرین ماتریس عدم تشابه بر اساس ضریب نی (Nei 1972) تشکیل و تجزیه خوشه­ای‌ با استفاده از روش UPGMA و NJ انجام شد. ضریب همبستگی کوفنتیک مربوط به دندروگرام‌ به دست آمده با روش UPGMA، 551/0 و با روش NJ، 287/0 بود. با توجه به اینکه ضریب کوفنتیک بدست­ آمده با روش UPGMA بالاتر از NJ بوده و این امر نشان­دهنده­ی همبستگی بیشتر بین ماتریس تشابه و دندروگرام رسم شده از این روش می­باشد، در نتیجه تنها اطلاعات مربوط به این دندروگرام ارایه شد (شکل1).

 

 

 

 


جدول 1- اسامی ژنوتیپ های انار شیرین ایران واقع در کلکسیون یزد.

Table 1- Name of Iranian Sweet Pomegranate (Punica granatum L.) Genotypes deposited on Yazd collection.

شماره

Nubmer

ژنوتیپ

Genotype

شماره

Nubmer

ژنوتیپ

Genotype

1

Oud Shirin Narize (Fars)

99

Shirin Kam Bar Najaf Abad (Esfahan)

2

SHahvare Shirin Sarvestan (Fars)

100

Shirin Sormehei Kohpayeh (Esfahan)

3

Bihasteh Khafare Jahrom Shirin (Fars)

101

Shirin Pish Ras Kohpayeh (Esfahan)

5

Shetoni Sidone Marvdasht SHirin (Fars)

102

Shirin Bi Hasteh Najaf Abad (Esfahan)

6

SHirin Hasteh Dar Ghasr Dasht (Fars)

103

Shirin Pish Ras Najaf Abad (Esfahan)

7

Shahvar Eij Estahban SHirin (Fars)

104

Shirin Poost Sefid Natanze (Esfahan)

8

Khafari Jahrom SHirin (Fars)

105

Bi Hasteh Kam Bar Shirin (Esfahan)

9

Bihasteh Sarvestan SHirin  (Fars)

106

Shirin Poost Ghermeze Kohpayeh (Esfahan)

10

Jaze Daneh Ghermeze Shirin  (Fars)

107

Shirin Poost Nazok Natanze (Esfahan)

11

Bihasteh Nairize Shirin (Fars)

108

Shirin Hasteh Rize Najaf Abad (Esfahan)

12

Shahvar  Shirin Ghasr Dasht (Fars)

109

Bi Hasteh Por Bar Shirin (Esfahan)

13

Bihasteh Ghasr Dasht Shirin  (Fars)

110

Shirin Gar Najaf Abad (Esfahan)

14

Asali Sarvestan Shirin (Fars)

111

Shirin Poost Ghermeze Natanze (Esfahan)

15

Tashto Eij Estahban SHirin (Fars)

112

Bihasteh Ladize  SHirin (Sistan va Balochestan)

16

Bi Daneh Darjazin Shirin (Fars)

113

Bihasteh SHirin (Sistan va Balochestan)

17

Kadro Poost Nazok Kazeron Shirin (Fars)

114

Bihasteh Sangan  SHirin  (Sistan va Balochestan)

18

Poost Seahe Kazerun Shirin (Fars)

115

Vashik SHirin (Sistan va Balochestan)

19

Kadro Poost Koloft Shirin (Fars)

116

SHirin Mamoli (Sistan va Balochestan)

20

Shekari Marvast Shirin(Yazd)

117

Shirin Ostokhani Geno (Hormozgan)

21

Shahvare Shirin Yazdi Shahed(Yazd)

118

Shirin Poost Ghermez (Hormozgan)

22

Post Siah Abarand Abad Shirin  (Yazd)

119

Shirin Garach Haje Abad (Hormozgan)

23

Tabo va Larze Mehr Mahi SHirin(Yazd)

120

KHors Shirin Haji Abad  (Hormozgan)

24

Khormai Marvast Mahrize SHirin(Yazd)

121

Shirin Kahieh Haji Abad (Hormozgan)

25

Gabri Ardakan Shirin (Yazd)

122

Shirin Daneh Ghermeze Kan (Tehran)

26

Khatoni Shirin Aqhda (Yazd)

123

Vahshi Kan Shirin (Tehran)

27

Shahvar Aghda Ardakan Shirin (Yazd)

124

Shirin Taghlid Kan (Tehran)

28

Tab Va Larze Aban Mahi Shirin (Yazd)

125

Shirin Ghomi Kan (Tehran)

29

Shirin Poost Koloft Harat (Yazd)

126

Shirin Poost Sabze Ezeh (Khoozestan)

30

Nimoli Kadoei Herabarjan Shirin (Yazd)

127

Shahvar Post  Ghermez Shirin (Semnan)

31

Dadashi Poost Koloft Shirin (Yazd)

128

Shirin Poost Nazok Darjzin (Semnan)

32

Shahvar Dadashi Darajeh Do Shirin (Yazd)

129

Gharanchok Sefid Lasajard Shirin (Semnan)

33

Sefideh Poost Khoshk Bafgh Shirin (Yazd)

130

Shahvar Poost Sefid Shirin (Semnan)

34

Shirin Poost NazokAbarkoh (Yazd)

131

Shirin Poost Koloft (Semnan)

35

Dadashi Garach Poost Nazok Shirin (Yazd)

132

Gharanchok Daneh Sorkh Shirin (Semnan)

36

Garch Sahvare Darajeh 2 Shirin (Yazd)

133

Shirin Poost Sefid (Chahar Mahal va Bakhtiari)

37

Kotji Por Bar Bafgh Shirin (Yazd)

134

Vahshi Shirin (Chahar Mahal va Bakhtiari)

38

Ghors Gelo Kotah Bafgh Shirin (Yazd)

135

Shirin Sabze Poost Nazok (Kohkiloyeh va Boyer Ahmad)

39

Narak Shirin Ashkzar (Yazd)

136

Shirin Poost Sefid (Kohkiloyeh va Boyer Ahmad)

40

Shirin Poost Koloft Abar Koh (Yazd)

137

Rash Shirin Narak (Kohkiloyeh va Boyer Ahmad)

41

Shirin Shahvar Ashkzar (Yazd)

138

SHekar NarDaneh Sefid Baneh Shirin (Kordestan)

42

Poost Sefid Khoshk Bafgh Shirin (Yazd)

139

Poost Siahe Saveh Shirin (Markazi)

43

Sefideh Shireh Shirin  Bafgh (Yazd)

140

Alak Shirin Saveh (Markazi)

44

Shahvar Dadashi Darajeh Yek Shirin (Yazd)

141

Tabestani save Shirin ( Markazi )

45

Shirin Poost Nazok Marvast (Yazd)

142

Malas Shirin Saveh (Markazi)

46

Shirin Taneh Sorkh Saghand (Yazd)

143

Shirin Poost Sefid Saveh (Markazi)

47

Shirin Shahvar Darajeh Yek Saghand (Yazd)

144

Ghermeze Nar Shirin Shabestar (Azarbayejan Gharbi)

48

Shirin Poost Koloft Bahabad Bafgh (Yazd)

145

Shirin Golmankhaneh Eromiah (Azarbayejan GHarbi)

49

Shirin Malas Marvast Mahrize (Yazd)

146

Agh Nar Shirin Shabestar (Azarbayejan Sharghi )

50

SHirin Poost Koloft Saghand (Yazd)

147

SHekar NarTasoj Shirin (Azarbayejan Sharghi)

51

Shirin Tah Sorkh Darajeh Do Saghand (Yazd)

148

Shirin Miveh Dorosht (Azarbayejan Sharghi)

52

Torsh Poost Koloft Saghand SHirin (Yazd)

149

Pish Ras Shirin Dareh Horand (Azarbayejan Sharghi)

53

Shoor Poost Koloft Saghand SHirin (Yazd)

150

Shirin Dareh Horand (Azarbayejan Sharghi)

54

Garch Dadash Poost Nazok Shirin (Yazd)

151

Shirin Daneh Riz (Azarbayejan Sharghi)

55

Shirin Jojok Bajeston (Khorasan)

152

Shirin Daneh Ghermeze (Azarbayejan Sharghi)

56

Shirin Sang Sefid Sabzevar (Khorasan)

153

Shirin Zod Ras (Azarbayejan Shrghi)

57

Zargoshei Torbat Haidarieh Shirin (Khorasan)

154

Shirin Poost Ghermeze (Azarbayejan Sharghi)

58

Shirin Fahloje Tabas (Khorasan)

155

Shirin Poost Sefid (Azarbayejan Sharghi)

59

Shahvar Darajeh Ek Shirin (Khorasan)

156

Shirin Bi Hasteh Chenjeh (Kermanshah)

60

Shirin Poost Ghermez Sabzevar (Khorasan)

157

Poost Seahe Shirin (Kermanshah)

61

Shahvar Shirin Bajestoni (Khorasan)

158

Shirin Poost Koloft (Kermanshah)

62

Shirin Poost koloft Bajeston (Khorasan)

159

Shirin Nar Paveh (Kermanshah)

63

Shahvar Fahlonje Tabas Shirin (Khorasan)

160

Zar Nar Ravavsar Paveh Shirin (Kermanshah)

64

Ghand Poost Sefid Shirin (Khorasan)

161

Sabze Shirin Charmak Kalam (Ilam)

65

Ghand Neghab Kashmar Shirin (Khorasan)

162

Shirin Kam Bar Saleh Abad (Ilam)

66

Shirin Daneh Ghermes Ferdus (Khorasan)

163

Shirin Daneh Sefid Mehran (Ilam)

67

Shirin Neghab Kashmar (Khorasan)

164

Post Ghermez  Shahr Babak SHirin (Kerman)

68

Kaviri Bagh Malek Ezeh Shirin (Khorasan)

165

Dombkoh Post Ghermeze Bam SHirin (Kerman)

69

Shirin Daneh Sefid Ramhormoze (Khorasan)

166

Dambkohe Sar Jangal Bam Shirin (Kerman)

70

Shirin Namoli Ferdus (khorasan)

167

Abdandan Shirin  Ravar (Kerman)

71

Bi Daneh Kashmar Shirin (Khorasan)

168

Shirin Poost Ghermez Rafsanjan (Kerman)

72

Shirin Daneh Sefid Ferdos (Khorasan)

169

Bihasteh Daneh Ghermez Shirin (Kerman)

73

Shekar Nar Poost Koloft Shirin (Mazandaran)

170

Shahi Daneh Ghermez Shirin (Kerman)

74

Kabdar Shirin Behshahr (Mazandaran)

171

Shirin Poost Sefid Rafsanjan (Kerman)

75

Shirin Jangal Sisangan (Mazandaran)

172

Dom Lak Chatrod Shirin (Kerman)

76

Shirin Agha Mandali Gorgan (Mazandaran)

173

Shirin Poost Ghermez Ravar (Kerman)

77

Agha Mohseni Gorgan Shirin (Mazandaran)

174

Shirin Hasteh Rize Baft (kerman)

78

Shirin Zir Ab Savadkohe (Mazandaran)

175

Shirin Poost Koloft Baft (Kerman)

79

Shirin Nar Behshahr (Mazandaran)

176

Zagh Poost Ghermez Shirin (Kerman )

80

Roshanaei Bi Daneh Gorgan Shirin (Mazandaran)

177

Khasak Daneh Ghermes Ravar Shirin (Kerman)

81

SHekar Nar Poost Nazok Shirin (Mazandaran)

178

Shirin Daneh Ghermes Rafsanjan (Kerman)

82

Shirin Mamoli Gorgan (Mazandaran)

179

Shirin Shahvar Sirjan (Kerman)

83

Shirin Goli Nar Behshahr (Mazandaran)

180

Shirin Poost Nazok Baft (Kerman)

84

Bazri Shirin Dastjerd (Esfahan)

181

Shirin Khas Sirach Shahdad (Kerman)

85

Ardestani Post Sefid SHirin (Esfahan)

182

Shirin Hasteh Rize SHahdad (kerman)

86

Post Sefid  Homa Abad Shirin (Esfahan)

183

Jazi Poost Sefid Shirin (Kerman)

87

Post Syahe Dastjerd Shirin (Esfahan)

184

Shirin Garach Sirjan (Kerman)

88

Bihasteh  Najaf Abad Shirin (Esfahan)

185

Shahi Daneh Seahe Chatrud Shirin (Kerman)

89

Shirin Poost Sefid Shahreza (Esfahan)

186

Shirin Hasteh Dar Khabar Baft (Kerman)

90

Shirin SHahvar Ardestan (Esfahan)

187

Shirin Dandeh Dare Khabar Baft (Kerman)

91

Poost Seahe Ardestan Shirin (Esfahan)

188

Bi Hasteh Shirin Khabar Baft (Kerman)

92

Bi Hasteh Ardestan Shirin (Esfahan)

189

Zard Anar Khoram Abad Shirin (Lorestan)

93

Shirin Mamoli Ardastan (Esfahan)

190

Ghermeze Shirin Kohdasht (Lorestan)

94

Shirin Poost Ghermeze Zavareh (Esfahan)

191

Shirin Daneh Ghermeze Khoram Abad (Lorestan)

95

Shirin Zardabady Ardestan (Esfahan)

192

Zard Mahali Tang Seab Shirin (Lorestan)

96

Shirin Shahvar Kohpayeh (Esfahan)

193

Shirin Lori Khoram Abad (Lorestan)

97

Hasteh Dar Por Bar Shirin (Esfahan)

194

Shahvar Miveh Dorosht Tarom Shirin (Zanjan)

98

Shirin Poost Koloft (Esfahan)

195

Shirin Poost Ghermeze Ramsar (Gilan)

 

جدول 2- اطلاعات بدست آمده از آغازگرهای ریزماهواره.

Table 2 - Produced information by microsatellite primers.

H

PIC

اندازه

Size

تعداد آلل

Number of alleles­

آغازگر

Primer

0.814

0.789

190-180

4

MP07

0.883

0.872

240-270

4

MP12

0.919

0.915

160-145

8

MP26

0.713

0.668

190-160

3

MP30

0.568

0.496

305-250

2

MP39

0.775

0.741

220-200

3

MP42

 

 

نتایج نشان داد که هیچ ارتباط خاصی بین قرارگیری ژنوتیپ­ها در دسته­ها بر مبنای تقسیم­بندی­های استانی و یا ژنوتیپ­هایی با نام­گذاری مشابه وجود نداشته و ژنوتیپ­ها بطور مستقل از این عوامل طبقه­بندی شده­اند. از 5 گروه حاصل، گروه­های 1، 3 و 4 حاوی بیشترین تعداد نمونه­ها بوده و هر یک از 2 گروه بعدی (2 و 5) تنها حاوی 3 نمونه انار بودند. با بررسی این دندروگرام،  مشاهده می­شود که هیچ ارتباط خاصی بین قرارگیری نمونه­ها در گروه­های پنج­گانه بر مبنای تقسیم­بندی­های استانی و نمونه­های با نام­گذاری مشابه وجود نداشته و نمونه­ها بطور مستقل از این عوامل طبقه ­بندی شده­اند. برای مثال درگروه 5، 3 نمونه پوست قرمز زواره اصفهان (با شماره 94 در دندروگرام)، نار پاوه کرمانشاه (159) و پوست کلفت بافت کرمان (175) با هم در یک دسته قرار گرفته­اند. نمونه پوست سفید کهگیلویه بویراحمد (136) و پوست قرمز کوهپایه اصفهان (106) در گروه 4 طبقه­بندی شدند. در بعضی موارد نیز نمونه­های با اسامی مشابه مربوط به استان­های مختلف در کنار هم در یک دسته قرار گرفتند مثلا در گروه 1، نمونه­های شهوار فارس، خراسان و یزد با شماره­های 7، 59،44  در کنار هم قرار گرفتند.

 

 

 

 

 

شکل 1- گروه بندی 194 ژنوتیپ انار شیرین ایران با استفاده از نشانگر ریزماهواره بر اساس الگوریتم UPGMA.

Figure 1- Grouping of 194 Iranian sweet Pomegranate (Punica granatum L.) Genotype using microsatellite markers according to UPGMA algorithm.

 

 

نتایج تجزیه خوشه­بندی بر مبنای مدل، بر اساس شاخص آماری Bayesian، به منظور پی بردن به ساختار فاصله­ای جمعیت­ها و با فرض اینکه مدل تبار [1] از نوع مخلوط[2] و مدل فراوانی آللی از نوع پیوسته باشد و نیز با فرض K=1 تا K=10 (K نشان دهنده­ی تعداد جمعیت است) نشان داد که در ژرم­پلاسم موجود 6 جمعیت وجود دارد که هیچ یک از آنها بر مبنای استان­هایی که این ژنوتیپ­ها از آنجا منشا گرفته یا جمع آوری شده بودند، بطور کامل از هم تفکیک نشده­اند (شکل2). اختلاط شدید مشاهده شده در این ژرم­پلاسم، این فرض را که تبار ژنوتیپ­های مورد مطالعه از نوع مخلوط باشد اثبات می­کند. یعنی فرد i ممکن است بخش­هایی از ژنوم خود را از تبار خود در جمعیت K، به ارث برده باشد. همچنین فراوانی آللی نیز ممکن است در جمعیت­های مختلف به علت مهاجرت و یا تبار مشترک، مشابه باشد (شکل 2).

 

 

 

 

شکل 2- دسته­بندی ژرم­پلاسم انار بر اساس نرم افزار Structur.

Figure 2- Clastring of Pomegranate Germplasm using structure software.

 



 

شکل 3- تجزیه به مختصات اصلی در 194 ژنوتیپ شیرین انار بومی ایران با استفاده از نشانگرهای SSR.

Figure 3- Principal coordinate analysis of 194 Iranian sweet pomegranate accessions based on SSR markers.

 

 

با استفاده از محاسبه­ی مقادیر مشخصه[3]، بر اساس اولین محور با مقدار مشخصه 665/16 و درصد واریانس 18/7 و دومین محور با مقدار مشخصه 245/12 و درصد واریانس 28/5، از طرح اولین 2 مختصات برای ترسیم شکل PCoA استفاده شد (شکل3). تجزیه به مختصات اصلی نیز قادر به نمایش تفکیک واضحی در ژرم­پلاسم موجود نگردید و تصویر پیچیده­ای از روابط ژنتیکی بین ژنوتیپ­ها و ارقام ایجاد کرد و به نظر می­رسد به ابعاد بیشتری جهت توضیح روابط بین ژنوتیپ­ها نیاز است. طبق نظرMelchinger  (1993) زمانی که اولین، دومین یا سومین مختصات اصلی کمتر از 25% کل واریانس را بیان می­کند، روش­های تجزیه خوشه­ای برای کشف روابط بین ژنوتیپ­ها حساس­تر و قابل اعتمادتر از تجزیه PCoA می­باشد.

به طور کلی نتایج بدست آمده از تجزیه با روش­های مختلف یکدیگر را تائید می­کنند. به نظر می­رسد عدم مطابقت بین نواحی جغرافیایی ژنوتیپ­ها و نام­گذاری و خصوصیات ژنتیکی آن­ها از خصوصیات ژرم­پلاسم­های انار شیرین بومی ایران می­باشد. تجزیه ژرم­پلاسم انار تونس که برپایه خصوصیات میوه توسط      Mars and Marrakchi (1999) انجام شده بود، نشان داد که منشا جغرافیایی ارقام، تعیین کننده دسته­بندی آنها بر پایه خصوصیات نمی­باشد. در مطالعه­ای که با استفاده از نشانگر RAPD بر روی 24 ژنوتیپ انار ایران انجام گردد نیز گزارش شد که هیچ کلاستربندی مشخصی بر اساس صفات مورفولوژیک و نام ژنوتیپ­ها وجود نداشت، بنابراین بسیاری از ارقام­ بر پایه­ صفات ظاهری و شیمیایی-فیزیکی خود می­توانند از یکدیگر متمایز شوند و به عنوان شیرین، ترش، ملس، زودرس طبقه­بندی شوند (Sarkhosh et al., 2006). در مطالعه­ای دیگر بر روی ژنوتیپ­های تونس برمبنای AFLP نیز گزارش شد که دسته­بندی ژنوتیپ­ها مستقل از منشا جغرافیایی­شان بوده است (Jbir et al., 2008).

مطالعه حاضر نیز نشان داد که ژنوتیپ­های انار شیرین ژرم­پلاسم موجود بر اساس مکان­ها و یا نام­گذاری­های مشابه شباهتی در دسته­بندی نشان نمی­دهند، که یکی از دلایل آن ممکن است عدم شناخت منشا دقیق گیاه باشد یعنی انارهایی که در یک منطقه جغرافیایی وجود دارند در اصل از مکان دیگری منشا گرفته ولی تحت نام جدیدی در مقصد کشت شده باشند. چنین نتایجی اغلب بدین علت رخ می­دهد که جابجایی ژنوتیپ­ها از منطقه اصلی به سایر بخش­های کشور بیشتر برپایه خصوصیات مورفولوژیکی و جمع­آوری و کدگذاری ژنوتیپ­ها در کلکسیون می­باشد که این امر لزوم دقت در هنگام نام­گذاری ژنوتیپ­ها و همچنین لزوم استفاده همزمان از اطلاعات مولکولی و مورفولوژیک را برای تاسیس کلکسیون آشکار می­سازد. زیرا که برخی از جهش­ها و تغییرات ژنتیکی در خصوصیاتی نظیر رنگ میوه، شکل، اندازه درخت رخ می­دهند که از نظر فنوتیپی به ­راحتی قابل شناسایی هستند، اما با استفاده از برخی نشانگرهای مولکولی قابل تشخیص نیستند. همچنین باید توجه شود که تاثیرات بعد از نسخه­برداری و توارث غیرهسته­ای نیز می­تواند یکی از دلایل عدم تناسب نشانگرهای مولکولی و خصوصیات مورفولوژیک باشد بنابراین انجام مطالعات مورفولوژیکی بیشتر و یا مطالعه صفات فنولوژیک بر روی برگ، گل و میوه برای گرفتن نتایج قابل اعتمادتر در ژنوتیپ­های انار می­تواند مثمر ثمر باشد.

تعداد ناکافی نشانگرهای چندشکل استفاده شده در این مطالعه می­تواند عامل دیگر عدم مشاهده رابطه مشخص بین نمونه­های هر گروه بر اساس تقسیم­بندی­های جغرافیایی باشد. بنابراین ممکن است با افزایش تعداد نشانگرهای SSR مورد استفاده به تفکیک بهتری در ژرم­پلاسم مورد مطالعه دست یابیم که این امر مستلزم طراحی و استفاده از آغازگرهای SSR بیشتری می­باشد. همین­طور از آنجایی که آغازگرهای SSR از نواحی غیرکدکننده طراحی شده است، در حالیکه خصوصیات مورفولوژیک حاصل توالی­های بیان شونده و برهم­کنش آنهاست، بنابراین قسمتهایی از ژنوم که بوسیله این آغازگرها تکثیر شده احتمالا در ژنهای کدکننده برای خصوصیات مورفولوژیکی قرار ندارند، بنابراین استفاده از آغازگرهای EST که بر پایه نواحی کدشونده طراحی می­شوند، پیشنهاد می­گردد.

 

 

 


منابع

Behzadi Shahrbabaki H (1998). Genetic Diversity of Pomegranate Genotypes in Iran. Nashr Amoozesh Keshavarzi. Tehran, Iran.

Currò S, Caruso M, Distefano G, Gentile A, La Malfa L (2010). New microsatellite loci for pomegranate, Punica granatum (Lythraceae). American Journal of Botany 58-60.

Hasnaoui N, Buonamici A, Sebastiani F, Mars M, Trifi M, Vendramin G (2010). Development and characterization of SSR markers for pomegranate (Punica granatum L.) using an enriched library. Conservation Genetic Resource. 

Jbir R, Hasnaoui N, Mars M (2008). Characterization of Tunisian pomegranate (Punica granatum L.) cultivars using amplified fragment length polymorphism analysis. Scientia Horticulturae 115: 231–237.

Mars M, Marrakchi M (1999). Diversity of pomegranate (Punica granatum L.) germplasm in Tunisia. Genetic Resource Crop Evolution 46: 461-467.

Melchinger AE (1993). Use of RFLP markers for analyses of genetic among breeding materials and prediction of hybrid performance. D.R. Buxton (ed.) 621–628.

Nei M (1972). Genetic distance between populations. American Naturalist. 106: 283-292.

Pazouki L, Mardi M, Salehi Shanjani P, Hagidimitriou M, Pirseyedi S.M, Naghavi M.R, Avanzato D, Vendramin E, Kafkas S, Ghareyazie B, Ghaffari M.R, Khayam Nekoui S.M (2010). Genetic diversity and relationships among Pistacia species and cultivars. Conservation Genetics 11:311–318.

Pirseyedi S.M, Valizadegan S, Mardi M, Ghaffari M,  Mahmoodi P,  Zeinalabedini M,  Khayam S.M (2010). Isolation and characterization of novel microsatellite markers in pomegranate (Punica granatum L.). International Journal of Molecular Science 11: 2010-2016.

Salehi Shanjani P, Mardi M, Pazouki L, Hagidimitriou M, Avanzato D, Pirseyedi S.M, Ghaffari M.R, Khayam Nekoui S.M (2009). Analysis of the molecular variation between and within cultivated and wild Pistacia species using AFLPs. Tree Genetics and Genomes 5:447–458.

Sarkhosh A, Zamani Z, Fatahi R, Ebadi A (2006). RAPD markers reveal polymorphism among (Punica granatum L.) genotypes. Scientia Horticulturae 111:24-29.

Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S (2007). MEGA4: molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular Biology and Evolution 8: 1596-1599.

Zane L, Bargelloni L, Patarnello T (2002). Strategies for microsatellite isolation: a review. Molecular Ecology 1-16.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


The Survey of Genetic Diversity & Population Structure Analysis of Iranian Sweet Pomegranate (Punica granatum L.) Germplasm Using SSR Markers

 

Mousavi Derazmahalleh S.M. 1, Zeinalabedini M.* 2, Mardi M.3,Marashi S.H. 4, Malekzadeh S.5, Kazemi M.6, Roodbar shojaie T.6, Zahravi M.7

 

1 MSc student, Plant Breeding Dept., University of Ferdousi, Mashhad, Iran.

2 Assistant Professor, Genomics Dept., Agricultural Biotechnology Research Institute of Iran(ABRII), Karaj, Iran.

3 Associated Professor, Genomics Dept., Agricultural Biotechnology Research Institute of Iran(ABRII), Karaj, Iran.

4 Associated Professor, Plant Breeding Dept., University of Ferdousi, Mashhad, Iran.

5 Association Professor, Plant Breeding Dept., University of Ferdousi, Mashhad, Iran.

6 Technician, Genomics Dept., Agricultural Biotechnology Research Institute of Iran(ABRII), Karaj, Iran.

7 Association Professor, Iran Gene Bank, Seed & Plant Improvement Institute, Karaj, Iran.

 

 

Abstract:

The pomegranate (Punica granatum L.) is native horticultural plants of Iran which have been cultivated from ancient times for its economic, ornamental and medicinal properties globally. Now Iran is one of the largest manufacturers and exporters of pomegranate in the world. Although the number of Punica species is very low, but there is a high morphological diversity have been observed within the existing varieties and genotypes in country. Therefore, the use of appropriate markers in order to separate the rich pomegranate germplasm of country is necessary. In this study, six out of 50 microsatellite markers (SSR) were polymorphic on 194 samples of the sweet pomegranate germplasm. Total numbers of observed alleles were 24, the number of alleles per locus have ranged between 2 to 8. Average polymorphism information content and heterozygosity of these primers were 0.746 and 0.778 respectively, have proved strong nature of microsatellite markers in genetic diversity studies. In order to assess of genetic relationships and population structure, Cluster analysis was performed by methods UPGMA and NJ with MEGA4 software, structure analysis model-based Bayesian by STRUCTURE2.3 software and principal coordinate analysis (PCoA) with NTSYS software. Results of all mentioned methods have shown that cultivars and genotypes are generally clustered independently from their geographical origin and their proposed denomination suggesting that severe admixture in studied samples. Survey of our study indicated that there is a high genetic diversity among of sweet pomegranate germplasm in Iran that this result can be used for purpose of breeding.

Keyword: Pomegranate, Genetic diversity, Structure, Microsatellite marker.

 



* نویسنده مسئول: مهرشاد زین­العابدینی           تلفن: 02632703536                  mzeinolabedini@abrii.ac.ir Email:

[1] Ancestry model

[2] Admixture

[3] Eigenvalue

* Corresponding  Author: Zeinalabedini M.    Tel: 026-32703536                    Email: mzeinolabedini@abrii.ac.ir

 
Behzadi Shahrbabaki H (1998). Genetic Diversity of Pomegranate Genotypes in Iran. Nashr Amoozesh Keshavarzi. Tehran, Iran.
Currò S, Caruso M, Distefano G, Gentile A, La Malfa L (2010). New microsatellite loci for pomegranate, Punica granatum (Lythraceae). American Journal of Botany 58-60.
Hasnaoui N, Buonamici A, Sebastiani F, Mars M, Trifi M, Vendramin G (2010). Development and characterization of SSR markers for pomegranate (Punica granatum L.) using an enriched library. Conservation Genetic Resource. 
Jbir R, Hasnaoui N, Mars M (2008). Characterization of Tunisian pomegranate (Punica granatum L.) cultivars using amplified fragment length polymorphism analysis. Scientia Horticulturae 115: 231–237.
Mars M, Marrakchi M (1999). Diversity of pomegranate (Punica granatum L.) germplasm in Tunisia. Genetic Resource Crop Evolution 46: 461-467.
Melchinger AE (1993). Use of RFLP markers for analyses of genetic among breeding materials and prediction of hybrid performance. D.R. Buxton (ed.) 621–628.
Nei M (1972). Genetic distance between populations. American Naturalist. 106: 283-292.
Pazouki L, Mardi M, Salehi Shanjani P, Hagidimitriou M, Pirseyedi S.M, Naghavi M.R, Avanzato D, Vendramin E, Kafkas S, Ghareyazie B, Ghaffari M.R, Khayam Nekoui S.M (2010). Genetic diversity and relationships among Pistacia species and cultivars. Conservation Genetics 11:311–318.
Pirseyedi S.M, Valizadegan S, Mardi M, Ghaffari M,  Mahmoodi P,  Zeinalabedini M,  Khayam S.M (2010). Isolation and characterization of novel microsatellite markers in pomegranate (Punica granatum L.). International Journal of Molecular Science 11: 2010-2016.
Salehi Shanjani P, Mardi M, Pazouki L, Hagidimitriou M, Avanzato D, Pirseyedi S.M, Ghaffari M.R, Khayam Nekoui S.M (2009). Analysis of the molecular variation between and within cultivated and wild Pistacia species using AFLPs. Tree Genetics and Genomes 5:447–458.
Sarkhosh A, Zamani Z, Fatahi R, Ebadi A (2006). RAPD markers reveal polymorphism among (Punica granatum L.) genotypes. Scientia Horticulturae 111:24-29.
Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S (2007). MEGA4: molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular Biology and Evolution 8: 1596-1599.
Zane L, Bargelloni L, Patarnello T (2002). Strategies for microsatellite isolation: a review. Molecular Ecology 1-16.