Genetic variability in exon 9 of PEPCK-M gene in different strains of chickens using PCR-RFLP method

Document Type : Research Paper

Authors

Abstract

Phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK) catalyzes the first step of the gluconeogenesis cycle. There are two isozymes forms of this enzyme, cytosolic phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK-C) and mitochondrial phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK-M) which present in mitochondria and cytoplasm Current research has been conducted to identify the allelic polymorphism in the PEPCK-M gene in breeder hens of native fowls and commercial broiler and layer chickens. Blood samples were collected randomly from 150 birds of three strains and DNA was extracted using modified salting out method. A fragment of 401 bp in length was amplified from exon 9 of PEPCK-M gene. For genotyping of each sample the PCR products were digested by AccI restriction enzyme. The frequency of AccI- and AccI+ allele was estimated at 0.73 and 0.27 in native fowls population, 0.6 and 0.4 in broiler and 0.85 and 0.15 in layer lines, respectively. Two genotypes of AccI -/- and AccI -/+ were observed with the frequency of 0.46 and 0.54 in native fowls, 0.20 and 0.80 in broiler line and 0.70 and 0.30 in commercial layer line, respectively. The comparison of allelic frequency showed no statistical differences between native fowls population with broiler and layer lines, but this results indicated significantly differences between broiler and layer lines (P<0.05).The comparison of genotypic frequency showed that there were significant differences between three populations (P<0.05). No any AccI +/+genotype was detected in the genotyped samples. The difference in genotypic distribution may be as a consequence of different selection strategies used in these populations.

Keywords


تنوع ژنتیکی اگزون 9 ژن فسفو انول پیروات کربوکسی کیناز میتوکندریایی در سویه­های مختلف مرغ با استفاده از تکنیک PCR-RFLP

 

زهره یوسفی*1، قدرت رحیمی میانجی2، زربخت انصاری3

1دانش آموخته کارشناسی ارشد اصلاح نژاد دام، گروه علوم دامی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری

2 استاد گروه علوم دامی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری

3 استادیار گروه علوم دامی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری

تاریخ دریافت: 25/02/1392، تاریخ پذیرش: 07/03/1393

چکیده

فسفو انول پیروات کربوکسی کیناز، اولین مرحله واکنش را در چرخه گلوکونئوژنز کاتالیز می­کند. دو فرم ایزوزیمی از این آنزیم، شامل فسفو انول پیروات کربوکسی کیناز سیتوپلاسمی  و فسفو انول پیروات کربوکسی کیناز میتوکندریایی (PEPCK-M) وجود دارد که در سیتوپلاسم و میتوکندری حضور دارند. پژوهش حاضر برای مقایسه چند شکلی­های آللی در جایگاه ژنی PEPCK-M در سویه­های مرغ تجاری گوشتی، تخم­گذار و مرغ­های مولد از ایستگاه اصلاح نژاد مرغ بومی مازندران انجام گرفته است. نمونه­های خون به طور تصادفی از 150 قطعه مرغ از این سه جمعیت جمع­آوری و استخراجDNA  باروش نمکی بهینه یافته انجام شد. یک قطعه­ی 401 جفت بازی از اگزون 9 ژن  PEPCK-Mتکثیر و سپس جهت تعیین ژنوتیپ، محصولات PCR با آنزیم برشی AccI مورد تیمار آنزیمی قرار گرفتند. فراوانی هر یک از آلل­های AccI– وAccI+ به­ترتیب در مرغ بومی مازندران برابر با 73/0 و 27/0، در مرغ گوشتی برابر با 6/0 و 4/0 و در مرغ تخم­گذار برابر با 85/0 و 15/0 محاسبه شد. دو ژنوتیپ AccI-/- و AccI+/- با فراوانی هر یک به ترتیب 46/0 و 54/0 در جمعیت مرغ بومی مازندران، 2/0 و 8/0 در جمعیت مرغ گوشتی و 7/0 و 3/0 در جمعیت مرغ تخم­گذار مشاهده شد. مقایسه فراوانی ژنی بین جمعیت مرغ­های بومی مازندران با مرغ­های گوشتی و تخم گذار اختلاف معنی­داری نداشت، اما این اختلاف در بین جمعیت مرغ­های گوشتی و تخم گذار از لحاظ آماری معنی­دار بود (P<0.05). همچنین مقایسه فراوانی ژنوتیپی بین هر سه جمعیت از لحاظ آماری اختلاف معنی­داری را نشان داد(P<0.05) . در نمونه­هاى مورد مطالعه ژنوتیپ AccI+/+ مشاهده نشد. اختلاف در توزیع ژنوتیپی ممکن است در نتیجه اختلاف در استراتژی­های انتخاب استفاده شده در این جوامع باشد. ﺑﺎ ﺗﻮﺟﻪ ﺑﻪ اینکه ژن PEPCK-M در جمعیت­های مورد بررسی دارای ﭼﻨﺪﺷﮑﻠﯽ ﻗﺎﺑﻞ ملاحظه­ای ﻣﯽ­ﺑﺎﺷﺪ ﻣﯽ­ﺗﻮان از آن در ﺑﺮﻧﺎﻣﻪ­ﻫﺎی اﻧﺘﺨﺎب و اﺻﻼح ﻧﮋادی آﯾﻨﺪه اﺳﺘﻔﺎده ﻧﻤﻮد.

کلمات کلیدی: چند شکلی، فسفوانول پیروات کربوکسی کیناز،PCR-RFLP ، مرغ بومی، مرغ گوشتی، مرغ تخم­گذار.



مقدمه

امروزه ژنتیک مولکولی اهمیت ویژه و خاصی در انتخاب و اصلاح نژاد دام­ها، پیدا نموده است، زیرا امکان انتخاب دقیق­تر و دستیابی به پاسخ سریعتر را ممکن می­سازد. انتخاب بر اساس نشانگر­هاى ژنتیکی یکی از راهکار­هاى مؤثر در اصلاح نژاد است که منجر به افزایش تولید می­شود. به دلیل پیشرفت شایان توجه در تکنیک­هاى ژنتیک مولکولی و اهمیت به­سزاى آن در طراحی برنامه­هاى اصلاحی، نیاز به انجام بررسی­هاى مولکولی خصوصاً در برنامه­هاى انتخاب بر پایه نشانگرهاى ژنتیکى (MAS)[1] بیش از پیش احساس می­شود (Mohammadabadi et al., 2010; Mohammadifar et al., 2013). در این راستا استفاده از تکنیک[2] PCR-RFLPبه منظور شناسایی[3]SNPها از اهمیت ویژه­اى برخوردار می­باشد Beccavin et al., 2001)).

فسفو انول پیروات کربوکسی کیناز[4]   (PEPCK) به عنوان یک آنزیم کلیدی در فرایند گلوکونئوژنیک نقش مهمی را در تنظیم گلوکونئوژنز دارد که تولید فسفو انول پیروات را از اگزالواستات کاتالیز می­کند (Tilghman et al., 1976; Scrutton & Utter, 1968). عملکرد این آنزیم با توجه به گونه حیوانی (Nordlie & Lardy, 1963; Soling & Kleineke, 1976)، مراحل مختلف رشد در گونه­های مختلف (Savon et al., 1993; Ballard & Hanson, 1967) و ارگان (Iynedjian et al., 1975) متفاوت می­باشد. در مرغ،[5]PEPCK-C  فرم غالب در کلیه می­باشد، اما این آنزیم در کبد مرغ حتی در طول گرسنگی­های طولانی مدت نیز مشاهده نشده است (Watford et al., 1981). بنابراین فرض شده است که احتیاج به گلوکونئوژنز کبدی در مرغ توسط نوع میتوکندریایی این آنزیم که به مقدار زیاد صرف نظر از شرایط تغذیه­ای وجود دارد بر­طرف می­شود (Kochi et al., 1980).

فرم­های سیتوزولی(C)  و میتوکندریایی(M)  فسفوانول پیروات کربوکسی کیناز توسط ژن­های هسته­ای مختلفی کد می­شوند (Garber et al., 1972)، که پس از رمز­گذاری و ساخت آنزیم، هر یک از آنزیم­ها وارد اندامک یا بخش مربوطه خود می­شود (Parsanejad et al., 2003). آنزیم تولید شده حاصل از ژن [6]PEPCK-M درون اندامک میتوکندری سلول مورد استفاده قرار گرفته و همان عملکرد نوع سیتوزولی را در چرخه گلوکونئوژنز انجام می­دهد. ساختار ژنی این آنزیم هنوز شناخته نشده است، اما پیشنهاد شده است که حداقل 16 کیلو باز طول دارد. در مطالعات مختلف مشخص شده است که در برخی شرایط بیوشیمیایی خاص درون سلول با افزایش اتصال نوکلئوتید­های حلقوی، اندازه mRNA این ژن به مقدار 4/3 کیلو باز افزایش می­یابد (Weldon et al., 1990) اما در آنالیز Northern-blot مشخص شده که طول mRNA این ژن در انسان، 25/2 کیلو باز بوده که حدود 6/0 کیلو باز از mRNA ژن  PEPCK-Cکوتاه­تر می­باشد. همین طور آزمایشات مبتنی بر بسط آغازگر نشان داده است که ناحیه ´5 غیر­ترجمه­ای mRNA ژن مربوطه حدود 134 جفت باز طول دارد (Modaressi et al., 1996).

فعالیت PEPCK-M توسط تنوع غذایی و تحریک هورمونی که فعالیت PEPCK-C را تغییر می­دهد، تحریک نمی­شود. فرم میتوکندریایی PEPCK، برخلاف PEPCK-C که در سطوح خیلی کم در جگر جنینی حضور دارد، در طی نمو جنین بیان می­شود (Savon, 1991).

توالی اسید آمینه PEPCK-M در مرغ از توالی نوکلئوتیدی 3571 جفت بازی و از هم­پوشانی 3 کلون cDNA به دست آمده است. در مرغ توالی پروتئینی حاصل از این ژن شامل 607 اسید آمینه در آنزیم بالغ و یک توالی رهبر با 9 پپتید در فرم پیش ساز می­باشد. ناحیه́ 3 غیر ترجمه­ای این ژن 6/1 کیلو باز طول داشته که چندین عامل تکراری را شامل می­شود، ولی در این ناحیه توالی سیگنالی برای پلی­آدنیلاسیون وجود ندارد. هر سه cDNA کلون شده ژن، دو mRNA به طول 2/4 و 4/3 کیلو باز در جگر و کلیه­ جوجه­هایی که گرسنگی داده شده و هم جوجه­هایی که تغذیه طبیعی شده­اند، نشان داده شد (Weldon et al., 1990). آنالیز اسید­های آمینه پروتئین در نوع میتوکندریایی نشان از وجود غنی از اسید آمینه­های پرولین و تریپتوفان در ساختمان پروتئین دارد (Hebda & Nowak, 1982).

تنوع ژنتیکی موجود در این ژن در جوجه­های سویه تخم­گذار حاکی از آن است که نژاد­های با چند­شکلی زیاد در این ژن نسبت به بیماری­های توموری و "مارک" مقاوم­تر هستند. لذا، احتمال دارد که این ژن بتواند به عنوان یک ژن کاندید برای مقاومت به بیماری مارک و بیماری­های توموری در طیور مورد توجه قرار گیرد (Li et al., 1998).

هدف از این پژوهش مطالعه چند­شکلی­های آللی و چگونگی توزیع آن­ها در بین سویه­های مختلف مرغ تجاری گوشتی، تخم­گذار و مرغ­های مولد ایستگاه اصلاح نژاد مرغ بومی مازندران بود.

 

مواد و روش ها

جمع­آوری نمونه­های خون

 در پژوهش حاضر از سویه­های مرغ­های تجاری گوشتی، تخم­گذار و مرغ­های بومی مازندران به طور تصادفی 50 قطعه مرغ از هر جمعیت انتخاب و خون­گیری از سویه­های مورد بررسی از طریق ورید زیر بال انجام شد. از هر پرنده حدود 2-1 میلی لیتر خون گرفته شد. برای جلوگیری از انعقاد خون از محلول EDTA[7] به نسبت 1 به 10 استفاده شد. نمونه­ها بلافاصله بعد از شماره­گذاری با حفظ شرایط زنجیره سرد به آزمایشگاه منتقل شده و در دمای 20- درجه سانتی­گراد تا زمان استخراج DNA نگهداری شدند.

 

جداسازی DNA و واکنش زنجیره­ای پلیمراز

DNA ژنومی از نمونه­هاى خون با روش استخراج نمکی ارائه شده توسط Miller et al (1998) استخراج شد. با استفاده از آغازگر­های پیشنهاد شده توسط Torkamanzehi et al (2007)، یک قطعه 401 جفت بازی از ناحیه اگزون 9 ژن PEPCK-M به وسیله واکنش زنجیره­ای پلیمراز تکثیر شد که توالی این آغازگرها به صورت: (آغازگر رفت) 5'-  CCTTCGCCATGAGCCCCTTTTTC -3' و (آغازگر برگشت)  5'-  CAGCTCCGCCATGACATCCCT -3' بود (Torkamanzehi & Kuhnlein, 2007). واکنش PCR در حجم نهایی 25 میکرولیتر شامل 100-50 نانوگرم DNA ژنومی، 75/0 میکرولیتر   MgCl2 ( mM6/1)، 5/2 میکرولیتر بافر PCR با غلظت X1، 25/1 میکرولیتر از هر یک از آغازگر­های رفت و برگشت (Pmol10)، 5/0 میکرولیتر dNTPs ( mM10) و1 واحدآنزیم Taq پلیمراز که در نهایت با آب مقطر به حجم 25 میکرولیتر رسید، انجام گرفت. شرایط تکثیر به صورت زیر بود: واسرشته سازی اولیه°C 95 به مدت 5 دقیقه، و 35 چرخه شامل واسرشته سازی ثانویه در°C 94 به مدت 60 ثانیه، دمای اتصال آغازگر­ها°C 62 به مدت 80 ثانیه و دمای تکثیر°C 72 به مدت 90 ثانیه و از دمای تکثیر نهایی °C72 به مدت 5 دقیقه استفاده شد.

آنالیز RFLP

برای تعیین ژنوتیپ هر نمونه از روش PCR-RFLP و الکتروفورز ژل آگارز استفاده شد. واکنش هضم آنزیمی محصولاتPCR  در حجم 15 میکرولیتر حاوی 1 واحد آنزیم AccI، 1 میکرولیتر بافر R، 7 میکرولیتر محصول PCR و 8/6 میکرولیتر آب مقطر آماده و در دمای°C 37 به مدت 12 ساعت تیمار آنزیمی انجام گرفت. پس از هضم آنزیمی و الکتروفورز محصولات برش داده شده با استفاده از ژل آگارز 2 درصد، از رنگ آمیزی اتیدیوم بروماید برای رویت سازی باندها استفاده شد.

 

آنالیز آماری

فراوانی ژنی و ژنوتیپی با استفاده از نرم افزار Pop Gene نسخه 2/3 تعیین شد. مقایسه فراوانی ژنی و ژنوتیپی جایگاه مورد مطالعه بین سه سویه مرغ­های بومی مازندران، گوشتی و تخم­گذار از روش دقیق فیشر و روش آزمون مربع – کای و نیز آزمون تعادل هاردی– واینبرگ با  استفاده از برنامه SAS نسخه 1/9 انجام گرفت.

 

نتایج

با استفاده از واکنش زنجیره­ای پلیمراز (PCR) و یک جفت آغازگر اختصاصی یک قطعه 401 جفت بازی از اگزون 9 ژن PEPCK-M تکثیر و صحت اندازه قطعه تکثیری توسط ژل آگارز 5/1 درصد به همراه نشانگر وزنی M100 مورد تأئید قرار گرفت (شکل 1).


 

 

 

شکل1- الگوی باند­ی حاصل از تکثیر ژن PEPCK-M از موقعیت 1517 تا 1917 اگزون 9. M اندازه باندهای خط­کش مولکولی 100 جفت بازی از پایین به بالا به قرار زیر می باشد (100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000) .

Figure 1- Banning pattern of PEPCK-M gene amplification from position 1517 to 1917 of exon 9.M is the 100bp molecular ruler.

 


تیمار آنزیمی

آنزیم AccI دارای یک جایگاه برش روی محصول PCR اگزون 9 ژن PEPCK-M است. در نتیجه عمل هضم آنزیمی دو نوع ژنوتیپ روی ژل آگارز مشاهده شد. به این ترتیب که در یک حالت شناسایی آنزیم روی هر دو کرومورزم همولوگ برش می­خورد و دو باند در محدوده 61 و 340 جفت بازی تشکیل می­شود (آلل AccI+). در حالت دوم هیچ یک از دو رشته DNA برش نمی­خورد، در نتیجه تنها قطعه 401 جفت بازی حضور خواهد داشت (آلل AccI-). نتایج هضم آنزیمی در شکل 2 نشان داده شد.

 

 

 

شکل2- الکتروفورز محصولات حاصل از هضم توسط آنزیم AccI. چاهک شماره 2، 5 و 7 ژنوتیپ AccI -/-، و بقیه چاهک­ها ژنوتیپ  AccI +/-. M اندازه باندهای خط­کش مولکولی 100 جفت بازی از پایین به بالا به قرار زیر می­باشد(100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000) .

Figure 2- Electrophoresis of digestion products by AccI enzyme. Lanes 2, 5 and 7 AccI -/- genotype and other lanes AccI +/- genotype. M is the 100bp molecular ruler.

 


فراوانی ژنی و ژنوتیپی محصولات هضم آنزیم AccI جایگاهPEPCK-M

از سه ترکیب ژنوتیپی ممکن، دو ژنوتیپ AccI-/- و AccI+/- در جمعیت­های مورد بررسی با فراوانی­های مختلف محاسبه شدند. ضمناً ژنوتیپ AccI+/+ در هیچ یک از این جمعیت­ها مشاهده نشد. فراوانی آللی و ژنوتیپی در جایگاه PEPCK-M در هر یک از جمعیت­های مورد بررسی به ترتیب در جدول­هاى 1 و 2 ارائه شده است.

 

 

جدول 1- مقایسه فراوانی آللی جایگاه PEPCK-M در بین سویه­های مورد مطالعه.

Table 1- comparison of PEPCK-M allelic frequency in between studied strains.

جمعیت

Population

فراوانی آللی

Allelic frequency

سطح احتمال

P-value

AccI-

AccI+

مرغ بومی

Native fowls

مرغ گوشتی

broiler

مرغ تخم­گذار

layer

مرغ بومی

Native fowls

0.73

0.27

---

0.2912

0.1396

مرغ گوشتی

broiler

0.6

0.4

0.2912

---

0.0063

مرغ تخم گذار

layer

0.85

0.15

0.1396

0.0063

---

 


فراوانی آللAccI- در جمعیت مرغ­های تخم گذار نسبت به جمعیت مرغ­های بومی و گوشتی بیشتر و در مقابل آلل AccI+ در جمعیت مرغ­های گوشتی بیشترین مقدار فراوانی را داشت.

 

 مقایسه فراوانی ژنی و ژنوتیپی جایگاهPEPCK-M  بین سویه­های مختلف

بر اساس نتایج به دست آمده ژنوتیپAccI -/- در جمعیت مرغ­های تخم­گذار با فراوانی 70 درصد برآورد شده است که بیشتر از جمعیت مرغ­های بومی و گوشتی بوده است. فراوانی ژنوتیپ هتروزیگوت AccI+/- در جمعیت مرغ­های گوشتی 80 درصد محاسبه شد که نسبت به دو جمعیت دیگر بیشتر بود و نشان از تنوع بیشتر این جایگاه آللی در این سویه دارد. در هیچ کدام از سه جمعیت، ژنوتیپ هموزیگوتAccI +/+  مشاهده نشد (جدول 2). آلل AccI- در جمعیت مرغ­های تخم­گذار با فراوانی 85/0 و آلل AccI+ با فراوانی 4/0 در جمعیت مرغ­های گوشتی بیشترین مقدار را داشتند. مقایسه فراوانی ژنی جمعیت مرغ­های بومی مازندران با مرغ­های گوشتی و تخم­گذار اختلاف معنی­داری نداشت اما مقایسه فراوانی ژنی بین جمعیت مرغ­های گوشتی و تخم­گذار از لحاظ آماری اختلاف معنی­داری نشان داد(P< 0.05) . همچنین مقایسه فراوانی ژنوتیپی بین هر سه جمعیت از لحاظ آماری اختلاف معنی­داری را نشان داد(P< 0.05) .

 

 

جدول 2- مقایسه فراوانی ژنوتیپی جایگاهPEPCK-M  در بین سویه­های مورد مطالعه.

Table 1- comparison of PEPCK-M genotypic frequency in between studied strains.

جمعیت

Population

فراوانی ژنوتیپی(تعداد) Genotypic  frequency (Number)

                                سطح احتمال

P-Value                                    

 

AccI -/-

AccI +/-

مرغ بومی

Native fowls

مرغ گوشتی

broiler

مرغ تخم­گذار

layer

مرغ بومی

Native fowls

 0.46(23)

0.54 (27)

---

0.0057

0.0150

 

مرغ گوشتی

broiler

0.2 (10)

0.8 (40)

0.0057

---

0.0001

 

مرغ تخم گذار

layer

0.7 (35)

0.3 (15)

0.0150

0.0001

---

 

                 

-         اعداد داخل پرانتز تعداد افراد تعیین ژنوتیپ شده در هر یک از جمعیت­ها مى­باشند.

 

 

 

همچنین در نتیجه ﺗﺠﺰﯾﻪ و ﺗﺤﻠﯿﻞ آﻣﺎری ژﻧﻮﺗﯿﭗ ﻫﺎ توسط ﻧﺮم اﻓﺰارPop Gene ، ﭘﺎراﻣﺘﺮﻫﺎ و ﺷﺎﺧﺺ­ﻫﺎی آﻣﺎری از ﻗﺒﻴﻞ ﺗﻌﺪاد آﻟﻞ در ﻫـﺮﻟﻮﻛـﻮس (N)، ﺗﻌـــﺪاد آﻟـــﻞ ﻣـــؤﺛﺮ (Ne)، ﻫﺘﺮوزﻳﮕﻮﺳـــﻴﺘﻲ ﻣـــﺸﺎﻫﺪه شده (Ho)، ﻫﺘﺮوزﻳﮕﻮﺳـــﻴﺘﻲ ﻣـــﻮرد اﻧﺘﻈـــﺎر (He) و ﺷــﺎﺧﺺ ﺷــﺎﻧﻮن نیز برای هر جمعیت محاسبه شد ﮐﻪ ﻧﺘﺎﯾﺞ در ﺟﺪول 3 ارائه ﺷﺪه است. جمعیت مرغ بومی دارای بیشترین مقدار هتروزیگوسیتی مشاهده شده و جمعیت مرغ گوشتی دارای کمترین مقدار می­باشد (به­ترتیب 8/0 و 3/0). بیشترین و کمترین تعداد آلل مؤثر نیز به ترتیب مربوط به جمعیت مرغ بومی (923/1) و جمعیت مرغ گوشتی (324/1) بود.

 

بحث

فرم میتوکندریایی ژن PEPCK همان واکنش PEPCK-C را انجام می­دهد اما توسط ژن­های هسته­ای مختلفی کد می­شود. در مرغ PEPCK میتوکندریایی تنها فرم این آنزیم در جگر می­باشد و 60 درصد PEPCK را در کلیه تشکیل می­دهد (Watford et al., 1981). در حالی که سطح فعالیت فرم سیتوپلاسمی توسط هورمون­هایی از قبیل گلوکاگون، انسولین و گلوکوکورتیکویید­ها تعدیل می­شود (Lamers et al., 1982; Granner et al.,1983) اما فرم میتوکندریایی به طور مداوم بیان می­شود (Graber et al., 1972).

 

 

 

جدول 3- ﺗﻌﺪاد آﻟﻞ واقعی و ﻣـــؤﺛﺮ، ﻫﺘﺮوزﻳﮕﻮﺳـــﻴﺘﻲ مشاهده شده و ﻣـــﻮرد اﻧﺘﻈـــﺎر  و ﺷــﺎﺧﺺ ﺷــﺎﻧﻮن در هر جمعیت.

Table 3- number of effective and different allele, Expected and Observed Heterozygosity and Shannon's Index in each Population.

جمعیت

Population

اندازه نمونه

(N)

Sample size

آلل واقعی

(Na)

Different Alleles

آلل مؤثر

(Ne)

Effective Alleles

شانون

(I)

Shannon's Index

هتروزیگوسیتی مشاهده شده (Ho)

Observed

Heterozygosity

هتروزیگوسیتی مورد انتظار (He)

Expected Heterozygosity

مرغ بومی

Native fowls

50

2.000

1.923

0.673

0.800

0.480

مرغ گوشتی

broiler

50

2.000

1.342

0.423

0.300

0.255

مرغ تخم­گذار

layer

50

2.000

1.651

0.583

0.540

0.394

 

 

 

با توجه به نقش مهم PEPCK در متابولیسم انرژی، در مطالعه حاضر تنوع ژن PEPCK-M مورد بررسی قرار گرفته است. اندازه قطعه تکثیر یافته از اگزون 9 ژن PEPCK-M در پژوهش حاضر 401 جفت باز بوده که با پژوهش Torkamanzehi et al (2007) مطابقت داشت. نتایج حاصل از هضم این ژن شامل آلل AccI- یک قطعه­ی 401 جفت باز و آلل AccI+ شامل دو قطعه­ی 340 و 61 جفت بازی بوده است. نتیجه بررسی چند شکلی در جایگاه مورد نظر منجر به شناسایی دو ژنوتیپAccI-/- و AccI+/- شد. فراوانی آلل AccI- در هر سه جمعیت نسبت به آلل AccI+ بیشتر بوده است. مقایسه فراوانی ژنی جمعیت مرغ­های بومی مازندران با مرغ­های گوشتی و تخم­گذار اختلاف معنی­داری نداشت، اما مقایسه فراوانی ژنی بین جمعیت مرغ­های گوشتی و تخم­گذار تجاری از لحاظ آماری اختلاف معنی­داری نشان داد(P< 0.05) .

آلل AccI- در جمعیت مرغ­هاى تخم­گذار بالاترین میزان فراوانی را دارا بود که این وضعیت ممکن است به دلیل وجود همبستگی احتمالی بین این آلل با صفات مطلوب تولیدى نظیر تولید تخم­مرغ در جمعیت مرغ­هاى تخم­گذار تجارى باشد.

گزارش شده است که صفت تولید تخم­مرغ و سن در اولین تخم گذاری به طور معنی­داری تحت تأثیر این جایگاه ژنی قرار می­گیرد. در پژوهش Torkamanzehi et al (2007) اثر ژنوتیپ­های PEPCK-M، در مکان­های AccI -/-، AccI +/- و  AccI +/+بر سه صفت سن در اولین تخم­گذاری، نرخ تولید تخم­مرغ و تعداد تخم­مرغ در مرغ­های تخم­گذار نژاد لگهورن مورد آزمون قرار گرفت. آنالیز حداقل مربعات نشان داد اگزون 9 ژن PEPCK-M به طور معنی­داری سن در اولین تخم­گذاری را تحت تأثیر قرار می­دهد، در پژوهش این محققین با استفاده از تکنیک RFLP و برش آنزیمی، سه ژنوتیپ در جایگاه AccI مشاهده شد. فراوانی ژنوتیب­هایAccI-/-، AccI+/- و AccI+/+ به ترتیب 131/0، 492/0 و 377/0 گزارش شد و بر اساس آنالیز RFLP در جنس ماده، ژنوتیب­هاى AccI در تعادل هاردی-واینبرگ قرار داشتند. به علاوه، هر دو آلل با فراوانی متوسط برآورد شدند که این نشانه­ای از حضور انتخاب طبیعی به نفع هتروزیگوت­ها بود.

در پژوهش حاضر ژنوتیپ AccI+/+ در هیچ کدام از جمعیت­های مورد مطالعه مشاهده نشد و فراوانی ژنوتیپ­های AccI -/- و AccI+/- به ترتیب در جمعیت مرغ­های بومی 46/0 و 54/0، در مرغ­های گوشتی 2/0 و 8/0 و در مرغ­های تخم گذار 7/0 و 3/0 برآورد شد. ضمناً در این پژوهش فراوانی آلل  AccI-38/0 و فراوانی آلل AccI+ 62/0 گزارش شد که با فراوانی آللی در جمعیت­های مورد مطالعه ما کاملاً مغایرت دارد که این ممکن است در نتیجه استراتژی­های مختلف انتخاب در جوامع مذکور باشد.

در پژوهش حاضر مقایسه فراوانی ژنوتیپی بین جمعیت­های مورد مطالعه از لحاظ آماری اختلاف معنی­داری را نشان داد(P<0.05) . با وجود ارتباط معنی­دار بین این ژنوتیپ­ها می­توان گفت آلل­های موجود در این لوکوس تحت تأثیر عوامل تغییر دهنده فراوانى آللى و ژنوتیپی قرار دارند و ظاهراً انتخاب در این جمعیت­ها برای افزایش یا کاهش صفات فنوتیپی مورد نظر صورت گرفته است.

در صورت وجود رکورد­های فنوتیپی در جمعیت­های مورد مطالعه می­توان در مورد اثر ژن­ مورد نظر روی رکورد­ها اظهار نظر کرد. ژن کد کننده  PEPCK-Mکه جز مؤثر در فرایند گلوکونئوژنز از لاکتات از طریق چرخه کوری می­باشد تنوع زیادی را در سویه­های مختلف از مرغ­های تخم­گذار (لگهورن) نشان داد. Li et al (1998) بر اساس آنالیز RFLP در جایگاه MspI ژن PEPCK-M در مجموع 7 آلل را تشخیص دادند.

فراوانی­های آللی در 6 جفت از سویه­های منتج شده از جمعیت­های پایه ژنتیکی مختلف، مورد برآورد قرار گرفته بود. هر جفت شامل 2 سویه بودند که در حساسیت به بیماری مارک(MD)[8]، ویروس القا کننده بیماری نئوپلاستیک اختلاف داشتند.

فراوانی معمول­ترین هاپلوتایپ (M2) به طور پیوسته در سویه­های حساس نسبت به سویه­های مقاوم بیشتر بود. بر اساس این نتایج PEPCK-M ممکن است به عنوان یک ژن کاندید، مؤثر بر حساسیت به بیماری مارک باشد. تغییرات در گلوکونئوژنز ممکن است اثر متقابل بین ازدیاد نئوپلازیا[9]و متابولیسم میزبان را تحت تأثیر قرار دهد.

بررسی چند شکلی تک نوکلئوتیدی (SNP) و ارتباط دادن ژنوتیپ­ها با صفات متعدد در طیور مى­تواند منجر به پیشرفت ژنتیکى و بهبود تولیدات آن­ها شود. در این پژوهش مقایسه فراوانی ژنوتیپ AccI -/- بین دو جمعیت تجاری مورد مطالعه اختلاف معنی­داری نشان ­داد که ممکن است در نتیجه برنامه­های اصلاح نژادی برای صفات تولیدی مختلف ایجاد شده باشد.

از آنجایی که نژاد لگهورن برای افزایش عملکرد تخم­گذاری انتخاب شده است پس می­توان احتمال داد فراوانی بالای آلل AccI– در جمعیت مرغ­های تخم­گذار با تولید تخم­مرغ در ارتباط می­باشد و این امر احتمالا دلیل بر وجود اختلاف معنی­دار در وفور این آلل بین دو سویه مرغ گوشتی و تخم­گذار شده است.

با توجه به وقوع چند شکلی در این جایگاه­ها و ارتباط آن­ها با صفات تولیدی و تولید­مثلی طیور، این پژوهش می­تواند نقطه شروع برای پژوهش­های بیشتر به منظور شناسایی نقش دقیق­تر این جایگاه ژنی در ارتباط با صفات عملکردی در طیور باشد.


 

 

منابع

Ballard FJ, Hanson RW (1967). Phosphoenolpyruvate Carboxykinase and Pyruvate Carboxylase in Developing Rat Liver. Journal of Biological Chemistry 104:866.

Beccavin C, Chevalier B, Cogburn LA,Simon J, Duclos MJ (2001). Insulin-like growth factors and body growth in chickens divergently selected for high or low growth rate. Journal of Endocrinol 168: 297-306.

Garber AJ, Ballard FJ, Hanson RW (1972). The significance of mitochondrial phosphoenolpyruvate formation in the regulation of gluconeogenesis in guinea pig liver. In metabolism and the regulation of metabolic processes in mitochondria (Mehlman MA, HansonRW, eds) Academic press. New York pp: 109-135.

Granner D, Andreone T, Sasaki K, Beale E (1983). Inhibition of transcription of phosphoenolpyruvate carboxykinase gene by insulin. Journal of Nature. 305: 549-551.

Hanson W, Reshef L (1997). Regulation of phosphoenolpyruvate carboxykinase (GTP) gene expression. Annual ReviewJournal of BiologicalChemistry 66: 581-611.

Hebda CA, Nowak T (1982). The purification, characterization and activation of phosphoenolpyruvate carboxykinase from chicken liver mitochondria. Journal of Biological Chemistry 257: 5503 – 5514.

Hod Y, Utter MF, Hanson RW (1982). The mitochondrial and cytosolic forms of avian phosphoenolpyruvate are encoded by different messenger RNAS. Journal of Biological Chemistry 257: 13787- 13794.

Iynedjian PB, Ballard FJ, Hanson RW (1975). The regulation of phosphoenolpyruvate carboxykinase (GTP) synthesis in rat kidney cortex. The role of acid-base balance and glucocorticoids. Journal of Biological Chemistry 250(14): 5596–603.

Kochi H, Serizawa K, Kikuchi G (1980).On the nature of three forms of phosphoenolpyruvate carboxykinase occurring in cytosol of chicken liver. Journal of Biochem 88: 895-904.

Lamers W, Hanson RW, Meisner H (1982). cAMP stimulates transcription of the gene for the gene for cytosolic Phosphoenolpyruvate carboxykinase in rat liver. Nuclei. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 79: 5137-5141.

Li S, zadworny D, Aggrey SE, KuhnLein U (1998). Mitochondrial PEPCK: a highly polymorphic gene with allele’s co- selected with marekُ s disease resistance in chickens. Journal. Anim. Genet 29: 395-397.

Miller SA, Dykesand DD, Polesky HF (1988).A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Res 16: 1215.

Modaressi S, Christ B, Bratke J, Zahn S, Heise T, Germann KJ (1996). Molecular cloning, sequencing and expression of the cDNA of the mitochondrial form of PEPCK form human Liver. Journal. Biochem 315: 807- 814.

Mohammadabadi M.R, Nikbakhti, Mirzaee MHR, Shandi MA, Saghi DA, Romanov MN, Moiseyeva IG (2010).Genetic variability in three native Iranian chicken Populations of the khorasan province based On microsatellite markers. Russian Journal of Genetics 46: 1–5.

Mohammadifar A, Faghih Imani SA, Mohammadabadi MR, Soflaei M (2013). The effect of TGFb3 gene on phenotypic and breeding values of body weight traits in Fars native fowls. Iranian Journal of Agricultural Biotechnology 5: 125-136

Nordlie RC, Lardy HA (1963). Mammalian Liver Phosphoenolpyruvate Carboxykinase Activities. Journal of Biological Chemistry 238: 2259-2265.

Nordlie RC, Varricchio FE, Holten DD (1965). Effects of altered hormonal states and fasting on rat-liver mitochondrial phosphoenolpyruvate carboxykinaselivers. Journal of.Biochem. Biophys. Acta 97: 214.

Parsanejad R, TorkamanZehi A, Zadworny D, Kuhnlein U (2003). Alleles of cytosolic phosphoenolpyruvate carboxykinas: trait association and interaction with mitochondrial PEPCK in a strain of white leghorn chickens. Journal of Poultry Science 82: 1708 -1715.

Savon S (1991). Studies of PEPCK gene expression on in the avian system. PhD. Thesis Case Western Reserve University (health sciences).

Savon S, Hakimi P, Hanson RW (1993). Expression of the genes for the mitochondrial and cytosolic forms of phosphoenolpyruvate carboxykinase in avian liver during development. Journal. Biological. Neonate 64(1): 62-68.

Savon S, Hakimi P, Hanson RW (1993). Expression of the genes for the mitochondrial and cytosolic forms of phosphoenolpyruvate carboxykinase in avian liver during development. Journal of Biological. Neonate 64(1): 62-68.

Scrutton MC, Utter MF (1968). The regulation of glycolysis and gluconeogenesis in animal tissues. Annual. Review. Biochem 37:249-302.

Soling HD, Kleineke J (1976). Species dependent regulation of hepatic gluconeogenesis in higher animals in Gluconeogenesis: Its regulation in mammalian species (Hanson R.W. and Mehlman, M.A. Eds.). John wiley & Sons, New York. pp: 369-462.

Tilghman SM, Hanson RW, Ballard FJ (1976). Hormonal regulation of phosphoenolpyruvate carboxykinase (GTP) in mammalian tissues in Gluconeogenesis: It's Regulation in Mammalian Species (Hanson RW, Mehlman, MA, eds.) pp. 47-91, John Wiley & Sons, New York.

Torkamanzehi A, Kuhnlein U (2007). Restriction fragment length and single strand conformational polymorphisms in chicken mitochondrial phosphoenolpyruate carboxykinase (PEPCK) gene and its association with egg production. Pakistan. Journal of Biological. Sciences 10(22): 4075-4080.

Watford M, Hod Y, Chiao YB, Uttert MF, Hanson RW (1981). The unique role of the kidney in gluconeogenesis in the chicken.Journal of Biological Chemistry 256: 10023- 10027.

Weldon SL, Rendo A, Mathias AS, Hod Y, kalonick PA, Sanon S, Hanson RW (1990). Mitochondrial phosphoenolpyruvate carboxykinase form the chicken: comparison of the cDNA and protein sequences whit the cytosolic isozyme. Journal of Biological Chemistry265: 7308-7317.

 

 

 


Genetic variability in exon 9 of PEPCK-M gene in different strains of chickens using PCR-RFLP method

 

Yousefi Z.*1, Rahimi Mianji Gh.2, Ansari Z.3

 

1 M.Sc. Student of animal breeding, Animal Science Department, Sari Agricultural Sciences and Natural Resources University

2 Professor of Animal Science Department, Sari Agricultural Sciences and Natural Resources University

3 Assistant Professor of Animal Science Department, Sari Agricultural Sciences and Natural Resources University

 

 

Abstract

Phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK) catalyzes the first step of the gluconeogenesis cycle. There are two isozymes forms of this enzyme, cytosolic phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK-C) and mitochondrial phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK-M) which present in mitochondria and cytoplasm Current research has been conducted to identify the allelic polymorphism in the PEPCK-M gene in breeder hens of native fowls and commercial broiler and layer chickens. Blood samples were collected randomly from 150 birds of three strains and DNA was extracted using modified salting out method. A fragment of 401 bp in length was amplified from exon 9 of PEPCK-M gene. For genotyping of each sample the PCR products were digested by AccI restriction enzyme. The frequency of AccI- and AccI+ allele was estimated at 0.73 and 0.27 in native fowls population, 0.6 and 0.4 in broiler and 0.85 and 0.15 in layer lines, respectively. Two genotypes of AccI -/- and AccI -/+ were observed with the frequency of 0.46 and 0.54 in native fowls, 0.20 and 0.80 in broiler line and 0.70 and 0.30 in commercial layer line, respectively. The comparison of allelic frequency showed no statistical differences between native fowls population with broiler and layer lines, but this results indicated significantly differences between broiler and layer lines (P<0.05).The comparison of genotypic frequency showed that there were significant differences between three populations (P<0.05). No any AccI +/+genotype was detected in the genotyped samples. The difference in genotypic distribution may be as a consequence of different selection strategies used in these populations.

Keywords: polymorphism, posphoenolpyruvatecarboxykinase, native fowls, broiler, layer.



* نویسنده مسئول: زهره یوسفی                         تلفن: 09112563606                                 Email: yosefi­_2004@yahoo.com

[1] Marker Assisted Selection

[2] PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism

[3] Single Nucleotide Polymorphism

4 Phosphoenolpyruvate Carboxykinase

[5] Cytosolic Phosphoenolpyruvate Carboxykinase

6 Mitochondrial Phosphoenolpyruvate Carboxykinase

[7] Ethylene diamin tetra acetic acid

[8] Marek′s disease

[9] Neoplasia

* Corresponding Author: Yousefi Z.                Tel: 09112563606                    Email: yosefi_2004@yahoo.com

Ballard FJ, Hanson RW (1967). Phosphoenolpyruvate Carboxykinase and Pyruvate Carboxylase in Developing Rat Liver. Journal of Biological Chemistry 104:866.
Beccavin C, Chevalier B, Cogburn LA,Simon J, Duclos MJ (2001). Insulin-like growth factors and body growth in chickens divergently selected for high or low growth rate. Journal of Endocrinol 168: 297-306.
Garber AJ, Ballard FJ, Hanson RW (1972). The significance of mitochondrial phosphoenolpyruvate formation in the regulation of gluconeogenesis in guinea pig liver. In metabolism and the regulation of metabolic processes in mitochondria (Mehlman MA, HansonRW, eds) Academic press. New York pp: 109-135.
Granner D, Andreone T, Sasaki K, Beale E (1983). Inhibition of transcription of phosphoenolpyruvate carboxykinase gene by insulin. Journal of Nature. 305: 549-551.
Hanson W, Reshef L (1997). Regulation of phosphoenolpyruvate carboxykinase (GTP) gene expression. Annual ReviewJournal of BiologicalChemistry 66: 581-611.
Hebda CA, Nowak T (1982). The purification, characterization and activation of phosphoenolpyruvate carboxykinase from chicken liver mitochondria. Journal of Biological Chemistry 257: 5503 – 5514.
Hod Y, Utter MF, Hanson RW (1982). The mitochondrial and cytosolic forms of avian phosphoenolpyruvate are encoded by different messenger RNAS. Journal of Biological Chemistry 257: 13787- 13794.
Iynedjian PB, Ballard FJ, Hanson RW (1975). The regulation of phosphoenolpyruvate carboxykinase (GTP) synthesis in rat kidney cortex. The role of acid-base balance and glucocorticoids. Journal of Biological Chemistry 250(14): 5596–603.
Kochi H, Serizawa K, Kikuchi G (1980).On the nature of three forms of phosphoenolpyruvate carboxykinase occurring in cytosol of chicken liver. Journal of Biochem 88: 895-904.
Lamers W, Hanson RW, Meisner H (1982). cAMP stimulates transcription of the gene for the gene for cytosolic Phosphoenolpyruvate carboxykinase in rat liver. Nuclei. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 79: 5137-5141.
Li S, zadworny D, Aggrey SE, KuhnLein U (1998). Mitochondrial PEPCK: a highly polymorphic gene with allele’s co- selected with marekُ s disease resistance in chickens. Journal. Anim. Genet 29: 395-397.
Miller SA, Dykesand DD, Polesky HF (1988).A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Res 16: 1215.
Modaressi S, Christ B, Bratke J, Zahn S, Heise T, Germann KJ (1996). Molecular cloning, sequencing and expression of the cDNA of the mitochondrial form of PEPCK form human Liver. Journal. Biochem 315: 807- 814.
Mohammadabadi M.R, Nikbakhti, Mirzaee MHR, Shandi MA, Saghi DA, Romanov MN, Moiseyeva IG (2010).Genetic variability in three native Iranian chicken Populations of the khorasan province based On microsatellite markers. Russian Journal of Genetics 46: 1–5.
Mohammadifar A, Faghih Imani SA, Mohammadabadi MR, Soflaei M (2013). The effect of TGFb3 gene on phenotypic and breeding values of body weight traits in Fars native fowls. Iranian Journal of Agricultural Biotechnology 5: 125-136
Nordlie RC, Lardy HA (1963). Mammalian Liver Phosphoenolpyruvate Carboxykinase Activities. Journal of Biological Chemistry 238: 2259-2265.
Nordlie RC, Varricchio FE, Holten DD (1965). Effects of altered hormonal states and fasting on rat-liver mitochondrial phosphoenolpyruvate carboxykinaselivers. Journal of.Biochem. Biophys. Acta 97: 214.
Parsanejad R, TorkamanZehi A, Zadworny D, Kuhnlein U (2003). Alleles of cytosolic phosphoenolpyruvate carboxykinas: trait association and interaction with mitochondrial PEPCK in a strain of white leghorn chickens. Journal of Poultry Science 82: 1708 -1715.
Savon S (1991). Studies of PEPCK gene expression on in the avian system. PhD. Thesis Case Western Reserve University (health sciences).
Savon S, Hakimi P, Hanson RW (1993). Expression of the genes for the mitochondrial and cytosolic forms of phosphoenolpyruvate carboxykinase in avian liver during development. Journal. Biological. Neonate 64(1): 62-68.
Savon S, Hakimi P, Hanson RW (1993). Expression of the genes for the mitochondrial and cytosolic forms of phosphoenolpyruvate carboxykinase in avian liver during development. Journal of Biological. Neonate 64(1): 62-68.
Scrutton MC, Utter MF (1968). The regulation of glycolysis and gluconeogenesis in animal tissues. Annual. Review. Biochem 37:249-302.
Soling HD, Kleineke J (1976). Species dependent regulation of hepatic gluconeogenesis in higher animals in Gluconeogenesis: Its regulation in mammalian species (Hanson R.W. and Mehlman, M.A. Eds.). John wiley & Sons, New York. pp: 369-462.
Tilghman SM, Hanson RW, Ballard FJ (1976). Hormonal regulation of phosphoenolpyruvate carboxykinase (GTP) in mammalian tissues in Gluconeogenesis: It's Regulation in Mammalian Species (Hanson RW, Mehlman, MA, eds.) pp. 47-91, John Wiley & Sons, New York.
Torkamanzehi A, Kuhnlein U (2007). Restriction fragment length and single strand conformational polymorphisms in chicken mitochondrial phosphoenolpyruate carboxykinase (PEPCK) gene and its association with egg production. Pakistan. Journal of Biological. Sciences 10(22): 4075-4080.
Watford M, Hod Y, Chiao YB, Uttert MF, Hanson RW (1981). The unique role of the kidney in gluconeogenesis in the chicken.Journal of Biological Chemistry 256: 10023- 10027.
Weldon SL, Rendo A, Mathias AS, Hod Y, kalonick PA, Sanon S, Hanson RW (1990). Mitochondrial phosphoenolpyruvate carboxykinase form the chicken: comparison of the cDNA and protein sequences whit the cytosolic isozyme. Journal of Biological Chemistry265: 7308-7317.