Regeneration of two commercial sugarcane cultivars (CP48-103 and CP69-1062) from terminal leaves derived explants

Document Type : Research Paper

Authors

Abstract

Sugarcane is one of the most important industrial plants. There are many ways to improve the agronomic traits of this plant, such as genetic engineering and gene transfer methods. These modern techniques depend on optimizing the regeneration of plants from callus tissue. In this study, we attempted to optimize all different stages of tissue culture for regenerating the plants from callus tissue derived from terminal roll lives of two commercial sugarcane cultivars, CP48-10 and CP69-1062. Two types of cutting were applied, ring cutting and half-cylinder cutting from roll leaves. Among these cutting types, ring cutting from the roll leaves gives better results. Using solid MS medium with 3 mg per liter 2,4-D could attain the maximum callus production. To produce shoots from callus, the hormone combination of  1 mg per liter BAP and 2 mg per liter Kinetin showed the best response. Seedlings produced in MS medium containing 5 mg per liter IBA, 1 mg per liter Kinetin and 3 mg per liter NAA accompanied by 3 g per liter activated charcoal rendered the most root production. In the treatments with activated charcoal, the regenerated seedlings had superiority for the traits, days to root emergence, root length and number of roots in plants.

Keywords


باززایی دو رقم تجاری نیشکر CP48-103 و CP69-1062 از ریزنمونه­های برگ انتهایی

 

صادق کلانترهرمزی1، محمدرضا سیاهپوش*2، حمید رجبی معماری2، حسن حمدی3، محمود شمیلی3، جمیل حمودی3

 

1دانشجوی کارشناسی ارشد اصلاح نباتات دانشکده کشاورزی دانشگاه شهید چمران اهواز.

2عضو هیئت علمی دانشکده کشاورزی دانشگاه شهید چمران اهواز.

3عضو هیئت علمی موسسه تحقیقات و آموزش توسعه نیشکر و صنایع جانبی خوزستان.

 

تاریخ دریافت: 26/10/1391، تاریخ پذیرش: 20/01/1393

 

چکیده

نیشکر یکی از مهم­ترین گیاهان صنعتی کشور است. با توجه به عدم گلدهی این گیاه در شرایط مزرعه­ای در مناطق نیشکرخیز ایران، مهندسی ژنتیک و استفاده از روش­های انتقال ژن از جمله راهکارهای مهم جهت بهبود صفات زراعی این گیاه است. استفاده از این تکنیک­ها در اصلاح نیشکر نیازمند بهینه­سازی باززایی این گیاه از بافتهای مختلف گیاهی از جمله برگ است. در این تحقیق تلاش شد تا کلیه مراحل کشت بافت دو رقم تجاری نیشکر CP48-10 و CP69-1062 از برگ­های پیچیده انتهایی ساقه بهینه­سازی شود. برای تهیه نمونه­های مناسب کشت، دو روش برش مورد بررسی قرار گرفت که روش برش استوانه از وسط، در مورد برگ­های پیچیده انتهایی نسبت به تهیه­ رینگ از نتایج بهتری برخوردار بود. استفاده از محیط کشت MS جامد با 3 میلی­گرم در لیتر هورمون 2,4-D بهترین نتایج را برای تولید کالوس در­پی داشت. به منظور تولید شاخساره از کالوس­ها، ترکیب هورمونی 1 میلی­گرم در لیتر BAP به همراه 2 میلی­گرم در لیتر کینتین بهترین پاسخ­دهی را داشت. گیاهچه­های تولید شده، در محیط MS حاوی 5 میلی­گرم در لیتر  IBA به همراه 1 میلی­گرم در لیتر کینتین و همین­طور تیمار 3 میلی­گرم در لیتر  NAAبه همراه 3 گرم در لیتر زغال فعال، بهترین شرایط برای ریشه­دهی را داشتند. در تیمارهایی که از زغال فعال استفاده شده بود، گیاهچه­های حاصل از نظر صفات اندازه­گیری شده شامل: زمان ریشه زایی، طول ریشه و تعداد گیاهان به ریشه رفته نتایج بهتری را نسبت به عدم استفاده از آن نشان دادند.

واژه­های کلیدی: باززایی، سترون­سازی، کالوس، کشت بافت، کینتین، نیشکر.


 


مقدمه

 امروزه نیشکر (Saccharum spp.) در بیش از 120 کشور جهان کشت می­شود و نقش مهمی را در اقتصاد کشاورزی ایفا می­کند. نیشکر نزدیک به 70 درصد شکر جهان را تأمین می­کند (Gallo-Meagher et al., 2000). به منظور انتقال ژن و تولید گیاهان زراعی با ویژگی­های جدید ژنتیکی، به تولید این گیاهان در شرایط درون شیشه ای نیاز است. تولید گیاهان کامل به تعداد زیادتر و در مدت زمان کوتاه­تر نسبت به شرایط طبیعی، از مزایای عمده کشت بافت گیاهی و لازمه فناوری مهندسی ژنتیک می­باشد (Cheng et al., 2001). این موضوع در بهبود ژنتیکی گیاه نیشکر که به روش غیرجنسی تکثیر می­یابد از اهمیت ویژه­ای برخوردار است (Liu and Chen, 1984; Krishnamurthi, 1986). در کشت بافت یک ریزنمونه در یک محیط غذایی مصنوعی و با غلظت­ها و ترکیبات مناسب هورمونی در شرایط استریل کشت می گردد. موفقیت در کشت بافت گیاهی وابسته به عوامل متعددی است که از جمله آنها می­توان به ژنوتیپ گیاه، نوع ریزنمونه، ترکیب محیط کشت و شرایط محیطی اشاره نمود (Ono et al., 1994). تحقیقات مختلفی با هدف تکثیر ژنوتیپ­های مختلف نیشکر از جوانه­های جانبی و یا باززایی از بافت کالوس مریستم انتهایی اجرا شده­اند (Sarvari and Hoseinzade, 2000؛  Ramin, 2003؛Daneshvar, 2007؛ Karim et al, 2002). در پژوهشی نشان داده شد که معمولاً قطعات کوچک بافت پینه (با وزن حدود 200 میلی­گرم) جهت انتقال به محیط باززایی مناسب­تر هستند، زیرا فقط سلول­های سطحی و زیرین بافت پینه که در تماس با محلول غذایی است باززایی می­شوند (Khalil, 2002). در مطالعه ­ای دیگر، تیمارهای مطلوب     کالوس­زایی و باززایی در واریته نیشکر Nayan معرفی شدند (Behera and Sahoo, 2009). بالاترین درصد کالوس تولیدی در محیط MS حاوی 5/2 میلی­گرم بر لیتر 2,4-D بدست آمد. بهترین پاسخ به باززایی با 2 میلی­گرم بر لیتر BAP به همراه 5/0 میلی­گرم بر لیتر  NAA مشاهده شد.

محققین نشان دادند که افزودن 3 میلی­گرم در لیتر 2,4-Dبه محیط کشت MS بهترین نتیجه را در تولید کالوس رقم تجاریCP73-21 می­تواند داشته باشد (Ali et al., 2008). پژوهشگرانی نیز موفق به تولید کالوس از هشت واریته مختلف نیشکر در محیط حاوی 3 میلی­گرم بر لیتر  2,4-D گردیده و سپس اقدام به باززایی کالوس­های حاصله بر روی محیط MS تغییر یافته به همراه 500 میلی­گرم در لیتر هیدورلیزات کازئین نمودند (Gandonou et al., 2005). در تحقیقی پاسخ به کشت بافت در دو رقم Co 86032 وCoJ 64  مطالعه شد. از بین نمونه­های مناسب تولید کالوس، بهترین نتایج از محیط کشتی شامل: 3 میلی­گرم در لیتر2,4-D، 10% آب نارگیل فیلترشده، 100 میلی­گرم در لیتر میواینوزیتول و 20 گرم در لیتر ساکارز بدست آمد (Arvinth et al., 2010). پژوهش­های انجام شده به منظور بهینه­سازی ریزازدیادی گیاه نیشکر در ایران اندک بوده و آزمایش­های انجام گرفته در کشورهای دیگر بیشتر بر روی ارقامی است که اکثراً در ایران کشت نمی­شوند (Ramin, 2005). هدف از این پژوهش بهینه­سازی مراحل کشت بافت از    برگ­های پیچیده انتهایی ساقه و بدست آوردن ترکیبات هورمونی و غذایی مناسب برای دو رقم تجاری CP48-103 و CP69-1062 است که در سطح وسیع در ایران کشت می­شوند.

 

مواد و روش ها

مواد گیاهی

در این پژوهش از قلمه­های دو رقم تجاری CP48-103 و CP69-1062 نیشکر استفاده شد. قلمه­ها از مزارع حاوی گیاهانی با طول عمر 6 تا 8 ماه برش داده شده و به آزمایشگاه انتقال یافتند. برگ­های اضافی چیده شده و بخشی از سر نی که حاوی مریستم انتهایی و برگ­های اطراف آن بود مورد استفاده قرار گرفت.

 

2-2- بهینه­سازی شستشو و سترون­سازی نمونه­ها و میزان آنتی­بیوتیک

به منظور بهینه­سازی روش شستشو و سترون­سازی، سر نی حاوی مریستم انتهایی به همراه برگ­های پیچیده انتهایی[1] با روش­های مختلف شستشو و با مواد سترون­ساز تیمار شدند و در محیط­های کشت­ حاوی آنتی­بیوتیک و بدون آنتی­بیوتیک قرار گرفتند. این بخش در طی یک آزمایش فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی با 8 تکرار و با 4 فاکتور به شرحی که در ادامه آمده است به اجرا در آمد: C) فاکتور ژنوتیپ شامل دو رقم 1-CP48-103 و 2- CP69-1062، W) فاکتور شستشو با آب شامل دو روش 1- شستشوی اولیه و سپس قراردادن زیر آب روان به مدت دو ساعت 2- شستشوی اولیه و سپس سه بار شستشو هربار دو تا سه دقیقه، S) فاکتور مواد سترون­ساز شامل سه ترکیب 1- کلرور جیوه با غلظت 700 میلی­گرم در لیتر، به مدت 12 دقیقه 2- هیپوکلریت سدیم 5/2% به مدت 10 دقیقه و سپس الکل 70% به مدت یک دقیقه 3- هیپوکلریت سدیم 5/2% به مدت 10 دقیقه، کلرورجیوه به مدت 12 دقیقه و سپس الکل 70% به مدت یک دقیقه و A) فاکتور آنتی­بیوتیک شامل صفر و 300 میلی­گرم در  لیتر آنتی­بیوتیک سفاتوکسیم در محیط کشت بودند.

لازم به ذکر است که بعد از هر مرحله اعمال تیمار، نمونه­ها سه بار با آب دوبار تقطیر استریل شستشو شدند و در تمام تیمارها آخرین مرحله شستشو در زیر هود انجام شد. سپس به منظور اطمینان از حذف اثرات مواد مورد استفاده در شستشو دو لایه برگی بطور مجزا جدا و شستشو شد و به محیط MS  حاوی 3 میلی­گرم در لیتر 2,4-D به همراه 30% ساکارز منتقل شدند. پس از انتقال ریزنمونه­ها به محیط کشت  کالوس­زایی، پتری­ها در محدوده دمایی 1 ± 26 درجه سانتی­گراد و در شرایط تاریکی قرار گرفتند.

بهینه­سازی نوع برش ریزنمونه­ها

به منظور بررسی تأثیر نوع برش نمونه­ها بر میزان کالوس­زایی، تحقیقی در طی آزمایش فاکتوریل در قالب طرح پایه کاملاً تصادفی با 2 فاکتور و 8 تکرار (پتری‌) طراحی و اجرا گردید. فاکتور­ها شامل فاکتور ژنوتیپ با دو سطح و فاکتور برش شامل: 1- برش رینگی به ضخامت 3 تا 5 میلی­متر 2- برش نیم استوانه­ای به ضخامت 2 تا 5/1 سانتی­متر بود. در هر پتری 10 عدد نمونه قرار گرفت و صفات درصد تولید کالوس، تعداد روز تا تولید کالوس و تعداد نمونه­های نکروزه شده شمارش و اندازه­گیری شدند.

 

بهینه­سازی ترکیب هورمونی برای تولید کالوس

2-4-1- غلظت بهینه 2,4-D

پنج غلظت متفاوت 2,4-D شامل 1، 2، 5/2، 3 و 5/3 میلی­گرم درلیتر محیط کشت در طی آزمایش فاکتوریل در قالب طرح پایه کاملاً تصادفی بر روی 2 ژنوتیپ نیشکر با 8 تکرار (پتری) مورد بررسی قرار گرفتند. برای محیط کشت پایه، محیط کشتی که حاوی محیط MS، 30 گرم ساکاروز، 500 میلی­گرم در لیتر کازئین بود که جهت جامدسازی از 7/0 درصد آگار استفاده شد (Sadat et al., 2008). هر تکرار شامل 10 نمونه از برگ­های پیچیده انتهایی بود که پس از سترون­سازی، برش و قرارگیری روی محیط، در دمای 1 ± 26 درجه سانتی­گراد و درشرایط تاریکی قرار داده شدند. صفات    اندازه­گیری شده در این آزمایش شامل تعداد روز تا ظهور کالوس و درصد تولید کالوس بود.

 

غلظت بهینه NAA+IBA

در آزمایشی دیگر هشت غلظت 1، 2، 3، 4، 5، 6، 7 و 8 میلی­گرم در لیتر از ترکیب   هورمون­های NAA و IBA به نسبت 1:1 استفاده شد. محیط کشت پایه در این آزمایش نیز محیط کشتی حاوی محیط MS، 30 گرم ساکاروز، 500 میلی­گرم در لیتر کازئین بود که جهت جامد سازی از 7/0 درصد آگار استفاده شد (Sadat et al., 2008). این آزمایش نیز بصورت فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی و با 6 تکرار (پتری) اجرا گردید. به­طوری ­که اثر غلظت­های مختلف هورمونی بر روی 2 ژنوتیپ CP48-103 و CP69-1062 مورد بررسی قرار گرفت. در هر پتری از 10 ریزنمونه استفاده شد و صفات تعداد روز تا ظهور کالوس، تعداد کالوس­ها و همچنین درصد نکروزه شدن اندازه­گیری شد.

 

بهینه­سازی محیط القاء ساقه از بافت کالوس

جهت باززایی گیاهچه از کالوس­های بدست آمده، محیط MS با 7 گرم آگار به همراه 30 گرم ساکاروز با یکی از 6 تیمار متفاوت هورمونی ارائه شده در جدول 1 استفاده شد. این آزمایش نیز بصورت فاکتوریل در قالب طرح کاملا تصادفی با 4 تکرار (گلدان شیشه‌ای کوچک) اجرا گردید. به­طوری­که اثر تیمارهای مختلف هورمونی بر روی 2 ژنوتیپ نیشکر بررسی شد. به منظور انجام این آزمایش، نمونه کالوس­های جنین­زایی که 25 روز از عمر آنها گذشته بود به محیط­های مورد آزمایش منتقل شده و در شرایط دمایی 1 ± 26 درجه سانتی­گراد و در مقابل نور قرار گرفتند. در طی انجام این آزمایش صفت تعداد روز تا ظهورساقه یادداشت برداری شد و پس از 7 هفته تعداد ساقه­های باززایی شده شمارش شدند.

 

 

 

 

بهینه­سازی محیط کشت برای تولید ریشه

گیاهچه­های حاصل از آزمایش قبل که دارای طولی حدود 3 تا 5 سانتی­متر بودند برای    ریشه­زایی به محیط کشت MS حاوی یکی از سطوح تیماری جدول 2 منتقل شدند. این بررسی طی آزمایش فاکتوریل در قالب طرح پایه کاملاً تصادفی با 4 تکرار (گلدان شیشه‌ای کوچک) اجرا شد و اثر ترکیبات مختلف محیط کشت بر  ریشه­دهی 2 رقم CP48-103 و CP69-1062 مطالعه شد. هر تکرار شامل 4 گیاهچه بود. بعد از گذشت 5 هفته تعداد گیاهان به ریشه­ رفته و طول ریشه­ها اندازه­گیری شد. در طی این مدت نیز تعداد روز تا ظهور ریشه­چه در هر گیاه یادداشت گردید.

 

 

جدول 1- ترکیب­ محیط­های کشت تولید گیاهچه از کالوس­های دو رقم تجاری نیشکر.

Table 1- Media Composition of seedling production from callus in two commercial sugarcane cultivars.

 منبع

Reference

ترکیب محیط کشت

Media culture composition

تیمار

Treatment

Ramin, 2003

MS + 30 g شکر + 7 g آگار +1  mg/l IBA

1

Sadat et al, 2008;

 Ather et al, 2009

MS + 30 g شکر + 7 g آگار +1  mg/l BAP + 0.2  mg/l  NAA

2

Ramanand et al, 2006

MS + 30 g شکر + 7 g آگار +1 mg/l  BAP +0.5  mg/l  NAA

3

Ramin, 2003

MS + 30 g شکر + 7 g آگار +1  mg/l BAP + 2  mg/l Kinetin

4

Hamudi et al, 2005;

 Biradar et al, 2009

MS + 30 g شکر + 7 g آگار +2  mg/l BAP

5

تحقیق حاضر

present study

MS + 30 g شکر + 7 g آگار +2  mg/l BAP + 2  mg/l Kinetin

6

 


جدول 2- ترکیب­ محیط­های کشت برای تولید ریشه از گیاهچه­های باززایی شده دو رقم تجاری نیشکر.

Table 2 - Media Composition for root production in regenerated seedlings of two commercial sugarcane cultivars.

منبع

Reference

ترکیب محیط کشت

Media culture composition

تیمار

Treatment

Hamudi et al, 2005

MS + 30 g شکر + 6.5 g آگار + 2  mg/l IBA+3 g/lزغال فعال

1

Ramin, 2003

MS + 30 g شکر + 6.5 g آگار + 5  mg/l IBA + 1 mg/l Kinetin+  3g/l زغال فعال

2

Ramin, 2003

MS + 30 g شکر + 6.5 g آگار + 2 mg/l NAA+  3g/lزغال فعال

3

Behera and Saho, 2009

MS + 30 g شکر + 6.5 g آگار + 3 mg/l NAA

4

تحقیق حاضر

present study

MS + 30 g شکر + 6.5 g آگار +3 mg/l NAA+  3  زغال فعال

5

Athers et al, 2009

MS + 30 g شکر + 6.5 g آگار + 3 mg/l GA3

6

تحقیق حاضر

present study

MS + 30 g شکر + 6.5 g آگار +3 mg/l GA3+  3 g/lزغال فعال

7

 


آنالیزهای آماری

تجزیه داده­ها با استفاده از نرم افزار آماری SAS انجام شد. پیش از انجام آنالیز واریانس دو فرض اصلی تجزیه واریانس شامل نرمال بودن توزیع داده­ها با کمک آزمون­های شاپیر-ویلک و کلموگروف-سمیرنوف و یکنواخت بودن واریانس خطاهای آزمایشی با کمک آزمون بارتلت بررسی شد. با توجه به شمارشی بودن داده­های بدست آمده، بر روی تمامی داده­ها تبدیل­ جذری انجام شد.

 

نتایج و بحث

شستشوی نمونه­ها

نتایج حاصل از تجزیه واریانس داده­ها (جدول 3) حاکی از تفاوت معنی­دار بین ارقام، روش­های سترون­سازی و سطوح آنتی­بیوتیک بود. تفاوت معنی­داری بین روش­های شستشو حاصل نشد. نتایج مقایسات میانگین بین توده­ها نشان داد که رقم CP48 با میانگین 59% دارای درصد آلودگی بالاتری نسبت به رقم CP96، با میانگین 28% درصد بود. در روش­های ضدعفونی، اولین روش دارای بالاترین میزان آلودگی (58%) بود. روش دوم و سوم ضدعفونی، به ترتیب با میانگین­های 38% و 8/35%، فاقد تفاوت معنی­دار بودند. این نتایج با داده­های تحقیقی انجام شده بر روی رقم CP73-21 نیشکر مطابقت داشت (Sadat et al., 2008). نتایج استفاده یا عدم استفاده آنتی­بیوتیک، تفاوت معنی­داری در سطح 1% را نشان داد. تیمارهای حاوی آنتی­بیوتیک با میانگین 3/22% آلودگی در مقایسه با میانگین 8/65% درصدی عدم استفاده از آنتی­بیوتیک، در گروه­های جداگانه­ای دسته­بندی شدند (شکل 1).

نتایج حاصل نشان داد که روش شستشوی  نمونه­ها چندان وابسته به ژنوتیپ و محل کشت ژنوتیپ مورد مطالعه نیست. در شستشوی   نمونه­ها، عدم وجود تفاوت معنی­دار به این معنی است که می­توان از تیمار دو ساعت زمان برای شستشو صرف نظر کرد و پس از 3 بار شستشوی عادی نمونه­ها، وارد مراحل بعدی سترون­سازی شد. از روش­های سترون­سازی، بین روش دوم و سوم تفاوتی دیده نشد. ولی با توجه به خطرات سمیت کلرورجیوه برای انسان و مشاهده    نمونه­های نکروزه شده در زمان استفاده از کلرور جیوه در بین نمونه­ها، استفاده از روش دوم سترون­سازی توصیه می­شود. تیمارهای استفاده و یا عدم استفاده از آنتی­بیوتیک سفاتوکسیم در محیط کشت به خوبی نشان دادند که استفاده از آنتی­بیوتیک برتری قابل توجهی نسبت به عدم استفاده از آن دارد.

 

نوع برش نمونه

در آزمایش نوع برش نمونه­ها جهت تولید کالوس، بین ارقام از نظر صفات اندازه­گیری شده تفاوتی دیده نشد. همان­طورکه در جدول 4 مشاهده می­شود، نوع برش در مورد دو صفت تعداد کالوس و تعداد روز تا تولید کالوس در سطح 1% تفاوت معنی­داری نشان دادند ولی برای دو صفت درصد کالوس جنین­زا و درصد نمونه نکروزه شده تفاوت حاصل، معنی­دار نبود. همچنین اثر متقابل برش در رقم در هیچ یک از صفات بررسی شده معنی­دار نبود. نتایج مقایسات میانگین نشان داد که از نظر صفت درصد تولید کالوس، روش برش نیم استوانه­ای با میانگین 4/96% نسبت به روش برش رینگی با میانگین 2/84% برتری داشت. همچنین در مورد صفت تعداد روز تا تولید کالوس، روش برش رینگی با میانگین 28/24 روز، طولانی­تر از برش         نیم­استوانه­ای با میانگین 5/18 روز بود.

همانطور­که ملاحظه می­شود برش        نیم­استوانه­ای نتایج بهتری را در تولید کالوس نشان داده است. علت این امر را می­توان به افزایش سطح مقطع برش­یافته در تماس با محیط نسبت داد. در این شرایط، نمونه بیشتر در تماس با محیط حاوی مواد غذایی قرار گرفته و میزان بیشتری از هورمون 2,4-D را دریافت می­کند (Thrope, 1981; Taiz and Zeiger, 1998). علاوه بر این بافت کالوس از محل زخم تولید می­شود و هرچه برش با سطح مقطع بزرگتر وجود داشته باشد حجم بافت کالوس تولید شده بیشتر خواهد بود. لازم به ذکر است که نمونه­های تهیه شده به صورت رینگ، قبل از استقرار روی محیط کشت به سرعت اکسید شده و دیگر برای ادامه کار کیفیت لازم را دارا نبودند در حالی که چنین حالتی کمتر در برش نیم­استوانه­ای مشاهده گردید.

 

 

 

 

جدول 3- جدول تجزیه واریانس بررسی میزان آلودگی بر اساس تیمارهای شستشو، سترون­سازی و آنتی­بیوتیک در دو رقم نیشکر. **، *وn.s به ترتیب تفاوت معنی­دار در سطح 1%، 5% و عدم تفاوت معنی­دار.

Table 3 - Analysis of variance for infection percentage based on washing, sterilization and antibiotics treatments in two varieties of sugarcane. **,* and n.s respectively significant at 1%, 5% and non-significant.

منبع تغییرات

 Source of variation

Df

میانگین مربعات

 Mean square

رقم (C)

1

**166.882

شستشو (W)

1

n.s 0.255

سترون­سازی (S)

2

**33.723

آنتی بیوتیک (A)

1

**328.13

C × W

1

**2.296

C × S

2

**52.286

C × A

1

n.s 1.171

W × S

2

**5.348

W × A

2

n.s 0.421

S × A

2

**16.598

W × S × A

2

**4.703

C × W × S

2

**3.39

C × W × A

1

n.s 0.421

C × S × A

2

**25.328

C × W × S × A

2

**9.203

خطا ( Error)

168

0.338

CV%

 

21.94

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 1- درصد آلودگی حاصل از روش­های مختلف شستشو، سترون­سازی و آنتی­بیوتیک در دو رقم نیشکر. W) فاکتور شستشو با آب (دو روش)، S) فاکتور مواد سترون­ساز (سه ترکیب)، A) فاکتور آنتی­بیوتیک (دو سطح) و C) فاکتور ژنوتیپ (دو رقم)

Figure 1 - Infection percentage of different sterilizing methods including washing, antibiotic and antiseptic materials in two genotypes of sugarcane. (W) Washing with water (two methods), (S) Sterilizing materials (three compounds), (A) Antibiotics (two levels) and (C) Genotypes (two genotypes).

 

جدول 4- جدول تجزیه واریانس صفات مختلف بر اساس تیمارهای نوع برش در دو رقم نیشکر. ** ، *وn.s به ترتیب تفاوت معنی­دار در سطح 1%، 5% و عدم تفاوت معنی­دار.

Table 4 - Analysis of Variance for different traits based on cutting methods in two varieties of sugarcane. * *,* and n.s respectively significant at 1%, 5% and non-significant.

روز تا تولید کالوس

Days to callus production

درصد نکروزه شدن

Necrotic percentage

 

درصد کالوس جنین زا

Percentage of embryogenic callus

درصد تولید کالوس

Percentage of callus production

Df

منبع تغییرات

Source of variation

n.s 0.035

n.s 0.001

n.s 0.00001

n.s 0.035

1

رقم (Cultivar)

** 234.32

n.s 0.0005

n.s 0.002

** 10.324

1

برش (Cutting)

n.s 0.892

n.s 0.0006

n.s 0.007

n.s 0.035

1

برش × رقم

 (Cutting ×Cultivar)

1.89

0.001

0.002

0.44

24

خطا ( Error)

6.43

8.28

5.34

7.34

 

CV%

 



آزمایش تعیین ترکیب هورمونی مناسب برای تولید کالوس

غلظت بهینه 2,4-D

در این آزمایش، صفت تعداد روز تا ظهور کالوس و درصد تولید کالوس بین ارقام تفاوت معنی­داری نشان نداد (جدول 5). بین سطوح هورمونی استفاده شده در هر دو صفت      اندازه­گیری شده تفاوت در سطح 1% معنی­دار بود. چنین اختلافاتی در مطالعه نیز گزارش شده است (Sarvari and Hoseinzade, 2000).

نتایج مقایسات میانگین به روش دانکن نشان داد که تیمار 3 میلی­گرم در لیتر 2,4-D  با 5/97% تولید کالوس به همراه تیمار 5/2 میلی­گرم در لیتر  2,4-Dبالاترین درصد کالوس­زایی را دارا بودند و در یک دسته قرار گرفتند. از نظر تعداد روز تا ظهور کالوس، تیمار هورمونی 1 میلی­گرم در لیتر دارای بیشترین تعداد روز تا ظهور کالوس بوده و کمترین تعداد روز، مربوط به غلظت 3 میلی­گرم در لیتر با میانگین 5/14 روز بود (شکل 2).

 

 

جدول 5- جدول تجزیه واریانس صفات درصد تولید کالوس و تعداد روز تا تولید کالوس در سطوح مختلف هورمون 2,4-D در دو رقم نیشکر. ** ، *وn.s به ترتیب معنی­دار در سطح 1%، 5% و عدم معنی­داری.

Table 5 - Analysis of variance for percentage of callus production and days to callus production at different 2,4-D levels. * *,* and n.s respectively significant at 1%, 5% and non-significant.

روز تا تولید کالوس

Days to callus production

درصد تولید کالوس

Percentage of callus production

Df

منبع تغییرات

Source of variation

n.s 11.25

6.05 n.s

1

رقم (Cultivar)

**551.26

**83.57

4

هورمون (Hormone)

n.s 3.65

n.s 2.57

4

هورمون× رقم

(C× H)

2.86

0.69

70

خطا (Error)

8.33%

11.54%

 

CV%

 

 

شکل 2- مقایسه میانگین (به روش دانکن) صفات در سطوح مختلف هورمون 2,4-D. A) تعداد روز تا تولید کالوس. B) درصد تولید کالوس.

Figure 2 – Mean comparisons (using Duncan test) for different traits at different levels of 2,4-D. A) Days to callus production. B) Percentage of callus production.

 

 

تیمار 3 میلی­گرم در لیتر از 2,4-D بهترین نتایج را دارا بود، اما در خیلی از موارد بین این سطح هورمونی و 5/2 میلی­گرم در لیتر، تفاوت معنی داری دیده نشد. در مواردی گزارش شده است که با افزایش سطح 2,4-D حجم کالوس بدست آمده افزایش می­یابد (Ramanand et al., 2006) ولی در پژوهش ما به دلیل از دست رفتن کالوس­ها و آلوده شدن آنها در زمان توزین، امکان ارزیابی حجم کالوس فراهم نگردید. باید به این نکته هم توجه داشت که با افزایش غلظت هورمون، احتمال وقوع تنوع سوماتیکی نیز بیشتر شده و گیاهان حاصل دارای ویژگی­های غیرعادی خواهند بود (Farsi and Zolala, 2003; Silvarolla, 1992; Damasco, 1996). زیرا این تنوع، مسیر طبیعی رشد، توسط مریستم­های بعدی را دنبال نکرده و گیاهانی که از کالوس باززایی می­شوند، مستعد تولید واریانت­های سوماکلونی هستند (Burner and Grisham, 1995). در این پژوهش با در نظر گرفتن موارد عنوان شده سطح 5/2 میلی­گرم در لیتر از هورمون2,4-D  به عنوان سطح مناسب انتخاب شد (شکل 3). در بعضی از منابع به دلیل نرم و آبدارشدن کالوس­های بدست آمده، استفاده از BAP به میزان کم توصیه شده است (Sadat et al., 2008) اما مشاهدات این تحقیق نشان داد که بعضی از نمونه­ها حتی تحت تأثیر غلظت­های کم این هورمون نیز به ساقه­دهی تحریک شدند به همین دلیل استفاده از این هورمون در مراحل بعد متوقف شد.

 

غلظت بهینه­ی NAA+IBA

نتایج تجزیه واریانس استفاده هم­زمان از دو هورمون NAA و IBA نشان داد که در دو صفت تعداد روز تا تولید کالوس و صفت تعداد کالوس تولیدی، تفاوت معنی­داری در فاکتورهای ارقام و هورمون دیده نشد و تنها ارقام استفاده شده در درصد نکروزه شدن متفاوت بودند (به دلیل عدم معنی­داری اکثر فاکتورها، از آوردن جدول تجزیه واریانس سطوح خودداری شد). نتایج مقایسات میانگین نشان داد که رقم CP69 با میانگین 4/29% نکروزه شدن نسبت به رقم CP48 با میانگین 3/18%، تفاوت معنی­داری در سطح 5% داشت. در مورد سطوح هورمونی اعمال شده نیز تنها در صفت درصد نکروزه شدن تفاوت   معنی­دار مشاهده شد. هیچ یک از سطوح هورمونیNAA  و IBA به تنهایی تولید کالوس نکردند.

در استفاده هم­زمان از دو هورمون اکسینی NAA و IBA، به دلیل عدم تولید کالوس در غلظت­های 1 تا 5 میلی­گرم در لیتر، این سطوح در تجزیه­های آماری وارد نشدند. در غلظت­های بالاتر هر چند که این مشکل تا حدی تعدیل گردید ولی باز هم تولید کالوس پایین بوده و درصد بالای نکروزه شدن مشاهده گردید. در نهایت سطح هورمونی 7 میلی­گرم در لیتر بالاترین پاسخ را داشت ولی همچنان بازدهی پایین این سطح هورمونی مانع از معرفی آن به عنوان تیمار هورمونی مناسب برای تولید کالوس از  ریزنمونه­ها شد. در غلظت­های بالای هورمونی اعمال شده در این آزمایش تنوعات رشدی مشاهده شد برای مثال در تیمارهای بالای 5 میلی­گرم در لیتر، تولید ریشه­های نابجا دیده شد.

در تحقیقی اثر دو نوع اکسین NAA و IBA‎ در غلظتهای 0،‏ 5/0 و 1 میلی­گرم در لیتر بر تولید کالوس نیشکر رقم NCO310 مورد مقایسه قرار گرفت (Daneshvar, 2007). بررسی­های آماری نشان داد که بین تاثیر اکسین­های IBA و NAA تفاوت معنی­داری بر تولید کالوس وجود داشت. همچنین غلظت­های مختلف اکسین IBA تفاوت معنی­داری بر تولید کالوس داشتند. در غلظت یک میلی­گرم در لیتر IBA در پایان هفته پنجم وزن­تر کالوس بطور معنی­داری نسبت به سایر تیمارها بیشتر بود که نتایج این پژوهش بر خلاف      داده­های حاصل از تحقیق حاضر است.

 

بررسی محیط برای باززایی ریزنمونه­ها

نتایج تجزیه واریانس صفات مختلف در جدول 6 آمده است. از لحاظ صفات تولید ساقه و باززایی از کالوس، بین ارقام تفاوت معنی­داری دیده نشد. تیمارهای هورمونی اعمال شده از نظر صفات روز تا ظهور ساقه و تعداد ساقه تولیدی به ترتیب در سطح 1% و 5% تفاوت معنی­دار نشان دادند. همچنین اثر متقابل هورمون و رقم در هیچ کدام از فاکتورهای اندازه­گیری شده معنی­دار نبود.

نتایج مقایسات میانگین نشان داد (شکل 3) که بالاترین تعداد روز تا ظهور ساقه مربوط به تیمار اول )1 میلی­گرم در لیترIBA) بود و کمترین تعداد روز تا ظهور ساقه در تیمار چهارم (1 میلی­گرم در لیترBAP  به همراه 2 میلی­گرم در لیتر کینتین) حاصل شد که این نتایج با پژوهش Ramin (2003) مطابقت دارد. از نظر تعداد ساقه­های تولیدی، بالاترین تعداد مربوط به تیمار چهارم با میانگین 5/4 عدد و کمترین تعداد در تیمار دوم ساقه­دهی، با میانگین 37/3 عدد بود. بین تیمارهای دوم، سوم و پنجم تفاوت      معنی­داری دیده نشد.

درضمن از نظر ظاهری و مشاهداتی، در بین تیمارهای اعمال شده، تیمار 1 میلی­گرم در لیتر BAP به همراه 2/0 میلی­گرم در لیتر NAA، کیفیت ساقه­دهی برتری نسبت به سایرین داشت. در پژوهشی برای باززایی رقم CP73-21 از بافت کالوس، همین ترکیب محیط کشت، بیشترین تأثیر را در باززایی به همراه داشت (Sadat et al., 2008) که با نتایج حاصل از این تحقیق مطابقت دارد.

با توجه به نتایج حاصله، از بین تیمارهای اعمال شده برای تولید ساقه، تیمار شماره چهار (1 میلی­گرم در لیتر BAP به همراه 2 میلی­گرم در لیتر کینتین) بهترین پاسخ را به باززایی داشت، که این نتایج با پژوهش Ramin (2003) مطابقت دارد. این تیمار از نظر تعداد روز تا ظهور ساقه کمترین تعداد روز و از نظر تعداد ساقه تولیدی دارای بیشترین تعداد بود. با توجه به دلایل ذکر شده، این تیمار به عنوان بهترین ترکیب هورمونی معرفی شد.

 

محیط کشت برای تولید ریشه

نتایج تجزیه واریانس تیمارهای تولید ریشه نشان داد (جدول 7) که بین ارقام استفاده شده، در صفات تعداد روز تا ظهور ریشه و بالاترین طول ریشه، در سطح 1% تفاوت معنی­داری دیده شد ولی از لحاظ تعداد گیاهان به ریشه ­رفته بین آنها تفاوتی وجود نداشت. در تمام فاکتورهای اندازه­گیری شده بین تیمارهای هورمونی اعمال شده تفاوت معنی­داری در سطح 1% دیده شد. در نتایج حاصل از مقایسات میانگین روز تا ظهور ریشه، رقم CP69 با میانگین 14/13 روز نسبت به رقم CP48 با میانگین 9/11 روز دیرتر تولید ریشه کرد.

تیمار اول (2 میلی­گرم در لیترIBA به همراه 3 گرم در لیتر زغال فعال) با میانگین 33/16 روز بیشترین و تیمار پنجم (3 میلی­گرم در لیتر NAA به همراه 3 گرم در لیتر زغال فعال) با میانگین 83/9 روز کمترین تعداد روز تا ظهور ریشه را دارا بودند. در مقایسات میانگین صفت بالاترین طول ریشه، رقم CP48 با میانگین 7/4 سانتی­متر، طول ریشه بلندتری از رقم CP69 داشت ولی از نظر تعداد ریشه بین دو واریته تفاوتی دیده نشد. تمیارهای 2 و 4 دارای بالاترین طول ریشه بودند و در گروهی جداگانه قرار گرفتند. در این مقایسه تیمار 1 کمترین طول ریشه را دارا بود. در این پژوهش بیشترین تعداد گیاهان به ریشه رفته در تیمارهای 5، 2 و 3 با میانگین 100% دیده شد.

از میان تیمارهای بررسی شده تیمار 5 میلی­گرم در لیتر  IBAبه همراه 1 میلی­گرم در لیتر  کینتین و 3 گرم در لیترزغال فعال، بلندترین طول ریشه را تولید کرد که این نتایج با مطالعه Ramin (2003) هم­خوانی داشت. این تیمار به همراه تیمار پنجم، (3 میلی­گرم در لیترNAA  به همراه زغال فعال) سریع­تر از سایرین به     ریشه­دهی رسید.


 

 

 جدول 6- جدول تجزیه واریانس صفات مرتبط با باززایی نمونه­های کالوس در دو رقم نیشکر تحت تیمارهای مختلف هورمونی.

 Table 6 - Analysis of variance for the traits related to regeneration of callus in two sugarcane cultivars and different hormone treatments.

تعداد ساقه

Number of Shoots

روزتا ظهور ساقه

Days to shoot production

Df

منبع تغییرات

Source of variation

n.s 0.33

n.s 2.08

1

رقم (Cultivar)

* 1.33

** 29.63

5

هورمون (Hormone)

n.s 0.03

n.s 1.36

5

هورمون × رقم

(Hormone×Cultivar)

0.37

2.37

36

خطا (Error)

15.97

4.49

 

CV%

** ، *وn.s به ترتیب معنی­دار در سطح 1%، 5% و عدم معنی­داری.

*, ** and n.s respectively significant at 1%, 5% and non-significant

 

 

شکل 3- مقایسه میانگین (به روش دانکن) تیمارهای مختلف هورمونی به منظور باززایی کالوس. A) تعداد روز تا ظهور ساقه B) تعداد ساقه. ترکیبات تیمارهای متفاوت هورمونی در جدول 1 آورده شده است.

Figure 3 – Mean comparisons (using Duncan test) of different hormone treatments for regeneration from callus. A) Days to shoot production. B) Number of Shoot. The combination of different hormone treatments is presented in table 1.

 

 

 

در تیمار پنجم نیز نتایج نزدیکی بدست آمد به همین دلیل این دو تیمار به عنوان بهترین ترکیب­های هورمونی برای تولید ریشه در دو رقم CP48 و CP69 معرفی شدند. در این آزمایش با وجود استفاده از تیمارهای برتر موجود در سایر آزمایشاتی که استفاده از اسید جیبرلیک­ به میزان 3 میلی­گرم در لیتر توصیه شده (Ather et al., 2009) و یا ترکیب محیط کشت ارائه شده در تحقیق دیگر (Behera and Sahoo, 2009)، با این حال نتایج مشابهی حاصل نشد که علت را می­توان به شرایط رشدی متفاوت و عکس العمل متفاوت ارقام موجود در کشور در مقابل ارقام استفاده شده در سایر پژوهش­ها نسبت داد.

 

افزودن زغال فعال به محیط کشت موجب جذب رنگ دانه­های سمی (سیاه و قهوه­ای) که از ترکیبات فنلی هستند، شده و در نتیجه ادامه رشد گیاهچه­ها را در محیط کشت امکان پذیر می­سازد (Heinz and Mee, 1969). البته بعضی از ترکیبات هورمونی از جمله اکسین­ها،   سیتوکینین­ها و برخی از ویتامین­ها و املاح مانند آهن و روی به وسیله زغال جذب می شوند. بنابراین، باید این مواد به مقدار کافی و مناسب در محیط کشت استفاده شوند (Pierik, 1997).

 

جدول 7- جدول تجزیه واریانس صفات مرتبط با تولید ریشه در دو رقم نیشکر تحت تیمارهای مختلف هورمونی.

Table 8 - Analysis of variance for the traits related to rooting of seedlings for two cultivars and different hormone treatments.

تعداد گیاهان به ریشه رفته

Number of seedlings producing root

 طول ریشه

Root length

روز تا ظهور ریشه

Days to root production

Df

منبع تغییرات

Source of variation

n.s 0.09

** 8.64

** 16.09

1

رقم(Cultivar)

** 1.32

** 0.709

** 44.35

6

هورمون(Hormone)

n.s 0.03

n.s 0.03

n.s 0.37

6

هورمون × رقم

(Hormone×Cultivar)

0.14

0.04

1.35

28

خطا(Error)

10.58

5.16

3.30

 

CV%

** ، *وn.s به ترتیب معنی­دار در سطح 1%، 5% و عدم معنی­داری.

*, ** and n.s respectively significant at 1%, 5% and non-significant.

 

 

شکل 4- اثرتیمارهای هورمونی متفاوت برصفات مختلف گیاهچه­ها در دو رقم تجاری نیشکر. A) روز تا ظهور ریشه. B) تعداد گیاهان به ریشه رفته. C) بالاترین طول ریشه. ترکیبات تیمارهای متفاوت هورمونی در جدول 2 آورده شده است.

Figure 4 – The effects of  hormonal treatments on different seedlings traits in two commercial varieties of sugarcane. A) Days to root production. B) Number of seedlings producing root C) Root length. The combination of different hormone treatments are presented in table 2.

 

 

از طرف دیگر، زغال فعال برخی از مواد مثل اتیلن تولید شده به وسیله گیاهچه درون شیشه را که می­تواند مانع ادامه رشد گیاهچه شود، جذب می­کند (Schenk and Hildebrandt, 1972; Thrope, 1981) و ضمناً استفاده از زغال فعال کمک می­کند تا هرچه بیشتر شرایط محیط کشت به شرایط گیاه در محیط خارج از شیشه شبیه شود که این مورد بعدها برای انتقال گیاه به محیط مزرعه می­تواند مفید بوده و استقرار اولیه گیاه را بهبود بخشد (Schenk and Hildebrandt, 1972). مراحل مختلف کشت بافت گیاه نیشکر در آزمایش اخیر را می‌توان در شکل 5 مشاهده کرد.

نتیجه­گیری نهایی

جمع­بندی نتایج حاصل از تحقیق حاضر نشان داد که بهترین روش سترون­سازی شامل مراحل سه بار شستشوی عادی (هر بار دو تا سه دقیقه) با آب جاری و سپس استفاده از هیپوکلریت سدیم 5/2%، الکل 70% و قرار دادن نمونه­ها روی محیط حاوی آنتی­بیوتیک سفاتوکسیم با غلظت 300 میلی­گرم در لیتر بود. نتایج نشان داد که درصد کالوس­های جنین­زا و درصد نکروزه شدن نمونه­ها تا حد زیادی مستقل از نوع برش بود و به ویژگی­های خود رقم و سایر شرایط کشت بستگی داشت. اما از لحاظ درصد تولید کالوس و تعداد روز تا تولید کالوس برش نیم استوانه­ای نسبت به برش رینگی بهترین نتیجه را بدست داد.

در تولید کالوس، غلظت 3 میلی­گرم در لیتر از هورمون 2,4-D بهترین نتایج را داشت. به دلیل ساقه­دهی زود­ هنگام کالوس­ها در محیط 2,4-D به همراه BAP، استفاده از هورمون BAP در این بخش متوقف شد. تیمار هورمونی NAA به همراه IBA دارای بازدهی بسیار پایین بوده و نمی­تواند جایگزین هورمون 2,4-D شود. تیمار 1 میلی­گرم در لیترBAP به همراه 2 میلی­گرم در لیتر کینتین بهترین نتایج را در باززایی از نمونه­ها نشان داد. در تولید ریشه از نمونه­های باززایی شده، تیمار 5 میلی­گرم در لیتر IBA به همراه 1 میلی­گرم در لیتر کینتین و همین­طور تیمار 3 میلی­گرم در لیتر NAA به همراه 3 ­گرم در لیتر زغال فعال به عنوان تیمارهای برتر انتخاب شدند. رعایت موارد عنوان شده به همراه بکارگیری ترکیب­های مناسب هورمونی و شرایط مناسب دمایی و دوره­های نوری دقیق، به محقق کمک می­کند تا درنهایت کشت بافتی با درصد     پاسخ­دهی بالا و با سرعت بیشتر در باززایی گیاه نیشکر از بافت کالوس داشته باشد.

 

سپاسگزاری

از آقایان مهندس کمال ارگانی و مهندس مصطفی مومن‌زاده شوشتری به دلیل همکاری در انجام این تحقیق، سپاسگزاری می‌شود. 

 

 

 

شکل 3- مراحل مختلف کشت بافت نیشکر. 1) ریزنمونه برگهای انتهایی بر روی محیط تولید کالوس 2) تولید بافت کالوس از ریزنمونه 3) ظهور جوانه­های حاصل از بافت کالوس در محیط القاء ساقه­زایی 4) تکثیر شاخساره درون شیشه 5) القاء ریشه­زایی در محیط 6) انتقال گیاهچه‌های مناسب به گلدان­های خاک تحت شرایط کنترل شده.

Figure 3 - Different stages of sugarcane tissue culture. 1) The terminal leaf explants on callus production medium, 2) Callus production of explants, 3) The germination of callus tissue on  shoot induction medium, 4) In vitro shoot proliferation, 5) Root induction in medium, 6) Transfer the seedlings to soil pots  under controlled conditions.

 

 

منابع

Ali A, Naz S, Siddiqui FA (2008). Rapid clonal multiplication of sugarcane (Saccharum officinarum L.) through callogenesis and organogenesis. Pakistan Journal of botany 40: 123-138.

Arvinth S, Arvinth J, Srikanth S, Arun RK, Selvakesavan N, Mukunthan MN, Premachandran P, Ananda Kumar N, Subramonian S (2010). Genetic transformation and pyramiding of aprotinin-expressing sugarcane with cry1Ab for shoot borer (Chilo infuscatellus) resistance. Plant Cell Reports 29: 383–395.

Ather A, Khan S, Rehman A, Nazir M (2009). Optimization of the protocols for callus induction, regeneration and acclimatization of sugarcane cv. thatta-10. Pakistan Journal of botany 41: 815-820.

Behera KK, Sahoo S (2009). Rapid In vitro Micro propagation of Sugarcane (Saccharumofficinarum L. cv-Nayana) Through Callus Culture. Journal of Nature and Science (ISSN) 7: 1545-0740.

Biradar S, Biradar DP, Patil VC, Patil SS, Kambar NS (2009). In vitro plant regeneration using shoot tip culture in commercial cultivar of sugarcane. Karnataka Journal of Agricultural Science 22: 21-24.

Burner DM, Grisham MP (1995). Induction and stability of phenotypic variation in sugarcane (Succharum spp.) as affected by propagation procedure. Crop Science 35: 875-880.

Cheng PK, Lakshmanan P, and Swarup S (2001). High frequency direct shoot regeneration and continuous production of rapid-cycling Brassicaoleracea in in vitro. In Vitro Cellular and Developmental Biology Plant 37: 592 598.

Damasco OP, Graham GC, Henry RJ, Adkins SW, Smith MK, Godwin ID (1996). Random amplified polymorphic DNA (RAPD) detection of dwarf off-types in micropropagated Cavendish (Musa spp. AAA) bananas. Plant Cell Reports 16: 118-123.

Daneshvar MH (2007). Modification of surface sterilization process and callus production from sugarcane vegetative organs (Saccharum officinarum). Journal of Agricultural Sciences 38: 267-275.

Farsi M, Zolala J (2003). Introduction to plant biotechnology. Ferdowsi university press. pp 495.

Gallo-Meagher M, English RG, Abouzid A (2000). Thidiazuron stimulates shoot regeneration of sugarcane embryogenic callus. In Vitro Cellular and Developmental Biology Plant 36: 37-40.

Gandonou C, Errabil TA, Idaomar M (2005). Effect of genotype on callus induction and plant regeneration from leaf explants of sugarcane. African Journal of Biotechnology 4: 1250-1255.

Hamudi J, Parvizi almani M, Bani Abasi N (2005). In vitro micropropagation of some commercial variety and promising clones of sugarcane using lateral and terminal buds and callus. Shekarshekan 100:15-26.

Heinz D J, Mee GWP (1969). Plant differentiation from callus tissue of Saccharum species. Crop Science 9: 346-348.

Karim MZ, Amin, MN, Hossain MA, Islam S, Hossin F, Alam R (2002). Micropropagation of two Sugarcane (Saccharum officinarum) varieties from callus culture.Iranian Journal of Agricultural Science 2: 682-685.

Khalil SM (2002). Regeneration via somatic embryogenesis and microprojectile-mediated co-transformation of sugarcane. Arab Journal of Biotechnology 5: 19-32.

Krishnamurthi M (1986). Sugarcane improvement through tissue culture process, American journal of Sugarcane Technology 29: 23-28

Liu MC, Chen WH (1984). Tissue and cell culture, an aid to sugarcane breeding-III. Highsucrose and vigorously growing cell clone 71-489. Tiawan Sugar 31: 77-84.

Ono Y, Takahata Y, Kaizuma N (1994). Effect of genotype on shoot regeneration from cotyledonary explants of rapeseed (Brassica napus L.). Plant Cell Reports 14:13-17.

Pierik RLM (1997). In vitro Culture of higher plants. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Netherland, pp143.

Ramanand N, Kureel N, Subhanand M, Lal S, Singh B (2006). Plantlet Regeneration Through Leaf Callus Culture in Sugarcane. Sugar Technology 8: 85-87.

Ramin AA (2003). In Vitro propagation of sugarcane (Saccharum officinarum). Science and Technology of Agriculture and Natural Resources 3: 41-49.

Sadat Sh, Bihamta M, Emam SA (2008). Effect of plant growth regulators on callus induction and regeneration of sugarcane variety CP73-21. Journal of Agricultural Sciences and Natural Resources 15: 47-54.

Sarvari M, Hoseinzade A (2000). Effect of genotype, tissue culture and explant on callus induction and plant regeneration in sugarcane. Journal of Agricultural Sciences 31: 211-220.

Schenk RU, Hilderandt AC (1972). Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures. Canada Journal of Botany 50: 199-204.

Silvarolla MB (1992). Plant genomic alterations due to tissue culture. Journal of Brazil. American Association for the Advancement of Science 44: 329-33.

Taiz L, Zeiger E (1998). Plant Physiology.2nd ed., Sinauer Associates, Inc. Publishers. Massachusetts.

Thrope TA (1981). Plant Tissue Culture: Method and Applications in Agriculture. Academic Press, N. Y., USA.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


Regeneration of two commercial sugarcane cultivars (CP48-103 and CP69-1062) from terminal leaves derived explants

 

Kalantarhormozi S.1, Siahpoosh M.R.*2, Rajabi Memari H.2, Hamdi H.3, Shomeili M.3, Hamoudi J.3  

 

1 MSc. Student, Agronomy and Plant Breeding Department, College of Agriculture, Shahid Chamran University of Ahwaz.

2 Assistant Professor, Agronomy and Plant Breeding Department, College of Agriculture, Shahid Chamran University of Ahwaz.

3 Research and Development Institute of Sugarcane Industry.

 

 

Abstract

Sugarcane is one of the most important industrial plants. There are many ways to improve the agronomic traits of this plant, such as genetic engineering and gene transfer methods. These modern techniques depend on optimizing the regeneration of plants from callus tissue. In this study, we attempted to optimize all different stages of tissue culture for regenerating the plants from callus tissue derived from terminal roll lives of two commercial sugarcane cultivars, CP48-10 and CP69-1062. Two types of cutting were applied, ring cutting and half-cylinder cutting from roll leaves. Among these cutting types, ring cutting from the roll leaves gives better results. Using solid MS medium with 3 mg per liter 2,4-D could attain the maximum callus production. To produce shoots from callus, the hormone combination of  1 mg per liter BAP and 2 mg per liter Kinetin showed the best response. Seedlings produced in MS medium containing 5 mg per liter IBA, 1 mg per liter Kinetin and 3 mg per liter NAA accompanied by 3 g per liter activated charcoal rendered the most root production. In the treatments with activated charcoal, the regenerated seedlings had superiority for the traits, days to root emergence, root length and number of roots in plants.

 

Key words: Regeneration, Sterilization, Callus, Tissue culture, Kinetin, Sugarcane.

 

 



* نویسنده مسئول: محمدرضا سیاهپوش                      تلفن: 06133364056                                             Email: siahpoosh@scu.ac.ir

[1]- Roll leaf

* Corresponding Author: Siahpoosh M.R.               Tel: 06133364056            Email: siahpoosh@scu.ac.ir

 

 
Ali A, Naz S, Siddiqui FA (2008). Rapid clonal multiplication of sugarcane (Saccharum officinarum L.) through callogenesis and organogenesis. Pakistan Journal of botany 40: 123-138.
Arvinth S, Arvinth J, Srikanth S, Arun RK, Selvakesavan N, Mukunthan MN, Premachandran P, Ananda Kumar N, Subramonian S (2010). Genetic transformation and pyramiding of aprotinin-expressing sugarcane with cry1Ab for shoot borer (Chilo infuscatellus) resistance. Plant Cell Reports 29: 383–395.
Ather A, Khan S, Rehman A, Nazir M (2009). Optimization of the protocols for callus induction, regeneration and acclimatization of sugarcane cv. thatta-10. Pakistan Journal of botany 41: 815-820.
Behera KK, Sahoo S (2009). Rapid In vitro Micro propagation of Sugarcane (Saccharumofficinarum L. cv-Nayana) Through Callus Culture. Journal of Nature and Science (ISSN) 7: 1545-0740.
Biradar S, Biradar DP, Patil VC, Patil SS, Kambar NS (2009). In vitro plant regeneration using shoot tip culture in commercial cultivar of sugarcane. Karnataka Journal of Agricultural Science 22: 21-24.
Burner DM, Grisham MP (1995). Induction and stability of phenotypic variation in sugarcane (Succharum spp.) as affected by propagation procedure. Crop Science 35: 875-880.
Cheng PK, Lakshmanan P, and Swarup S (2001). High frequency direct shoot regeneration and continuous production of rapid-cycling Brassicaoleracea in in vitro. In Vitro Cellular and Developmental Biology Plant 37: 592 598.
Damasco OP, Graham GC, Henry RJ, Adkins SW, Smith MK, Godwin ID (1996). Random amplified polymorphic DNA (RAPD) detection of dwarf off-types in micropropagated Cavendish (Musa spp. AAA) bananas. Plant Cell Reports 16: 118-123.
Daneshvar MH (2007). Modification of surface sterilization process and callus production from sugarcane vegetative organs (Saccharum officinarum). Journal of Agricultural Sciences 38: 267-275.
Farsi M, Zolala J (2003). Introduction to plant biotechnology. Ferdowsi university press. pp 495.
Gallo-Meagher M, English RG, Abouzid A (2000). Thidiazuron stimulates shoot regeneration of sugarcane embryogenic callus. In Vitro Cellular and Developmental Biology Plant 36: 37-40.
Gandonou C, Errabil TA, Idaomar M (2005). Effect of genotype on callus induction and plant regeneration from leaf explants of sugarcane. African Journal of Biotechnology 4: 1250-1255.
Hamudi J, Parvizi almani M, Bani Abasi N (2005). In vitro micropropagation of some commercial variety and promising clones of sugarcane using lateral and terminal buds and callus. Shekarshekan 100:15-26.
Heinz D J, Mee GWP (1969). Plant differentiation from callus tissue of Saccharum species. Crop Science 9: 346-348.
Karim MZ, Amin, MN, Hossain MA, Islam S, Hossin F, Alam R (2002). Micropropagation of two Sugarcane (Saccharum officinarum) varieties from callus culture.Iranian Journal of Agricultural Science 2: 682-685.
Khalil SM (2002). Regeneration via somatic embryogenesis and microprojectile-mediated co-transformation of sugarcane. Arab Journal of Biotechnology 5: 19-32.
Krishnamurthi M (1986). Sugarcane improvement through tissue culture process, American journal of Sugarcane Technology 29: 23-28
Liu MC, Chen WH (1984). Tissue and cell culture, an aid to sugarcane breeding-III. Highsucrose and vigorously growing cell clone 71-489. Tiawan Sugar 31: 77-84.
Ono Y, Takahata Y, Kaizuma N (1994). Effect of genotype on shoot regeneration from cotyledonary explants of rapeseed (Brassica napus L.). Plant Cell Reports 14:13-17.
Pierik RLM (1997). In vitro Culture of higher plants. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Netherland, pp143.
Ramanand N, Kureel N, Subhanand M, Lal S, Singh B (2006). Plantlet Regeneration Through Leaf Callus Culture in Sugarcane. Sugar Technology 8: 85-87.
Ramin AA (2003). In Vitro propagation of sugarcane (Saccharum officinarum). Science and Technology of Agriculture and Natural Resources 3: 41-49.
Sadat Sh, Bihamta M, Emam SA (2008). Effect of plant growth regulators on callus induction and regeneration of sugarcane variety CP73-21. Journal of Agricultural Sciences and Natural Resources 15: 47-54.
Sarvari M, Hoseinzade A (2000). Effect of genotype, tissue culture and explant on callus induction and plant regeneration in sugarcane. Journal of Agricultural Sciences 31: 211-220.
Schenk RU, Hilderandt AC (1972). Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures. Canada Journal of Botany 50: 199-204.
Silvarolla MB (1992). Plant genomic alterations due to tissue culture. Journal of Brazil. American Association for the Advancement of Science 44: 329-33.
Taiz L, Zeiger E (1998). Plant Physiology.2nd ed., Sinauer Associates, Inc. Publishers. Massachusetts.
Thrope TA (1981). Plant Tissue Culture: Method and Applications in Agriculture. Academic Press, N. Y., USA.