Document Type : Research Paper
Authors
Abstract
Keywords
بررسی EST های گندم در برهمکنش با قارچ بیمارگر Mycosphaerella graminicola
جلال غلامنژاد1، فروغ سنجریان2، ابراهیم محمدی گلتپه*3، ناصر صفایی4، خدیجه رضوی5
1دانشجوی دورۀ دکتری بیماریشناسی گیاهی، دانشگاه تربیت مدرس
2استادیار پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری
3استاد دانشکدۀ کشاورزی دانشگاه تربیت مدرس، بخش بیماریشناسی گیاهی
4دانشیار دانشکدۀ کشاورزی دانشگاه تربیت مدرس، بخش بیماریشناسی گیاهی
5استادیار پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری
تاریخ دریافت: 28/12/1392، تاریخ پذیرش: 24/07/1393
چکیده
در این مطالعه، 10438 EST که در پایگاه NCBI در رابطه با تعامل گندم و بیمارگر Mycosphaerella graminicola (فرم غیرجنسی Zymoseptoria tritici) ثبت شده بودند، استخراج شدند. پروتئینهای غیر تکراری و مرتبط با EST ها در بانک اطلاعاتی NCBI توسط نرم افزار SEQtoolsبه دست آمدند. این پروتئین ها بر اساس نوع، طبقه بندی شده و در 279 گروه قرار گرفتند. سپس در سایتKEGG ، مسیر 112 عدد از این پروتئینها تجزیه و تحلیل و 55 مسیر شناسایی و ارتباط بین این مسیرها و پاسخهای دفاعی گندم مورد بررسی قرار گرفت. در ادامه این مسیرها بر اساس عملکرد گروهبندی شده و در هشت گروه عملکردی (شامل پروتئینهای دفاعی، پروتئینهای درگیر در فرایند انرژی سلولی، پروتئینهای درگیر در فرایند متابولیسم سلولی، پروتئینهای درگیر در فرایند پردازش پروتئینها، پروتئینهای درگیر در فرایند پردازش RNA، پروتئینهای درگیر در چرخههای سلولی، پروتئینهای درگیر در تخریب پروتئینها و پروتئینهای درگیر در فرایند سیگنالدهی سلولی) قرار گرفتند. مسیرهای متابولیکی تثبیت کربن در فرایند فتوسنتز و پروتئینهای درگیر در فرایند دفاعی به ترتیب با دارا بودن 745 و 251 EST، در مرتبۀ اول و دوم قرار داشتند.. سپس نقش ESTها مخصوصاً آنهایی که در مسیرهای دفاعی گیاهی درگیر بودند به صورت موردی مطالعه شدند و عملکرد آنها در مسیر دفاع گیاه گندم مشخص شد. با استفاده از اطلاعاتی که این بررسی در اختیار قرار میدهد میتوان ژنهای دیگری که به طور مستقیم و همچنین غیر مستقیم در فعالیتهای دفاعی گیاهی شرکت میکنند، مورد بررسی قرار داد.
کلمات کلیدی: گندم، KEGG، NCBI، SEQtools، EST، Mycosphaerella graminicola.
مقدمه
بیماری لکهبرگی سپتوریایی گندم ناشی از Mycosphaerella graminicola (Fuckel) (آنامورفZymoseptoria tritici ) (Quaedvlieg, et al., 2011) از مهمترین بیماریهای این محصول درجهان میباشد که سالیانه خسارات فراوانی را وارد میسازد (Darestani Farahani et al., 2009). این بیماری از جمله عوامل محدود کننده گندم بهویژه در سالهای اخیر بوده است. استفاده از ارقام مقاوم مؤثرترین، اقتصادیترین و سالمترین روش از نظر زیستمحیطی برای کنترل این بیماری به شمارمی رود (Gilchrist et al., 1999). در پژوهشی Brading et al. (2002) با بررسی مقاومت اختصاصی چند رقم گندم حساس و مقاوم و ژنهای کنترل کننده مقاومت آنها در مقابل جدایههای عامل بیماری لکه برگی سپتوریایی، رابطه ژن برای ژن را بین مقاومت اختصاصی گندم و بیماریزایی M. graminicola مورد تأکید قراردادند (Brading et al., 2002).
تا سال 2009، بیش از 45 میلیون Expressed Sequence Tag (EST) متعلق به بیش از 1400 گونه مختلف از موجودات یوکاریوت ایجاد شده است. غالباً، زمانی از اطلاعات حاصل ازEST ها استفاده میشود که پروژه ژنوم موجود مورد مطالعه، بطور کامل به پایان نرسیده است، همچنین ازEST ها به عنوان راهی کم هزینه برای کشف ژنهای جدید میتوان بهره برد. از این ESTها میتوان در زمینههای فیلوژنتیک، پروفایل بیانی ژنها و پروتئومیکس نیز استفاده کرد (Parkinson and Blaxter, 2009).
بر اساس اطلاعات موجود، تا سال 2012، تعداد 1318964 EST در پایگاه بانک ژن مربوط به جنس Triticumsp، و تعداد 1286060 EST مربوط به گونۀ T. aestivum ثبت شده است http://avena.pw.usda.gov/genome)).
با تجمع انبوه اطلاعات EST، پایگاه TIGR در بخش Gene Index و زیر بخش Wheat وظیفه تجزیه، تحلیل و جمع‌بندی و بالاخره قابل مشاهده و بازیابی نمودن این اطلاعات را بر عهده گرفته، در این پایگاه ابتدا توالیهای EST و همچنین ET با یکدیگر در یک ردیف (Align) قرار میگیرند تا به توالیهای مشترکی دست یابند که آنها را توالیهای توافق پیشنهادی یا TC (Tentative consensus) نامیده‌‌اند (Majidian et al. 2011). برای سرهم کردن هر دو توالی کافی است ۹۵ درصد همسانی در توالی مشترکی به طول ۴۰ نوکلئوتید یافت شود. اطلاعات مربوط به عملکرد ژنها، در بانک اطلاعات PATHWAY ذخیره شدهاند، این بانکهای اطلاعاتی محتوی اشکال گرافیکی از فرایندهای سلولی، نظیر متابولیسم، پردازش اطلاعات ژنتیکی، پردازش اطلاعات محیطی هستند (Ogata et al., 1999).
در مطالعهای برهمکنش گیاه گندم و Fusarium graminearum در مراحل ابتدایی بیماری با استفاده از ساخت کتابخانۀ cDNA و بررسی EST ها، بررسی شد. در این مطالعه نشان داده شد که در توسعه اولیه بیماری، بیان هشتاد و چهار ژن قارچی افزایش مییابد. عملکرد احتمالی 49 عدد از این ژنها با تجزیه و تحلیل بیوانفورماتیک مشخص شد. برای سی و پنج عدد از این EST ها هیچ همولوگی در پایگاه داده مورد شناسایی قرار نگرفت. احتمالاً این ESTهای ناشناخته، نشان دهنده ژنهایی از graminearum F. هستند که قبلاً شناخته نشدهاند. چهار ژن موجود در یکی از این کتابخانه‌ها برای جایگزینی هدفمند ژن انتخاب شدند. تحقیق مذکور منجر به شناسایی یک همولوگ دو جزئی از تنظیم کننده پاسخهای درگیر در بیماریزایی قارچ شد. جهش در این ژن منجر به کاهش اسپورزایی و تاخیر در گسترش بیماری سوختگی خوشه قارچ در گندم شد (Goswami et al., 2006).
پژوهشی توسط Dracatos et al., (2006) باعنوان توصیف مارکرهای EST-SSR در مورد بیماری زنگ طوقۀ گیاه چاودار با عامل Puccinia coronata f.sp. lolii انجام شد. آنها از نشانگرهای مولکولی تکرار توالی ساده در ارتباط با ژن (SSR) برای مطالعۀ تنوع ژنتیکی عامل بیماری زنگ طوقه استفاده کردند. آنالیز 1100 توالی EST که از یک کتابخانه cDNA مربوط به یوریدیوسپور به دست آمد، منجر به شناسایی 55 لوکوس SSR شد. زیر مجموعهای از 12 نشانگر قوی EST –SSR برای بررسی تنوع بیمارگر که از مناطق مختلف جمع آوری شده بود، مورد استفاده قرار گرفت. آنها نشان دادند که نشانگر EST -SSR در مورد بیماری زنگ میتواند برای گونههای قارچی نزدیک و همچنین جنس Puccinia spp.و دیگر قارچهای رشتهای مناسب باشد (Dracatos et al., 2006).
در مطالعۀ حاضر، ESTهای گندم در برهمکنش با قارچ بیمارگر Mycosphaerella graminicola، که قبلاً ساخته شده و در پایگاه بانک ژن NCBI ثبت شده بودند، مورد بررسی قرار گرفته است. در مرحلۀ ابتدایی بعد از گردآوری و ذخیرۀ ESTها، ژنهای متناظر با هر EST مورد شناسایی قرار گرفتند. بعد از شناسایی این ژنها، مسیرهایی که این ژنهای شناخته شده در آنها شرکت میکنند، مورد ارزیابی قرار گرفتند. در نهایت ارتباط این مسیرها با تنش این بیمارگر بررسی شدند.
مواد و روش ها
ابتدا در پایگاه NCBI ، ESTهایی که در بر همکنش قارچ M. graminicola و گیاه گندم ثبت شده بودند، مورد جستجو قرار گرفتند. در مورد این تنش پنج نمونه (Sample) در قسمت BioSample (Biological Baterial Descriptions) یافت شدند. این پنج نمونه مربوط به دو گروه تحقیقاتی مختلف بود. بیوسمپل 1 مربوط به صداقت فر و همکاران بود که در سال 2011 (EST: LIBEST_027453) با تعداد 32 EST در پایگاه NCBI ثبت شده بودند. بیوسمپل 2، 3، 4 و 5 مربوط به Tingey و همکاران در سال 2002 (EST: LIBEST_012193; EST: LIBEST_012194; EST: LIBEST_012201; EST: LIBEST_012202) بود که هر کدام به ترتیب دارای 2041، 2929، 2761 و 2675 EST بودند. این تعداد EST که مربوط به هر بیوسمپل بود به صورت دسته جمعی با فرمت FASTA ذخیره شدند. در نهایت اطلاعات توالی 10438 EST به صورت پنج فایل جداگانه به دست آمد.
همۀ EST های جمع آوری شده در مرحلۀ قبل، در پایگاه TIGR یا Computational Biology and Functional Genomics Laboratoary وارد شدند، با استفاده از اطلاعات موجود در این پایگاه توالی توافقی یا TC متناظر اکثر ESTها به دست آمد. سپس با استفاده از جستجوگر BLASTx ژنهای مربوط به این توالیهای توافقی بررسی شدند.
از نرم افزار Seqtools نیز جهت به دست آوردن پروتئینهای متناظر توالیهای EST استفاده شد. با انجام این عملیات مشخص شد که از 10438 توالی EST ، 3668 توالی دارای پروتئین متناظر هستند. این تعداد از EST ابتدا بر اساس نوع پروتئینها دستهبندی شده و با حذف پروتئینهای تکراری در 279 دسته قرار گرفتند. این پروتئینها در سایت KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) وارد شدند تا مسیرهایی که این پروتئینها در آنها شرکت میکنند مورد بررسی قرار گیرند. در نهایت از 279 پروتئین، 112 عدد در این پایگاه دارای مسیر (Pathway) بودند. بعضی از پروتئینها مانند پروتئینهای وابسته به بیماریزایی (PR-Proteins) دارای مسیر مشخصی در پایگاه نبودند.
در نهایت مسیرهایی که پروتئینهای شناخته شده در آنها شرکت میکنند با استفاده از پایگاه (KEGG) شناسایی شده و ارتباط بین این مسیرها با یکدیگر و همچنین با تنش بیمارگر مورد بررسی قرار گرفتند.
نتایج و بحث
طبقه بندی ژنها از نظر عملکرد
بیش از 95% از EST ها دارای توالیهای توافقی در پایگاه TIGR بودند، در نتیجه نیاز به همردیف سازی اینESTها و ساخت کانتیگ و یافتن سینگلتونها نبود. 46% از EST های جمع آوری شده (3668) بعد از جستجوی بلاست دارای پروتئینهای متناظر بودند. بر اساس نتایجی که از بررسی پروتئینها با استفاده از نرمافزار Seqtools به دست آمد پروتئینهای مورد مطالعه در 279 دسته قرار گرفتند. سپس این 279 دسته بر اساس عملکرد در داخل سلول طبقه بندی شده و در 21 گروه قرار گرفتند (شکل 2).
|
خروجی |
|
پروتئین های متناظر با هر EST Corresponding protein
|
|
10438 EST مربوط به برهمکنش گندم و بیمارگر سپتوریا 10438 EST of wheat-pathogen Septoria interactions |
|
نرم افزار Seqtools
|
|
KEGG |
|
مسیرهایی که این پروتئین های در آن ها شرکت می کنند. Protein pathway |
|
داده های ورودی |
|
ورودی |
|
خروجی |
|
Output |
|
Output |
|
Input data |
|
Input data |
شکل 1- مسیر پردازش اطلاعات در این تحقیق (برای مطالعۀ جزئیات هر بخش به متن مراجعه شود).
Figure 1- Data processing pathway in this study (See text for more information)
شکل 2- طبقه بندی پروتئینهای به دست آمده از بررسی ESTهای گندم در برهمکنش با بیمارگرM. graminicola از نظر عملکرد.
Figure 2- Functional classification of predicted proteins based on ESTs involving in M. graminicola and wheat interaction
بر اساس نتایج حاصل از نرمافزار Seqtools حاصل از بررسی 3668 EST که دارای پروتئین متناظر بودند این پروتئینها در 279 گروه قرار گرفتند. مسیر تعدادی از این پروتئینها با استفاده از پایگاه KEGG تعیین شد. بر این اساس، 55 مسیر در پایگاه KEGG مورد شناسایی قرار گرفت که پروتئینهای شناخته شده در آنها شرکت میکردند، سپس این مسیر یا چرخهها بر اساس عملکرد در هشت گروه طبقه بندی شدند. این گروههای عملکردی شامل گروههای زیر بودند:
1- گروه پروتئینهای دفاعی 2- پروتئینهای درگیر در فرایند انرژی سلولی 3- پروتئینهای درگیر در فرایند متابولیسم سلولی 4- پروتئینهای درگیر در فرایند پردازش پروتئینها 5- پروتئینهای درگیر در فرایند پردازش RNA 6- پروتئینهای درگیر در چرخه های سلولی 7- پروتئین های درگیر در تخریب پروتئینها و 8- پروتئینهای درگیر در فرایند سیگنال دهی سلولی (جدول1).
هر یک از گروههای عملکردی دارای چندین مسیر هستند، که پروتئینهای شناخته شده دراین مسیرها درگیر هستند. جدول 1 گروهبندی عملکردی، مسیرها و پروتئینهای متناظر با هر EST را بههمراه تعداد EST هر مسیر نشان میدهد.
پروتئینهای درگیر در فرایند انرژی سلولی، بیشترین تعداد EST (745) را در بین هشت گروه عملکردی به خود اختصاص دادند. در این گروه، پروتئین ریبولوز 1، 5- بیس فسفات کربوکسیلاز- اکسیژناز (روبیسکو) با تعداد 631 EST ، از بیشترین تعداد EST برخوردار بود.
پس از پروتئینهای درگیر در فرایند انرژی سلولی، پروتئینهای درگیر در فرایند دفاعی با تعداد 231 EST، مرتبۀ دوم را به خود اختصاص دادند. در این گروه، آنزیم های پراکسیداز با 74 EST بیشترین تعداد EST را در بین پروتئینهای دفاعی دارا بود.
گروه پروتئینهای درگیر در فرایند سیگنال دهی، 74 EST، پروتئین های درگیر در تخریب پروتئین ها، 45 EST، گروه پروتئین های درگیر در فرایند متابولیسم سلولی 43 EST، گروه پروتئینهای درگیر در فرایند پردازش پروتئین ها و پروتئینهای درگیر در فرایند پردازش RNA هر کدام با 31 EST و گروه پروتئینهای درگیر در چرخههای سلولی،4 EST ثبت شده در پایگاه NCBI، را در بر همکنش با قارچ Z. septoria به خود اختصاص دادند.
جدول 1- گروههای عملکردی، مسیرهای سلولی و پروتئین های پیش بینی شده بر اساس آنالیز EST.
Table 1- Functional groups, Cell pathways and protein predicted by EST analysis.
|
پروتئین های مرتبط Corresponding proteins |
تعداد EST Number of ESTs |
مسیر سلولی Cell pathway |
گروه های عملکردی Functional groups |
|
|
|
|
|
پروتئینهای درگیر در فرایند دفاعی Defense proteins |
1 |
|
Ferulate-5-hydroxylase, partial [Panicum virgatum] |
2 |
فنیل پروپانوئید Phenylpropanoeid |
|
|
|
Peroxidase [Triticum aestivum] |
18 |
|
|
|
|
Peroxidase 2-like [Brachypodium d.] |
2 |
|
|
|
|
Peroxidase 5 [Triticum monococcum] |
12 |
|
|
|
|
Thylakoid ascorbate peroxidase [Triticum aestivum] |
14 |
|
|
|
|
Glutathione peroxidase 4 |
28 |
|
|
|
|
Putative 4-coumarate coA ligase [Lolium multiflo] |
20 |
|
|
|
|
Uroporphyrinogen decarboxylase (pathogen) |
5 |
بیوسنتز دیترپنوئید Biosynthesis of diterpenoids
|
|
|
|
ABC transporter [Oryza sativa Japonica] |
8 |
ABC ترانسپورتر ABC Transporter |
|
|
|
ABC transporter F family member 1 |
16 |
|
|
|
|
Catalase [Secale cereale] |
20 |
متابولیسم گلیوزیلات و دیکربوکسیلات Glycosylat and dicarboxylate metabolism |
|
|
|
Calcium-dependent protein kinase [Homo sapiens] |
9 |
توکسوپلاسمولیز Toxoplasmolyse
|
|
|
|
Cytosolic Cu/Zn superoxide dismutase [Triticum aestivum] |
8 |
|
|
|
|
Protein kinase Xa21, receptor type |
8 |
سیستم دو جزئی Two-component system
|
|
|
|
Hsp90-like protein, partial [Lolium perenne] |
9 |
برهمکنش بیمارگر و گیاه Plant-Pathogen interactions
|
|
|
|
Cyclic nucleotide and calmodulin-regulation |
2 |
|
|
|
|
Phosphoribulokinase [Triticum aestivum] |
13 |
|
|
|
|
NBS-LRR type protein [Oryza sativa Japonica Group] |
5 |
|
|
|
|
Glutathione S-transferase 2 |
32 |
Drug Cytochrome p450 |
|
|
|
Hsp90-like protein, partial [Lolium perenne] |
9 |
متابولیسم نیکوتینامید و نیکوتینیت |
|
|
|
Fatty acid hydroxylase [Cordyceps militaris CM01]
|
8 |
Biosynthesis of nicotinamide
بیوسنتز واکس، سوبرین و کوتین |
|
|
|
4-coumarate coA ligase [Lolium multiflo.] |
3 |
Biosynthesis of Wax
بیوسنتز یوبیکوئیتین و دیگر ترپنوئیدها Biosynthesis of ubiquitin
|
|
|
|
Seed imbibition protein [Triticum aestivum] |
1 |
متابولیسم گالاکتوز Galactose metabolism |
پروتئینهای درگیر در فرایند انرژی سلولی Cellular energy |
2 |
|
Cell wall invertase [Lolium perenne] |
2 |
|
|
|
|
Gda-1 [Triticum urartu] |
18 |
|
|
|
|
Alpha-glucosidase like protein [Hordeum vulgare] |
2 |
|
|
|
|
Iron(III)-phytosiderophore uptake mediate |
6 |
متابولیسم سوکروز و نشاسته Sucrose and starch metabolism
|
|
|
|
Cell wall invertase [Lolium perenne] |
2 |
|
|
|
|
UDP-glycosyltransferase 83A1-like |
2 |
|
|
|
|
Zinc finger A20 and AN1 domain-co |
5 |
|
|
|
|
Probable beta-D-xylosidase 6-like |
1 |
|
|
|
|
Alpha-glucosidase like protein [Hordeum vulgare] |
2 |
|
|
|
|
Calcium-dependent protein kinase 3-like protein |
4 |
فتوسنتز Photosynthesis |
|
|
|
3-ketoacyl-CoA synthase 11-like |
11 |
طویل شدن اسیدهای چرب Fatty acid elongation |
|
|
|
Alcohol dehydrogenase superfamily zinc-containing |
2 |
|
|
|
|
AMP-dependent synthetase and ligase |
2 |
|
|
|
|
Ribulose bisphosphate carboxylse |
631 |
|
|
|
|
NADH dehydrogenase |
7 |
فسفریلاسیون اکسیداتیو Oxidative phosphorylation |
|
|
|
Lipase [Hordeum vulgare subsp. Vulgare] |
5 |
|
|
|
|
Beta-D-xylosidase 6-like |
1 |
متابولیسم آلدریت و آسکوربات Ascorbate metabolism |
|
|
|
Monodehydroascorbate reductase 4 [Triticum aestivum] |
1 |
|
|
|
|
Arabinoxylan arabinofuranohydrolase [Hordeum vulgar] |
8 |
متابولیسم نوکلئوتیدهای قندی و آمینوقندها Amino sugar and nucleotide sugar metabolism |
|
|
|
Probable rhamnose biosynthetic en. |
2 |
|
|
|
|
Acetyl-coenzyme A synthetase-like |
17 |
متابولیسم پیرووات Pyruvate metabolism |
|
|
|
Glucose-6-phosphate dehydrogenase [Triticum aestivum] |
2 |
مسیر پنتوز فسفات Pentose phosphate pathway |
|
|
|
Lipoxygenase [Zea mays] |
1 |
متابولیسم لینولئیک اسید Linoleic acid metabolism |
|
|
|
Isocitrate dehydrogenase [NAD] ca. |
3 |
سیکل سیترات Citrate cycle |
|
|
|
Isocitrate dehydrogenase [NAD] ca. |
3 |
اسید اکسی کربوکسیلیک Oxocarboxylic acid |
|
|
|
Phosphoinositide-specific phospholipase C1 [Triticum aestivum] |
4 |
متابولیسم فسفات اینوزیتول Inositol phosphate metabolism |
|
|
|
Prolyl 4-hydroxylase subunit alpha |
2 |
متابولیسم پرولین وآرژنین Arginine and proline metabolism |
پروتئینهای درگیر در فرایند متابولیسم سلولی Cell Metabolism proteins |
3 |
|
Cytosol aminopeptidase [Oryza sativa Indica Group] |
3 |
|
|
|
|
Carbamoyl-phosphate synthase large |
2 |
|
|
|
|
Autophagy [Homo sapiens] |
|
تنظیم اتوفاژی Regulation of autophagy |
|
|
|
Nucellin-like aspartic protease [Hordeum vulgar] |
5 |
لیزوزوم Lysosome |
|
|
|
Proactivator polypeptide-like 1 |
6 |
|
|
|
|
Cysteine synthase |
5 |
متابولیسم سلنوکامپوند Selenocompound metabolism |
|
|
|
Pre-mRNA branch site p14-like protein [Zea mays] |
2 |
متابولیسم سیانوآمینواسید Cyanoamino acid metabolism
|
|
|
|
3-mercaptopyruvate sulfurtransfer |
6 |
متابولیسم میتونین وسیستئین Cysteine and methionin metabolism |
|
|
|
Ferredoxin-dependent glutamate sy. |
4 |
متابولیسم نیتروژن Nitrogen metabolism |
|
|
|
Alcohol dehydrogenase superfamily zinc-containing |
2 |
متابولیسم تیروزین Tyrosine metabolism |
|
|
|
Metallophosphoesterase A |
2 |
متابولیسم پورین Purine metabolism |
|
|
|
Glycine decarboxylase subunit [Triticum aestivum] |
2 |
متابولیسم گلیسین، تروئینین و سرین Serine, Threonine and glysine metabolism |
|
|
|
Carbamoyl-phosphate synthase larg. |
2 |
متابولیسم گلوتامیت، آسپارات و آلانین Alanine, Aspartate and glutamate metabolism |
|
|
|
DnaJ homolog subfamily C member 2 |
7 |
پردازش پروتئین ها در شبکۀ اندوپلاسمی Protein processing in endoplasmic reticulum |
پروتئینهای درگیر در فرایند پردازش پروتئین ها Protein possessing |
4 |
|
Calreticulin [Triticum aestivum] |
7 |
|
|
|
|
Hsp90-like protein, partial [Lolium perenne] |
9 |
|
|
|
|
Chaperone protein dnaJ 20, chloroplast |
4 |
|
|
|
|
70 kDa heat shock protein [Triticum aestivum] |
4 |
|
|
|
|
Pre-mRNA branch site p14-like protein [Zea mays] |
2 |
Spliceosome |
پروتئین های درگیر در فرایند پردازش RNA RNA possessing proteins |
5 |
|
Pre-mRNA-splicing factor SLU7-like |
5 |
|
|
|
|
70 kDa heat shock protein [Triticum aestivum] |
2 |
|
|
|
|
Cycloartenol synthase-like isoform |
7 |
|
|
|
|
Translation initiation factor 4G [Triticum aestivum] |
6 |
|
|
|
|
70 kDa heat shock protein [Triticum aestivum] |
4 |
|
|
|
|
Serine/threonine-protein phosphate |
5 |
مسیر mRNA surveillance mRNA surveillance pathway
|
|
|
|
RING-H2 finger protein ATL67-like |
4 |
Meales |
پروتئینهای درگیر در چرخه های سلولی Cell cycle |
6 |
|
26S proteasome non-ATPase regulation |
10 |
پروتئوزوم Proteosom |
پروتئینهای درگیر در تخریب پروتئین ها Protein degradation |
7 |
|
Proteasome subunit alpha type-5 |
5 |
|
|
|
|
20S proteasome subunit beta-4 [Triticum aestivum] |
2 |
|
|
|
|
U-box domain-containing protein 4 |
6 |
تجزیۀ پروتئین به وسیلۀ یوبی کوئیتین Ubiquitin mediated proteolysis |
|
|
|
E3 ubiquitin ligase BIG BROTHER |
3 |
|
|
|
|
Acetyl-coenzyme A synthetase-like |
17 |
|
|
|
|
DNA damage-binding protein 1-like |
2 |
|
|
|
|
Heat shock cognate 70 kDa protein |
24 |
مسیر سیگنال دهی MAPK MAPK Signaling pathway |
پروتئینهای درگیر در فرایند سیگنال دهی Signaling |
8 |
|
Histidine-containing phosphotransfer pr. |
6 |
انتقال سیگنال هورمون های گیاهی Plant hormone signal transduction |
|
|
|
Serine/threonine-protein kinase H. |
9 |
|
|
|
|
Probable xyloglucan endotransgluc. |
8 |
|
|
|
|
Two-component response regulatore |
2 |
|
|
|
|
SLT1 protein [Zea mays] |
5 |
برهمکنش SNARE در انتقال وزیکولی SNARE Interactions in vesicular transport |
|
|
|
RING-H2 finger protein ATL67-like |
4 |
تنظیم actin اسکلت سلولی Regulation actin cytoskeleton |
|
|
|
SGT1 [Triticum aestivum] |
7 |
مسیر سیگنال دهی گیرنده های NOD-Like NOD-Like receptor signaling pathway |
|
|
|
6-phosphofructo-2-kinase/fructose |
4 |
مسیر سیگنال دهی HIF-1 HIF-1 Signaling pathway |
|
|
|
General amino acid permease, partial [Homo sapiens] |
5 |
مسیر سیگنال دهی NFKAPA β signaling pathway |
|
|
پروتئینهای شناسایی شده
همانطور که قبلاً ذکر شد بیشترین تعداد EST (631) مربوط به ژن ریبولوز 1، 5- بیس فسفات کربوکسیلاز- اکسیژناز (روبیسکو) بود. این آنزیم کاتالیز کننده اولین مرحله از چرخه کالوین است که در استرومای کلروپلاست واقع است. روبیسکو فراوانترین آنزیم موجود در زمین است که ۵۰% کل پروتئین کلروپلاست را تشکیل می دهد. این آنزیم در واقع پلی بین حیات و دنیای بیجان برقرار کرده و کربن آلی را از دی اکسید کربن غیرآلی موجود در هوا بوجود میآورد. (Feller et al., 2008).
در اولین مرحله از چرخۀ کالوین، دی اکسیدکربن به یک قند پنج کربنه به نام ریبولوز ۱-۵ بیس فسفات متصل شده و تولید دو ملکول ۳- فسفو گلیسرات میکند، که این فعالیت به وسیلۀ آنزیم روبیسکو انجام میگیرد، به این فرایند تثبت کربن (Carbon fixation) گفته میشود (Kim et al., 2010) (شکل 2).
(الف A)
(ب B)
شکل2- مستطیلهای علامت گذاری شده با مکان نما، محل فعالیت آنزیم روبیسکو در مسیرهای متابولیسمی گلیکوزیلیت و دیکربوکسیلیت (الف) و تثبیت کربن (ب) در مسیرهای فتوسنتزی است (منبع: http://www.genome.jp/kegg).
Figure2- Rubisco enzyme indicated with red box in metabolic pathways of Glycosylate and Dicarboxylate (a) and carbon fixation (b) in photosynthetic pathways (http://www.genome.jp/kegg).
در مورد تأثیر بیمارگر Septoria tritici بر روی فتوسنتز گیاه گندم آلوده Robert et al (2006) مطالعهای انجام دادند. نتایج این مطالعه نشان داد که این بیمارگر با ایجاد لکه های نکروتیک سبب اختلال در تبادلات گازی، کاهش تعداد برگهای گندم، و محتوای نیتروژن و در نهایت کاهش فتوسنتز میگردد (Robert et al., 2005).
در پژوهشی Bonfig et al. (2006) کاهش در فتوسنتز را در برهمکنش ناسازگار گزارش کردند (Bonfig et al., 2006). کاهش در فتوسنتز گیاه گندم در ایزولههای غیربیماریزا نسبت به ایزولههای بیماریزا زودتر قابل ردیابی بود. این موضوع نشان میدهد که گیاهان فتوسنتز و دیگر مسیرهای متابولیسمی را تغییر میدهند تا بتوانند انرژی لازم برای تنفس و دیگر فرایندهای لازم برای دفاع گیاهی را فراهم کنند (Berger et al., 2007).
هر کدام از گروههای اصلی متابولیت های ثانویه مانند آلکالوئیدها، فنیل پروپانوئیدها و ترپنوئیدها و همچنین ترکیبات منحصر به فردی که در داخل گیاه تجمع پیدا میکنند، به صورت گستردهای در برهمکنش گیاه با بیمارگر مورد مطالعه قرار گرفتهاند (Ishihara et al., 2011). یکی از مسیرهایی که دارای تعداد نسبتاً زیاد EST است مسیر بیوسنتز فنیل پروپانوئید با 96 عدد EST می باشد. در حقیقت این مسیر یکی از مهمترین مسیرهای تولید متابولیتهای ثانویه دفاع گیاه در برابر تنشهای زنده است. بیوسنتز ترکیبات فنلی از مسیر فنیل پروپانوئید و از اسیدآمینۀ فنیلآلانین صورت میگیرد. این مسیر باعث بیوسنتز کومارینها، استیلبنها، اسیدهای فنلی و لیگنینها میشود. کلیدیترین آنزیم این مسیر فنیل آلانین آمونیا لیاز(PAL) است (Chandra et al., 2007).
گروه دیگری از متابولیتهای ثانوی لیگنانها هستند که در بسیاری از گیاهان از مسیر فنیل پروپانوئید ساخته میشوند. این ترکیبات معمولاً از دو واحد فنیل پروپانوئیدی تشکیل میشوند و در مکانیسمهای دفاعی گیاهان در برابر عوامل بیماریزا نقش دارند و فعالیت زیستی متنوعی از خود نشان میدهند. لیگنان مولکولهای کوچک فنلی هستند که دارای یک حلقه فنیلی و یک زنجیره سه کربنی هستند. این ترکیبات از مسیر بزرگ فنیلپروپانوئیدی سنتر میشوند(Dixon and Summer, 2003). این مسیر نقش بسیار زیادی در مقاومت در برابر تنشهای زنده و غیرزنده دارد. ترکیبات فنیلپروپانوئیدی از اسیدسینامیک مشتق می شوند، که خود اسیدسینامیک از اسیدآمینۀ فنیلآلانین تشکیل شده است (Vogt, 2010). آنزیم فنیلآلانینآمونیالیاز (PAL) واکنش تبدیل فنیلآلانین را به ترانسسینامیک اسید را هدایت میکند. این آنزیم نقش مهمی در فعالیتهای دفاعی گیاه مانند بیوسنتز اسیدسالیسیلیک (به عنوان سیگنال مقاومت سیستمیک در گیاهان عمل میکند)، بازی میکند (Chaman et al., 2003).
یکی از آنزیمهایی که دارای تعداد زیادی EST تحت مسیر فنیل پروپانوئید بود، پروکسیداز بود. این آنزیم 46 EST را به خود اختصاص داد. پراکسیداز از گروه گلیکوپروتئینها است و با مصرف پراکسیدهیدروژن (H2O2) باعث اکسیداسیون ترکیبات آلی و غیرآلی میشود. پراکسیداز از طریق اکسیداسیون ترکیبات فنلی و دهیدوژنه کردن منولیگنالها باعث لیگنینیشدن و در نتیجه باعث استحکام دیواره آوند چوبی میشود؛ همچنین این آنزیم باعث تولید گونههای اکسیژن فعال، سنتز فیتوالکسینها و تجمع ترکیبات فنلی در دیوارۀ سلولی گیاهان و در نتیجه محدود کردن گسترش بیمارگر در گیاه میشود (Sasaki et al., 2004).
گلوتاتیون پراکسیداز(GP) آنزیمی دیگر تحت مسیر فنیل پروپانوئید است و دارای 28 EST میباشد. این آنزیم نقشی کلیدی در حفاظت از غشاهای سلولی که در معرض تنش های اکسیداتیو قرار دارند، ایفا میکند. تولید این آنزیم طی تنش بیمارگر القا میگردد. این آنزیم باعث تولید دوبارۀ اسیدهای چرب غیراشباع از فسفولیپید هیدروپراکسید میشود. اسید اولئیک ،اسید لینولئیک و اسید پالمیتولئیک تعدادی از اسیدهای چرب غیر اشباع هستند. این ترکیبات در ساختار موم که از اولین سدهای دفاعی گیاه در برابر حملۀ بیمارگر است به کار میروند (Allen, 2008).
یکی دیگر از آنزیمهایی که دارای تعداد زیادی EST در گروه پروتئینهای دفاعی میباشد، آنزیم گلوتاتیون S ترانسفراز(GST) با 32 عدد EST است. این آنزیم جزئی از سیستمهای دفاعی گیاه در برابر آسیبهای ناشی از تنشهای زنده و غیرزنده است. این آنزیم در سمزدایی ترکیبات خارجی زیستی نقش دارد. گلوتاتیون S ترانسفراز آنزیمی دایمر و چند عملکردی است که در سمزدایی مواد داخلی (متابولیتهای درون سلول) و خارجی مانند داروها، حشرهکشها و متابولیت بیمارگرها دخالت دارد، بنابراین در هنگام تنش اکسیداتیو و همینطور جهت خنثیسازی مواد سمی آلی ناشی از بیمارگرها این آنزیم نقشی اساسی ایفا میکند (Hayes and Pulford, 1995).
در این مطالعه بیشترین تعداد EST را همانطور که انتظار میرفت، گروه عملکردی انرژی سلولی با تعداد 765 EST به خود اختصاص دادند، که با توجه به قرار گرفتن ژن روبیسکو در این گروه این امر منطقی به نظر می‌رسد. گروه پروتئینهای درگیر در فرایند دفاعی دومین گروه با 231 EST بود. نظر به فعال شدن واکنش های دفاعی در گیاه با حملۀ بیمارگر این یک پدیدۀ منطقی است.
در کلاس عملکردی پروتئینهای دفاعی، مسیرهای متابولیکی و آنزیمهای زیادی وجود دارند که بهطور خلاصه میتوان به پروکسیدازها، گلوتاتیون S ترانسفراز، کینازها، تکرارهای غنی از لوسین NBS-LRR، پروتئینهای شوک حرارتی Hsp70-90 و کاتالاز اشاره نمود. مطالعات زیادی نشان داده که ژنهای کدکنندۀ آنزیمهای پراکسیداز در اثر آلودگیهای قارچی، باکتریایی، ویروسی و ویروئیدی فعال میشوند و ژنهای کدکنندۀ این گروه از آنزیمها در خانوادۀ PR9 از PR پروتئینها قرار گرفتند (Pshenichnov et al., 2011). ژنهای مقاومت گروه NBS-LRR متداولترین گروه ژنهای مقاومت هستند. تاکنون مقاومت به بیمارگرها و همچنین آفات، تنها نقش ثابت شده برای ژنهای رمزکننده پروتئینهای دارای NBS-LRR در گیاهان بوده است (Guo et al., 2010). بیشتر پروتئینهای رمزشده توسط ژنهای مقاومت دارای یک محل اتصال به نوکلئوتید (Nucleotide Binding Site: NBS) هستند که به یک تکرار غنی از لوسین (Leucine-Rich Repeats: LRR) با طول متغیر در انتهای کربوکسیل متصل میباشد. این دامنهها در برهمکنشهای پروتئین-پروتئین و انتقال پیامهای مولکولی شرکت میکنند (Alscher and Cumming, 1990). آنزیمهای کاتالاز و پراکسیداز از مهمترین آنزیمهای دفاعی در برابر تنشهای زیستی هستند. آنزیم کاتالاز H2O2 را به آب و O2 تجزیه میکند و پراکسیداز با اکسیداسیون ترکیبات فنلی H2O2 را تجزیه میکند. این آنزیمها به همراه آنزیم سوپراکسید دیسموتاز سیستمهای اصلی آنزیمی سلول در برابر صدمات اکسیداتیو هستند (Yao and Tian, 2005).
EST ها ابزاری برای شناسایی ژن، کشف ژن و تعیین توالی ژن میباشد (Nagaraj et al., 2007). در حال حاضر شناسایی EST ها، به سرعت در حال انجام است. تا اول ژانویۀ سال 2013 حدود 74،200،000 EST در پایگاه داده های اطلاعات ثبت شده بود. در مورد تنشی که در این تحقیق مورد بررسی قرار گرفت همانطور که قبلاً ذکر شد تعداد زیادی EST (10438) در دسترس بود. با مطالعاتی که در مورد هر EST و ژن کد کنندۀ پروتئین آن انجام گرفت، مرحله به مرحله اطلاعات مربوط به EST ها طبقه بندی شدند و در نهایت این حجم بالای اطلاعات در هشت گروه عملکردی، تعدادی مسیر و همچنین پروتئین های شرکت کنندۀ در هر مسیر، طبقهبندی شد (جدول 1). در مرحلۀ پایانی پروتئینهایی که دارای تعداد بیشتری EST مخصوصاً در مسیرهای دفاعی گیاهی بودند به صورت موردی مطالعه شدند و نقش آنها در مسیر دفاع گیاه گندم مشخص شد. با استفاده از اطلاعاتی که این بررسی در اختیار قرار میدهد میتوان ژنهای دیگری که به طور مستقیم و همچنین غیر مستقیم در فعالیتهای دفاعی گیاهی شرکت میکنند، مورد بررسی قرار داد.
تشکر و قدردانی: تشکر و قدردانی: نگارندگان از پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری و دانشگاه تربیت مدرس جهت فراهم کردن امکانات این پژوهش تشکر و قدردانی می نمایند.
(الف A)
(ب B)
شکل3- مستطیلهای قرمز رنگ (1.11.1.7) مکانی که آنزیم پراکسیداز در مسیرهای متابولیسمی بیوسنتز فنیل پروپانوئید (الف) و مسیر متابولیسم فنیل آلانین (ب) شرکت می کند، نشان می دهد (منبع: http://www.genome.jp/kegg).
Figure 3- Peroxidase enzyme indicated with red box in biosynthesis pathways of phenylpropanoid (a) and phenyl alanine metabolism pathways (b) (http://www.genome.jp/kegg)
منابع
Alscher RG and Cumming JR (1990). Stress Responses in Plants: Adaptation and A cclimation Mechanisms. John Wiley and Sons, INC Publication.
Allen RD (2008). Dissection of oxidative stress tolerance using transgenic plants. Plant Physiology 107:1049–1054.
Berger S, Sinha AK and Roitsch T (2007). Plant physiology meets phytopathology: plant primary metabolism and plant-pathogen interactions. Journal of Experimental Botany 58: 4019-26.
Bonfig KB, Schreiber U, Gabler A, Roitsch T, Berger S (2006). Infection with virulent and avirulent P. syringae strains differentially affects photosynthesis and sink metabolism in Arabidopsis leaves. Planta 225: 1-12.
Brading PA, Verstappen ECP, Kema, GHJ, Brown JKM (2002). A gene-for-gene relationship between wheat and Mycosphaerella graminicola, the Septoria tritici blotch pathogen. Phytopathology 92:439–45.
Chandra A, Saxena R, Dubey A, Saxena P (2007). Change in pheny lalanine ammonia lyase activity and isozyme patterns of polyphenol oxidase and peroxidase by salicylic acid leading to enhanced resistance in cowpea against Rhizoctonia Solani. Acta Physiologiae Plantarum 29: 361–367.
Darestani Farahani M, Safaie N, Alizadeh A 2009. Genetic diversity of Iranian populations of Septoria tritici using RAPD analysis. Iranian Journal of Agricultural Biotechology 3: 1-16.
Dracatos PM, Dumsday JL, Olle RS, Cogan NOI, Dobrowolski MP, Fujimori MF, Roderick H, Stewart AV, Smith KF, Forster JW (2006). Development and characterization of EST-SSR markers for the crown rust pathogen of ryegrass (Puccinia coronata f.sp. lolii). Genome 49(6):572-583.
Feller U, Anders I, Mae T (2008). Rubiscolytics: fate of Rubisco after its enzymatic function in a cell is terminated. Journal of Experimental Botany 59 (7): 1615–24.
Dixon RA, Reddy MS (2003). Biosynthesis of monolignols. Genomic and reverse genetic approaches. Phytochemistry Review 2: 289-306.
Gilchrist L, Gomez B, Gonzalez R, Fuentes S, Mujeeb- Kazi A, Pfeiffer W, Rajaram S, Rodriguez R, Skovmand B, van Ginkel M, Valezquez C (1999). Septoriatriticiresistace sources and breeding progress at CIMMYT, 1970-99. pp. 134-139. In: Van Ginkel, M., McNab, A., and Krupinsky, J.(eds.), Septoria and Stagospora Diseases of Cereals. A Compilation of Global Research.CIMMYT, Mexico, D. F., Mexico.
Goodwin SB, McDonald, BA, and Kema, GHJ (2003). The Mycosphaerellasequencing initiative.pp.149-151. In: Kema, G. H. J., van Ginkel, M., Harrabi, M.(eds.). Global Insights into the Septoria and Stagonospora Diseases of Cereals: Proceedings of the Sixth International Symposium on Septoria and Stagonospora Diseases of Cereals, Tunis, Tunisia.
Goswami RS, Xu JR, Trail F, Hilburn K, Kistler HC (2006). Genomic analysis of host–pathogen interaction between Fusarium graminearum and wheat during early stages of disease development. Microboilogy 152: 1877-1890.
Guo L, Yanhua Y, Xinli X, Weilun Y (2010). Identification and functional characterisation of the promoter of the calcium sensor gene CBL1 from the xerophyte Ammopiptanthus mongolicus. BMC Plant Biology 10:18.
Ishihara A, Nakao T, Mashimo Y, Murai M, Ichimaru N, Tanaka C, Nakajima H, Wakasa K Miyagawa H (2011). Probing the role of tryptophan-derived secondary metabolism in defense responses against Bipolaris oryzae infection in rice leaves by a suicide substrate of tryptophan decarboxylase. Phytochemistry 72, 7-13.
Kim YM, Bouras N, Kav NN, Strelkov SE (2010). Inhibition of photosynthesis and modification of the wheat leaf proteome by Ptr ToxB: a host-specific toxin from the fungal pathogen Pyrenophora tritici-repentis. Proteomics 10, 2911-26.
Majidian P, Zeinalabedini M, Dejampour J, Najafi H, Mardi M, Dabbab M, Farsi M (2011). Study of genetic diversity and eco-geographic groups in some apricot cultivars and genotypes using flurescent-AFLP markers. Iranian Journal of Agricultural Biotechology 3: 67-76.
Nagaraj SH, Gasser RB, Ranganathan S (2007).A hitchhiker's guide to expressed sequence tag (EST) analysis. Brief. Bioinformatics 8 (1): 6–21.
Ogata H, Goto S, Sato K, Fujibuchi W, Bono H, Kanehisa M (1999). KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes. Nucleic Acids Research. 27, 29-34.
Parkinson J, and Blaxter M (2009). Expressed sequence tags: an overview. Methods in Molecular Biology 533:1-12.
Quaedvlieg W, Kema GHJ, Groenewald JZ., Verkley G J M, Seifbarghi S, Razavi M, Gohari AM, Mehrabi, R (2011). Zymoseptoria gen. Nov.: A new genus to accommodate Septoria-like species occurring on graminicolous hosts. Persoonia - Molecular Phylogeny and Evolution of Fungi 26: 57–69.
Pshenichnov E, Khashimova N, Akhunov A, Golubenko Z, Stipanovic RD (2011). Participation of Chitin-Binding Peroxidase Isoforms in the Wilt Pathogenesis of Cotton. American Journal of Plant Sciences 2: 43-49.
Robert C, Bancal M C, Lannou C, Ney B (2006). Quantification of the effects of Septoria tritici blotch on wheat leaf gas exchange with respect to lesion age, leaf number, and leaf nitrogen status. Journal of Experimental Botany 57: 225–234.
Sasaki K, Iwai T, Hiraga S, Kuroda K, Seo S, Mitsuhara I, Miyasaka A, Iwano M, Ito H, Matsui H, Ohashi Y (2004). Ten Rice Peroxidases Redundantly Respond to Multiple Stresses Including Infection with Rice Blast Fungus. Plant Cell Physiol. 45:1442-52
Yao HJ, and Tian SP (2005). Effect of biocontrol agent methyl jasmonate on postharvest diseases of peach fruit and the possible mechanisms involved. Applied Microbiology 98: 941-950.
Study of Wheat ESTs in its interaction with Mycosphaerella graminicola
Abstract
In this study, 10438 ESTs related to the interaction of wheat and Mycosphaerella graminicola (Anamorph: Zymoseptoria tritici) were searched in the NCBI Genebank. Non redundant related proteins of these ESTs in NCBI genebank were analyzed by Seqtools software. Among 10438 studied ESTs, 3868 ESTs had related proteins. These proteins were classified in 279 groups based on the type of them. Related pathways of 112 proteins were found in the KEGG site. Subsequently, the relationship between 55 searched pathways and defense responses in plants interact with pathogen was studied. Finally, these pathways were classified based on function in eight groups. Functional groups were included: Defense, Energy, Metabolism, Protein Process, RNA process, Cell cycle, Protein degradation and Signaling. The maximum number (745) of ESTs was related to proteins involved in cellular energy group, following by functional pathway related to defenses with 251 ESTs.
Key words: Mycosphaerella graminicola, EST, SEQtools, NCBI, KEGG.
* نویسنده مسئول: ابراهیم محمدی گل تپه تلفن: 02148292275 Email: emgoltapeh@yahoo.com
* Corresponding Author: Mohammadi goltapeh E. Tel: 03532240911 Email: jalal.gholamnejad@modares.ac.ir
)
