Assessment of genetic diversity in Iranian confectionary sunflower (Helianthus annuus L.) populations using retrotransposon based IRAP markers

Basir Niya, Ashkan; Darvish Zadeh, Reza; Abdollahi, Babak; Nabi Pour, Alireza

doi:10.22103/jab.2014.1290

Assessment of genetic diversity in Iranian confectionary sunflower (Helianthus annuus L.) populations using retrotransposon based IRAP markers

Document Type : Research Paper

Authors

10.22103/jab.2014.1290

Abstract

Genetic diversity is necessary for plant breeders to obtain new cultivars either with high yield, better quality, more adapted to abiotic stress or more resistant to pest and pathogens. Retrotransposons are current component of plant genomes. Ubiquitous, activity and abundant of retrotransposons thorough the plant genome, make them useful molecular marker. We used inter-retrotransposon amplified polymorphism (IRAP) markers to assess genomic diversity levels and survey the activity of LTR retrotransposon elements in 10 confectionary sunflower populations. Out of 25 single and combined IRAP primers, 11 primers produced scorable and polymorphic banding patterns. A total of 116 loci were amplified by using 11 IRAP primers on confectionary populations. 110 loci out of 116 were polymorphic. The lowest (0.74) and highest (0.88) Nei genetic similarity was observed between Hamedan and Mashhad and Marand and Esfahan populations, respectively. Cluster analysis based on UPGMA algorithm grouped the studied populations in 3 main classes. Analysis of molecular variance revealed that the high part of total variation was due to within populations. So it will be better to do selection within populations in breeding programs. The results showed that retrotransposons are active in sunflower genome and they are inserted in sunflower genome as head-to-head, head-to-tail and tail-to-tail orientations. Our results showed that retrotransposon-based molecular markers can be used as a valuable tool for genomic assessment in sunflower.

Keywords

20.1001.1.22286705.1393.6.1.2.2

Full Text

مطالعه تنوع ژنتیکی توده‌های بومی آفتابگردان‌ آجیلی (Helianthus annuus L.) ایران با استفاده از نشانگر‌های رتروترنسپوزونی IRAP

اشکان بصیرنیا¹، رضا درویش زاده²*، بابک عبدالهی مندولکانی³، علیرضا نبی پور ⁴

¹کارشناس ارشد، گروه اصلاح و بیوتکنولوژی گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه ارومیه

² دانشیار گروه اصلاح و بیوتکنولوژی گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه ارومیه

³ دانشیار گروه اصلاح و بیوتکنولوژی گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه ارومیه

⁴ استادیار معاونت تحقیقات برنج کشور، آمل، ایران

تاریخ دریافت: 15/09/1391، تاریخ پذیرش: 20/02/1392

چکیده

وجود تنوع ژنتیکی برای بدست آوردن ارقام با عملکرد بالا، کیفیت بهتر، تحمل بیشتر به تنش‌های زیستی و غیرزیستی و مقاومت بیشتر به آفات و بیماری‌ها، برای به‌نژادگران ضروری است. رتروترنسپوزون‌ها فراوان‌ترین و رایج‌ترین عناصر جابه‌جا شونده در ژنوم یوکاریوت‌ها به‌ویژه ژنوم گیاهان می‌باشند. توزیع گسترده رتروترنسپوزون‌ها در ژنوم گیاهان استفاده از آن‌ها را به‌ عنوان نشانگر‌های مولکولی برای بررسی تنوع ژنتیکی ایده‌آل ساخته است. در این مطالعه فعالیت رتروترنسپوزون‌ها و همچنین تنوع ژنتیکی در 10 توده بومی آفتابگردان‌ آجیلی با استفاده از نشانگرهای IRAP (Inter-retrotransposon amplified polymorphism) یررسی شد. از 25 آغازگر و ترکیب آغازگری IRAP، 11 آغازگر قادر به تولید الگوی باندی چند شکل با وضوح بالا بودند. 11 آغازگر IRAP، 116 مکان را تکثیر کردند که از این تعداد 110 مکان چند شکل بود. حداقل تشابه ژنتیکی نی (74/0) بین توده‌های همدان و مشهد، و حداکثر تشابه (88/0) بین توده‌های مرند و اصفهان مشاهده شد. تجزیه کلاستر با استفاده از آلگوریتم UPGMA، 10 توده بومی آفتابگردان آجیلی را در 3 گروه اصلی قرار داد. تجزیه واریانس مولکولی نشان داد تنوع درون تودهها بیشتر از تنوع بین تودها می باشد. بنابراین در برنامههای به نژادی آفتابگردان آجیلی، میتوان انتخاب را درون تودهها انجام داد. نتایج حاصل از واکنش زنجیره ای پلی مراز با نشانگرهای IRAP نشان داد که رتروترنسپوزون‌های مطالعه شده در ژنوم آفتابگردان فعال هستند و به صورت سر‌به‌سر، سر‌به‌دم و دم‌به‌دم در ژنوم ادغام شده‌اند. نتایج حاصل از مطالعه حاضر نشان می دهد که نشانگر‌های مبتنی بر رتروترنسپوزون ها ابزاری مفید برای مطالعات ژنومیکس در آفتابگردان می‌باشند.

واژه‌های کلیدی: آفتابگردان آجیلی، تجزیه کلاستر، توده های بومی، رتروترنسپوزون، نشانگرهای مولکولی.

مقدمه

آفتابگردان (Helianthus annuus L.) با مبدا تکامل شمال‌غرب آمریکا، یکی از مهمترین محصولات زراعی در جهان است (FAO, 2010). سطح زیر کشت آفتابگردان در جهان در سال زراعی 2008/2009 میلادی حدود 24 میلیون هکتار و مقدار بذر تولید شده حدود 33 میلیون تن می باشد (FAO, 2010). ارقام زراعی آفتابگردان دارای دو تیپ روغنی و آجیلی می‌باشند (Salunkhe et al., 1999). در تیپ آجیلی درصد روغن کمتر از ۳۰ درصد می باشد ولی درصد پروتئین بالایی دارند (Lu and Hoeft, 2009). وزن صد دانه بین ۱۰ تا ۲۰ گرم و حتی بیشتر متغییر است و به منظور مصرف آجیلی مورد استفاده قرار می گیرند(Lu and Hoeft, 2009)..

کشاورزی نوین باعث کاهش تنوع ژنتیکی گیاهان زراعی نسبت به اجداد وحشی آن‌ها شده است. وجود تنوع ژنتیکی برای بدست آوردن ارقام با عملکرد بالا، کیفیت بهتر، تحمل بیشتر به تنش‌های زیستی و غیرزیستی و مقاومت بیشتر به آفات و بیماری‌ها، برای به‌نژادگران ضروری است (Laurentin, 2009). خصوصیات مورفولوژیکی از جمله اولین نشانگرهای مورد استفاده در ارزیابی تنوع بین و میان جمعیتها بهشمار میآیند. ارزیابی با این نشانگرها معمولا کم هزینه و آسان است اما عوامل متعدد نامطلوبی با نشانگرهای مورفولوژیکی مرتبط هستند. اولین عامل وابستگی یا تاثیر پذیری بالای این صفات از شرایط محیطی است. علاوه بر شرایط محیطی تظاهر این نشانگرها بوسیله برهمکنشهای ناشی از اپیستازی و پلیوتروپی تغییر می نماید. تعداد نشانگرهای مورفولوژیک خصوصا در تلاقیهای درون گونهای بسیار محدود است. نشانگرهای مولکولی مبتنی بر DNA، تنوع در توالی DNA افراد مختلف را شامل می‌شوند. تنوع این نشانگرها در سطوح فنوتیپی تظاهر نمییابد. نشانگرهای مولکولی مبتنی بر DNA، تکمیل کننده نقاط ضعف نشانگرهای مرفولوژیکی بوده و اطلاعات بسیار مفیدی در‌باره چند‌شکلی، روابط ژنتیکی و تنوع ژنتیکی در اختیار محققین قرار می دهند (Chalmers et al., 2001). نشانگرهای مولکولی مختلفی از قبیل RFLP (Cheres and Knapp, 1998)، AFLP (Dong et al., 2007; Darvishzadeh, 2012)، RAPD (Iqbal et al., 2008) و SSR (Darvishzadeh et al., 2010; Kholghi et al., 2012) جهت بررسی تنوع ژنتیکی و پیش‌بینی عملکرد هیبرید‌ها در آفتابگردان استفاده شده است.

در دو دهه اخیر نشانگر‌های مولکولی بسیاری مبتنی بر رتروترنسپوزون‌ها برای بررسی خصوصیات ژنتیکی گیاهان توسعه یافته‌اند (Waugh et al., 1997; Flavel et al., 1998; Kalendar et al., 1999). فراوانی، توزیع و پراکنش بسیار بالای رتروترنسپوزون‌ها در ژنوم گیاهی، آن‌ها را به یک عامل ممتاز جهت توسعه سیستم‌های نشانگر مبتنی بر DNA تبدیل کرده است. مقایسات مستقیم بین نشانگر‌های مبتنی بر رتروترنسپوزون ها و سایر نشانگرها، حاکی از چندشکلی بالا و ارائه نمودن اطلاعات مفید توسط این نشانگر‌ها در گیاهان است (Abdollahi Mandoulakani et al., 2008; Abdollahi Mandoulakani et al., 2012; Queen et al., 2004; Tam et al., 2005). نشانگر [1]IRAP یکی از انواع نشانگرهای مبتنی بر رتروترنسپوزون ها می باشد که به‌عنوان یک نشانگر مولکولی جهت بررسی تنوع ژنتیکی و بررسی وقایع درج (insertion) رتروترنسپوزون‌ها در ژنوم گیاهان قابل استفاده است (Kalendar et al., 1999). از نشانگرهای رتروترانسپوزونی بطور موفقیت آمیزی در ارزیابی تنوع ژنتیکی در گیاهان مختلفی از قبیل جو (Kalendar et al., 1999)، گندم (Abdollahi Mandoulakani et al., 2008, 2009; Carvalho et al., 2010)، خانواده مرکبات (Biswas et al., 2010) و یونجه (Abdollahi Mandoulakani et al., 2012) استفاده شده است. در مطالعه ای، Vukich et al., (2009)، دو گروه از LTR های ژنوم آفتابگردان را جداسازی و توالی‌یابی نموده و سپس آغازگرهایی را جهت بدست آوردن الگوی تکثیری IRAP در 36 گونه وحشی و 26 واریته آفتابگردان طراحی کردند. آنها نشان دادند که نشانگرهای مبتنی بر رتروترنسپوزون ها می توانند بطور موثری جهت بررسی تنوع ژنتیکی آفتابگردان بکار روند. کشور ایران با توجه به شرایط اقلیمی خاص از مناطق مستعد کشت و کار انواع آفتابگردان بویژه آفتابگردان آجیلی می باشد. وجود ژرم پلاسم غنی آفتابگردان آجیلی در کشور ایران و فقدان اطلاعات کافی در مورد تنوع ژنتیکی و گروه بندی آنها محققین را بر آن داشت تا از نشانگرهای IRAP جهت بررسی تنوع ژنتیکی و تعیین گروه‌های هتروتیک و همچنین بررسی چند شکلی درجی[2] رتروترنسپوزون‌ها در توده‌های بومی آفتابگردان‌ آجیلی استفاده نمایند.

مواد و روش‌ها

مواد گیاهی و استخراج DNA

در این مطالعه، 10 توده بومی آفتابگردان آجیلی از مناطق مختلف مرسوم کشت آفتابگردان آجیلی در کشور شامل ارومیه، خوی، بوکان، مرند، میانه، سنندج، همدان، شاهرود، اصفهان و مشهد جمع‌آوری گردید. از هر توده تعداد 5 بذر در گلدان‌های کوچک حاوی ترکیب پیت ماس و ورمیکولیت کشت گردید و جهت رشد در اتاق رشد با دمای 25 درجه سانتی‌گراد و 54 درصد رطوبت قرار داده شد. نمونه برداری از برگ‌های جوان گیاهان 15 روزه با استفاده از نیتروژن مایع صورت گرفت و بافت‌های برگی تا زمان استخراج DNA در فریزر 80- درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند. DNA ژنومی با استفاده از روش Dellaporta et al., (1983) با اندکی تغییرات استخراج شد. DNA ژنومی در نهایت در مقدار µl100 بافرTE (Tris 10mM, EDTA 1mM; pH 8.0) حل شد. کمیت و کیفیت DNA در طول موج 260 نانومتر با استفاده از دستگاه بیوفتومتر 6131 (Eppendorf, Germany) تعیین شد. همچنین کیفیت DNA با استفاده از الکتروفورز ژل آگارز 8/0% با ولتاژ 80 ولت به مدت 45 دقیقه بررسی گردید. DNA های دارای اسمیر یا آلودگی حذف شده و مجددا از نمونههای آنها استخراج DNA انجام گرفت.

واکنش‌های IRAP

با استفاده از 9 آغازگر مبتنی بر LTR (جدول 1)، 9 آغازگر منفرد و 16 ترکیب آغازگری، برای مطالعه تنوع ژنتیکی و چند شکلی درجی رتروترنسپوزون‌ها در 10 توده بومی آفتابگردان‌ آجیلی شامل 50 فرد مورد آزمایش قرار گرفت که از این تعداد 11 آغازگر منفرد و ترکیب آغازگری قادر به تولید چندشکلی درجی در ژنوم آفتابگردان بودند (جدول 2). آغازگر‌ها بر اساس توالی‌های LTR رتروترنسپوزون‌ها طراحی شدند (Vukich et al., 2009; Schulman AH, Personal communication, 2012). واکنش‌های زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) در حجم نهایی µl20 حاوی حدودا 20 نانوگرم DNA ژنومی، µl2 از بافر PCR 10X، mM75/1 کلرید منیزیم، mM25/0 از هر dNTP(BioFluxbiotech; http://biofluxbiotech.com) و 1/1 واحد آنزیم تک پلیمراز (Cinagene Co., Tehran, Iran) و Mµ10 از هر آغازگر‌ در ترموسایکلر 96 پایه (Eppendorf Mastercycler Gradient Type 5331; Eppendorf AG, Hamburg, Germany) انجام شد. چرخه‌های دمایی برای تکثیر به صورت زیر برنامه‌ریزی شد: مرحله اول: واسرشت سازی اولیه در 94 درجه سانتی‌گراد به مدت 4 دقیقه، مرحله دوم: 37 چرخه که هر چرخه شامل دمای واسرشت‌سازی در 94 درجه سانتی‌گراد به مدت 40 ثانیه، دمای اتصال 53 تا 60 درجه سانتی‌گراد (بسته به ساختار آغازگر، جدول 2) به‌مدت 40 ثانیه و دمای توسعه در 72 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 2 دقیقه و مرحله سوم: دمای توسعه‌ی نهایی در 72 درجه سانتی‌گراد به‌ مدت 5 دقیقه. جداسازی قطعات با استفاده از الکتروفورز ژل آگارز 8/1% (Invitrogen Ultra Pure) به‌مدت 4 ساعت در 65 ولت صورت گرفت. رنگ آمیزی قطعات با استفاده از اتیدیوم بروماید با غلظت 1 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر انجام شد. عکس برداری و ذخیره اطلاعات با استفاده از سیستم ژل داکیومنتیشن (Gel Logic 212 PRO, USA) زیر نور UV انجام گرفت.

جدول 1- ساختار توالی آغازگر‌های رتروترنسپوزونی استفاده شده در توده های آفتابگردان آجیلی.

Table 1- Sequence structure of retrotransposon primers used on confectionary sunflower populations.

نوع رتروترنسپوزون	توالی(′3-′5)	آغازگر رتروترنسپوزونی
Retrotransposon type	Sequence (5´-3´)	Retrotransposon primer
LTR	AGAGGGGAATGTGGGGGTTTCC	1061
LTR	TCTCTATTTATAGCCGGAGAGGTG	1062
LTR	GATCCGGTTTCACGGGACTTAC	1063
LTR	CGAAGAACAAACCGAATCACC	1064
LTR	AGCCTCTGAAAGACTCGTTCG	1065
Helicopia LTR	GGTTTAGGTTCGTAATCCTCCGCG	Cf
Helicopia LTR	ACAGACACCAGTGGCACCAAC	Cr
SURE LTR	TAACGGTGTTCTGTTTTGCAGG	Uf
SURE LTR	AGAGGGGAATGTGGGGGTTTCC	UR1

جدول 2- آغازگرهای IRAP (ساده و مرکب یا ترکیبی) استفاده شده در توده های آفتابگردان آجیلی.

Table 2- IRAP primers (single primer and primer combination) used on confectionary sunflower populations.

اندازه باند (جفت باز)	دمای اتصال	درصد مکان های چند شکل	تعداد مکان های چند شکل	تعداد مکان تکثیر شده	آغازگرهای IRAP
Band length (base pair)	Annealing temperature	Percentage of polymorphic loci	Number of polymorphic loci	Number of loci	IRAP primers
2500-500	57	100	9	9	1062
3000-500	56	90	9	10	1065
3000-500	60	91	10	11	1061-1065
2000-250	53	88	8	9	1062-1065
3000-250	55	100	5	5	1063-1064
2000-250	57	83	5	6	1063-1065
3000-500	57	90	9	10	1064-1065
2000-500	60	100	9	9	CF
1500-250	58	100	18	18	Cr
2500-300	58	100	18	18	Uf
2000-250	60	91	10	11	Uf-UR1
		94.8	110	116	مجموع Sum
	57.3		10	10.5	میانگین Mean

آنالیز داده‌ها

ابتدا قطعات تکثیر شده به‌صورت 0 و 1 (0 برای عدم حضور باند و 1 برای حضور باند) نمره‌دهی شدند. تعداد نشانگرهای تکثیر شده، درصد نشانگرهای چندشکل، تعداد مکان‌ها با فراوانی بیشتر یا مساوی 5%، تعداد مکان‌های اختصاصی، میانگین هتروزیگوسیتی و خطای معیار میانگین هتروزیگوسیتی، سطح تمایز ژنتیکی (PhiPT) و میزان مهاجرت بین گروه‌ها (Nm) با استفاده از نرم‌افزار GenALEx 6 (Peakall and Smouse, 2006) محاسبه شد. آنالیز واریانس مولکولی (Analysis of molecular variance: AMOVA) برای بررسی تنوع ژنتیکی بین و درون توده‌های بومی با استفاده از نرم‌افزارGenALEx 6 انجام گرفت. برای تعیین فاصله ژنتیکی بین هر جفت از توده‌های بومی، ماتریس فاصله Nei با استفاده از نرم افزار GenALEx 6 محاسبه شد. ماتریس فاصله حاصل برای ترسیم دندروگرام بر پایه آلگوریتم UPGMA با استفاده از نرم‌افزار NTSYSpc 2.1 (Rholf, 2000) مورد استفاده قرار گرفت. برای بررسی مقدار سازگاری بین ماتریس فاصله با ماتریس کوفنتیک حاصل از دندروگرام، ضریب r کوفنتیک با استفاده از نرم افزار NTSYSpc 2.1 محاسبه شد. ماتریس Dcenter از ماتریس فاصله Nei با استفاده از نرم‌افزار NTSYSpc 2.1 محاسبه شد و برای انجام محاسبات تجزیه به مختصات اصلی (PCoA) با استفاده از نرم‌افزار NTSYSpc مورد استفاده قرار گرفت.

نتایج

در این بررسی، تعداد 9 آغازگر ساده و 16 ترکیب آغازگری برای مطالعه تنوع ژنتیکی 10 توده بومی آفتابگردان آجیلی استفاده شد که از این تعداد، 11 آغازگر تولید الگوی باندهای چند شکل با وضوح بالا نمودند (جدول 2). از سری رتروترنسپوزون‌های 1061 تا 1065 فقط 2 آغازگر 1062 و 1065 تولید الگوی باندی چندشکل نمودند و سایر آغازگرهای ساده از این سری، یا هیچ باندی تولید نکردند و یا اینکه الگوی مونومورف تولید نمودند. 5 آغازگر ترکیبی از سری 1061 تا 1065 تولید الگوی باندی چند شکل نمودند. از آغازگر‌های سری Helicopia[3] (آغازگرهای Cf و Cr، ((Vukich et al., 2009) و سری SURE[4] )آغازگرهای Uf و UR1 ((Vukich et al., 2009) ، آغازگر‌های ساده Cf، Cr و Uf تولید الگوی باند‌های چند شکل نمودند و از ترکیبات آغازگری ممکن بین آنها، فقط یک ترکیب آغازگری از آغازگر‌های SURE تولید الگوی باندی چند شکل نمود (جدول 2).

دمای اتصال آغازگر‌ها از 53 تا 60 درجه سانتی‌گراد متغییر بود و میانگین دمای اتصال 3/57 درجه سانتی‌گراد بود (جدول 2). یازده آغازگر مورد استفاده (5 آغازگر ساده + 6 ترکیب آغازگری) 166 مکان را تکثیر نمودند که از این تعداد، 110 مکان (8/94%) چند‌شکل میباشد (جدول 2). مکان‌های چند‌شکل به‌ازای هر آغازگر بین 5 تا 18 مکان متغییر بود. میانگین مکان‌های چند‌شکل به‌ازای هر آغازگر 10 بود (جدول 2). دامنه طول باند‌های تکثیر شده بین 250 تا 3000 جفت باز متغییر بود (جدول 2). الگوی باند‌های تکثیر شده توسط ترکیب آغازگری Uf-Ur1 در شکل 1 نشان داده شده است.

حداقل فاصله ژنتیکی بر اساس ضریب فاصله Nei (12/0) بین توده‌های بومی مرند و اصفهان، و حداکثر فاصله ژنتیکی (26/0) بین توده‌های بومی همدان و مشهد مشاهده شد (جدول 3). میانگین فاصله ژنتیکی بین توده‌های بومی 15/0 بود. دندروگرام حاصل از آلگوریتم UPGMA با استفاده از ضریب فاصلهNei توده‌های بومی آفتابگردان مورد مطالعه را در سه گروه قرار داد (شکل 2). با توجه به شکل 2، توده‌های بومی شاهرود، مرند، اصفهان، خوی و ارومیه در گروه اول قرار گرفتند. توده‌های بومی بوکان، سنندج و میانه در گروه دوم و توده بومی مشهد به تنهایی در گروه سوم قرار گرفت (شکل 3). نتایج تجزیه به مختصات اصلی (PCoA) نشان داد که دو مولفه اول در مجموع 4/50 درصد از تغییرات را توجیه می نمایند. گروه‌بندی توده های مورد مطالعه با استفاده از دو مولفه اول، همچون تجزیه کلاستر توده ها را در سه گروه قرار داد (شکل 3). آنالیز واریانس مولکولی نشان داد که از کل تنوع ژنتیکی، 13 درصد تنوع، بین توده‌ای و 87 درصد تنوع، درون توده‌ای می باشد (P≤0.05). حداقل تمایز ژنتیکی (009/0) بین توده‌های بومی سنندج و میانه و حداکثر تمایز ژنتیکی (224/0) بین توده‌های بومی همدان و میانه مشاهده شد (جدول 3). حداقل میزان مهاجرت (Nm=0.86) بین توده‌های بومی همدان و میانه و حداکثر آن (52/27) بین توده‌های بومی سنندج و میانه مشاهده شد (جدول 3). میانگین هتروزیگوسیتی در دامنه اعداد 255/0 تا 299/0 و تعداد آلل‌های موثر در دامنه 43/1 تا 53/1 بین توده‌های بومی مرند و سنندج مشاهده شد. ضریب شانون در دامنه 376/0 تا 435/0 بین توده‌های میانه و سنندج متغییر بود. درصد مکان‌های چند شکل بین 73/62 تا 45/75 درصد به‌ترتیب بین توده‌های میانه و خوی مشاهده شد. فراوانی تمامی باند‌های تکثیر شده بیشتر از 5% بود (جدول 4).

شکل 1- چند شکلی حاصل از ترکیب آغازگری UF-UR1. ستون M نشانگر وزن مولکولی بر حسب bp، ستون های 1 الی 5 افراد توده بومی شاهرود، ستون‌های 6 الی 10 افراد توده بومی همدان، ستون‌های 11 الی 15 افراد توده بومی ارومیه و ستون‌های 16 الی 20 افراد توده بومی مرند می‌باشند.

Figure 1- IRAP fingerprints using UF-UR1 primer on sunflower genotypes. Lanes from left to right: M show 1kb DNA ladder (Fermentas) in base pairs; 1 to 5: individuals from Shahroud population, 6 to 10: individuals from Hamadan population, 11 to 15: individuals from Urmia population, 16 to 20: individuals from Marand population.

شکل 2- دندروگرام 10 توده بومی آفتابگردان آجیلی براساس آلگوریتم UPGMA و ضرایب فاصله نی با استفاده از داده های IRAP.

Figure 2- Dendrogram of 10 confectionary sunflower populations based on UPGMA algorithm and Nei genetic distance using IRAP data.

شکل 3- پلات دو بعدی 10 توده بومی آفتابگردان آجیلی بر اساس تجزیه به مختصات اصلی.

Figure 3- Two dimensional plot of the genetic relationship among 10 sunflower populations produced by principle coordinate analysis on IRAP data.

جدول 3- تمایز ژنتیکی، فاصله ژنتیکی نی و میزان مهاجرت بین هر جفت از توده های بومی.

Table 3- Genetic differentiation (PhiPT), number of migration (Nm) and Nei genetic distance (GD) values between each pair-wise confectionary sunflower populations.

Pop1	Pop2	PhiPT	Nei GD	Nm	Pop1	Pop2	PhiPT	Nei GD	Nm
Hamedan	Shahrud	0.141	0.16	1.52	Khoy	Mashhad	0.131	0.21	1.65
Hamedan	Khoy	0.092	0.17	2.47	Urmia	Mashhad	0.177	0.23	1.15
Shahrud	Khoy	0.092	0.17	2.45	Marand	Mashhad	0.053	0.16	4.43
Hamedan	Urmia	0.136	0.19	1.59	Bukan	Mashhad	0.134	0.24	1.62
Shahrud	Urmia	0.030	0.14	7.98	Esfahan	Mashhad	0.090	0.17	2.51
Khoy	Urmia	0.077	0.13	3.00	Hamedan	Sanandaj	0.136	0.17	1.58
Hamedan	Marand	0.144	0.18	1.48	Shahrud	Sanandaj	0.174	0.19	1.18
Shahrud	Marand	0.094	0.15	2.39	Khoy	Sanandaj	0.159	0.20	1.32
Khoy	Marand	0.061	0.13	3.81	Urmia	Sanandaj	0.172	0.18	1.20
Urmia	Marand	0.144	0.17	1.49	Marand	Sanandaj	0.098	0.17	2.29
Hamedan	Bukan	0.194	0.22	1.03	Bukan	Sanandaj	0.097	0.16	2.33
Shahrud	Bukan	0.146	0.19	1.46	Esfahan	Sanandaj	0.085	0.16	2.69
Khoy	Bukan	0.149	0.20	1.43	Mashhad	Sanandaj	0.129	0.22	1.69
Urmia	Bukan	0.191	0.23	1.05	Hamedan	Mianeh	0.224	0.25	0.86
Marand	Bukan	0.082	0.21	2.79	Shahrud	Mianeh	0.177	0.19	1.15
Hamedan	Esfahan	0.156	0.17	1.35	Khoy	Mianeh	0.181	0.22	1.13
Shahrud	Esfahan	0.077	0.13	2.98	Urmia	Mianeh	0.154	0.21	1.37
Khoy	Esfahan	0.109	0.15	2.03	Marand	Mianeh	0.161	0.23	1.30
Urmia	Esfahan	0.164	0.16	1.27	Bukan	Mianeh	0.172	0.22	1.20
Marand	Esfahan	0.011	0.12	23.03	Esfahan	Mianeh	0.166	0.23	1.25
Bukan	Esfahan	0.048	0.15	4.92	Mashhad	Mianeh	0.154	0.22	1.36
Hamedan	Mashhad	0.208	0.26	0.95	Sanandaj	Mianeh	0.009	0.13	27.52
Shahrud	Mashhad	0.167	0.20	1.24

جدول 4- ویژگی های مکان های IRAP تکثیر شده، میانگین هتروزیگوسیتی، تعداد آلل موثر، ضریب شانون و درصد مکان های چند شکل در هر جمعیت.

Table 4- Characteristics of amplified IRAP loci, mean of heterozygosity, effective number of alleles, Shannon's information index and percentage of polymorphic loci in each studied sunflower population.

توده Population	HAMEDAN	SHAHROOD	KHOY	URMIA	MARAND	BUKAN	ESFAHAN	MASHHAD	SANANDAJ	MIANEH
No. Bands	93	91	98	98	97	101	95	95	103	94
No. Bands Freq. >= 5%	93	91	98	98	97	101	95	95	103	94
No. Private Bands	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
No. LComm Bands (<=25%)	1	0	0	0	0	1	0	0	0	0
No. LComm Bands (<=50%)	3	2	3	2	3	3	1	3	3	2
Mean He	0.261	0.258	0.281	0.283	0.255	0.255	0.291	0.262	0.299	0.261
SE of Mean He	0.020	0.019	0.018	0.018	0.018	0.019	0.019	0.019	0.019	0.021
Ne	1.46	1.45	1.48	1.49	1.43	1.44	1.52	1.45	1.53	1.48
I	0.381	0.38	0.417	0.419	0.382	0.377	0.423	0.386	0.435	0.376
Percentage of polymorphic loci	64.55	67.27	75.45	74.55	70.91	67.27	71.82	68.18	73.64	62.73

بحث

فعالیت رتروترنسپوزون‌ها در ژنوم آفتابگردان آجیلی

رتروترنسپوزون‌ها از لحاظ تئوری قادر هستند در جهت گیری‌های مختلف سربه‌سر (Head to head)، سربه‌دم (Head to tail) و دم‌به‌دم (Tail to tail) در ژنوم گیاهان درج شوند. در نشانگر‌های IRAP، یک آغاز‌گر منفرد در واکنش‌های زنجیره‌ای پلی‌مراز در صورتی تولید الگوی باندی‌ چندشکل خواهد کرد که دو رتروالمنت مشابه به صورت سربه‌دم در ژنوم گیاه و در فاصله مناسب از همدیگر درج شده باشند. اگر دو رتروالمنت غیر مشابه به صورت سربه‌سر در ژنوم گیاه درج شده باشند می‌توان فاصله بین آن‌ها را با طراحی دو آغازگر برای توالی‌های LTR شان، تکثیر نمود (Vukich et al., 2009). در این مطالعه به جهت افزایش احتمال تکثیر فاصله بین رتروالمنت‌ها علاوه بر آغاز‌گرهای منفرد یا ساده از ترکیب آغازگر‌های رتروترنسپوزونی (آغازگر‌های مرکب) نیز استفاده شد. از 9 آغاز‌گر رتروترنسپوزونی استفاده شده در این مطالعه 5 آغازگر ساده (1062, 1065, Cf, Cr & Uf) الگوی باند‌های چند شکل با وضوح بالا تولید کردند که نشان دهنده فعالیت بیشتر این رتروالمنت‌ها نسبت به سایر رتروالمنت‌های استفاده شده در ژنوم آفتابگردان آجیلی است. سایر آغازگر‌های منفرد هیچ الگوی باندی قابل نمره‌دهی ایجاد نکردند. 5 آغازگر مرکب یا ترکیبی از سری آغازگرهای ساده 1061 تا 1065 و 1 آغازگر مرکب از سری آغازگرهای Helicopia[5] (آغازگرهای ساده Cf و Cr، ((Vukich et al., 2009) و سری SURE[6] )آغازگرهای ساده Uf و UR1 ((Vukich et al., 2009) تولید الگوی باند‌های چند شکل با وضوح بالا نمودند. در ترکیب هر 5 آغازگر مرکب از سری 1061 تا 1065 رتروالمنت 1065 حضور داشت که این موضوع تائید کننده فعالیت بیشتر این رتروالمنت در ژنوم آفتابگردان آجیلی می‌باشد. 3 آغازگر ساده و 1 آغازگر مرکب یا ترکیبی حاصل از آغازگرهای Helicopia و SURE در مجموع 55 مکان چند شکل تولید کردند که این تعداد برابر با کل مکان‌های چند شکل تولید شده با 7 آغازگر ساده و مرکب از سری 1061-1065 (2 آغازگر ساده 1062 و 1065 و 5 آغازگر مرکب یا ترکیبی از سری 1061-1065) بود. این نتایج حاکی از فعالیت بیشتر رتروالمنت‌های Helicopia و SURE نسبت به سایر رتروالمنت‌های استفاده شده می باشد. با توجه به الگوهای باندی تولید شده از آغازگرهای ساده و مرکب یا ترکیبی می توان نتیجه گیری کرد که رتروالمنت‌های استفاده شده در ژنوم آفتابگردان حضور دارند و به صورت سربه‌سر، سربه‌دم و دم‌به‌دم در ژنوم آفتابگردان درج شده‌اند.

روابط ژنتیکی توده های بومی آفتابگردان آجیلی

بر اساس تجزیه واریانس مولکولی 87 درصد از تنوع ژنتیکی، ناشی از تنوع درون توده‌های بومی و 13 درصد مربوط به تنوع بین توده‌های بومی بود. تنوع ژنتیکی درون توده‌ای زیاد می‌تواند ناشی از طبیعت دگرگشنی گیاه آفتابگردان باشد. تنوع کم بین توده‌های بومی آفتابگردان‌ آجیلی نشان دهنده جریان کم ژنی بین توده‌های بومی است.(2012) Kholghi et al. نتایج مشابهی در مطالعه تنوع ژنتیکی توده‌های بومی آفتابگردان آجیلی با استفاده از نشانگر‌های ریزماهواره گزارش کردند. در مطالعه ایشان، 86 درصد از تنوع ژنتیکی ناشی از درون توده‌های بومی و 14 درصد از تنوع مربوط به بین توده‌های بومی بود.

حداقل تمایز ژنتیکی (9/0%) بین توده های بومی سنندج و میانه مشاهده شد. این موضوع می‌تواند ناشی از جریان بالای ژنی بین توده‌های سنندج با میانه باشد.(2012) Kholghi et al. نیز با استفاده از نشانگر‌های ریزماهواره و بر اساس ضرایب فاصله کسمان و لئونارد (Kosman and Leonard, 2005)، کمترین فاصله ژنتیکی را بین توده‌های بومی سنندج و میانه گزارش نمودند. حداکثر تمایز ژنتیکی با مقادیر تقریبا 21 و 22 درصد بین توده‌های بومی همدان با مشهد و میانه مشاهده شد. تمایز ژنتیکی بالای توده‌های بومی همدان با مشهد بدلیل فاصله جغرافیایی زیاد و طبعا ناچیز بودن جریان ژنی بین توده‌های بومی مذکور قابل انتظار است.

میزان مهاجرت بین اکثر توده‌های بومی به استثنای توده های بومی همدان با میانه و مشهد، بیش از 1 بود که می‌تواند ناشی از جابجایی بذر توسط انسان یا فاصله اندک جغرافیایی بین توده‌ها باشد (جدول 3). میزان مهاجرت بین توده‌های بومی همدان با میانه و مشهد کمتر از 1 بود که می‌تواند ناشی از فاصله جغرافیایی بین همدان با میانه و مشهد باشد. میزان مهاجرت بین توده‌ها (Nm) که نشان دهنده جریان ژنی بین توده‌هاست در صورتی که کمتر از 1 باشد نشان دهنده ایزوله شدن گروه‌ها از نظر جریان ژنی نسبت به همدیگر است(Wright, 1951) .

تجزیه کلاستر با آلگوریتم UPGMA با استفاده از ضرایب فاصله Nei، به طور بالقوه توده‌های بومی آفتابگردان را در 3 گروه هتروتیک دسته‌بندی کرد. مطابق با گزراشات قبلی در گیاهانی از قبیل زعفران (Sabzalian et al., 2009)، گندم (Abdollahi Mandoulakani et al., 2008, 2009) یونجه (Abdollahi Mandoulakani et al., 2012)، نتایج گروهبندی حاصل از تجزیه به مختصات اصلی با نتایج تجزیه خوشه‌ای در توافق بود (شکل 3). در گیاهان زراعی، یکی از معیارهای انتخاب والدین برای تلاقی و بهره‌مندی از پدیدهی هتروزیس، فاصلهی ژنتیکی میباشد. هرچند مکانیزم‌های ژنتیکی که در فرایند هتروزیس دخیل اند به خوبی درک نشده است ولی مشخص شده است که هیبرید‌های حاصل از تلاقی‌های بین والدین با روابط ژنتیکی کمتر و فاصله ژنتیکی بیشتر، قدرت بیشتری را نسبت به هیبرید‌های حاصل از والدین با روابط ژنتیکی نزدیکتر از خود نشان می‌دهند (Hallauer, 1999; Stuber, 1994). بنابراین جمعیتهایی با فاصله ژنتیکی بیشتر یا افراد متعلق به گروههای هتروتیک مختلف میتواند به طور بالقوه به عنوان والدین تلاقی در برنامه های اصلاحی آفتابگردان آجیلی مورد استفاده قرار گیرند.

با توجه به مطالب ذکر شده، از نظر اصلاحی حضور و فراوانی رتروترنسپوزون‌هایLTR در ژنوم آفتابگردان آجیلی، این امکان را فراهم می سازد تا بتوان با استفاده از نشانگرهای IRAP، تنوع ژنتیکی موجود در ژرم پلاسم آفتابگردان آجیلی را با دقت بالایی بررسی نمود. نتایج نشان داد تنوع زیادی در تودههای آفتابگردان آجیلی وجود دارد و تنوع درون تودهها بیشتر از تنوع بین تودها بود. بنابراین در برنامههای به نژادی آفتابگردان آجیلی، میتوان انتخاب را درون تودهها انجام داد.

سپاسگزاری

از پژوهشکده زیست فن‌آوری دانشگاه ارومیه بدلیل در اختیار قرار دادن امکانات آزمایشگاهی برای انجام این مطالعه سپاسگزاری می‌شود.

منابع

Abdollahi Mandoulakani B, Bihamta MR, Zali AA, Yazdi-Samadi B, Naghavi MR, Schulman AH (2008). Fine mapping of stripe rust resistance gene Yr15 in durum wheat. Seed and Plant Improvement Journal 24: 371–387 (In Persian).

Abdollahi Mandoulakani B, Bihamta MR, Schulman AH, Zali AB, Naghavi M (2009). Evaluation of retrotranposons as molecular markers in wheat. Modern Genetics Journal 4: 17–25 (In Persian).

Abdollahi Mandoulakani B, Piri Y, Darvishzadeh R, Bernoosi I and Jafari M (2012). Retroelement insertional polymorphism and genetic diversity in Medicago sativa populations revealed by IRAP and REMAP markers. Plant Molecular Biology Reporter 30: 286-296.

Biswas MK, Baig MNR, Cheng YJ, Deng XX (2010). Retrotransposon based genetic similarity within the genus citrus and its relatives. Genetic Resources and Crop Evolution 7: 963–972.

Carvalho A, Guedes-Pinto H, Martins-Lopes P, Lima-Brito J (2010). Genetic variability of old Portuguese bread wheat cultivars assayed by IRAP and REMAP markers. Annals of Applied Biology 3: 337– 345.

Cheres MT, Knapp SJ (1998). Ancestral origins and genetic diversity of cultivated sunflower: Coancestry analysis of public germplasm. Crop Science 38: 1476-1482.

Chalmers KJ, Campbell AW, Kretschmer J, Karakousis A (2001). Construction of three linkage maps in bread wheat, Triticum aestivum L. Australian Journal of Agricultural Research 52: 1089-1119.

Dong GJ, Liu GS, Li KF (2007). Studying genetic diversity in the core germplasm of confection sunflower (Helianthus annuus L.) in China based on AFLP and morphological analysis. Russian Journal of Genetics 43: 627-635.

Darvishzadeh R, Azizi M, Hatami-Maleli H, Bernusi I, Abdollahi Mandoulakani B, Jafari M, Sarrafi A (2010). Molecular characterization and similarity relationships among sunflower (Helianthus annuus L.) inbred lines using some simple sequence repeats. African Journal of Biotechnology 9: 7280-7288.

Darvishzadeh R (2012). Phenotypic and molecular marker distance as a tool for prediction of heterosis and F1 performance in sunflower (Helianthus annuus L.) under well-water and water-stressed conditions. Australian Journal of Crop Science 6: 732-738.

Dellaporta SL, Wood J, Hicks JB (1983). A plant DNA miniprepration: version II. Plant Molecular Biology Reporter 1: 19-21.

Hallauer AR (1999). Temperate maize and heterosis. In: Coors J and Pandey S (Eds.) Genetics and exploitation of heterosis in crops, CIMMYT, Mexico City 17–22 Aug. 1997 ASA, Madison, WI. pp. 353–361.

FAO, 2010; http//www.fao.org/docrep/012/al375e/al375e.pdf

Flavell AJ, Knox MR, Pearce SR, Ellis ΤΗΝ (1998). Retrotransposon based insertion polymorphisms (RBIP) for high throughput marker analysis. Plant Journal 16: 643–650.

Iqbal MA, Sadaqat HA, Khan IA (2008). Estimation of genetic diversity among sunflower genotypes through random amplified polymorphic DNA analysis. Genetics and Molecular Research 7: 1408-1413.

Kalendar R, Grob T, Regina M, Souniemi A, Schulman AH (1999). IRAP and REMAP: two new retrotransposon-based DNA fingerprinting techniques. Theoretical and Applied Genetics 98: 704-711

Kosman E, Leonard KJ (2005). Similarity coefficients for molecular markers in studies of genetic relationship between individuals for haploid, diploid and polypoloid species. Molecular Ecology 14: 415-424.

Kholghi M, Darvishzadeh R, Bernousi I, Pirzad A, Laurentin H (2012). Assessment of genomic diversity among and within Iranian confectionary Sunflower (Helianthus annuus L.) populations by using simple sequence repeat markers. Acta Agriculturae Scandinavica Section B- Soil and Plant Science 62: 488-498.

Laurentin H (2009). Data analysis for molecular characterization of plant genetic resources. Genetic Resources and Crop Evolution 56: 277-292.

Lu G, Hoeft E (2007). Sunflower. In C. Kole, & T. C. Hall (eds.), A compendium of transgenic crop plants Vol. 2, Oxford, Wiley-Blackwell.

Peakall R, Smouse PE (2006). GenAlEx 6: genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research. Molecular Ecology Notes 6: 288–295.

Queen RA, Gribbon BM, James C, Jack P, Falvell AJ (2004). Retrotransposon-based molecular markers for linkage and genetic diversity analysis in wheat. Molecular Genetics and Genomics 271: 91–97.

Rohlf FJ (2000). NTSYS-pc: numerical taxonomy and multivariate analysis system, version 2.1. Exeter Software, New York.

Sabzalian MR, Mirlohi AF, Saeidi G, Rabbani MT (2009). Genetic variation among population of wild safflower, Carthamus oxyacanthus analyzed by agro morphological traits and ISSR markers. Genetic Resources and Crop Evolution 56:1057-1064.

Salunkhe DK, Chavan JK, Adsule RN, Kadam SS (1999). World oil seeds: Chemistry, technology, and utilization. New York: Van Nostrand Reinhold.

Stuber CW (1994). Heterosis in plant breeding. Plant Breeding Reviews 12: 227–251.

Tan SM, Mhiri C, Vogelaar A, KerkveldM, Pearce SR, Le Grandbastien MA (2005). Comparative analyses of genetic diversities within tomato and pepper collections detected by retrotransposon-based SSAP, AFLP and SSR. Theoretical and Applied Genetics 110: 819-831.

Vukich M, Schulman AH, Giordani T, Natali L, Kalendar L, Cavallini A (2009). Genetic variability in sunflower (Helianthus annuus L.) and Helianthus genus as assessed by retrotransposon-based molecular markers. Theoretical and Applied Genetics 119: 1027-1038.

Waugh R, McLean K, Flavell AJ, Pearce SR, Kumar A, Thomas BBT, Powell W (1997). Genetic distribution of Bare1-like retrotransposable elements in the barley genome revealed by sequence specific amplification polymorphisms (S-SAP). Molecular and General Genomics 253: 687–694.

Wright S (1951). The genetical structure of populations. Annals of Eugenics 15: 323-354.

Assessment of genetic diversity in Iranian confectionary sunflower (Helianthus annuus L.) populations using retrotransposon based IRAP markers

Basirnia A.¹, Darvishzadeh R.*², Abdollahi Mandoulakani B.³, Nabipur A.⁴

¹MSc, Department of Plant Breeding and Biotechnology, Faculty of Agriculture, Urmia University, Iran.

²Associate Professor, Department of Plant Breeding and Biotechnology, Faculty of Agriculture, Urmia University, Iran.

³Associate Professor, Department of Plant Breeding and Biotechnology, Faculty of Agriculture, Urmia University, Iran.

⁴Assistant Professor, Deputy of Rice Research Institute, Amol, Iran.

Abstract

Keywords: Cluster analysis, landrace, Retrotransposon, Sunflower, molecular marker.

* نویسنده مسئول: رضا درویش زاده تلفن: 09149734458 r.darvishzadeh@urmia.ac.ir Email:

[1] Inter-retrotransposon amplified polymorphism

[2] Insertional polymorphism

[3] Helianthus copia-like detecting element

[4] Sunflower unidentified detecting retroelement

[5] Helianthus copia-like detecting element

[6] Sunflower unidentified detecting retroelement

* Corresponding Author: Darvishzadeh R. Tel: 09149734458 Email: r.darvishzadeh@urmia.ac.ir

References