Document Type : Research Paper
Authors
Abstract
Keywords
جداسازی، بیان ژن و تولید پروتئین افکتور PthA باکتری Xanthomonas citri subsp citri عامل بیماری شانکر مرکبات
مریم مختاری 1، محمدرضا صفرنژاد*2، سید مهدی علوی3، آدم ترکمن زهی1
1بخش زیست شناسی، دانشگاه سیستان و بلوچستان، زاهدان
2بخش ویروس شناسی گیاهی موسسه تحقیقات گیاه پزشکی کشور، تهران
3بخش بیوتکنولوژی گیاهی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فن آوری، تهران
تاریخ دریافت: 26/07/1393، تاریخ پذیرش: 17/09/1393
چکیده
بیماری شانکر باکتریایی مرکبات از جمله مهمترین بیماری های باغات لیموی مکزیکی در جنوب کشور می باشد که توسط باکتری Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) ایجاد می‌شود. پروتئین PthA باکتری عامل شانکر مرکبات، به عنوان پروتئین افکتور، نقش اساسی در فرایند بیماری زایی دارد و لذا غیر فعال سازی آن با استفاده از آنتی بادی می تواند منجر به ایجاد مقاومت بر علیه بیماری شود. در این تحقیق جداسازی و بیان ژن pthA و خالصسازی پروتئین حاصل از آن صورت پذیرفته است. برای این منظور با استفاده از منابع اطلاعاتی بانک ژن، آغازگرهای اختصاصی برای جداسازی ژن pthA طراحی شد و سپس قطعه ژنی مربوطه در ناقلpTZ57R/T همسانه سازی گردید. ژن مزبور سپس به صورت متصل به دنباله شش تایی هیستیدین در ناقل بیانی باکتریایی pET28a همسانه سازی گردیده و بیان آن به صورت نوترکیب در سویه BL21(DE3) باکتری Escherichia coli صورت پذیرفت. خالصسازی پروتئین نوترکیب PthA در شرایط طبیعی غیر واسرشتی و با استفاده از روش کروماتوگرافی تمایلی بر روی ستون نیکل صورت پذیرفت. صحت بیان پروتئین مذکور با روش های الکتروفورز پروتئین و وسترن بلاتینگ با استفاده از آنتی بادی های اختصاصی توالی شش تایی هیستیدین مورد بررسی و تایید قرار گرفت. پروتئین نوترکیب خالص بدست آمده می تواند به عنوان آنتی ژن برای تولید آنتی بادی های نوترکیب مونوکلونال مورد استفاده قرار گیرد.
کلید واژهها: شانکر مرکبات، پروتئین نوترکیب، افکتور پروتئین PthA، Xanthomonas citri subsp.citri.
مقدمه
مرکبات یکی از محصولات مهم باغی در ایران است. سطح زیر کشت مرکبات در دنیا در حدود نه میلیون هکتار می باشد که از این مقدار سهم ایران در حدود 268 هزار هکتار می باشد. میزان تولید مرکبات کشور حدود 29/4 میلیون تن میباشد.ایران به دلیل قرارگرفتن در شرایط جغرافیایى مناسب از لحاظ تولید مرکبات مقام هفتم را در بین تولید‌کنندگان عمده مرکبات جهان به خود اختصاص داده است (Ebrahimi, 2009). از مهمترین بیماریهای درختان لیموترش در مناطق جنوبی کشور بیماری شانکر مرکبات می باشد (Khodakaramian et al. 1999)که توسط باکتری(Xcc) Xanthomonas citri subsp. citri (Schaad et al., 2006) ایجاد می‌شود. مبارزه با این بیماری عمدتا به روش های شیمیایی و با استفاده از ترکیبات مسی می باشد. دستیابی به منابع مقاومت ژنتیکی از مهمترین راهکار ها در تولید ارقام مقاوم به بیماری میباشد که در این خصوص استفاده از ژن آنتی بادی های اختصاصی راهکاری نوین در این حوزه می باشد (Safarnejad et al. 2011).
علایم این بیماری در اندامهای هوایی گیاه شامل برگ‌ها، ساقه‌ها و میوه‌ها مشاهده میگردد. در برگ‌ها باکتری از طریق روزنه‌ها وارد می‌شود. آلودگی به‌صورت یک سری نقاط دایره‌ای در سطح پشتی برگ دیده می‌شود. باکتری سپس در فضای آزاد بین سلولی[1] جایگیری می‌کند و کلنی تشکیل می‌دهد.( Duan et al., 1999) اپیدرم برگ در نتیجه افزایش آلودگی به‌هم می‌ریزد و تکه‌تکه می‌شود. در برگ‌ها، ساقه‌ها و میوه‌ها زخم‌ها زیادتر شده و سپس حالت شانکر در محلهای آلوده ایجاد میگردد(Dunger et al., 2005; Brunings and Gabriel, 2003). سویههای مختلف گونه X. citri بر مبنای دامنه میزبانی به پاتوتیپهای مختلفی تعلق دارند که به صورت فرم ها (پاتوتیپها)ی مختلف بیماری شناخته می شوند. فرمهای مختلف بیماری در دنیا شامل A، B، C، D، Eو A* می باشند. این بیماری در ایران برای اولین بار در سال 1368 در منطقه کهنوج کرمان روی لیمو مکزیکی توسط علیزاده و رحیمیان مشاهده گردید (Alizadeh and Rahimian 1989). نتایج تحقیقات اخیر نشان داده است که تمامی انواع شناخته شده بیماری شانکر مرکبات در ایران از نوع A* می باشد (Pruvost et al. 2014).
ارتباط بین باکتریهای گرم‌منفی بیماری‌زای حیوانی و گیاهی با میزبانشان بستگی به یک نوع سیستم محافظت‌شده به نام سیستم ترشح نوع سه[2] دارد، که باعث انتقال فاکتورهای بیماریزایی و هارپینها به درون سلول میزبان می شود (Büttner et al., 2002; Cornelis & Van Gijsegem, 2000; Hueck, 1998). سیستم ترشحی نوع سه به وسیله یک توالی به طول 23 کیلو جفت باز از مجموعه ژنهای hrp کروموزومی یعنی از hrpA تا hrpF کد می‌شود که داخل شش اپران سازمان یافته است (Bonas et al., 1991; Büttner et al, 2002).
ژن pthA از جمله مهمترین ژنها در بیماریزایی باکتری عامل بیماری شانکر میباشد (Shiotani et al., 2007). همولوگ های این ژن شامل pthB و pthC در سویه های باکتری عامل شانکر مرکبات که باعث ایجاد فرم های B و C می شوند وجود دارند (Al-Saadi et al. 2007). این ژن درون خانواده ژنی به‌نام avrBs3/pthA (خانواده عفونت‌زایی و عدم بیماریزایی) (افکتورهای TAL[3]) قرار دارد. این خانواده به‌طور گسترده در گونه‌های زانتوموناس وجود دارند (Vauterin et al. 1995; Shiotani et al., 2007). ژن pthA در تمامی باکتریهای عامل شانکر مرکبات در حدود سه تا چهار کیلو جفت باز طول دارد. این ژن دارای نواحی تکراری پشت سرهم به تعداد 5/17 عدد می باشد که هر کدام از این تکرار‌ها 102 جفت باز مى‌باشد و در قسمت مرکزی ژن وجود دارند. این ناحیه تکراری برای تعیین اختصاصیت میزبان و همچنین عفونت‌زایی لازم میباشد (Al-Saadi et al., 2007). پروتئین PthA از 1163 آمینو اسید تشکیل گردیده است. قسمت میانی پروتئین PthA دارای 5/17 تکرار یکسان از 34 اسید‌آمینه می‌باشند که تعداد دقیق و آرایش واحد‌های تکراری در باکتری های مختلف متفاوت است. این تفاوت باعث عملکرد و اختصاصیت در هنگام ایجاد مقاومت و یا عفونت‌زایی در گونه‌های میزبان مربوطه در عدم حضور ژنهای مقاومت می‌شود (Shiotani et al., 2007; Ponciano et al., 2003).
تولید گیاهان مقاوم به بیماری مهمترین راهکار در مبارزه با بیماری شانکر مرکبات می باشد. عدم دسترسی به گیاهان مقاوم و محدودیت وجود ژنهای طبیعی مقاومت بر علیه بیماری سبب گردیده تا استفاده از سایر منابع مقاومت با روش های مبتنی بر مهندسی ژنتیک مورد توجه قرار گیرد. یکی از راه کار های نوین در ایجاد گیاهان مقاوم به بیماری، استفاده از مکانیسم مقاومت حاصل از بیان آنتی بادی در گیاه[4] می باشد. استفاده از این مکانیسم تاکنون منجر به ایجاد مقاومت بر علیه تعداد زیادی از بیماری های ویروسی، باکتریایی و قارچی شده است (Safarnejad et al. 2011, Malembic-Maher et al. 2005; Li et al. 2008 , Cervera et al. 2010, Yajima, et al. 2010). در مکانیسم اخیر، مختل نمودن فرایند بیماری زایی با هدف قرار دادن پروتئین های ضروری پاتوژن توسط اتصال اختصاصی آنتی بادی-آنتی‌ژن صورت می‌پذیرد. بر این اساس پروتئین PthA با دارا بودن وظایف ضروری در ایجاد بیماری می تواند یکی از بهترین کاندید ها در ایجاد مقاومت محسوب گردد. در تحقیقات قبلی آپتامر های اختصاصی با قابیلت اتصال به پروتئین PthA را در مورد سویه ایجاد کننده فرم A بیماری شانکر مرکبات ایجاد گردیده است (Zhao 2001). هدف نهایی از این تحقیق تولید گیاهان مقاوم به بیماری شانکر با استفاده از آنتی بادی های اختصاصی پروتئین افکتور می باشد.
در ابتدا لازمه ایجاد گیاه مقاوم به بیمارگر با کمک آنتی بادی، خالصسازی مهمترین پروتئین بیمارگر میباشد که نقش اساسی در ایجاد بیماری دارد. لذا هدف از اجرای تحقیق حاضر، جداسازی، بیان ژن pthA، خالصسازی و تولید انبوه پروتئین ژن مذکور می باشد که در ادامه به منظور تولید آنتیبادی اختصاصی مونوکلونال در جهت ایجاد مقاومت به این بیمارگر با ایجاد گیاهان تراریخته مورد استفاده قرار می‌گیرد.
مواد و روش ها
در این تحقیق از سویه شماره 88 باکتری X. citri subsp citri (تهیه شده از کلکسیون موجود در پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فن آوری) که قبلاً از باغات مرکبات منطقه رودان استان هرمزگان جداسازی شده بود، استفاده شد (Pruvost et al. 2014). کشت باکتری بر روی محیط LB [5] جامد صورت گرفت و از تک کلون باکتری برای کشت انبوه در محیط مایع LB استفاده گردید.
جهت استخراج DNA از باکتری، ابتدا باکتری در 10 میلی‌لیتر محیط مایع LB به مدت یک شب در شیکر انکوباتور با دمای 28 درجه سلسیوس و دور دورانی 200 دور در دقیقه کشت شد. از کشت شبانه برای استخراج DNA باکتری استفاده شد. برای این منظور کیت استخراج (ExiProgen™ Bacteria Genomic DNA Kit, Cat No K-4314, South Korea) مطابق دستورالعمل مربوطه استفاده گردید.
مشاهده DNA استخراج شده با استفاده از ژل آگاروز صورت پذیرفت و برای تعیین غلظت DNA استخراجی از نانودراپ اسپکتوفتومتر با جذب نوری 260 و 280 نانومتر استفاده شد. نمونه در دمای 80- درجه سلسیوس نگهداری گردید.
در این تحقیق قسمت یک چهارم انتهایی 3 پریم ژن pthA، با اندازه 606 جفت باز، به منظور جداسازی مورد استفاده قرار گرفت. طراحی آغازگر با استفاده از ترادف کامل ژن pthA موجود در بانک ژن (accession Nr. EF473086.1) صورت گرفت. جهت تسهیل در فرایند همسانهسازی در ناقل بیانی ترادفهای مربوط به هضم آنزیمهای XhoI/SalI در انتهای 5 پریم آغازگر در نظر گرفته شدند.
واکنش PCR در حجم 15 میکرولیتر شامل 5/1 میکرولیتر بافر (10X) PCR، 75/0 میکرولیتر کلرید منیزیوم 50 میلی مولار MgCl2، 3/. میکرولیتر از dNTPs (10 میلی مولار)، 5/1 میکرولیتر آغازگر پیش رو (5΄ TAAAATGTCGACAATGCCACTCCCACCC 3΄ ) و 5/1 میکرولیتر آغازگر پس رو (5΄ TAAAATCTCGAGTTACTGAGGCAATAGCTC3΄)، 2/0 میکرولیتر (Unit/µl 5) از آنزیم Taq DNA Polymerase (Fermentas, Pittsburgh PA, USA) 1 میکرولیتر DNA قالب و 3/8 میکرولیتر آب دو بار تقطیر تهیه شد. واکنش در دستگاه ترموسایکلر با برنامه دمایی شامل 5 دقیقه در 94 درجه سیلسیوس و 35 چرخه، 94 درجه سیلسیوس به مدت یک دقیقه، 60 درجه سیلسیوس به مدت یک دقیقه، 72 درجه سیلسیوس به مدت یک دقیقه و 30 ثانیه و مرحله گسترش نهایی در 72 درجه سیلسیوس به مدت 10 دقیقه انجام شد. محصول PCR روی ژل آگاروز 1% همراه با بافر TAE(1X) (40 mM Tris-acetate , 10 mM EDTA) و با ولتاژ 100 الکتروفورز شد. استحصال باند مورد نظر از روی ژل با استفاده از کیت [6]MBST طبق دستورالعمل شرکت مربوطه صورت پذیرفت.
همسانهسازی قطعه تکثیر شده ژن pthA در ناقل pTZ57R/T به روش T/A کلونینگ و طبق دستورالعمل شرکت سازنده (Fermentas, Pittsburgh PA, USA) صورت پذیرفت. تأیید همسانهسازی در کلونهای حاصله به روش غربال کلنی سفید-آبی، کلنی PCR، هضم آنزیمی و همچنین تعیین ترادف توسط پرایمر های یونیورسال به روش اتوماتیک توسط شرکت ژن فن آوران صورت گرفت. استخراج پلاسمید بر مبنای تخریب قلیایی باکتری‌ها (Sambrook et al., 1996) انجام پذیرفت.
پس از اطمینان از صحت قطعه همسانهسازی شده در کلون منتخب، انتقال قطعه ژنی pthA به پلاسمید بیانی pET28a با هضم آنزیمی صورت پذیرفت. برای این منظور سازه های-pthA pTZ57R/T و پلاسمید بیانی به صورت جداگانه با آنزیم های XhoI/SalI واکنش داده شده و پس از جداسازی و خالصسازی قطعات مربوطه از روی ژل آگاروز، الحاق قطعه ژنی pthA در ناحیه پایینی توالی تکرار شش تایی هیستیدین ناقل بیانی با استفاده از واکنش آنزیمی T4 DNA ligase صورت پذیرفت و سازه حاصله به روش شوک حرارتی(Sambrook et al., 1996) در سویه DH5α باکتری E.coli وارد گردید.
به منظور بیان ژن تولید کننده پروتئین افکتور، سازه بیانی حاوی ژن مربوطه، pET28a-pthA، با روش شوک حرارتی به سلولهای مستعد سویه BL21(DE3) باکتری E. coli منتقل شد. جهت بهینهسازی تولید پروتئین در میزبان باکتریایی، بیان ژن در شرایط مختلف دمایی، تحت تاثیر غلظتهای مختلف 5/0 و 1 میلی مولار [7]IPTG و در زمان های متغیر (3، 6 و 16 ساعت) مورد بررسی قرار گرفت (Sadeghi et al., 2011). به منظور ارزیابی میزان بیان ژن pthA در باکتری در حالات مختلف بیانی، نمونههایی برداشت شد و بر روی ژل پلیاکریل آمید حاوی سدیم دو دسیل سولفات[8] مورد بررسی قرار گرفت.
پس از بهینهسازی شرایط بیان، خالصسازی پروتئین نوترکیب افکتور تحت شرایط طبیعی با استفاده از ستون آگاروز حاوی یونهای نیکل صورت پذیرفت. برای این منظور ابتدا یک کلنی باکتری E. coli سویه BL21(DE3) حاوی سازه pET28a-pthA در محیط کشت مایع LB دارای آنتیبیوتیک کانامایسین (50 میکروگرم در میلی لیتر) به مدت 4-2 ساعت کشت شد تا جذب نوری (OD 600nm) آن به 4/0 برسد. به منظور القاء باکتری برای تولید پروتئین نوترکیب افکتور، IPTG با غلظت 5/0 میلی مولار در حجم نهایی افزوده گردید و محیط کشت به مدت 16 ساعت در دمای 30 درجه سیلسیوس در انکوباتور شیکر‌دار با دمای 30 درجه سیلسیوس و با دور همزن 250 دور در دقیقه قرار داده شد.
به منظور خالصسازی پروتئین نوترکیب، ابتدا جداسازی سلول های باکتریای با انجام سانتریفیوژ در 4000 دور در دقیقه به مدت 20 دقیقه صورت پذیرفت. ته نشین[9] به صورت شبانه در 20- درجه سلسیوس نگهداری شد. معلق سازی رسوب با استفاده از بافر لیز کننده صورت گرفت و تخریب دیواره سلولی باکتری با استفاده از اموج صوتی اولتراسونیک با توان 150 وات به تعداد پنج دوره 30 ثانیهای با فواصل میانی 30 ثانیه بر روی یخ صورت گرفت. سلولهای تخریب شده بهمدت 30 دقیقه در سانتریفیوژ یخچالدار با دمای چهار درجه سیلسیوس و با 10000 دور در دقیقه سانتریفیوژ و محلول رویی جهت خالصسازی جداسازی شد. خالصسازی با روش کروماتوگرافی میل ترکیبی نیکل[10] انجام پذیرفت (Shahriyari et al., 2013). تایید مرحله بیان و خالصسازی پروتئین توسط ژل پلیاکریل آمید و همچنین آزمون وسترن بلاتینگ انجام گرفت (Ausubel et al., 1995). به منظور شناسایی پروتئین نوترکیب بر روی غشا پلی وینیلیدن دیفلوراید[11] از آنتیبادیهای اختصاصی دنباله شش تایی هیستیدین[12] (Abcam, Cambridge, USA) استفاده گردید. ظهور باندهای اختصاصی مربوط به پروتئین نوترکیب متصل به ترادف شش تایی هیستیدین با افزودن عامل اکسید کنندهNBT [13]و سابسترات [14]BCIP ، صورت پذیرفت.
نتایج و بحث
استخراج DNA تحت شرایط لیز قلیایی صورت پذیرفت و محصول فرایند استخراج بر روی ژل آگاروز (شکل 1-الف) حاکی از خلوص بالای اسید نوکلئیک حاصله می باشد. غلظت DNA بدست آمده توسط طیفسنجی در حدود 70 نانوگرم بر میکرولیتر محاسبه گردید.
به منظور جداسازی قطعه ژنی pthA، واکنش PCR انجام گرفت و سپس DNA تکثیر یافته بر روی ژل آگارز بررسی شد. نتایج حاصله حاکی از جداسازی و تکثیر قطعهای در حدود 600 جفت باز بود (شکل1- ب).
به منظور تایید ماهیت قطعه تکثیر شده، با توجه به وجود سایت برشی آنزیم BamHI در محل نوکلئوتید شماره 459 قطعه ژنی، محصول پی سی ار با آنزیم برشی مذکور واکنش داده شد. محصول هضم آنزیمی بر روی ژل الکتروفورز حاکی از وجود دو قطعه DNA به طولهای 459 و 147 جفت باز می باشد که موید صحت اندازه قطعه تکثیر شده می باشد (شکل1- ج).
شکل 1- الف: استخراج دی‌ان‌ای ژنومی سویه 88 باکتری Xanthomonas citri subsp. citri چاهک 1: دی‌ان‌ای استخراج شده باکتری. چاهک 2: نشانگر مولکولی 100 جفت بازی محصول شرکت .Fermentas ب: محصول واکنش پی سی ار بر روی ژل الکتروفورز. چاهک 1: نشانگر 100 جفت بازی. چاهک 2: ژن pthA با طول تقریبی 606 جفت باز. ج: برش قطعه ژنی pthA با آنزیم BamHI. چاهک1: قطعه ژنی pthAبریده شده با BamHI. چاهک 2: Ladder 100 bp. چاهک 3: محصول پی سی ار قطعه ژنی pthA بریده نشده.
Figure 1- A: Extraction of DNA from strain 88 Xanthomonas citri subsp. citri, lane1: DNA extracted from bacteria. Lane 2: 100 bp molecular ladder. B: PCR product on agarose gel. Lane 1: 100 bp molecular ladder, lane 2: PthA gene with length around 606 bp. C: Digestion of pthA amplified fragment with BamHI enzyme. Lane 1: pthA fragment digested with BamHI, lane2: 100 bp ladder, lane 3: undigested pthA fragment.
پس از تکثیر و جداسازی قطعه ژنی pthA، باند مربوطه از روی ژل آگاروز جداسازی و خالص گردیده و در ناقل pTZ57R/T همسانه سازی گردید. به منظور بررسی صحت فرایند همسانه سازی، آزمون کلنی PCR در مورد تعدادی از کلنی های انتخاب شده صورت پذیرفت که نتیجه حاصله حاکی از وجود قطعه ژنی مربوطه در تعدادی از نمونه های انتخاب گردیده می باشد (شکل 2-الف). صحت وجود قطعه مورد نظر در کلون های انتخاب شده با انجام آزمون های تکمیلی هضم آنزیمی (شکل 2-ب) و همچنین تعیین ترادف مورد تایید قرار گرفت. همترازی ترادف منبع اطلاعاتی NCBI، حاکی از وجود تشابه بسیار بالا (100-95 درصد) در ترادف این قطعه ژنی در سویه ها و یا حتی گونه های مختلف زانتاموناس می باشد. این تشابه به دلیل اهمیت وجود ساختار محافظت شده این پروتئین برای ایفای نقش اساسی آن در فرایند بیماری زایی به عنوان پروتئین افکتور می باشد (Shiotani et al., 2007, Nino-Liu et al., 2006). این ساختار به نحوی در بین باکتری های گرام منفی محافظت شده می باشد که گاها پروتئین PthA باکتری های بیماری‌زای گیاهی می توانند در سلولهای جانوری نیز ایفای نقش نمایند (Mudgett 2005).
انتقال قطعه ژنی pthA به ناقل بیانی pET28a با انجام هضم آنزیمی (شکل 2-ج) و الحاق مجدد صورت پذیرفت. تایید فرایند همسانه سازی با انجام آزمون های کلنی PCR و هضم آنزیمی مجدد صورت پذیرفت. ناقل بیانی pET28 به منظور تولید پروتئین های نوترکیب در میزبان باکتریایی مورد استفاده قرار می‌گیرد. این پلاسمید دارای ترادف های کد کننده دنباله هیستیدین[15] می باشد که می تواند به صورت متصل به نواحی 5 پریم و یا 3 پریم ژن خارجی باشد. وجود این ترادف باعث تسهیل فرایند خالص سازی پروتئین نوترکیب با استفاده از ستون های حاوی یون نیکل می گردد (Berlec et al., 2006).
شکل 2- الف: نتایج آزمون کلونی پی‌سی‌ار جهت جداسازی کلون های حاوی قطعه ژنی pthA. چاهک های 1، 2 و 3 : کلونهای دارای قطعه ژنی pthA. چاهک 4: کلون فاقد قطعه ژنی pthA. چاهک 5: نشانگر 100 جفت بازی. ب: هضم آنزیمی به منظور جداسازی قطعه ژنی pthA از پلاسمید pTZ57R/T دارای این قطعه ژنی. چاهک 1: نشانگر 100 جفت بازی. چاهک 2: واکنش هضم آنزیمی پلاسمید pTZ57R/T دارای قطعه ژنی pthA و جداسازی قطعه ژنی pthA، ج: جدا شدن قطعه ژنی pthA در اثر هضم آنزیمی پلاسمید pET28a-pthA. چاهک 1: نشانگر 1000 جفت بازی. چاهک 2: نشانگر 100 جفت بازی. چاهک 3: قطعه ژنی جدا شده pthA و پلاسمید pET28a. چاهک 4: پلاسمید نوترکیب هضم نشده
Figure 2- A: The product of colony PCR for selection of clonies harbouring pthA gene. Lanes 1, 2 and 3: positive clonies harbouring pthA gene, lane 4: empty clone, lane 5: 100 bp molecular ladder. B: Double digestion of pTZ57R/T-pthA construct for isolation of pthA gene. Lane 1: 100 bp molecular ladder, lane 2: Isolation of pthA gene from pTZ57R/T-pthA by double digestion of construct. B: Double digestion of pET28a-pthA for isolation of pthA gene, lane 1: 1000bp molecular ladder, lane2: 100 bp molecular ladder, lane 3: isolated fragment of pthA from pET28a-pthA, lane 4: undigested pET28a-pthA construct.
پلاسمید نوترکیب pET28-pthA به سویه بیانی BL21(DE3) باکتری E. coli منتقل شد و تولید پروتئین افکتور توسط IPTG تحت راهانداز lac صورت پذیرفت. در طی مراحل مختلف بیان و خالص سازی پروتئین، نمونههایی برداشت گردیده و این روند با انجام الکتروفورز پروتئین مورد ارزیابی قرار گرفتند (شکل 3-الف). نتایج مربوطه نشان می دهد که تولید پروتئین PthA تحت تاثیر تیماری های مربوطه تغییر قابل توجهی نشان نداده است. نتایج تحقیقات قبلی بر روی پروتئین مشابه در شرایط مختلف متفاوت بوده است به نحوی که گاها میزان تولید تحت تاثیر تیمار های مشابه متغیر و یا یکسان بوده است (Zhao et al.,2001). تولید پروتئین در میزبان های خارجی به صورت نوترکیب از مهمترین راهکارها در مطالعات مربوط به بررسی نقش پروتئین و سایر موارد از قبیل تولید آنتی بادی های اختصاصی می باشد (Ariannejad etal., 2012; Papzan and Shahpiri 2012). عموما بیان پروتئینهای نوترکیب در میزبان های خارجی با چالش‌هایی همراه می باشد. این مشکلات به دلیل عدم تطابق کامل بیان و یا فولدینگ پروتئین خارجی در سیستم بیانی میزبان جدید می باشد (Rosano & Ceccarelli, 2014). در خصوص تولید پروتئین PthA در باکتری E. coli به نظر می رسد که با توجه به تشابه نوع میزبان، که هر دو پروکاریوتیک می باشند، مشکل خاصی در بیان ژن مربوطه ایجاد نگردیده است ولی با توجه به اینکه پروتئین مذکور در حالت اصلی از سلول باکتری خارج می گردد، تولید آن تحت شرایط پری‌پلاسمیک بهتر انجام خواهد گردید.
در این تحقیق ناحیه یک چهارم انتهایی پروتئین PthA برای جدا سازی ژن مربوطه و تولید پروتئین در نظر گرفته شد. تحقیقات قبلی نشان داده است که این قسمت دارای نواحی لوسین زیپر[16] می باشد که باعث اتصال پروتئین به مولکول های DNA می گردد. همچنین این قسمت دارای ترادف های جاگیری در هسته[17] و ناحیه فعال کننده رونویسی[18] می‌باشند که منجر به ایفای وظایف مهمی در فرایند بیماری زایی می گردند ((Shiotani et al., 2007, Yang and Gabriel, 1995). مشخص شده که ناحیه انتهایی کربوکسیل PthA بیشترین شانس را برای قرارگرفتن در سطح پروتئین دارد و بنابراین نقش مهمی را در اتصالات پروتئین-پروتئین دارا می باشد. این پروتئین در القاء واکنش فوق حساسیت در مرکبات نقش اساسی دارد (Zhao et al, 2001). بنابراین با توجه به نقش های حیاتی این قسمت از پروتئین در فرایند بیماری زایی، تولید و خالص سازی این قسمت به منظور تهیه آنتیبادی های اختصاصی صورت پذیرفت.
پس از تخریب سلولهای باکتری و آزاد سازی پروتئینهای سلولی، جداسازی و خالص سازی پروتئین نوترکیب متصل به دنباله هیستیدین با استفاده از ستون آگاروز حاوی ذرات نیکل صورت پذیرفت. نتایج بیان و خالص سازی پروتئین نوترکیب افکتور، حاکی از بیان مناسب این پروتئین در میزبان باکتریایی و خلوص بالای آن در نمونه خالص شده میباشد (شکل 4).
|
A |
B |
شکل 3- الف: بررسی بیان ژن pthA در شرایط مختلف القایی بر روی ژل SDS- PAGE. چاهک 1: نشانگر پروتئینی 170 کیلودالتون. چاهک 2: نمونه قبل از القاء. چاهک 3: میزان بیان سه ساعت پس از القاء با IPTG، 5/0 میلی مولار. چاهک 4: بیان 3 ساعت پس از القاء با IPTG، 1میلی مولار. چاهک 5: بیان 6 ساعت پس از القاء با IPTG، 5/0 میلی مولار. چاهک 6: بیان 6 ساعت پس از القاء با IPTG، 1 میلی مولار. چاهک 7: بیان 16 ساعت پس از القاء با IPTG، 5/0 میلی مولار. چاهک 8: بیان 16 ساعت پس از القاء با IPTG 1 میلی مولار.
ب: آزمون وسترن بلات با استفاده از آنتی بادی اختصاصی دنباله هیستیدین. چاهک 1: نشانگر پروتئینی. چاهک 2: بیان قطعه ژنی pthA بعد القاء با IPTG 1 میلی مولار به مدت شش ساعت و تولید پروتئین مربوطه به طول 26 کیلودالتون. چاهک 3: قبل از افزودن IPTG.
Figure 3- A: Assessment of expression of pthA gene in different inducing environments. Proteins were analyzed by SDS-PAGE. Lane 1: 170 kDa protein marker. Lane 2: non-induced cells, lane 3: expression 3 hour after induction by 0.5 mM IPTG, lane 4: expression 3 hour after induction by 1 mM IPTG, lane 5: expression 6 hour after induction by 0.5 mM IPTG, lane 6: expression 6 hour after induction by 1 mM IPTG, expression 16 hour after induction by 0.5 mM IPTG, lane 8: expression 16 hour after induction by 1 mM IPTG. B: western blot analysis by applying anti his tag antibody. Lane 1: prestained marker, lane 2: expression 6 hour after induction by 1 mM IPTG, Lane 3: non-induced cells.
با مقایسه باند پروتئین خالص با باندهای موجود در نشانگر پروتئین، وزن پروتئین نوترکیب افکتور در حدود 26 کیلو دالتون تعیین گردید که از این مقدار 2/22 مربوط به پروتئین اصلی و مابقی مربوط به دنباله متصل به پروتئین ناشی از پلاسمید بیانی می باشد. میزان پروتئین حاصله با انجام مقایسه با پروتئین استاندارد آلبومین سرم خون[19] در حدود 100 میکروگرم بر میلی‌لیتر تخمین زده شد. تولید پروتئین بصورت نوترکیب در سلول باکتری از جمله مرسوم ترین روشها برای تولید مقادیر مورد نیاز در امور تحقیقاتی و یا تجاری می باشد (Rosano & Ceccarelli, 2014). استفاده از این سیستم جهت بیان ژنهای خارجی در میزبان باکتری استفاده موارد متعدد برای تولید پروتئین نوترکیب استفاده گردیده است (Safarpur et al., 2012 , Shahriari et al., 2013 ). ژائو[20] و همکاران در سال 2001 به منظور تولید آپتامر های اختصاصی بر علیهPthA، این پروتئین را به صورت کامل و همچنین ناحیه انتهایی کربوکسیل (100 آمینواسد انتهایی) را در میزبان باکتریایی بیان و خالص سازی نمودند. استفاده از این پروتئین ها منجر به تولید آپتامرهایی پروتئینی با طول 7 آمینواسید گردید که در آزمایشات in vivo، توانست باعث جلوگیری از فعالیت پروتئین افکتور گردد(Zhao et al., 2001). این تحقیق برای اولین بار ژن pthA از سویه ایجاد کننده فرم A* بیماری شانکر مرکبات جداسازی و بیان گردیده و خالص سازی پروتئین مربوطه به صورت نوترکیب صورت پذیرفت. تولید پروتئین نوترکیب PthA می تواند به منظور انجام واکنش های تداخل میزبان-پاتوژن[21] و همچنین برای تولید آنتی بادی های مونوکلونال نوترکیب و به منظور ایجاد مقاومت بر علیه بیماری با استراتژی مقاومت وابسته به پلانتی بادی[22] مورد استفاده قرار گیرد.
شکل 4- خالصسازی پروتئین افکتور به صورت نوترکیب متصل به دنباله شش تایی هیستیدین بر روی ستون نیکل. چاهک 1: پروتئین تخلیص شده PthA با وزن 26 کیلو دالتون. چاهک 2: نشانگر وزن مولکولی پروتئین.
Figure 4- Purification of efector protein as fussed to 6His tag on nickel column. Lane 1: Purified pthA protein with molecular weight around 26 kDa. Lane 2: protein molecular ladder.
سپاسگزاری:
نویسندگان مقاله بر خود لازم می دانند از همکاری صمیمانه دانشجویان و کارشناسان محترم بخش بیوتکنولوژی گیاهی پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فن آوری تشکر و قدردانی نمایند.
منابع
Alizadeh A, Rahimian H (1989). Citrus canker in Kerman province. Iranian Journal of Plant Pathology 26:118. (In Farsi)
Al-Saadi A, Reddy JD, Brunings A, Gabriel D (2007). All five host-range variants of Xanthomonas citri carry one pthA homolog with 17.5 repeats that determines pathogenicity on citrus, but none determine host-range variation. Molecular Plant-Microbe Interactions 20: 934-943.
Ariannejad H, Nassiri MR, Aslaminejad A, Tahmoorespour M, Valizadeh R, Asoodeh A, Ghovvati S (2012). Cloning, nucleotide characterization and modeling expression of phytase gene phyC from Bacillus subtilis. Journal of Agricultural Biotechnology 4: 19-33 (In Farsi).
Ausubel F, Brent R, Kingstone R )1995(. Current Protocols in Molecular Biology. New York, Wiley Interscience.
Benov L, AI-Ibraheem J (2002). Disrupting Escherichia coli: A comparison of methods. Journal of Biochemistry and Molecular Biology 35: 428-43.
Berlec A, Jevnikar Z, Majhenic AC, Rogelj I, Strukelj B (2006). Expression of the sweet-tasting plant protein brazzein in Escherichia coli and Lactococcus lactis: a path toward sweet lactic acid bacteria. Applied microbiology and biotechnology 73: 158-165.
Bonas U, Schulte R, Fenselau S, Minsavage GV, Staskawicz BJ, Stall RE (1991). Isolation of a gene cluster from Xanthomonas campestris pv. vesicatoria that determines pathogenicity and the hypersensitive response on pepper and tomato. Molecular Plant-Microbe Interaction 4: 81-88.
Brunings AM, Gabriel DW (2003). Xanthomonas citri: breaking the surface. Molecular Plant Patholology 4: 141-157.
Büttner D, Nennstiel D, Klüsener B, Bonas U (2002). Functional analysis of HrpF, a putative type III translocon protein from Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Journal of bacteriology 184: 2389-2398.
Cervera M, Esteban O, Gil M, Gorris MT, Martínez MC, Peña L, Cambra M (2010). Transgenic expression in citrus of single-chain antibody fragments specific to Citrus tristeza virus confers virus resistance. Transgenic Research 19: 1001-1015.
Cornelis GR,Van Gijsegem F (2000). Assembly and function of type III secretory systems. Annual Reviews in Microbiology 54: 735-774.
Duan Y, Castaneda A, Zhao G, Erdos G, Gabriel DW (1999). Expression of a single, host-specific, bacterial pathogenicity gene in plant cells elicits division, enlargement, and cell death. Molecular Plant-Microbe Interactions 12: 556-560.
Dunger G, Arabolaza AL, Gottig N, Orellano EG, Ottado J (2005). Participation of Xanthomonas axonopodis pv. citri hrp cluster in citrus canker and nonhost plant responses. Plant Pathology 54: 781–788.
Ebrahimi Y (2009). Citrus situation in Iran. Ministry of Jihad e Agriculture. P39. (In Farsi)
Khodakaramian G, Rahimian H, Mohamadi M, Alameh A (1999). Phenotypic features, host range and distribution of the strains Xanthomonas axonopodis including citrus canker in southern Iran. Iranian Journal of Plant Pathology 35: 102-111. (In Farsi).
Hueck CJ (1998). Type III protein secretion systems in bacterial pathogens of animals and plants. Microbiology and molecular biology reviews 62: 379-433.
Li HP, Zhang JB, Shi RP, Huang T, Fischer R, Liao Y (2008). Engineering Fusarium head blight resistance in wheat by expression of a fusion protein containing a Fusarium-specific antibody and an antifungal peptide. Molecular Plant Microbe Interaction 21: 1242-1248.
Malembic-Maher S, Gall FL, Danet JL, Borne FD, Bové JM, Garnier-Semancik M (2005). Transformation of tobacco plants for single-chain antibody expression via apoplastic and symplasmic routes, and analysis of their susceptibility to stolbur phytoplasma infection. Plant Science 168: 349-358.
Mudgett MB (2005). New insights to the function of phytopathogenic bacterial type III effectors in plants. Annual Review of Plant Biology 56: 509–531.
Nino-Liu DO, Ronald PC, Bogdanove AJ (2006). Xanthomonas oryzae pathovars: model pathogens of a model crop. Molecular Plant Pathology 7: 303-324.
Papzan Z, Shahpiri A (2012). Comparison of Reduction Activity of three Rice (Oryza sativa) Thioredoxin Isoforms in Reaction with Insulin. Journal of Agricultural Biotechnology 4: 35-48 (In Farsi).
Ponciano G, Ishihara H, Tsuyumu S, Leach JE (2003). Bacterial effectors in plant disease and defense: keys to durable resistance? Plant diseases 87: 1272-1282.
Pruvost O, Goodarzi T, Boyer1K, Soltaninejad H, Escalon A, Alavi S M, Javegny S, BoyerC, Cottyn B, Gagnevin L,Vernière C (2014). Genetic structure analysis of strains causing citrus canker in Iran reveals the presence of two different lineages of Xanthomonas citri pv. citri pathotype A*. Plant Pathology 64:776-784.
Rosano GL, Ceccarelli E A (2014). Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges. Frontiers in Microbiology 5: 172.
|
Sadeghi HMM, Rabbani M, Rismani E, Moazen F, Khodabakhsh F, Dormiani K, Khazaei Y (2011). Optimization of the expression of reteplase in Escherichia coli. Research in Pharmaceutical Sciences 6: 87–92. |
Safarnejad MR, Salehi Jouzani GR, Tabatabaie M, Twyman RM, Schillberg S (2011). Antibody-mediated resistance against plant pathogens. Biotechnology Advances 29: 961-971.
Safarpur H, Safarnejad MR, Tabatabaei M, Mohsenifar A (2012). Developing of nano-biosensor based high-throughput screening for evaluation of sugar beet germlines against Polymyxa betae. Communication in Applied Biological Science 77: 7-14.
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1996). Molecular Cloning - A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory.
Schaad NW, Postnikova E, Lacy G, Sechler A, Agarkova I, Stormberg PE, Stormberg VK, Vidaver AK (2006). Emended classification of Xanthomonad pathogens on citrus. Systemaic andApplied Microbiology 29: 690–695.
Shahryari F, Shams-Bakhsh M, Safarnejad MR, Safaiee N, Ataie Kachoiee S (2013). Preparation of polyclonal antibody against Immunodominant membrane protein (IMP) of Candidatus Phytoplasma aurantifolia. Iranian Journal of Biotechnology 11: 14-21.
Shiotani H, Fujikawa T, Ishihara H, Tsuyumu S, Ozaki K (2007). A pthA homolog from Xanthomonas axonopodis pv. citri responsible for host-specific suppression of virulence. Journal of bacteriology 189: 3271-3279.
Vauterin L, Hoste B, Kersters K, Swings JG (1995). Reclassification of Xanthomonas. International Journal of Systematic Bacteriology 45: 472 – 489.
Yajima W, Verma SS, Shah S, Rahman MH, Liang Y, Kav NN (2010). Expression of anti-sclerotinia scFv in transgenic Brassica napus enhances tolerance against stem rot. Nature of Biotechnology 27: 816-821.
Yang Y, Gabriel DW (1995). Xanthomonas avirulence/pathogenicity gene family encodes functional plant nuclear targeting signals. Molecular Plant-Microbe Interaction 8: 627-631.
Zhao G (2001). Phage display screening and expression in plants of peptide aptamers that bind to pthA. Dissertation, University of Florida.
Isolation, gene expression and PthA effector protein production of Xanthomonas citri subsp citri causal agent of citrus bacterial canker
Mokhtari M.1, Safarnejad M.R.*2, Alavi S.M.2, Torkamanzehi A.3
1Department of Biology, Sistan and Baluchestan University, Zahedan.
2Department of Plant Viruses, Iranian Research Institute of Plant Protection, Tehran.
3Department of Plant Biotechnology, National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology, Tehran.
Abstract
The citrus bacterial canker is among the most important diseases in Mexican lime gardens in southern area of Iran. The disease is caused by Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc). The PthA bacterial protein, as an effector protein, is crucial in pathogenesis pathway. Inhibition of its functions through antibody could lead to suppression of disease in plant. The present study was performed for isolation and expression of pthA gene and purification of PthA recombinant protein. For this aim the specific primers were designed for isolation of 606 bp of hydroxyl terminal of this gene followed by PCR amplification and cloning into pTZ57R/T vector. The coding sequence of truncated pthA was inserted to pET28a bacterial expression vector as a C-terminal fusion to 6XHis tag. Production of recombinant protein was performed in BL21(DE3) strain of E. coli. The purification was done under native condition through affinity chromatography on nickel column. Total yield was assessed by SDS-PAGE and western blotting analysis. The results confirmed production of PthA recombinant protein with molecular weight around 26 kDa. The purified recombinant protein could be used as an antigen for production of recombinant monoclonal antibodies.
Key words: Citrus bacterial canker, Xanthomonas citri subsp citri , recombinant protein, PthA, effector protein.
* نویسنده مسئول: محمدرضا صفرنژاد تلفن: 02122403012 Email: mrsafarnejad@yahoo.com
[1] Apoplast
[2] type III protein secretion system (TTSS)
[3] Transcriptional Activator-like (TAL) effectors
[4] Plantibody-mediated resistance
[5] Luria-Bertani
[6] DNA Extraction Kit, MBST, Iran
[7] Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)
[8] sodium dodecyl sulfate- polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)
[9] Pellet
[10] Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography (IMAC)
[11] Polyvinylidene difluoride (PVDF)
[12] Anti-6X His tag® antibody [4D11]
[13] nitro blue tetrazolium
[14] 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate
[15] 6His-tag
[16] leucine zipper
[17] nuclear localization signal
[18] transcriptional activation domain
[19] Bovine serum albumin (BSA)
[20] Zhao
[21] Plant-microbe interaction
[22] Plantibody-mediated resistance
* Corresponding Author: Safarnejad M.R. Tel: 02122403012 Email: mrsafarnejad@yahoo.com
|
Sadeghi HMM, Rabbani M, Rismani E, Moazen F, Khodabakhsh F, Dormiani K, Khazaei Y (2011). Optimization of the expression of reteplase in Escherichia coli. Research in Pharmaceutical Sciences 6: 87–92.
|
)
