Genetic diversity analysis in a global panel of rice genotypes by microsatellites

Document Type : Research Paper

Authors

Abstract

The study was designed to characterize the genetic diversity of 95 rice genotypes from various countries by 67 microsatellite markers which covered all rice chromosomes. Number of 303 alleles was detected with an average of 4.52 alleles per locus. The average polymorphism information content value across the marker dataset was 0.51, and it was varied from 0.81 (RM 10346) to 0.11 (RM 4862). The cluster analysis based on UPGMA and Nei genetic distance grouped the studied population in four main subgroups with a significant tendency to cluster by geographical origins. Phylogenetic relationships among the genotypes were in agreement with cluster analysis results. Principal co-ordinates analysis (PCoA) with considering two first co-ordinates that explained about 71.15% of the total variation also confirmed cluster analysis results. Accuracy of cluster analysis was assessed by analysis of molecular variance and results revealed significant difference between clusters. The present study by evaluation genetic distances in part of Iranian germplasm against foreign inbreed lines and varieties obtain appropriate results for applying Iranian germplasm in rice breeding projects.

Keywords


بررسی تنوع ژنتیکی یک کلکسیون بین­المللی برنج به وسیله نشانگر ریزماهواره

 

مجتبی جهانی*1، قربانعلی نعمت زاده2، قاسم محمدی نژاد3

 

1. دانشجوی دکتری اصلاح نباتات، دانشگاه شهید باهنر کرمان

2. استاد اصلاح نباتات، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری

3. دانشیار اصلاح نباتات، دانشگاه شهید باهنر کرمان

 

تاریخ دریافت: 11/12/1393، تاریخ پذیرش: 07/08/1394

 

 

چکیده

در این تحقیق به منظور بررسی تنوع ژنتیکی برنج مجموعه ای از 95 ژنوتیپ از کشورهای مختلف جمع­آوری و با 67 نشانگر ریزماهواره که تمامی کروموزوم­های برنج را پوشش می­دادند ارزیابی شدند. مجموعا تعداد 303 آلل چندشکل با میانگین 52/4 آلل به ازای هر جایگاه ریزماهواره تکثیر یافت. آماره محتوی اطلاعات چند شکلی دارای میانگین 51/0 در کل جمعیت بود. حداکثر و حداقل محتوی اطلاعات چند شکل به ترتیب مربوط به نشانگر ریز­ماهواره  10364 RM (81/0) و RM 4862 (11/0) بود. تجزیه خوشه­ای بر مبنای ضریب فاصله نی ژنوتیپ­ها را بر مبنای تفاوت­های ژنتیکی و مبدا جغرافیایی در 4 گروه اصلی جای داد. تجزیه به مختصات اصلی با در نظر داشتن دو مولفه اول که 15/71 % از تغییرات کل را توجیه می­کردند نیز نتایج تجزیه خوشه­ای را تایید کرد. صحت گروه­بندی افراد به وسیله تجزیه واریانس مولکولی ارزیابی و  تایید شد. این تحقیق با ارزیابی فواصل ژنتیکی بخشی از ژرم پلاسم برنج ایرانی در مقابل ارقام و لاین­های خارجی نتایج مناسبی برای بهره­وری از ذخایر توارثی داخلی در برنامه­های به­نژادی را فراهم می­کند.

واژه­های کلیدی: برنج، تنوع ژنتیکی، SSR، تجزیه خوشه ای، تجزیه به مختصات اصلی

 

 



مقدمه

برنج (Oryza Sativa) غذای اصلی بیش از نیمی از مردم جهان است، جمعیت کشور­های مصرف کننده برنج روز به روز در حال افزایش است و پیش بینی می­شود تا سال 2030 تولید برنج باید تا 40 درصد افزایش پیدا کند (Khush, 2005). بنابراین سرمایه گذاری در زمینه افزایش کمیت و کیفیت برنج از طریق بهنژادی نقش بسیار مؤثری در تامین غذای بشر خواهد داشت. برای اتخاذ تدابیر اصلاحی مناسب، بـهنژادگـر بایـستی از تنوع ژنتیکی صفات گیاه مورد نظر شناخت کافی داشته باشد تا برنامه های بهنژادی خود را با وسـعت نظـر بیـشتری تـدوین نماید. تولید ارقام پر محصول و با کیفیت مطلـوب، از طریـق شناسـایی ذخـایر ژنتیکـی و اطـلاع از میـزان تنـوع ژنتیکـی موجود در جوامع گیاهی و ارقام دارای صفات مطلوب میسر می­شود. برنج دارای یکی از بزرگترین کلکسیون­های ذخایر توارثی در جهان است (Jackson and Juggan, 1993). کشور ایران  نیز با داشتن ژرم پلاسمی وسیع سهم بسزایی در ذخایر توارثی بین­المللی برنج دارد. برای استفاده از این سرمایه عظیم، اطلاع از ماهیت و میزان تنوع موجود در ژرم پلاسم، از اهمیت بسیار زیادی در برنامه­های بهنژادی برخوردار است. والدینی که از لحاظ ژنتیکی متفاوت هستند، هیبریدهایی با هتروزیس بیشتر تولید می­کنند و احتمال به دست آوردن نتاج تفرق یافته برتر (تفکیک متجاوز) افزایش می­باید. ارزیابی و طبقه بندی ذخایر توارثی همچنین می­تواند برای شناسایی نمونه­های تکراری و آسان نمودن مدیریت حفظ منابع ژنتیکی استفاده شود. اطلاعات حاصل از بررسی تنوع و فواصل ژنتیکی کلکسیون­های بین­المللی برای مدیریت و بهره­وری ذخایر توارثی برای بهنژادگران ضروری است. تنوع ژنتیکی عموما بر اساس تجزیه و تحلیل شجره­ای، مورفولوژی، ایزوزایم­ها و مارکر­های مولکولی مبتنی DNA بررسی می­شوند (Doebley et al., 1988; Smith et al., 1997; Smith and Smith, 1992). انواع مختلفی از نشانگر­های مبتنی بر DNA شامل: چند شکلی حاصل از قطعات برش یافته (RFLP)، قطعات DNA تکثیر یافته تصادفی (RAPD)، چندشکلی حاصل از قطعات تکثیر یافته (AFLP) و توالی­های ساده تکراری (SSR) در مطالعات تنوع ژنتیکی گیاهی به کار گرفته شده است (Tanksley, 1983). در میان نشانگر­های مبتنی بر DNA توالی­های ساده تکراری (ریزماهواره­ها) که عموما قطعاتی شامل اجزای تکرار شونده 6-1 تایی هستندRotolski et al,.1996) ) در مطالعات انگشت نگاری DNA، تنوع ژنتیکی، تشخیص ارقام و نقشه یابی ژنتیکی به علت طبیعت چند آللی، تکرار پذیری، الگوی همبارزی، فراوانی چند­شکلی و پوشش ژنومی مناسب به وفور در مطالعات تنوع ژنتیکی برنج به کار گرفته می­شوند(Ashfaq and Khan 2012; Cao et al., 2006; Choudhary et al., 2013; Huang et al., 2010; Abutalebi et al., 2014; Zarea et al., 2013)  تغییرات ژنتیکی در جمعیت­های گیاهی می­تواند به وسیله مکانیسم­های مختلفی از قبیل جهش، نوترکیبی ژنتیکی، مهاجرت، جریان ژنی، رانده شدن ژنتیکی و گزینش به وجود آیند. مطالعات تنوع ژنتیکی فرآیندی است که تفاوت یا شباهت گونه­ها، جمعیت­ها و یا افراد را با استفاده از روش­ها یا مدل­های آماری خاصی بیان می­کند (Mohammadi and Prasanna, 2003). روش­های آماری چند متغیره نقش مهمی در بررسی تنوع ژنتیکی بر عهده دارند. یکی از این روش­های آماری تجزیه خوشه­ای است که افراد را بر اساس فواصل در یک تصویر گرافیکی (دندروگرام) از هم جدا و گروه­بندی می­کند. در این روش ابتدا فاصله دو به دو تمامی افراد توسط یک سری الگوریتم­­ها مشخص می­شود و سپس با الگوریتم­های تجزیه خوشه­ی دندروگرام رسم می­شود. از دیگر روش­های آماری چند متغیره برای بررسی تنوع ژنتیکی تجزیه به مختصات اصلی است که با ارئه پلات­های دو و سه بعدی روابط ژنتیکی میان افراد مورد بررسی را با توجه به اطلاعات نشانگر­های مولکولی آشکار می­کند. چنین روش­های اساس مطالعه بسیاری از محققین برای بررسی تنوع ژنتیکی ذخایر توارثی گیاهان بوده است:(Jin et al., 2010)  416 ژنوتیپ برنج که شامل ارقام بومی، لاین­های اصلاحی و کولتیوارهای برنج بود را به وسیله 100 نشانگر ریزماهواره با روش­ ساختار شناسی به 7 زیر جامعه تقسیم کردند. در حالی­که در مطالعه(Yan et al., 2009)  در بررسی تنوع ژنتیکی 90 ژنوتیپ برنج بر پایه 108 نشانگر ریز ماهواره و یک نشانگر Indel افراد در تجزیه خوشه­ای بر مبنای ضریب فاصله Rogers  و روش UPGMA به سه خوشه اصلی تقسیم شدند. همچنین در این مطالعه تجزیه به مولفه­های اصلی با توجیه حدود 70% از تغییرات توسط دو مولفه اول نیز نتایج تجزیه خوشه­ای را تایید کرد و ژنوتیپ­ها را به سه گروه اصلی تقسیم بندی کرد. در مطالعه دیگری  (Choudhary et al., 2013)تعداد100 ژنوتیپ برنج را به وسیله 52 نشانگر ریزماهواره مورد ارزیابی قرار دادند. مجموعا 184 آلل با میانگین 63/3 آلل در هر لوکوس گزارش شد. تجزیه خوشه­ای 100 ژنوتیپ برنج را به چهار گروه متمایز تقسیم کرد.  (Zhang et al., 2011) از 274 نشانگر ریزماهواره برای ارزیابی تنوع ژنتیکی در 150 ژنوتیپ برنج استفاده کردند و در بررسی تنوع ژنتیکی دو گروه اصلی را گزارش کردند. هدف از این مطالعه بررسی تنوع ژنتیکی به وسیله الگوریتم­های فاصله محور و همچنین تجزیه به مولفه­های اصلی به منظور بررسی روابط ژنتیکی و فواصل ارقام و ژنوتیپ­های بومی ایرانی در یک کلکسیون بین­المللی ژنوتیپ­های برنج می­باشد.

 

مواد و روش­ها

مواد گیاهی شامل مجموعه ای از 95 ژنوتیپ از کشورهای ایران، هند، ایتالیا، فیلیپین، ویتنام و چین بود (جدول 1).

 


جدول 1- نام و مبدا ژنوتیپ­های ارزیابی شده.

Table 1- Name and origin of evaluated genotypes.

شماره

Number

نام

Name

مبدا

Origin

شماره

Number

نام

Name

مبدا

Origin

شماره

Number

نام

Name

مبدا

Origin

1

سنگ جو

SANGE JO

ایران

IRAN

33

کریپتو

CRIPTO

ایتالیا

ITALY

65

IR 84677-132-2-B

فیلیپین Philippines

2

ماری 305

MARI 305

-

34

گرده

GERDEH

ایران

IRAN

66

IR 84678-25-5-B

فیلیپین

Philippines

3

حسن سرایی

HASAN SARAI

ایران

IRAN

35

دشت

DASHT

ایران

IRAN

67

HHZ 5-SAL9-Y3-Y1

فیلیپین

Philippines

4

اهلمی طارم

EHLAMI TAROM

ایران

IRAN

36

قائم

GHAEM

ایران

IRAN

68

HHZ 8-SAL9-DT1-Y1

فیلیپین

Philippines

5

شصتک

SHASTAL

ایران

IRAN

37

آی آر 24

IR24

فیلیپین

Philippines

69

HHZ 11-Y6-Y1-Y1

فیلیپین

Philippines

6

یوسن

USEN

ویتنام

Vietnam

38

آی آر 58

IR58

فیلیپین

Philippines

70

HHZ 11-SAL6-Y1-Y1

فیلیپین

Philippines

7

سی اچ 2

CH 2

هندوست

ان

INDIA

39

آبجی بوجی

ABJI BUJI

ایران

IRAN

71

HHZ 12-Y4-Y3-Y1

فیلیپین

Philippines

8

بینام

BINAM

ایران

IRAN

40

عنبر بو

ANBARBOO

ایران

IRAN

72

HHZ 5-SAL10-DT1-DT1

فیلیپین

Philippines

9

لوملینو

LOMELLINO

ایتالیا

ITALY

41

دمسیاه

DOMSIAH

ایران

IRAN

73

HHZ 5-SAL10-DT2-DT2

فیلیپین

Philippines

10

کورالو

CORALLO

ایتالیا

ITALY

42

آمل 3

AMOL 3

ایران

IRAN

74

HHZ 5-Y3-SAL3-DT1

فیلیپین

Philippines

11

حسنی

HASANI

ایران

IRAN

43

سپید رود

SEPIDROD

ایران

IRAN

75

HHZ 9-DT 7-SAL2-DT1

فیلیپین

Philippines

12

مانجینگ

MANJING

چین

CHINA

44

IR 83140-B-11-B

فیلیپین

Philippines

76

HHZ 11-Y11-Y3-DT1

فیلیپین

Philippines

13

فوجی مینوری

FUJI MINORI

ایران

IRAN

45

IR 83140-B-28-B

فیلیپین

Philippines

77

HHZ 17-DT 6-SAL3-DT1

فیلیپین

Philippines

14

اوندا

ONDA

ایتالیا

ITALY

46

IR 83140-B-32-B

فیلیپین

Philippines

78

ایری 123

IRRI 123

فیلیپین

Philippines

15

رایب

RIBE

ایتالیا

ITALY

47

IR 83140-B-26-B

فیلیپین

Philippines

79

آی آر 64

IR 64

فیلیپین

Philippines

16

دولار

DULAR

هندوستان

INDIA

48

IR 83141-B-17-B

فیلیپین

Philippines

80

ایری 132

IRRI 132

فیلیپین

Philippines

17

رم

ROMEO

ایتالیا

ITALY

49

IR 83141-B-18-B

فیلیپین

Philippines

81

IR 04L191

فیلیپین

Philippines

18

JASMINE 85

ویتنام

Vietnam

50

IR 83142-B-19-B

فیلیپین

Philippines

82

IR 66946-3R-178-1-1

فیلیپین

Philippines

19

آمل2

AMOL 2

ایران

IRAN

51

IR 83142-B-20-B

فیلیپین

Philippines

83

زرک

ZARAK

ایران

IRAN

20

سالاری

SALARI

ایران

IRAN

52

IR 83142-B-21B

فیلیپین

Philippines

84

نماریوران

NEMARIVARAN

ایران

IRAN

21

پژوهش

PAJOUHESH

ایران

IRAN

53

IR 83142-B-49-B

فیلیپین

Philippines

85

آلم سبز

ALAM SABZ

ایران

IRAN

22

آی آر  56

IR56

فیلیپین

Philippines

54

IR 83142-B-57-B

فیلیپین

Philippines

86

کا اچ 23

KH23

-

23

طارم امیری

TAROM AMIRI

ایران

IRAN

55

IR 83142-B-60-B

فیلیپین

Philippines

87

کلا چای زود رس

KOLA CHAI ZOODRAS

ایران

IRAN

24

رشتی

RASHTI

ایران

IRAN

56

IR 83142-B-61-B

فیلیپین

Philippines

88

خزر

KHAZAR

ایران

IRAN

25

غریب

GHARIB

ایران

IRAN

57

IR 83142-B-79-B

فیلیپین

Philippines

89

شاهک

SHAHAK

ایران

IRAN

26

آی آر 50

IR50

فیلیپین

Philippines

58

IR 83142-B-7-B-B

فیلیپین

Philippines

90

سردک

SARDAK

ایران

IRAN

27

صدری

SADRI

ایران

IRAN

59

IR 83142-B-8-B-B

فیلیپین

Philippines

91

شلتوک هراز

SHALTOK HARAZ

ایران

IRAN

28

بالدو

BALDO

ایتالیا

ITALY

60

IR 84675-7-3-2-B-B

فیلیپین

Philippines

92

قاطردم بیریشک

GHATERDOM BIRISHK

ایران

IRAN

29

آمل 1

AMOL 1

ایران

IRAN

61

IR 84675-25-7-3-B-B

فیلیپین

Philippines

93

پردیس

PARDIS

ایران

IRAN

30

بجار

BEJAR

ایران

IRAN

62

IR 84675-58-4-1-B-B

فیلیپین

Philippines

94

ندا

NEDA

ایران

IRAN

31

VIALONE NANO

ایتالیا ITALY

63

IR 84677-34-1-B

فیلیپین

Philippines

95

جلودار

JELODAR

ایران

IRAN

32

RINGO

ایتالیا

ITALY

64

IR 84677-51-1-B

فیلیپین

Philippines

     

 

 

این مجموعه از بانک بذر ملی ایران، موسسه تحقیقات بین‌المللی برنج[1] و پژوهشکده ژنتیک و زیست فناوری کشاورزی طبرستان [2] دریافت گردید. ژنوتیپ­های برنج در شرایط گلخانه­ای کشت و مقدار 1/0 گرم از برگ‌های جوان هر ژنوتیپ برداشت شد. استخراج DNA از روش تغییر یافته(Dellaporta et al., 1983)  که برای گیاه برنج بهینه شده انجام شد. 67 نشانگر ریزماهواره با پوشش هر دوازده کرموزوم برنج (تقریبا 6 نشانگر در هر کروموزوم) از پایگاه داده Gramene  (http://www.gramene.org/) گزینش شدند. واکنش زنجیره پلی­مراز در حجم نهایی 5/12 میکرو­لیتر محتوی 5/0 میلی­مولار از هرکدام از پرایمرهای پیشرو و برگشتی، 2/0 میلی مولار dNTPs، 5/1 میلی مولار MgCl2، بافر واکنش زنجیره پلی­مراز با غلظت 1X، 60 نانو گرم DNA ژنومی و یک واحد از آنزیم پلیمراز Taq بود. نمونه­ها در دستگاه ترمال سایکلر Veriti (Applied Biosystems) به مدت 5 دقیقه در دمای واسرشته سازی 95 درجه سانتیگراد قرار گرفتند و سپس وارد 35 چرخه سه گانه واسرشته سازی، اتصال و بسط به شرح 95 درجه سانتیگراد به مدت 45 ثانیه، دمای بهینه شده برای اتصال به مدت 45 ثانیه و 72 درجه سانتیگراد به مدت 1 دقیقه شدند متعاقبا بسط نهایی به مدت 5 دقیقه در دمای 72 درجه سانتیگراد انجام شد. توالی­های ساده تکراری تکثیر شده دارای الگوی نواربندی با تفاوت ناچیز هستند از این رو برای تفکیک این محصولات واکنش زنجیره پلی­مراز نشانگر ریزماهواره قبل از بارگذاری، واسرشته شدند. برای این منظور مقدار 2 میکرولیتر از بافر بار­گذاری حاوی فرم­آمید به 5/12 میکرولیتر محصول PCR اضافه شد. همچنین نشانگر وزنی استاندارد نیز که به آن بافر بارگذاری حاوی فرم­آمید اضافه شده به همراه دیگر نمونه ها به مدت 5 دقیقه در دمای 95 درجه سانتی‌گراد به منظور واسرشته سازی قرار گرفتند و بلافاصله بر روی یخ منتقل شدند، این نمونه­ها بر روی ژل پلی­اکریل آمید واسرشته کننده 6 درصد بارگذاری شدند و در نشانگرهای همچون SSR که فقط یک لوکوس در فرآیند PCR تکثیر می­شود. می‌توان در یک ژل چندین مجموعه محصول PCR را بارگذاری کرد. با این توضیح که بهینه سازی فرایند PCR به خوبی انجام شده بود و رشته های غیر هدف تکثیر نشده باشند.مقدار 2 میکرولیتر از محصول PCR واسرشته شده در داخل چاهک­ها بارگذاری شده و الکتروفورز با قدرت ثابت 65 وات راه­اندازی شد. مدتی پس از سیر  نمونه ها در ژل مجموعه دوم محصولاتPCR  در همان چاهک ها بارگذاری شدند (برای هربار بارگذاری از یک نشانگر استاندارد وزنی مجزا استفاده می­شود).  در تمام طول مدت انجام الکتروفورز دمای ژل روی 50 درجه سانتیگراد ثابت نگه داشته شد تا محصولات واکنش زنجیره پلی­مراز فرم خطی خود را حفظ کنند. آشکار سازی الگوی نواربندی به وسیله رنگ­آمیزی نیترات نقره طبق روش ابداعی  (Ji et al., 2007)انجام شد. تصاویر اسکن شده ژل­ها به وسیله نرم افزار TotalLab امتیازدهی شدند. در شکل 1 تصویر ژل آکریل آمید نشانگر RM487 با سه بارگذاری و نشانگر استاندارد وزنی مجزا آورده شده است. شاخص­های نشانگری (تعداد آلل، فراوانی آلل غالب، محتوی اطلاعات چند شکلی) به وسیله نرم افزار­های  GenAlEx V 6.5 (Peakall and Smouse, 2012) و 3.25 PowerMarker V (Liu and Muse, 2005) محاسبه شدند. ضریب فاصله Nei از طریق نرم‌افزار3.25  PowerMarker V و رسم دندروگرام با الگوریتم‌ UPGMA در نرم‌افزار XLSTAT   (Addinsoft, 2012) انجام شد.به منظور بررسی میزان تنوع بین و درون خوشه­های معرفی شده تجزیه­واریانس مولکولی (AMOVA) انجام شد. آزمون معنی داری آماره F در AMOVA بر اساس 999 جایگشت در افراد مربوط به خوشه­ها انجام شد. تجزیه به مختصات اصلی و رسم بای پلات ها از طریق نرم­فزار GenAlEx V6.5 (Peakall and Smouse, 2012) انجام شد. مکان برش صحیح دندروگرام با توجه به پراکنش ژنوتیپ ها در بای­پلات تجزیه به مختصات اصلی انجام و به وسیله تجزیه واریانس مولکولی تایید شد.

 

 

 

شکل 1- تصویر ژل پلی اکریل آمید مربوط به نشانگر ریزماهواره RM487.

Figure 1- Image of polyacrylamide gel for RM487

 


نتایج و بحث

در این مطالعه 67 نشانگر الگوی نواربندی چند شکل داشتند که در این میان بیش‌ترین تعداد آلل مربوط به ریز ماهواره RM 1341 با 10 آلل بود. در مورد اهمیت تعداد آلل های تکثیر شده باید به این نکته اشاره کرد که تعداد آلل های تکثیر شده از مکان ژنی، تأثیر مستقیمی بر میزان هتروزیگوسیتی، فراوانی ژنوتیپی و محتوای اطلاعات چند شکلی آن نشانگر دارد. با افزایش تعداد آلل تکثیر شده در یک مکان، میزان اطلاع‌رسانی آن مکان برای تعیین تنوع ژنوتیپ ها افزایش می­یابد. تعداد 303 آلل با میانگین 52/4 آلل در هر مکان در این 67 نشانگر تکثیر یافت. به طوری­که فراوانی آلل غالب در دامنه 94/0 (RM4862) تا 26/0 (RM10346) در جامعه مورد مطالعه متغیر بود (جدول 2). میزان متوسط تعداد آلل در مقایسه با مطالعات پیشین(Borba et al., 2010) و  (Agrama et al., 2007)کمتر بود که این تفاوت را می­توان به تفاوت در اندازه جامعه و میزان تنوع بین افراد جامعه مربوط مورد مطالعه مربوط دانست. مقایسه تعداد آلل­ها و فراوانی آلل غالب در مکان­های ژنی مختلف نشان داد که عموماً حداکثر فراوانی آلل غالب مربوط به نشانگرهایی بود که دارای تعداد آلل کمتری بودند. میزان محتوی اطلاعات چند شکلی در جامعه مورد بررسی از 11/0 تا 81/0 متغیر بود. نشانگر ریز ماهواره 10364 RM واقع در کروموزوم یک برنج بیش‌ترین میزان آماره محتوی اطلاعات چند شکلی را به خود اختصاص داد این در حالی است که نشانگرRM 4862  که به کروموزوم 11 مربوط می­شود دارای کمترین محتوی اطلاعات چند شکلی بود. به طور کلی میانگین آماره محتوی اطلاعات چند شکلی در جامعه ارزیابی شده 51/0 بود که حاکی از چند شکلی مناسب در تمامی نشانگر­ها می­باشد. اطلاعات نشانگری در جدول 2 آورده شده است. در مطالعه­ای در مجموعه­ای از 20 رقم ایرانی که به وسیله 19 نشانگر SSR بررسی شدند محتوی اطلاعات چند شکلی از مقدار 7/0 تا 89/0 متغیر بود و میانگین این آماره به میزان 817/0 برآورد شده بود (Amini Nasab et al., 2012). به منظور تعیین اندازه فاصله ژنتیکی 95 ژنوتیپ بر اساس اطلاعات 67 نشانگر ریزماهواره، دندروگرام حاصل از تجزیه خوشه ای به روش UPGMA ترسیم شد (شکل 2). تجزیه خوشه­ای ژنوتیپ­های برنج این مجموعه را به 4 گروه اصلی تقسیم­بندی کرد. خوشه اول شامل 21، خوشه دوم شامل 13 و خوشه سوم و چهارم به ترتیب 36 و 25 ژنوتیپ را در خود جای دادند. خوشه اول حاوی ارقام بومی و محلی ایرانی مانند سنگ جو، حسن سرایی، شصتک، عنبر بو و دمسیاه بود در حالی­که خوشه دوم ارقام ایتالیایی همچون بالدو، رینگو، کریپتو و اوندا را در خود جای بود. خوشه سوم که بزرگترین خوشه در این مجموعه بود ارقام پر محصول و مدرن ایرانی و همچنین برخی از لاین­های اصلاحی وارد شده از موسسه بین­المللی تحقیقات برنج را در برگرفته بود از این ارقام می­توان به ارقام پرمحصول ندا، قائم، پردیس حسنی، آمل 1، آمل 2 و آمل 3 اشاره کرد. نهایتا خوشه چهارم لاین­های اصلاحی با پیشوند IR را شامل بود. نتایج تجزیه به مختصات اصلی به نوعی تأییدی بر نتایج تجزیه خوشه­ای بود به نحوی که توانست با دو مختصات اول که مقدار 15/71 % از تغییرات کل را توجیه می­کردند ژنوتیپ­ها را در پلات دو­بعدی به 4 گروه متمایز (شکل 3) تقسیم کردند.

 


جدول 2- فهرست نشانگرهای ارزیابی شده.

Table 2- List of evaluated markers.

نشانگر

Marker

کروموزوم

Chromosome

اندازه محصول (bp)

Size of product (bp)

فراوانی آلل غالب

Major allele frequency

تعداد آلل

Number of alleles

محتوی اطلاعات چند شکلی

Polymorphism information

نشانگر

Marker

کروموزوم

Chromosome

اندازه محصول (bp)

Size of product (bp)

فراوانی آلل غالب

Major allele frequency

تعداد آلل

Number of alleles

محتوی اطلاعات چند شکلی

Polymorphism information

RM10346

1

293

0.26

7

0.81

RM17488

4

166

0.76

3

0.36

RM10386

1

216

0.27

8

0.8

RM17492

4

113

0.69

2

0.33

RM10402

1

287

0.43

5

0.66

RM241

4

264

0.58

6

0.58

RM1201

1

189

0.5

4

0.61

RM401

4

241

0.37

5

0.72

RM3148

1

159

0.43

6

0.66

RM6314

4

169

0.55

4

0.56

RM3746

1

139

0.37

5

0.63

RM6748

4

255

0.41

9

0.76

RM414

1

159

0.86

2

0.21

RM3345

5

201

0.55

7

0.63

RM443

1

167

0.45

3

0.52

RM3631

5

82

0.6

3

0.42

RM466

1

191

0.58

2

0.37

RM459

5

437

0.68

4

0.43

RM5

1

194

0.48

5

0.63

RM3343

6

146

0.33

9

0.79

RM580

1

145

0.62

9

0.56

RM340

6

139

0.58

7

0.57

RM106

2

297

0.62

2

0.36

RM454

6

268

0.87

3

0.21

RM112

2

128

0.69

2

0.33

RM510

6

193

0.42

4

0.59

RM1358

2

374

0.34

7

0.77

RM527

6

106

0.48

4

0.61

RM174

2

268

0.56

2

0.37

RM11

7

115

0.31

7

0.78

RM262

2

154

0.33

4

0.66

RM2878

7

165

0.6

3

0.4

RM279

2

164

0.38

4

0.62

RM436

7

81

0.61

2

0.36

RM4499

2

176

0.85

3

0.24

RM256

8

127

0.82

2

0.25

RM497

2

199

0.56

3

0.5

RM284

8

87

0.64

4

0.5

RM1164

3

97

0.72

2

0.32

RM310

8

176

0.38

7

0.74

RM16

3

148

0.47

4

0.63

RM447

8

112

0.55

7

0.61

RM186

3

124

0.48

3

0.42

RM7027

8

122

0.65

3

0.38

RM2334

3

155

0.36

8

0.78

RM8018

8

199

0.69

7

0.47

RM282

3

136

0.38

3

0.59

RM288

9

125

0.57

2

0.37

RM3607

3

254

0.51

3

0.52

RM566

9

143

0.35

9

0.78

RM468

3

159

0.56

3

0.5

RM3123

10

197

0.89

4

0.19

RM487

3

176

0.73

2

0.32

RM596

10

242

0.65

2

0.35

RM6959

3

92

0.33

8

0.74

RM1341

11

183

0.32

10

0.74

RM 3471

4

149

0.46

5

0.67

RM441

11

185

0.31

6

0.77

RM1359

4

241

0.59

5

0.55

RM4862

11

558

0.94

2

0.11

RM17466

4

172

0.93

2

0.13

RM101

12

154

0.82

3

0.28

RM17473

4

493

0.77

5

0.36

RM309

12

178

0.38

3

0.59

RM17483

4

148

0.85

2

0.22

RM3739

12

377

0.69

5

0.45

RM17486

4

194

0.43

7

0.72

           

 

 

شکل 2- دندروگرام حاصل از تجزیه خوشه ای 95 ژنوتیپ برنج بر اساس اطلاعات 67 نشانگر ریز­ماهواره.

Figure 2- Clustering analysis for 95 rice genotypes base on 67 microsatellite marker.

 

همانطور که در پلات دو­بعدی مشخص است خوشه­های اول و سوم که هر دو دارای ارقام ایرانی هستند فاصله و تمایزکمتری دارند.

تجزیه واریانس مولکولی برای بررسی تمایز و تفکیک خوشه­های ناشی از تجزیه خوشه­ای انجام شد. میزان واریانس درون خوشه­ها 64 % و بین خوشه­ها 36 % محاسبه گردید. مقدار آماره (359/0=F) و در سطح 1 % معنی دار بود (جدول 3) که نشان دهنده تمایز بالا میان خوشه­ها است. در تمامی روش­های به کار برده شده برای تفکیک مجموعه مورد مطالعه مبدا جغرافیایی ژنوتیپ­ها در تفکیک آن­ها دخیل بود و ارقام هر کلاستر عموما از یک کشور بخصوص بودند و یا ویژگی­های ژنتیکی مشابه­ای داشتند. اختلاط برخی ارقام ایرانی مدرن از جمله ندا، پژوهش، قائم و پردیس با ارقام خارجی می­تواند حاکی از این مطلب باشد که ارقام ایرانی مدرن ممکن است حاوی بخشی از ژنوم ارقام خارجی باشند که توسط والدین آنها به این ارقام انتقال یافته است.

 

نتیجه گیری

در این تحقیق از نشانگر ریزماهواره به منظور بررسی تنوع ژنتیکی مجموعه­ای از ژنوتیپ­های ایرانی، لاین­های اصلاحی و ارقام ایرانی و خارجی استفاده شد. نشانگر­های مانند RM 10346 و RM 10386 که دارای بیشترین محتوای اطلاعات چند شکلی بودند را می­توان در مطالعات آتی تنوع ژنتیکی برنج به علت چند شکلی مناسب به کار برد. نتایج بررسی تنوع ژنتیکی به وسیله تجزیه­های مختلف به خوبی قادر به تفکیک ژنوتیپ­های برنج بود.

 

جدول3- تجزیه واریانس مولکولی بین خوشه­ها.

Table 3- Analysis of molecular variance between clusters.

منبع تغییرات

Source of variation

درجه آزادی

Degree of freedom

مجموع مربعات

Sum od squares

میانگین مربعات

Mean of squares

تخمین واریانس

Estimated variance

درصد تغییرات

Present of variation

F

بین خوشه­ها

Between clusters

3

2285.111

761.704

30.998

36

0/395**

درون خوشه­ها

Within clusters

91

5039.268

55.377

55.377

64

 

کل total

94

7324.379

 

86.375

100

 

 

شکل3- پلات دو بعدی مختصات اول و دوم در تفکیک خوشه­ها.

Figure 3-  Bi-dimensional plot of two first coordinates for classification of groups

 

 

در تمامی روش­های به کار برده شده برای تفکیک مجموعه مورد مطالعه مبدا جغرافیایی ژنوتیپ­ها در تفکیک آن­ها دخیل بود و ارقام هر خوشه عموما از یک کشور بخصوص بودند و یا ویژگی­های ژنتیکی مشابه­ای داشتند. ارقام ایتالیایی، ژنوتیپ­های بومی ایرانی، لاین­های موسسه بین­المللی تحقیقات برنج و ارقام مدرن و پر­محصول در خوشه­های جداگانه تفکیک شدند. همچنین بر اساس نتایج تحقیق بهره­گیری از نشانگر­های ریز­ماهواره و تجزیه خوشه ای به روش UPGMA بر اساس معیار فاصله نی در مطالعات تنوع ژنتیکی کارا بنظر می­رسند.


منابع

Addinsoft, S. A. R. L. (2012). "XLstat 2012: Leading Data Analysis and Statistical Solution for Microsoft Excel." Addinsoft SRL 

Agrama HA, Eizenga GC, Yan W (2007). Association mapping of yield and its components in rice cultivars. Molecular Breeding. 19:341-356.

Amini Nasab R, Ebrahimi M.A, Ebadi A.A, Ghodsi M (2012). Study of Genetic Variation in Iranian Rice (Oryza sativa L.) Varieties by using Molecular Markers Linked with Drought Resistance Genes.Crop Biotechnology. 2:15-25

Abutalebi Sh, Fotokian M.H, Zeinalabedini M (2014). Evaluation of Genetic Diversity and Population Structure of Rice Cultivars using Microsatellite Markers linked to iron and zinc. Journal of Agricultural Biotechnology. 16:1-14

Ashfaq M, Khan AS (2012). Genetic diversity in basmati rice (Oryza sativa L.) germplasm as revealed by microsatellite (SSR) markers. Russian journal of genetics. 48:53-62.

Borba, T. C. D. O., Brondani, R. P. V., Breseghello, F., Coelho, A. S. G., Mendonça, J. A., Rangel, P. H. N., & Brondani, C. (2010). Association mapping for yield and grain quality traits in rice (Oryza sativa L.). Genetics and molecular biology 33: 515-524.

Cao Q, Lu B-R, Xia H, Rong J, Sala F, Spada A, Grassi F (2006). Genetic diversity and origin of weedy rice (Oryza sativa f. spontanea) populations found in north-eastern China revealed by simple sequence repeat (SSR) markers. Annals of botany. 98:1241-1252

Choudhary, G., Ranjitkumar, N., Surapaneni, M., Deborah, D. A., Vipparla, A., Anuradha, G., Siddiq, E. A. & Vemireddy, L. R. (2013). Molecular genetic diversity of major Indian rice cultivars over decadal periods. PloS one 8: e66197.

Dellaporta S, Wood J, Hicks J (1983). A plant DNA minipreparation: Version II. Plant Molecular Biology Reporter 1:19-21.

Doebley J, Wendel J, Smith JSC, Stuber C, Goodman M (1988). The origin of cornbelt maize: The isozyme evidence. Economic Botany 42:120-131.

Huang M, Xie F-m, Chen L-y, Zhao X-q, Jojee L, Madonna D (2010). Comparative Analysis of Genetic Diversity and Structure in Rice Using ILP and SSR Markers. Rice Science 17: 257-268.

Jackson M, Juggan R (1993). Sharing the diversity of rice to feed the world. Diversity. 9:22-25

Ji YT, Qu CQ, Cao BY (2007). An optimal method of DNA silver staining in polyacrylamide gels. Electrophoresis 28: 1173-1175.

Jin L, Lu Y, Xiao P, Sun M, Corke H, Bao J (2010). Genetic diversity and population structure of a diverse set of rice germplasm for association mapping. Theorethical Applied Genetics 121:475-487.

Khush, G.S. (2005). What it will take to feed 5.0 billion rice consumers in 2030. Plant Molecular Biology 59: 1–6.

Liu K, Muse SV (2005). PowerMarker: an integrated analysis environment for genetic marker analysis. Bioinformatics 21: 2128-2129.

Mohammadi S, Prasanna B (2003). Analysis of genetic diversity in crop plants—salient statistical tools and considerations. Crop Science 43: 1235-1248.

Peakall R, Smouse PE (2012). GenAlEx 6.5: genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research--an update. Bioinformatics 28: 2537-2539.

Rotolski IA, VogeI JM, Morgoante M, PoweII IW, Andre C, Tingey SV (1996). Generating and using DNA markers in plants Nonmammalian genomic analysis: a practical guide:75.

Smith JS, Chin EC, Shu H, Smith OS, Wall SJ, Senior ML, Mitchell SE, Kresovich S, Ziegle J (1997). An evaluation of the utility of SSR loci as molecular markers in maize (Zea mays L.): comparisons with data from RFLPs and pedigree. Theorethical Applied Genetics 95: 163-173

Smith O, Smith J (1992). Measurement of genetic diversity among maize hybrids-a comparison of isozymic, RFLP, pedigree, and heterosis data. Maydica 37: 53-60.

Tanksley SD (1983) Molecular markers in plant breeding. Plant Molecular Biology Reports 1: 3-8

Yan WG, Li Y, Agrama HA, Luo D, Gao F, Lu X, Ren G (2009). Association mapping of stigma and spikelet characteristics in rice (Oryza sativa L.) Molecular Breeding 24: 277-292.

Zarea R, Mohammadi-Nejad G, Shahsavand-Hassani H  (2013). Allelic variation of containing markers in responsible QTL for salinity tolerance (Saltol) at seedling stage in Iranian rice cultivars. Journal of Agricultural Biotechnology. 5:1-14

Zhang, P., Li, J., Li, X., Liu, X., Zhao, X., & Lu, Y. (2011). Population structure and genetic diversity in a rice core collection (Oryza sativa L.) investigated with SSR markers. PloS one 6: e27565.

 

 

 

 

Genetic diversity analysis in a global panel of rice genotypes by microsatellites

 

Jahani M.*1, Nematzadeh Gh.A.2, Mohammadi-Nejad Gh.3

 

1Department of Agronomy and Plant Breeding, College of Agriculture, Shahid Bahonar University of Kerman, Iran.

2Department of biotechnology and Plant Breeding, College of Agronomy Sciences, Sari Agricultural Sciences and Natural Resources University (SANRU), Iran.

3Department of Agronomy and Plant Breeding, College of Agriculture, Shahid Bahonar University of Kerman, Iran.

 

 

 

Abstract

The study was designed to characterize the genetic diversity of 95 rice genotypes from various countries by 67 microsatellite markers which covered all rice chromosomes. Number of 303 alleles was detected with an average of 4.52 alleles per locus. The average polymorphism information content value across the marker dataset was 0.51, and it was varied from 0.81 (RM 10346) to 0.11 (RM 4862). The cluster analysis based on UPGMA and Nei genetic distance grouped the studied population in four main subgroups with a significant tendency to cluster by geographical origins. Phylogenetic relationships among the genotypes were in agreement with cluster analysis results. Principal co-ordinates analysis (PCoA) with considering two first co-ordinates that explained about 71.15% of the total variation also confirmed cluster analysis results. Accuracy of cluster analysis was assessed by analysis of molecular variance and results revealed significant difference between clusters. The present study by evaluation genetic distances in part of Iranian germplasm against foreign inbreed lines and varieties obtain appropriate results for applying Iranian germplasm in rice breeding projects.

Key words: Rice, Genetic diversity, SSR, Cluster analysis, Principal Co-ordinates Analysis.

 



* نویسنده مسئول: مجتبی جهانی                                      تلفن: 03433257510                  Email: mojtaba.jahani@hotmail.com

[1] International Rice Research Institute (IRRI)

[2] Genetics and Agricultural Biotechnology Institute of Tabarestan (GABIT)

* Corresponding Author: Jahani M.                 Tel: 03433257510              Email: mojtaba.jahani@hotmail.com

Addinsoft, S. A. R. L. (2012). "XLstat 2012: Leading Data Analysis and Statistical Solution for Microsoft Excel." Addinsoft SRL 
Agrama HA, Eizenga GC, Yan W (2007). Association mapping of yield and its components in rice cultivars. Molecular Breeding. 19:341-356.
Amini Nasab R, Ebrahimi M.A, Ebadi A.A, Ghodsi M (2012). Study of Genetic Variation in Iranian Rice (Oryza sativa L.) Varieties by using Molecular Markers Linked with Drought Resistance Genes.Crop Biotechnology. 2:15-25
Abutalebi Sh, Fotokian M.H, Zeinalabedini M (2014). Evaluation of Genetic Diversity and Population Structure of Rice Cultivars using Microsatellite Markers linked to iron and zinc. Journal of Agricultural Biotechnology. 16:1-14
Ashfaq M, Khan AS (2012). Genetic diversity in basmati rice (Oryza sativa L.) germplasm as revealed by microsatellite (SSR) markers. Russian journal of genetics. 48:53-62.
Borba, T. C. D. O., Brondani, R. P. V., Breseghello, F., Coelho, A. S. G., Mendonça, J. A., Rangel, P. H. N., & Brondani, C. (2010). Association mapping for yield and grain quality traits in rice (Oryza sativa L.). Genetics and molecular biology 33: 515-524.
Cao Q, Lu B-R, Xia H, Rong J, Sala F, Spada A, Grassi F (2006). Genetic diversity and origin of weedy rice (Oryza sativa f. spontanea) populations found in north-eastern China revealed by simple sequence repeat (SSR) markers. Annals of botany. 98:1241-1252
Choudhary, G., Ranjitkumar, N., Surapaneni, M., Deborah, D. A., Vipparla, A., Anuradha, G., Siddiq, E. A. & Vemireddy, L. R. (2013). Molecular genetic diversity of major Indian rice cultivars over decadal periods. PloS one 8: e66197.
Dellaporta S, Wood J, Hicks J (1983). A plant DNA minipreparation: Version II. Plant Molecular Biology Reporter 1:19-21.
Doebley J, Wendel J, Smith JSC, Stuber C, Goodman M (1988). The origin of cornbelt maize: The isozyme evidence. Economic Botany 42:120-131.
Huang M, Xie F-m, Chen L-y, Zhao X-q, Jojee L, Madonna D (2010). Comparative Analysis of Genetic Diversity and Structure in Rice Using ILP and SSR Markers. Rice Science 17: 257-268.
Jackson M, Juggan R (1993). Sharing the diversity of rice to feed the world. Diversity. 9:22-25
Ji YT, Qu CQ, Cao BY (2007). An optimal method of DNA silver staining in polyacrylamide gels. Electrophoresis 28: 1173-1175.
Jin L, Lu Y, Xiao P, Sun M, Corke H, Bao J (2010). Genetic diversity and population structure of a diverse set of rice germplasm for association mapping. Theorethical Applied Genetics 121:475-487.
Khush, G.S. (2005). What it will take to feed 5.0 billion rice consumers in 2030. Plant Molecular Biology 59: 1–6.
Liu K, Muse SV (2005). PowerMarker: an integrated analysis environment for genetic marker analysis. Bioinformatics 21: 2128-2129.
Mohammadi S, Prasanna B (2003). Analysis of genetic diversity in crop plants—salient statistical tools and considerations. Crop Science 43: 1235-1248.
Peakall R, Smouse PE (2012). GenAlEx 6.5: genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research--an update. Bioinformatics 28: 2537-2539.
Rotolski IA, VogeI JM, Morgoante M, PoweII IW, Andre C, Tingey SV (1996). Generating and using DNA markers in plants Nonmammalian genomic analysis: a practical guide:75.
Smith JS, Chin EC, Shu H, Smith OS, Wall SJ, Senior ML, Mitchell SE, Kresovich S, Ziegle J (1997). An evaluation of the utility of SSR loci as molecular markers in maize (Zea mays L.): comparisons with data from RFLPs and pedigree. Theorethical Applied Genetics 95: 163-173
Smith O, Smith J (1992). Measurement of genetic diversity among maize hybrids-a comparison of isozymic, RFLP, pedigree, and heterosis data. Maydica 37: 53-60.
Tanksley SD (1983) Molecular markers in plant breeding. Plant Molecular Biology Reports 1: 3-8
Yan WG, Li Y, Agrama HA, Luo D, Gao F, Lu X, Ren G (2009). Association mapping of stigma and spikelet characteristics in rice (Oryza sativa L.) Molecular Breeding 24: 277-292.
Zarea R, Mohammadi-Nejad G, Shahsavand-Hassani H  (2013). Allelic variation of containing markers in responsible QTL for salinity tolerance (Saltol) at seedling stage in Iranian rice cultivars. Journal of Agricultural Biotechnology. 5:1-14
Zhang, P., Li, J., Li, X., Liu, X., Zhao, X., & Lu, Y. (2011). Population structure and genetic diversity in a rice core collection (Oryza sativa L.) investigated with SSR markers. PloS one 6: e27565.