Association analysis for morphological traits in grapevine using SSR and AFLP markers

Document Type : Research Paper

Authors

Abstract

Grapevine (Vitis sp.), belongs to Vitaceae family, is one of the most important food sources in world because of its wide consumptions. In the current investigation, 22 SSR primer pairs and 7 AFLP primer combinations were used to identify molecular makers associated with 14 flower and fruit related traits in Iranian grapevine germplasm. The traits studied, included fruit water content, percentage of pollen germination, percentage of fruit production, bunch and berry weight, fruit lobe and single seed weight, bunch and yielding system length and width, total soluble solids, acid content and fruit pH. Stepwise regression analysis showed significant relationship between some SSR alleles and all 14 traits in grapevine varieties. In general, 49 alleles produced by 18 SSR primers, showed significant association with variation of 14 traits. The highest and lowest number of associated markers achieved for berry weight and fruit lobe weight each with 7 alleles and pH, fruit acid content, fruit water content and percentage of pollen germination each with 1 alleles, respectively. Significant association between polymorphism of AFLP markers and studied traits was also detected. Forty-nine AFLP fragments showed significant association with the variations of 14 traits. Some of the associated AFLP segments were common among different traits. The fruit lobe weight, with 11 associated markers and total soluble solids, percentage of fruit production, pollen germination and bunch width each with 1 associated marker, were the traits with the highest and lowest number of associated AFLP markers, respectively.

Keywords


تجزیه ارتباط صفات مورفولوژیک در انگور با استفاده از نشانگرهای SSR  و AFLP

 

حامد دولتی بانه1، سید ابوالقاسم محمدی2، بابک عبدالهی مندولکانی*3، ساسان رحمان­پور4

1 دانشیار پژوهشی مرکز تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی استان آذربایجان غربی، ارومیه

2 استاد گروه زراعت و اصلاح نباتات دانشکده کشاورزی دانشگاه تبریز

3 دانشیار گروه اصلاح و بیوتکنولوژی گیاهی دانشکده کشاورزی دانشگاه ارومیه

4 دانشجوی کارشناسی ارشد بیوتکنولوژی کشاورزی، گروه اصلاح و بیوتکنولوژی گیاهی دانشکده کشاورزی دانشگاه ارومیه

تاریخ دریافت: 21/12/1391، تاریخ پذیرش: 07/12/1392

چکیده

انگور متعلق به تیره Vitaceae است و به علت داشتن مصارف متعدد به عنوان یک منبع مهم غذایی همیشه مورد توجه بوده است. به منظور شناسایی نشانگرهای مرتبط با 14 صفت شامل حجم آب میوه، درصد جوانه‌زنی دانه گرده، درصد تشکیل میوه، میانگین وزن تک خوشه و وزن تک حبه، وزن گوشت میوه، وزن تک بذر، طول و عرض خوشه و سیستم باردهی، مواد جامد محلول میوه، مقدار اسید و pH میوه در 48 رقم انگور ایرانی موجود در کلکسیون مرکز تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی استان آذربایجان غربی از 22 جفت آغازگر SSR و 7 ترکیب آغازگری AFLP استفاده گردید. تجزیه رگرسیون گام به گام رابطه معنی­داری بین تعدادی از نشانگرهای SSR و تمامی 14 صفت مورد مطالعه در ارقام انگور نشان داد. در کل 49 آلل از 18 نشانگر SSR ارتباط معنی­دار با تغییرات 14 صفت نشان دادند. وزن حبه و وزن گوشت میوه هرکدام با 7 آلل بیشترین و صفات pH میوه، اسید میوه، حجم آب میوه و درصد جوانه زنی گرده با یک آلل کمترین تعداد آلل مرتبط را داشتند. از 7 جفت ترکیب آغازگری AFLP مورد استفاده، 49 قطعه رابطه معنی­داری با تغییرات 14 صفت نشان دادند. تعدادی از این قطعات برای صفات مختلف مشترک بودند. وزن گوشت میوه با 11 نشانگر مرتبط بیشترین و صفات مواد جامد محلول، درصد تشکیل میوه، جوانه زنی گرده و عرض خوشه با یک نشانگر مرتبط، کمترین تعداد نشانگرهای مرتبط AFLP را به خود اختصاص دادند.

واژه‌های کلیدی: انگور، تجزیه ارتباط، صفات مورفولوژیک، نشانگرهای مرتبط

 

 

مقدمه

        انگور به علت داشتن مصارف متعدد به عنوان یک منبع مهم غذایی همیشه مورد توجه بشر بوده است. این گیاه متعلق به تیره Vitaceae است که بیش از 13 جنس و 700 گونه دارد. گل‌ها در این تیره یا کامل بوده و یا به صورت تک جنس نر و ماده دیده می­شوند. جنس‌های Ampelopsis، Vitis و Parthenocissus  در نواحی معتدله رشد می­کنند و سایر جنس­ها در نواحی گرمسیری و نیمه گرمسیری پراکنده می­باشند (Doulati Baneh, 2007). مهم‌ترین جنس این خانواده از لحاظ اقتصادی و غذایی جنس Vitis می‌باشد که شامل دو زیرجنس Euvitis با 38 کروموزوم و زیرجنس Muscadinea با 40 کروموزوم است. زیرجنس Muscadinea در قاره آمریکا پراکنده بوده در حالی‌که زیر جنس Euvitis دارای تعداد زیادی گونه در مناطق مختلف جهان می­باشد (Janick and James, 1996). در حال حاضر منشاء اغلب ارقام انگور موجود، مورد بحث کارشناسان می­باشد بطوری‌که هیچ توافقی در مورد مرکز اولیه اهلی‌شدن انگور و یا مراکز ثانویه آن وجود ندارد (Labra et al., 2003). براساس مطالعات باستان‌شناسی گیاهی پیشنهاد شده ‌است که اهلی‌شدن انگور ابتدا در نیمه دوم هزاره چهارم قبل از میلاد مسیح در دو ناحیه هم‌جوار، ناحیه مزوپوتامیا (شامل جنوب آناتولی، سوریه، شمال لبنان، کردستان و غرب ایران) و جنوب دریای خزر اتفاق افتاده است. برطبق تئوری واویلوف اهلی شدن انگور Vinifera ابتدا در ناحیه دریای خزر اتفاق افتاده که در آن ناحیه بیشترین تنوع ژنتیکی مشاهده گردیده‌است (McGovern, 2003).

بر اساس گزارشات موجود در حدود 800 تا 1000 رقم انگور در ایران وجود دارد که تعدادی از این ارقام از اهمیت اقتصادی بالایی بویژه برای مصارف تازه خوری و تهیه کشمش برخوردار می­باشند (Zahedi, 1996). از جمله ارقام مهم انگور می­توان به بیدانه سفید، بیدانه قرمز، عسکری، یاقوتی، شاهرودی، شاهانی، ریش بابا، پیکانی، فخری، رشه، صاحبی و چندین رقم دیگر اشاره نمود. انگورهای خوراکی ایران از گونه Vinifera می­باشند. در ایران علاوه بر این گونه، دو نوع انگور شامل گونه Labruscae در شمال کشور و انگورهای وحشی از زیر گونه Silvestris در جنگل‌های شمال و مناطق مرطوب دامنه کوه‌های زاگرس نیز وجود دارند (Doulati baneh et al., 2007).

به دلیل تنوع ارقام انگور و اهمیت اقتصادی آن، مطالعات وسیعی در شناسایی ارقام و گونه­های جدید، بهبود خصوصیات مورفولوژیکی، مقاومت به آفات و بیماری‌ها و تنش­ها از طریق به‌نژادی انجام گرفته ‌است (Karami, 1996). اندازه ژنوم انگور با 38 کروموزوم در حدود 108× 75/4 جفت باز است. این ژنوم ترکیبی از توالی­های تکراری و غیرتکراری می­باشد که DNA تکراری بیش از 95% کل ژنوم را تشکیل می­دهد (Grassi et al., 2002). شناسایی نواحی ژنومی دخیل در کنترل صفات کمی بر مبنای عدم تعادل پیوستگی است و به دو روش اصلی صورت می­گیرد: تجزیه پیوستگی که در این روش اغلب از جمعیت­های ساختگی مانند نسل F2، تلاقی برگشتی، هاپلوییدهای مضاعف که در آنها عدم تعادل پیوستگی در بیشترین حد خود است استفاده می­شود. این روش بر مبنای تعیین همبستگی نواحی کروموزومی مشترک بین خویشاوندان در یک جمعیت در حال تفرق با صفت مورد مطالعه است. امروزه علاوه بر این از روش تجزیه ارتباط (Association analysis) نیز برای شناسایی مکان­های ژنی دخیل در صفات کمی و کیفی استفاده می­شود. در این روش برخلاف تجزیه پیوستگی، ارتباط بین ژنوتیپ و فنوتیپ افراد مستقیما برای شناسایی نواحی کروموزومی دخیل در کنترل صفت بررسی می­شود. روش تجزیه پیوستگی در گیاهان چند ساله و بویژه درختان میوه بواسطه نیاز به زمان طولانی برای تولید جمعیت­های مصنوعی و حساسیت برخی از گونه­ها به خویش­آمیزی در راستای ایجاد این جمعیت­ها، عملی به نظر نمی­رسد. بنابراین به عنوان روشی جایگزین، اخیرا از تجزیه ارتباط ژنوتیپ و فنوتیپ در این گیاهان استفاده می­شود (Gupta et al., 2005). این مطالعات شامل استفاده از ژرم­پلاسم گیاهان برای شناسایی نشانگرهای مولکولی مرتبط با تغییرات صفات مورد بررسی است. در پژوهشی Fanizza et al. (2005) برای شناسایی QTLهای موثر در عملکرد میوه در انگور، جمعیتی شامل 184 ژنوتیپ انگور V. vinifera را با استفاده از 203 نشانگر AFLP و 55 جفت آغازگر SSR مورد بررسی قرار دادند. نتایج نشان داد که عملکرد انگور با توجه به طبیعت چند ساله این گونه، کنترل ژنتیکی پیچیده‌ای دارد. نتایج حاصل از بررسی QTLهای موثر در باروری انگور نشان داد که یک QTL بزرگ اثر در گروه لینکاژی 5 پایداری بالایی در نسل‌های بعدی دارد. بعلاوه 3 QTL دیگر در گروه لینکاژی 5 و دو QTL در گروه لینکاژی 14 شناسایی شدند که در نسل‌های بعدی فقط در برخی نتاج فعال بودند (Doligez et al., 2010). تاکنون تجزیه ارتباط برای بسیاری از صفات مورفولوژیک به منظور شناسایی مکان­های کروموزومی دخیل در کنترل این صفات در انگور گزارش نشده است. بنابراین هدف از این تحقیق انگشت‌نگاری تعدادی از ژنوتیپ‌های انگور به منظور شناسایی نشانگرهای مرتبط با برخی صفات مورفولوژیک بود.  

 

 مواد و روشها

مواد گیاهی

در این مطالعه از 48 رقم انگور زراعی موجود در کلکسیون مرکز تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی استان آذربایجان غربی استفاده گردید (جدول 1).

 


جدول 1-  اسامی ارقام انگور مورد استفاده در تحقیق حاضر.

Table 1- Grapevine varieties used in the current study.

نام فارسی

English name

نام فارسی

English name

نام فارسی

English name

ریش بابا قرمز

Red Rish baba

قره شیره

Gara shireh

مایه مو

Mayeh mo

طایفی

Tayefi

عسکری

Askari

تبرزه قرمز

Red tabarzeh

کشمش قرمز

Red keshmesh

بیدانه سفید

White bidaneh

سفید شخ شخ

White shakh shakh

فخری

Fakhri

رجین

Rejin

قزل اوزوم

Gezel uzum

شاهرودی

Shahroudi

سرقوله

Sarguleh

گرمیان

Garmian

قره شانی

Gara shani

چاوه گا

Chava ga

اینک امجی

Ink amji

صاحبی

Sahebi

یاقوتی

Yaguti

لعل قرمز

Red laal

خلیلی سفید

White khalili

قره گندمه

Gara gandomeh

گزندایی

Xandaei

رزقی

Rezgi

دسترچین

Dastarchin

آغ شانی

Agh shani

حسینی

Hoseini

خلیلی قرمز

Red khalili

جیغ جیغا

Jigh jigha

تبرزه سفید

White tabarzeh

آق ملحی

Agh malhi

لعل سفید

White laal

قره ملحی

Gara malhi

گوی ملکی

Goi molki

کلکه ریوی

Kelkeh rivi

سقل سولیان

Sagal solyan

سایانی

Sayani

سیاه معمولی

Common black

ات اوزوم

At uzum

کلاتی

kalati

ساچاخ

Sachakh

لعل سیاه

Black laal

مام برایمه

Mam braymeh

شیرازی

Shirazi

رشه

Rasheh

بول مازو

Bul mazu

انگوتکه

Angutka

 

 

 

ارزیابی صفات کمی و کیفی

        از هرکدام از این ارقام 12 بوته 14 ساله انتخاب شدند. تاک­ها به صورت ایستاده با روش تربیت کوردون دو طرفه، در باغ کلکسیون انگور ایستگاه تحقیقات باغبانی دکتر نخجوانی کهریز نگهداری می­شوند. در زمان تشکیل میوه و زمان رسیدن حبه­ها هر‌کدام از صفات حجم آب میوه، درصد جوانه‌زنی دانه گرده، درصد تشکیل میوه (در حالت گرده افشانی آزاد و کنترل شده)، میانگین وزن تک‌خوشه و وزن تک حبه، وزن گوشت میوه و تک بذر، تعداد بذر، طول، عرض خوشه، مواد جامد محلول میوه، مقدار اسید و pH میوه در 10 تکرار در 3 سال اندازه­گیری شدند. برای اندازه گیری حجم آب میوه (بر حسب میلی­لیتر)، عصاره استحصالی از 100 گرم میوه هر رقم بعد از آب­گیری و صاف کردن با استوانه مدرج اندازه‌گیری شدند. برای اندازه‌گیری درصد جوانه‌زنی دانه گرده، خوشه­های ارقام انگور در زمان 50 الی 70 درصد گل‌دهی از بوته جدا و روی یک ظرف شیشه­ای تمیز تکان داده و سپس دانه­های گرده با استفاده از تیغ، جمع­آوری و در ظروف مخصوص نگهداری شدند. گرده­ها روی محیط یک درصد آگار همراه با 5 درصد ساکارز کشت و به­مدت یک شبانه­‌روز در دمای 26 درجه سانتی­گراد نگه­داری شدند. سپس در چندین میدان دید میکروسکوپ تعداد دانه­های جوانه­زده و تعداد کل، شمارش و درصد جوانه‌زنی محاسبه گردید. برای محاسبه درصد تشکیل میوه، از دو روش کیسه گذاری سه عدد خوشه از هر رقم (با اندازه و موقعیت تقریباً مشابه) و هم بدون کیسه­گذاری (گرده افشانی آزاد) استفاده شد.

با شمارش تعداد کالیپترا و تعداد حبه­های تشکیل شده، درصد تشکیل میوه از فرمول 100× تعدادگل/تعداد حبه = تشکیل میوه (%) محاسبه شد. میانگین وزن تک خوشه و وزن تک حبه از توزین چهار عدد خوشه و 100 عدد حبه به­دست آمد. برای اندازه‌گیری وزن گوشت میوه و تک‌بذر، تعداد 30 حبه انگور از هر رقم انتخاب و توزین شدند و سپس با جدا کردن بذرهای هر حبه، وزن گوشت میوه به ­دست آمد و از اختلاف وزن کل به گوشت حبه، وزن بذر محاسبه شد. همچنین تعداد بذر موجود در هر حبه نیز شمارش و میانگین­گیری گردید. از هر بوته تعداد سه خوشه از موقعیت­های یکسان روی شاخه انتخاب و صفات طول و عرض خوشه اندازه­گیری شدند. مقدار مواد جامد محلول میوه با استفاده از دستگاه رفراکتومتر، مقدار اسید با تیتراسیون و pH میوه با استفاده از دستگاه pH­متر اندازه­گیری شدند.

 

ارزیابی­های مولکولی

جهت استخراج DNA، 10-5  عدد برگ جوان (5-2 سانتی متر) از هر نمونه انگور بدون دمبرگ برداشته شدند و پس از اتیکت‌گذاری، در ازت مایع منجمد و به فریزر 80-  درجه سانتی گراد منتقل شدند.  استخراج DNA با روش Lodhi  و همکاران (1994) انجام شد. برای ارزیابی کمیت و کیفیت DNA استخراجی به ترتیب از اسپکتروفتومتر در طول موجهای 260 و 280 نانومتر و الکتروفورز ژل آگارز 1 درصد استفاده شد. پس از تعیین غلظت نمونه­ها، جهت استفاده در واکنش زنجیره­ای پلی مراز غلظت آنها به مقدار 25 نانوگرم در میکرولیتر برای تجزیه نشانگرهای ریزماهواره و AFLP رقیق شدند.

 

 

واکنش‌های تکثیر­ ریزماهواره‌ها

در این بررسی از 22 جفت آغازگر ریزماهواره هسته­ای استفاده شد (جدول 2). اساس انتخاب این آغازگرها، چندشکلی بالای آنها در مطالعات قبلی بود(Sefc et al., 2000; Laucou et al., 2011) . برای تکثیر جایگاه‌های ریزماهواره، واکنش زنجیره­ای پلی‌مراز با حجم 10 میکرولیتر با اجزایی به ترکیب بافر PCR 1 برابر، کلرید منیزیوم 5/2 میلی مولار، dNTP10 میلی مولار، آنزیمTaq  پلیمراز 1 واحد، هر کدام از آغازگرها با غلظت 10 میکرومولار و DNA الگوی 25 نانوگرم انجام شد. چرخه­های حرارتی PCR بصورت یک چرخه شامل واسرشته‌سازی اولیه به مدت 4 دقیقه و دمای 94 درجه سانتی­گراد، 35 چرخه شامل واسرشته‌سازی: 94 درجه سانتی­گراد به مدت یک دقیقه، اتصال آغازگرها به رشته‌های الگو بسته به نوع آغازگرها 50 تا 59 درجه سانتی­گراد به مدت یک دقیقه، بسط در دمای 72 درجه سانتی­گراد به مدت 2 دقیقه و بسط نهایی شامل 72 درجه سانتی­گراد به مدت 7 دقیقه بود. برای تفکیک محصولات PCR از ژل پلی‌اکریلامید واسرشته‌ساز 6 درصد و رنگ‌آمیزی نیترات نقره استفاده شد. جهت تعیین اندازه نسبی قطعات تکثیری، از آلل­های پنج رقم انگور مرجع شامل Cabernet sauvignon, Cabernet franch, Pinot noir, Chardoney, Barbera  به صورت بارگذاری چند تایی محصول PCR آنها برای هر نشانگر در طول ژل و استفاده از نشانگر وزن مولکولی،DNA Molecular Weight Marker VIII (0.019-1.11kbp) » از شرکت Roche در دو انتها و وسط ژل  استفاده گردید. برای الکتروفورز از دستگاه الکتروفورز عمودی شرکت Bio Rad استفاده شد.

 

واکنش­های AFLP

واکنش­های AFLP بر اساس روش Vos و همکاران (1995) انجام گرفت. بدین ترتیب که DNA (200 نانو گرم) به مدت سه ساعت با آنزیم­های برشی EcoR1(1U) وMse1(1U) هضم و سپس آداپتورهای EcoR1 (pmol5) وMse1 (pmol5) توسط آنزیم T4-DNA-Ligase به قطعات حاصل از برش متصل شدند. این واکنش در دمای 37  درجه سانتی‌گراد و به مدت شش ساعت ادامه یافت. این محلول به عنوان الگو در واکنش تکثیر اولیه استفاده شد که حاوی آغازگرهای مکمل توالی ناحیه مرکزی آداپتورهای دو آنزیم بکار رفته می­باشد. اجزای واکنش شامل 20 میکرولیتر مخلوط DNA برشی/ متصل شده به آداپتور، 50 نانوگرم از آغازگرهای انتخابی، 200 میکرومول از هر کدام ازdNTP ، 5/0 واحد آنزیم Dynazyme П و 5 میکرولیتر بافر بود.

 

 


جدول 2- نام، توالی و خصوصیات آغازگرهای ریزماهواره مورد استفاده در تحقیق حاضر.

Table 2- Name, sequence and properties of SSR primers used in current study.

PICd

Hec

تنوع ژنی

Genic diversity

تعداد آلل

Number of alleles

بیشترین فراوانی آللی

The max allelic frequency

سایز آلل

Allele size

LGb

Taa

Forward (5’ – 3’)

Reverse (5’ – 3’)

آغازگر

Primer

0.74

0.89

0.77

8

0.34

153-171

5

50

ggtctgaatacatccgtaagtatat

acggtgtgctctcattgtcattgac

VrZAG47

0.76

0.75

0.78

11

0.39

186-206

7

50

ggtgaaatgggcaccgaacacacgc

ccatgtctctcctcagcttctcagc

VrZAG62

0.82

0.97

0.84

11

0.26

135-163

10

58

tatgaaagaaacccaacgcggcacg

tgcaatgtggtcagcctttgatggg

VrZAG64

0.37

0.26

0.45

3

0.68

188-200

4

52

ggcggaggcggtagatgagagggcg

acgcaacggctagtaaatacaacgg

VrZAG83

0.83

0.75

0.85

12

0.23

224-246

16

56

ctagagctacgccaatccaa

tataccaaaaatcatattcctaaa

VVMD5

0.79

0.78

0.81

9

0.24

236-264

7

54

agagttgcggagaacaggat

cgaaccttcacacgcttgat

VVMD7

0.82

0.88

0.84

14

0.27

137-230

11

56

taacaaacaagaagaggaat

agcacatccacaacataatg

VVMD8

0.46

0.48

0.53

5

0.62

212-224

18

56

tgactcgccaaaatctgacg

cacacatatcatcaccacacgg

VVMD17

0.57

0.76

0.63

5

0.51

243-266

6

56

ggttgtctatggagttgatgttgc

gcttcagtaaaaagggattgcg

VVMD21

0.74

0.68

0.78

8

0.26

237-267

11

56

ttccgttaaagcaaaagaaaaagg

ttggatttgaaatttattgagggg

VVMD25

0.42

0.54

0.5

5

0.62

247-261

1

56

gagacgactggtgacattgagc

ccatcaccaccatttctactgc

VVMD26

0.71

0.79

0.75

8

0.37

175-194

5

56

gtaccagatctgaatacatccgtaagt

acgggtatagagcaaacggtgt

VVMD27

0.71

0.69

0.74

9

0.39

239-271

4

59

tatgattttttaggggggtgagg

ggaaagatgggatgactcgc

VVMD32

0.86

0.97

0.87

14

0.18

123-153

11

53.4

cagcccgtaaatgtatccatc

aaattcaaaattctaattcaactgg

VVS2

0.37

0.65

0.49

2

0.56

212-218

2

52

tgccctatcaattagttcaccta

tcgactttgatatattgatgatt

VVS3

0.49

0.59

0.53

6

0.64

166-180

8

58

ccatcagtgataaaacctaatgcc

cccaccttgcccttagatgtta

VVS4

0.77

0.75

0.79

11

0.39

120-167

14

58

cactggcctgttgggagataat

ccttcaactggaaaagcctgtc

ISV2

(VMC6e1)

0.59

0.83

0.65

5

0.4

133-149

2

58.4

aaggaggagttgagatgtagta

gagtaagagagaagcaagaaaa

ISV3

(VMC6f1)

0.73

0.86

0.76

6

0.3

162-199

2

59

tgcatagtgctgtaggccattg

tctgtcattgctgtccctttca

ISV4

(VMC6g1)

0.56

0.5

0.63

9

0.46

130-198

-

55

catcattcatccaaattatgtag

tttagtaggttagggataccagt

VMC6g10

0.73

0.89

0.76

12

0.38

132-186

9

58

ctctcttttccgaaattggggt

attttccctggaaacaaagtgg

VMC6d12

0.88

0.88

0.89

15

0.19

93-145

-

50

caacagaattcaaatgaaatgga

caaacagcataaatacacaagga

VMC6g7

0.67

0.72

0.71

8.6

0.39

 

 

 

 

میانگین

Ta: دمای اتصال، LG: گروه لینکاژی، He: هتروزیگوسیتی مورد انتظار، PIC: محتوای اطلاعاتی نشانگر. گروه لینکاژی نشانگرهای VMC6g10 و VMC6g7 مشخص نمی­باشد.

 

 

این واکنش تکثیر در حجم 50 میکرولیتر انجام شد. چرخه­های حرارتی شامل 94 درجه سانتی­گراد (2 دقیقه)، 20 چرخه شامل واسرشته­سازی در 94 درجه (45 ثانیه)، اتصال در 60 درجه (30 ثانیه) و بسط در 72 درجه (1 دقیقه) و سپس مرحله بسط نهایی در 72 درجه به مدت 7 دقیقه بود. محصول تکثیر  اولیه به نسبت 50 : 1 با آب رقیق و برای تکثیر انتخابی استفاده شد. آغازگرهای ECOR1 با استفاده از ایزوتوپ Y32 p ATP نشان دار شدند. مخلوط تکثیر انتخابی به حجم نهایی 20 میکرولیتر، شامل 5/2 میکرو مخلوط رقیق شده تکثیر اولیه، 5 نانوگرم از آغازگر ECOR1 نشان دار شده، 30 نانو گرم از آغازگر MseI ، 200 میکرو مول از هر dNTP ، 5/0 واحد آنزیم Dynazyme П  و 1 میکرولیتر از بافر آنزیم بود. چرخه­های حرارتی در این مرحله نیز شامل دو دقیقه واسرشته سازی اولیه در 94 درجه سانتی­گراد و 36 چرخه شامل واسرشته­سازی در 94 درجه سانتی­گراد به مدت 30 ثانیه، اتصال در 65 درجه سانتی­گراد به مدت 30 ثانیه در چرخه اول و کاهش 7/0 درجه سانتی­گراد در 13 چرخه بعدی و 56 درجه سانتی گراد برای 23 چرخه دیگر و در نهایت بسط در دمای 72 درجه سانتی­گراد به مدت 60 ثانیه بود. 5/1 میکرولیتر از محصول پی­سی­آر با حجم مساوی از بافر بارگذاری (80 درصد فرمامید، گزیلن سیانول FF یک mg/ml، بروموفنل بلو یک mg/ml، EDTA 10 میلی مول، pH 8 ) مخلوط و به مدت 5 دقیقه در دمای 92 درجه سانتی­گراد واسرشته شد. بقیه مراحل همانند روش تجزیه ریز ماهواره­ها بود.

 

 

 جدول 3-  نام و توالی آغازگرهای AFLP مورد استفاده در تحقیق حاضر.

Table 3- Name and sequence of the AFLP primers used in current study.

آغازگرها        Primer

توالی          Sequence

M00

5’-GATGAGTCCTGAGTAA-3’

E00

5’-GACTGCGTACCAATTC-3’

E31

5’-GACTGCGTACCAATTCAAA-3’

E32

5’-GACTGCGTACCAATTCAAC-3’

E34

5’-GACTGCGTACCAATTCAAT-3’

E38

5’-GACTGCGTACCAATTCACT-3’

M31

5’-GATGAGTCCTGAGTAAAAA-3’

M32

5’-GATGAGTCCTGAGTAAAAC-3’

M34

5’-GATGAGTCCTGAGTAAAAT-3’

M36

5’-GATGAGTCCTGAGTAAACA-3’

M38

5’-GATGAGTCCTGAGTAAACT-3’

M39

5’-GATGAGTCCTGAGTAAAGA-3’

 

 



تجزیه و تحلیل داده‌ها

برای هر نشانگر ریزماهواره، آلل­ها در ژنوتیپ­های مورد بررسی به صورت a، b و c نامگذاری شدند. همچنین بر‌اساس نشانگر وزن مولکولی، اندازه و طول هر کدام از باندها محاسبه گردید و به هر نشانگر بسط داده شد. در روش AFLP هر ردیف باندی چند شکل به عنوان یک مکان یا نشانگر در نظر گرفته‌ شد. قطعات DNA تکثیری براساس هم‌ردیفی باندها و بصورت یک (حضور باند) و صفر (عدم حضور باند) امتیازبندی شد.  به منظور انجام تجزیه ارتباط و بررسی ارتباط داده­های ژنوتیپی حاصل از نشانگرهای ریزماهواره و AFLP و داده­های فنوتیپی ارقام انگور، و شناسایی نواحی ژنومی درگیر در کنترل آن‌ها از تجزیه رگرسیون گام به گام با استفاده از نرم افزار SPSS نسخه 19 استفاده شد.

  

نتایج و بحث

ارتباط نشانگرهای ریزماهواره­ای و صفات زراعی

تجزیه واریانس رگرسیونی رابطه معنی­داری بین تعدادی از نشانگرهای ریزماهواره و تمامی 14 صفت مورد مطالعه در ارقام انگور نشان داد. در کل 49 آلل از 18 نشانگر ریزماهواره ارتباط معنی­دار با تغییرات 14 صفت نشان دادند. وزن حبه و وزن گوشت هر کدام با 7 آلل بیشترین و صفات pH، اسید میوه، حجم آب میوه و درصد جوانه‌زنی گرده با یک آلل کمترین تعداد آلل مرتبط را تولید نمودند. همه 7 آلل مرتبط شناسایی شده برای صفات وزن حبه و وزن گوشت یکسان بودند و این آلل­ها به ترتیب 75 و 74 درصد تغییرات وزن حبه و وزن گوشت میوه را در ارقام انگور مورد بررسی تبیین نمودند.

همچنین 3 آلل مثبت مرتبط با وزن تک بذر و 5 آلل مثبت مرتبط با طول خوشه، حدود 60 درصد تغییرات این صفات را توجیه نمودند. کمترین میزان تغییرات تبیین شده توسط نشانگرهای مرتبط با به صفت pH میوه بود که حدود 9 درصد تغییرات را شامل می­شد. تعدادی از آلل­ها برای صفات مختلف مشترک بودند. به عبارت دیگر رابطه معنی­دار (مثبت یا منفی) با بیش از یک صفت داشتند (جدول 5). بعنوان مثال آلل i  جایگاه VMC6G7 دارای رابطه مثبت با صفات وزن حبه، وزن گوشت و تعداد بذر بود. آلل a جایگاه ISV4  دارای رابطه منفی با صفات تشکیل میوه و طول خوشه، آلل i در جایگاه VrZAG64 با صفات تشکیل میوه و عرض خوشه رابطه منفی و آلل b جایگاه VVMD25 برای صفات طول و وزن خوشه مشترک و دارای رابطه مثبت بودند. شناسایی نشانگرهای مشترک برای برخی صفات در این آزمایش احتمالا ناشی از اثرات پلیوتروپی و یا پیوستگی مکان­های مربوطه باشد (Jun et al., 2008). جایگاه VMC6G7 با بیشترین تعداد آلل مرتبط، دارای رابطه مثبت با pH میوه (آلل h )، وزن حبه، وزن گوشت میوه، تعداد بذر (آلل i) و عرض خوشه (آلل d) و رابطه منفی با طول خوشه (آلل m) بود. همچنین جایگاه VVMD8 با شش آلل مرتبط با صفات اندازه­گیری شده، دارای رابطه مثبت با وزن حبه و وزن گوشت (آلل h)، وزن تک بذر (آلل i)، درصد تشکیل میوه (آلل f) و جوانه‌زنی گرده (آللg) و دارای رابطه منفی با عرض خوشه (آلل n) بود. جایگاه ISV4 با 4 آلل مرتبط، رابطه منفی با صفات تعداد بذر (آلل d)، طول خوشه، درصد تشکیل میوه (آللa) و وزن خوشه (آلل f) نشان داد.

 

 

جدول4- ترکیبات آغازگری AFLP  مورد استفاده در تحقیق حاضر و خصوصیات آنها.

Table 4- AFLP primer combinations used in current study and their characteristics.

ترکیبات آغازگری

Primer combinations

مجموع باندها

Total bands

تعداد باندهای چند شکل

Number of polymorphic bands

تنوع ژنی

 Genic diversity

تعداد آللهای موثر

 Ne

E32-M38

36

27

0.263

1.53

E34-M34

41

9

0.074

1.121

E38-M36

80

34

0.168

1.297

E34-M38

62

17

0.1.6

1.191

E31-M32

112

48

0.133

1.234

E32-M31

59

24

0.161

1.286

E34-M39

69

26

0.13

1.224

میانگین

65.6

26.4

0.148

1.258

 


ارتباط نشانگرهای AFLP و صفات زراعی

تجزیه رگرسیون گام به گام، رابطه معنی­داری بین برخی نشانگرهای AFLP و صفات اندازه­گیری شده در ارقام نشان داد. از هفت جفت ترکیب آغازگری مورد استفاده، 49 باند رابطه معنی­داری با تغییرات 14 صفت نشان دادند. تعدادی از این باندها برای صفات مختلف مشترک بودند. چنانچه قبلا ذکر شد وجود نشانگرهای مشترک برای برخی صفات احتمالا ناشی از اثرات پلیوتروپی و یا پیوستگی مکان­های مربوطه باشد (Jun et al., 2008). وزن گوشت میوه با 11 نشانگر مرتبط بیشترین و صفات مواد جامد محلول، درصد تشکیل میوه، جوانه زنی گرده و عرض خوشه با یک نشانگر مرتبط کمترین تعداد نشانگرها را به خود اختصاص دادند (جدول 6).

 


جدول 5 – ضریب تبیین)  (R2   تصحیح شده و ضریب رگرسیون نشانگرهای SSR مرتبط با صفات زراعی در ارقام انگور.

Table 5- Adjusted R2 and regression coefficient of SSR markers associated with agronomical traits in grapevine varieties.

ضریب رگرسیون

Coefficient of regression

نشانگر مرتبط

Associated marker

R2 تصحیح شده

Adjusted R2

صفت Trait

0.48

VVMD27 (e*)

0.38

مواد جامد محلول 

-3.45

VVS2 (f)

 

Total soluble solids

-1.94

VVS2 (h)

 

 

0.32

VMC6G7 (h)

0.09

pH

0.37

VVMD5 (g)

0.17

میزان اسید میوه Acid content

1.08

VMC6G7 (i)

0.76

وزن حبه 

1.05

VVMD8 (h)

 

Berry weight

0.84

VVMD21 (d)

 

 

-1.6

ISV2 (j)

 

 

1.75

VVS4 (a)

 

 

-0.56

VMC6G7 (j)

 

 

1.04

VMC6G7 (i)

0.75

وزن گوشت

1.03

VVMD8 (h)

 

Fruit lobe weight

0.84

VVMD21 (d)

 

 

-1.59

ISV2 (j)

 

 

-0.56

VMC6G7 (j)

 

 

1.7

VVS4 (a)

 

 

0.10

VVMD8 (I)

0.61

وزن تک بذر

-0.02

ISV3 (b)

 

 Single seed weight

1.06

VMC6G7 (i)

0.55

تعداد بذر

0.64

ISV2 (f)

 

Seed numbers

-0.45

ISV4 (d)

 

 

4.23

VMC6G10(c)

0.16

حجم آب میوه Fruit water content

11.44

VrZAG62 (c)

0.48

درصد تشکیل میوه(گرده افشانی آزاد)

+11.4

VrZAG 64 (i)

 

Percentage of fruit production

21.2

VVMD8 (f)

 

 

-7.57

ISV4 (a)

 

 

16.8

VVMD8 (g)

0.24

جوانه زنی گرده Percentage of pollen germination

4.4

VrZAG 62 (j)

0.61

طول خوشه

2.77

VVMD25 (b)

 

Bunch length

-5.47

VMC6G7 (m)

 

 

2.99

VMC6D12 (f)

 

 

-2.6

ISV4 (a)

 

 

3.62

VMC6G7 (d)

0.38

عرض خوشه

-2.09

VrZAG 64 (i)

 

Bunch width

-3.65

VVMD8 (n)

 

 

183.52

VVMD25 (b)

0.45

وزن خوشه

-137.02

VrZAG 47 (c)

 

Bunch weight

-127.46

ISV4 (f)

 

 

19.8

VVMD21 (b)

0.48

درصد تشکیل میوه (کنترل شده)

12.4

VVMD25 ( c)

 

Percentage of fruit production

8.96

VVMD27 ( c)

 

(controlled)

30.4

VMC6G10 (b)

 

 

7.05

VVS2 (e)

 

 

6.07

VVMD5 (f)

 

 

   * حروف داخل پرانتز آلل‌های مرتبط با صفت در هر مکان ریزماهواره را نشان می‌دهد.


 


یازده نشانگر مرتبط شناسایی شده برای صفت وزن گوشت در مجموع 91 درصد تغییرات این صفت را در ارقام انگور تبیین کردند. همچنین 6 نشانگر مرتبط با pH میوه، 5 نشانگر مرتبط با وزن حبه و 5 نشانگر مرتبط با وزن تک بذر به ترتیب 68، 66 و 61 درصد از تغییرات کل این صفات را تبیین نمودند. کمترین میزان تغییرات توجیه شده (15 درصد) توسط یکی از نشانگرهای مرتبط با صفت مواد جامد محلول بود.

برخی از نشانگر های AFLP با چندین صفت رابطه معنی­داری داشتند. نشانگر شماره 56 مربوط به ترکیب آغازگری E31-M32 دارای رابطه مثبت با وزن حبه، وزن گوشت و وزن تک بذر بود. همچنین نشانگر شماره 38 حاصل از ترکیب آغازگری E38-M36 رابطه مثبت با مقدار اسید میوه و رابطه منفی با وزن گوشت نشان داد. نشانگر شماره 12 از همین ترکیب آغازگری دارای رابطه مثبت با وزن حبه و رابطه منفی با درصد تشکیل میوه در گرده افشانی آزاد بود. نشانگر 47 از آغازگرE34-M38  نیز رابطه منفی با وزن و گوشت حبه نشان داد. بیشترین و کمترین تعداد نشانگرهای AFLP مرتبط با صفات، به ترتیب مربوط به ترکیبات آغازگری E38-M36 (15 نشانگر مرتبط) و ترکیبات آغازگری E34-M35 و E34-M32 (یک نشانگر مرتبط) بود. از 15 نشانگر ترکیب آغازگری E38-M36، تعداد 7 نشانگر با 6 صفت رابطه مثبت نشان دادند. در بررسی ارتباط بین داده­های مولکولی و صفات زراعی در انگور گزارش شد که صفات اندازه حبه و خوشه با تنوع مولکولی همبستگی دارند (Siret et al., 2002). 

مطالعه حاضر اولین گزارش در استفاده از تجزیه ارتباط برای شناسایی نشانگرهای مرتبط با صفات مورفولوژیک در ارقام انگور ایرانی می­باشد. نتایج مطالعه حاضر و تحقیقات یاد شده نشان می­دهد که چنانچه از آغازگرهای بیشتر و جمعیت­های بزرگتر و متنوع­تری استفاده شود می­توان نشانگرهای دارای همبستگی بالا و قابل اعتماد با صفات مورد مطالعه را شناسایی و از آنها در پژوهش­های دیگر استفاده نمود. البته لازم است نشانگرهای مرتبط شناسایی شده در چنین مطالعاتی، در جمعیت­های بزرگ و همچنین در جمعیت­های در حال تفرق مورد آزمون قرار گیرد تا از پیوستگی آنها با صفات مربوطه اطمینان بعمل آید و بدین ترتیب کارآیی استفاده از این نشانگرها در برنامه­های اصلاحی افزایش یابد.                همچنین با توجه به اینکه اکثر نشانگرهای تولیدی توسط آغازگرهای مورد استفاده در این تحقیق بر روی صفات مورد مطالعه مؤثر بودند،

 

 


جدول 6- ضریب تبیین)  (R2   تصحیح شده و ضریب رگرسیون نشانگرهایAFLP مرتبط با صفات زراعی در ارقام انگور.

Table 6- Adjusted R2 and regression coefficient of associated AFLP markers with agronomical traits in grapevine varieties.

ضریب رگرسیون Coefficient of regression

نشانگر مرتبط  Associated marker

R2 تصحیح شده  Adjusted R2

صفت Trait

-2.19

E34-M39 (48)

0.16

مواد جامد محلول Total soluble solids

-0.24

E34-M38 (44)

0.68

pH

-0.444

E38-M36 (1)

 

 

-0.24

E34-M34 (20)

 

 

0.25

E31-M32 (34)

 

 

-0.245

E34-M38 (35)

 

 

-0.292

E34-M34 (34)

 

 

0.205

E34-M34 (36)

0.56

میزان اسید میوه

0.654

E38-M36 (38)

 

Acid content

0.371

E38-M36 (29)

 

 

-0.417

E32-M38 (23a)

 

 

-1.41

E34-M38 (47)

0.67

وزن حبه

-0.95

E34-M34 (7)

 

Berry weight

1.99

E31-M32 (56)

 

 

-0.695

E32-M38 (10a)

 

 

0.6

E38-M36 (12)

 

 

-1.14

E34-M38 (47)

0.92

وزن گوشت

1.57

E31-M32 (56)

 

Fruit lobe weight

-0.47

E32-M38 (26)

 

 

-0.67

E38-M36 (65)

 

 

-0.45

E34-M35 (2)

 

 

1.32

E31-M32 (39)

 

 

-1.72

E38-M36 (38)

 

 

-0.65

E34-M38 (21)

 

 

-0.44

E38-M36 (34)

 

 

-0.56

E31-M32 (15)

 

 

0.32

E38-M36 (66)

 

 

0.026

E38-M36 (63)

0.61

وزن تک بذر

0.019

E31-M32 (37)

 

Single seed weight

-0.017

E34-M39 (13)

 

 

0.058

E32-M38 (22a)

 

 

0.041

E31-M32 (56)

 

 

-0.871

E38-M36 (16)

0.39

تعداد بذر

-0.552

E34-M38 (84)

 

Seed number

6.1

E34-M38 (23)

0.32

حجم آب میوه

-5.2

E32-M38 (22)

 

Fruit water content

-10.43

E38-M36 (12)

0.19

درصد تشکیل میوه Percentage of fruit production

-16

E32-M38 (20)

0.18

جوانه زنی گرده  Percentage of pollen germination

3.7

E34-M32 (16)

0.61

طول خوشه

3.5

E38-M36 (58)

 

Bunch length

-8.9

E31-M32 (38)

 

 

-3.47

E38-M36 (29)

 

 

4.97

E32-M38 (25)

 

 

-3.43

E32-M38 (18)

0.23

عرض خوشه Bunch width

273.4

E34-M39 (50)

0.55

وزن خوشه

-185.9

E31-M32 (29)

 

Bunch weight

15.4

E38-M36 (15)

0.45

درصد تشکیل میوه

-15

E38-M36 (84)

 

Percentage of fruit production

-9.9

E32-M38 (27)

 

(controlled)

   * اعداد داخل پرانتز آلل‌های مرتبط با صفت در هر ترکیب آغازگری را نشان می‌دهد.


 

 

بنابراین احتمال دارد بتوان از این نشانگرها و آغازگرهای مربوط به آنها در برنامه­های اصلاحی انگور برای شناسایی والدین مناسب برای تهیه جمعیت­های نقشه­یابی و تولید ارقام هیبرید استفاده کرد. همچنین انجام چنین مطالعاتی می­تواند دانش پایه­ای در مورد ارقام انگور زراعی و ژنوتیپ­های ایرانی را بهبود بخشیده و در آینده راهگشا و راهنما برای برنامه­های اصلاحی انگور در کشور باشد.

 

 

 

منابع

Doligez A, Bertrand Y, Dias S, Grolier M, Ballester J, Bouquet A, This P (2010). QTLs for fertility in table grapevine (Vitis vinifera L.). Tree Genetics & Genomes 6: 413–422.

Doulati Baneh H, Mohammadi SA, Labra M, Nazemieh A, De Mattia F, Mardi M (2007). Chloroplast microsatellite markers to assess genetic diversity in wild and cultivated grapevines of Iran. Pakistan Journal of Biological Science 10: 1855-1859.

Fanizza G, Lamaj F, Costantini L, Chaabane R, Grando MS (2005). QTL analysis for fruit yield components in table grapevines (Vitis vinifera). Theorical Applied Genetics 111: 658-664

Grassi F, Labra M, Scienza A and Imazio S (2002) Chloroplast SSR markers to assess DNA diversity in wild and cultivated grapevine. Vitis 41: 157-158.

Gupta PK, Rustgi S, Kulwal PL (2005). Linkage disequilibrium and association studies in higher plants: Present status and future prospects. Plant Molecular Biology 57: 461-485

Janick J, James N (1996). Fruit Breeding. Vol.2: Vine and small fruit crops, John Wiley and sons, 471 pp.

Jun TH, Van K, Kim MY, Lee SH, Walker DR (2008). Association analysis using SSR markers to find QTL for seed protein content in soybean. Euphytica 62: 179-191.

Karami MJ (1996). Identification of grapevines of Kurdistan state. M.Sc. thesis, Agriculture Faculty of Tabriz University.

Labra M, Imazio S, Grassi F, Rossoni M, Citterio S, Sgorobati S, Sceinza A, Failla O (2003). Molecular approach to assess the origin of cv. Marzemino. Vitis 42: 137-140

Lodhi MA, Ye GN, Weeden NF, Reisch BI (1994). A simple and efficient method for DNA extraction from grapevine vine cultivars, Vitis species and Ampelopsis. Plant Molecular Biology Reporter 12: 6-13.

Laucou V, Lacombe T, Dechesne F, Siret R, Bruno JP, Dessup M, Dessup T, Ortigosa P, Parra P, Roux C, Santoni S, Varès D, Péros JP, Boursiquot JM (2011). High throughput analysis of grape genetic diversity as a tool for germplasm collection management. Theoretical and Applied Genetics 122: 1233–1245.

McGovern PE (2003). Ancient wine: The search of the origin of viticulture, Princeton University Press, New Jersey.

Sefc KM, Lopes MS, Lefort F,  Botta R, Roubelakis-Angelakis KA, Ibanez J, Pejic I, Wagner HW,  Glossl J, Steinkellner H (2000). Microsatellite variability in grapevine cultivars from different European regions and evaluation of assignment testing to assess the geographic origin of cultivars. Theoretical and Applied Genetics 100: 498-505.

Siret R, This P, Danzart M, Michel J (2002). Use of microsatellite markers for the analysis of genetic diversity in Vitis vinifera L.: correlation between molecular and agronomic data, Plant, Animal and microbe Genome Conference, January 12-16, Town and country center, San Diago, CA. 280 pp.

Vos P, Hogers R, Bleeker M, Reijans M, Van de lee T, Hornes M, Frijters A, Pot J, Peleman J, Kuliper M, Zabeau M (1995). AFLP: a new technique for DNA fingerprinting, Nucleic Acids Researchs 23: 4407-4414.

Zahedi B (1996). Identification of grapevines of Lorestan state. M.Sc. thesis, Agriculture faculty of Tehran University.

 

 

Association analysis for morphological traits in grapevine using SSR and AFLP markers

 

Dolati Baneh H.1, Mohammadi S.A.2, Abdollahi Mandoulakani B.*3, Rahmanpour S.4

 

 

1 Associate professor, Agricultural and Natural Resource Research center, West Azarbayejan, Urmia.

Professor, Department of Agronomy and Plant Breeding, Faculty of Agriculture, Tabriz University.

3Associate professor, Department of Plant Breeding and Biotechnology, Faculty of Agriculture, Urmia University.

4MSc student of Agricultural Biotechnology, Department of Plant Breeding and Biotechnology, Faculty of Agriculture, Urmia University.

 

Abstract

Grapevine (Vitis sp.), belongs to Vitaceae family, is one of the most important food sources in world because of its wide consumptions. In the current investigation, 22 SSR primer pairs and 7 AFLP primer combinations were used to identify molecular makers associated with 14 flower and fruit related traits in Iranian grapevine germplasm. The traits studied, included fruit water content, percentage of pollen germination, percentage of fruit production, bunch and berry weight, fruit lobe and single seed weight, bunch and yielding system length and width, total soluble solids, acid content and fruit pH. Stepwise regression analysis showed significant relationship between some SSR alleles and all 14 traits in grapevine varieties. In general, 49 alleles produced by 18 SSR primers, showed significant association with variation of 14 traits. The highest and lowest number of associated markers achieved for berry weight and fruit lobe weight each with 7 alleles and pH, fruit acid content, fruit water content and percentage of pollen germination each with 1 alleles, respectively. Significant association between polymorphism of AFLP markers and studied traits was also detected. Forty-nine AFLP fragments showed significant association with the variations of 14 traits. Some of the associated AFLP segments were common among different traits. The fruit lobe weight, with 11 associated markers and total soluble solids, percentage of fruit production, pollen germination and bunch width each with 1 associated marker, were the traits with the highest and lowest number of associated AFLP markers, respectively.

Keywords: Grapevine, Association Analysis, Morphological traits, Associated markers.

 

 

 

 

 



* نویسنده مسئول: بابک عبدالهی مندولکانی                            تلفن: 09122386990                         Email: b.abdollahi@urmia.ac.ir

* Corresponding Author: Abdollahi Mandoulakani B.             Tel: 09122386990        Email: b.abdollahi@urmia.ac.ir

Doligez A, Bertrand Y, Dias S, Grolier M, Ballester J, Bouquet A, This P (2010). QTLs for fertility in table grapevine (Vitis vinifera L.). Tree Genetics & Genomes 6: 413–422.
Doulati Baneh H, Mohammadi SA, Labra M, Nazemieh A, De Mattia F, Mardi M (2007). Chloroplast microsatellite markers to assess genetic diversity in wild and cultivated grapevines of Iran. Pakistan Journal of Biological Science 10: 1855-1859.
Fanizza G, Lamaj F, Costantini L, Chaabane R, Grando MS (2005). QTL analysis for fruit yield components in table grapevines (Vitis vinifera). Theorical Applied Genetics 111: 658-664
Grassi F, Labra M, Scienza A and Imazio S (2002) Chloroplast SSR markers to assess DNA diversity in wild and cultivated grapevine. Vitis 41: 157-158.
Gupta PK, Rustgi S, Kulwal PL (2005). Linkage disequilibrium and association studies in higher plants: Present status and future prospects. Plant Molecular Biology 57: 461-485
Janick J, James N (1996). Fruit Breeding. Vol.2: Vine and small fruit crops, John Wiley and sons, 471 pp.
Jun TH, Van K, Kim MY, Lee SH, Walker DR (2008). Association analysis using SSR markers to find QTL for seed protein content in soybean. Euphytica 62: 179-191.
Karami MJ (1996). Identification of grapevines of Kurdistan state. M.Sc. thesis, Agriculture Faculty of Tabriz University.
Labra M, Imazio S, Grassi F, Rossoni M, Citterio S, Sgorobati S, Sceinza A, Failla O (2003). Molecular approach to assess the origin of cv. Marzemino. Vitis 42: 137-140
Lodhi MA, Ye GN, Weeden NF, Reisch BI (1994). A simple and efficient method for DNA extraction from grapevine vine cultivars, Vitis species and Ampelopsis. Plant Molecular Biology Reporter 12: 6-13.
Laucou V, Lacombe T, Dechesne F, Siret R, Bruno JP, Dessup M, Dessup T, Ortigosa P, Parra P, Roux C, Santoni S, Varès D, Péros JP, Boursiquot JM (2011). High throughput analysis of grape genetic diversity as a tool for germplasm collection management. Theoretical and Applied Genetics 122: 1233–1245.
McGovern PE (2003). Ancient wine: The search of the origin of viticulture, Princeton University Press, New Jersey.
Sefc KM, Lopes MS, Lefort F,  Botta R, Roubelakis-Angelakis KA, Ibanez J, Pejic I, Wagner HW,  Glossl J, Steinkellner H (2000). Microsatellite variability in grapevine cultivars from different European regions and evaluation of assignment testing to assess the geographic origin of cultivars. Theoretical and Applied Genetics 100: 498-505.
Siret R, This P, Danzart M, Michel J (2002). Use of microsatellite markers for the analysis of genetic diversity in Vitis vinifera L.: correlation between molecular and agronomic data, Plant, Animal and microbe Genome Conference, January 12-16, Town and country center, San Diago, CA. 280 pp.
Vos P, Hogers R, Bleeker M, Reijans M, Van de lee T, Hornes M, Frijters A, Pot J, Peleman J, Kuliper M, Zabeau M (1995). AFLP: a new technique for DNA fingerprinting, Nucleic Acids Researchs 23: 4407-4414.
Zahedi B (1996). Identification of grapevines of Lorestan state. M.Sc. thesis, Agriculture faculty of Tehran University.