The study of Zn2+ and Cu2+ effects on myrosinase activity and sulforaphane production in Lepidium draba

بررسی اثر یون­های مس و روی  بر فعالیت آنزیم میروزیناز و تشکیل سولفارافان در گیاه Lepidium draba

مهدی محمدی¹، علی ریاحی مدوار*²، شهرام پورسیدی³،  مریم امینی­زاده¹

¹ دانش­آموخته کارشناسی ارشد رشته بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشکده علوم و فناوری­های نوین، دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته، کرمان، ایران.

² استادیار گروه بیوتکنولوژی، پژوهشکده علوم محیطی، پژوهشگاه علوم و تکنولوژی پیشرفته و علوم محیطی، دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته، کرمان، ایران.

³ استادیار گروه بیوتکنولوژی، دانشگاه شهید باهنر کرمان، ایران.

تاریخ دریافت: 20/11/1392، تاریخ پذیرش: 11/11/1393

چکیده

میروزیناز یک آنزیم بتا-تیوگلوکوزید گلوکوهیدرولاز است که با جدا نمودن یک گلوکز از گلوکوزینولات­ها یک حدواسط ناپایدار بنام آگلیکون تولید می­نماید. اگلیکون تحت شرایط محیط بازآرایی نموده و به ترکیبات مختلفی از قبیل  تیوسیانات، ایزوتیوسیانات و نیتریل تبدیل می­شود که از بین آن­ها، ایزوتیوسیانات­ها اهمیت دارویی بسیاری دارند. سولفارافان یکی از مهم­ترین ایزوتیوسیانات­ها است که از هیدرولیز گلوکوزینولات گلوکورافانین توسط میروزیناز بدست می­آید. در این تحقیق، جهت بررسی اثر یون­های مس و روی بر فعالیت آنزیم میروزیناز و بازآرایی قطعه آگلیکون در گیاه ازمک (Lepidium draba)، بترتیب مقدار گلوکز و مقدار سولفارافان تولید شده مورد آنالیز قرار گرفتند. نتایج نشان­دهنده افزایش معنی­دار فعالیت آنزیم میروزیناز در غلظت 8 میکرومولار یون روی در مقایسه با نمونه شاهد می­باشد، البته با افزایش غلظت این یون در محیط، فعالیت آنزیم بطور معنی­داری کاهش یافت. در حالیکه در حضور یون­های مس، فعالیت این آنزیم در تمامی غلظت­ها نسبت به نمونه شاهد به طور معنی­داری افزایش یافت و بیشترین میزان فعالیت در غلظت 4 میکرو­مولار­ یون مس مشاهده گردید. از طرف دیگر، مقدار سولفارافان در حضور هر دو یون به ویژه یون روی نسبت به نمونه شاهد کاهش یافت. از مجموع نتایج چنین استنباط می­شود، یون­های مذکور به ویژه عنصر مس در غلظت­های کم اثر تحریکی بر فعالیت میروزیناز دارد. همچنین این یون­ها به ویژه یون­ روی بر بازآرایی آگلیکون نیز تاثیر داشته و مسیر بازآرایی را به سمت ترکیباتی دیگر، غیر از ایزوتیوسیانات­ها منحرف می­کنند. لذا حضور یون­های فلزی در طی واکنش سبب کاهش تولید سولفارافان می­گردد.

کلمات کلیدی: گلوکوزینولات­ها، میروزیناز، ایزوتیوسیانات، سولفارافان، گلوکورافانین.

مقدمه

گلوکوزینولات­ها گروهی از ترکیبات ثانویه حاوی سولفور و نیتروژن هستند که از اسیدهای آمینه مشتق شده­اند و در گیاهان خانواده Brassica به فراوانی یافت می­شوند. تا به امروز حدود 120 نوع گلوکوزینولات­ مختلف گزارش شده ­است (Fahey et al., 2001) این ترکیبات که در واکوئل سلول­های گیاهان ذخیره می­شوند، پس از خورده شدن توسط علف­خواران، شکستن یا حمله پاتوژن­ها به سلول در تماس با آنزیم میروزیناز (β- تیو گلوکوزید گلوکوهیدرولاز) (EC  3.2.3.1) قرار می­گیرند. میروزیناز پیوند β-تیوگلوکوزیدی موجود در مولکول­های گلوکوزینولات را می­شکند و گلوکز، سولفات و یک ترکیب حدواسط ناپایدار به نام آگلیکون تولید می­کند (Liang et al., 2006). آگلیکون به صورت خود بخودی و بسته به شرایط محیط ترکیبات مختلفی از قبیل ایزوتیوسیانات­، نیتریل و تیوسیانات تولید می­کند (شکل 1) (Rask et al., 2000). گلوکورافانین (4-متیل سولفینیل بوتیل گلوکوزینولات) نوعی گلوکوزینولات است که تحت هیدرولیز آنزیمی میروزیناز تولید ایزوتیوسیانات سولفارافان (1-ایزوتیوسیانات-4-متیل سولفونیل بوتان) می­نماید که یک ماده شگفت­انگیز از نظر دارویی است (Traka & Richard, 2009). از مهم­ترین خواص درمانی و کلینیکی سولفارافان می­توان به القای آپوپتوز (Choi et al., 2008)، خواص ضد باکتریایی (Fahey et al., 2002)، ضد هیستون داستیلاز (Myzak et al., 2004)، خاصیت آنتی اکسیدانی (Gao et al., 2001 (Yeh & Yen, 2009;  و ضد متاستازی (Singh et al., 2009) و غیره اشاره نمود. از طرفی نیتریل­ها خواص درمانی مفیدی را نشان نداده­اند و حتی ممکن است برای سلول­های نرمال هم سمیت ایجاد کنند (Matusheski et al., 2001). حضور میروزیناز در تمامی گیاهان حاوی گلوکوزینولات اثبات گردید (Rask et al., 2000). میروزیناز بدست آمده از دانه­های خردل یک گلایکوپروتئین است که میزان کربوهیدرات­های آن به 18 درصد می­رسد و اغلب قند­های آن از نوع هگزوز می­باشد. آنزیم میروزیناز اغلب با گلوکوزینولات­ها یافت می­شود. این­ متابولیت­ها در تمام گونه­های خانواده شب­بو و همچنین در گونه­هایی چون Bataceae ، Caricaceae، Euphorbiaceae، Moringaceae نیز گزارش شده­اند (Ohtsuru et al., 1972). در قارچ­هایی چون Aspergillus sydowi و Aspergillus. niger  و باکتری­های اولیه Enterobacter cloacae وParacolobactrum aerogenoides  آنزیم­هایی با خصوصیات میروزیناز مشاهده شده است. همچنین در بافت­های پستان­داران و شته کلم Brevicoryne brassicae  و Lipaphis erisimi  آنزیم­های مشابهی گزارش شده است.

میزان فعالیت آنزیم میروزیناز در گونه­های مختلف گیاهی مورد آزمایش قرار گرفته و مشخص شده که آنزیم میروزیناز در Sinapis alba بیشترین فعالیت و درBrassica rapa  کمترین فعالیت را دارد (Henderson et al., 1972). مطالعات گذشته نشان داده است که آنزیم میروزیناز دارای دو زیر واحد کاملاً مساوی با وزن مولکولی KDa 75 می­باشد (Bones et al., 1989). مطالعات ایمونولوژی نشان داده است که میروزیناز با اتصال به پروتئین­های متصل شونده می­تواند مولکول­هایی با وزن بالا ایجاد کند (Eriksson et al., 2002). در خانواده Brassica  میروزیناز، کمپلکس­هایی با وزن مولکولی متفاوت ایجاد می­کند (KDa 600-500، KDa 350-270 و KDa 200-140) (Bellostas et al., 2008).

مشخص شده است که آنزیم میروزیناز استخراج شده از Sinapis alba حاوی یون روی است (Burmeister et al., 1997) بنابراین ممکن است که روی یا دیگر یون­های فلزی در ساختار میروزیناز سایر اعضای خانواده Brassica وجود داشته و نقش مهمی را در تجزیه گلوکوزینولات­ها داشته باشند. همچنین نشان داده شده است که یون روی در گیاه بروکلی باعث افزایش تولید سولفارافان و آزاد سازی گلوکز می­شود (Liang et al., 2006). بنابراین، این فرضیه وجود دارد که یون روی ممکن است بر فعالیت آنزیم میروزیناز و یا بازآرایی قطعه آگلیکون تاثیر بگذارد و موجب افزایش سولفارافان شود (Liang et al., 2006). به طور کلی مشخص شده است که pH پایین، وجود یون فرو و پروتئین­های Epithiospecifier برای تشکیل نیتریل­ها در هنگام شکستن گلوکوزینولات­ها به وسیله آنزیم میروزیناز مفید هستند (Zabala et al., 2005). البته یون فرو تاثیری بر آزادسازی گلوکز در تجزیه سینیگرین توسط میروزیناز در شرایط اسیدی ندارد (Butcher et al., 1984). همچنین گزارش شده است که یون­های مس و منیزیم باعث جلوگیری از تولید سولفارافان و آزاد سازی گلوکز در بروکلی می­شوند (Liang et al., 2006) اما مشخص نیست که بر فعالیت میروزیناز اثر دارد یا بر بازآرایی اگلیکون. گیاه ازمک با نام علمی  Lipidium draba Lاز خانواده براسیکا بوده و یک گیاه تجمع کننده فلزات سنگین از قبیل مس و روی می­باشد (Chehregani et al., 2007). این گیاه همچنین یک منبع بی­نظیر از گلوکورافانین برای تولید سولفارافان است (Powell et al., 2005). تاکنون گزارشی مبنی بر بهینه سازی شرایط هیدرولیز آنزیمی در این گیاه منتشر نشده است، این در حالی است که گیاه ازمک بطور عمده دارای دو نوع گلوکوزینولات گلوکورافانین و گلوکوسینالبین است (Powell et al., 2005) و این ویژگی عمل استخراج گلوکورافانین از این گیاه را نسبت به سایر گیاهان خانواده براسیکا به مراتب آسان­تر می­کند (Powell et al., 2005). همانطور که در بالا اشاره گردید، حضور فلزات مختلف می­تواند با اثر بر فعالیت آنزیم میروزیناز و بازآرایی قطعه آگلیکون، تولید سولفارافان را تحت تاثیر قرار دهد. لذا در این مطالعه، بمنظور بررسی اثرات غلظت­های مختلف یون­های روی و مس بر فعالیت آنزیم میروزیناز و بازآرایی قطعه آگلیکون در گیاهچه­های ازمک، بترتیب محتوی گلوکز و سولفارافان تولید شده مورد آنالیز قرار گرفتند.

شکل 1- واکنش هیدرولیز گلوکوزینولات توسط آنزیم میروزیناز (Liang et al., 2006).

Figure 1- Reaction of glucosinolates hydrolysis by myrosinase (Liang et al., 2006).      

مواد و روش­ها

کشت بذرها و تولید گیاهچه

بذرهای بالغ گیاه ازمک از اطراف استان کرمان در اواخر بهار و اوایل تابستان برداشت شد و توسط یک گیاه­شناس صحت گیاه مورد نظر تایید گردید. جهت ضد عفونی سطحی، ابتدا بذرها با اتانول 70 درصد به مدت 30 ثانیه آغشته شدند و پس از شستشو با آب مقطر استریل به مدت 10 دقیقه در هیپوکلریت سدیم 3 درصد غوطه­ور گردیدند و در نهایت با مقدار زیادی آب مقطر استریل شسته شدند. تعداد 30 عدد بذر روی محیطMS  (Murashige & Skook, 1962) حاوی آگار 8/0 درصد با فاصله تقریبی 5/0 سانتی­متر از یکدیگر در داخل پتری­ قرار گرفتند. سپس پتری­ها به ژرمیناتور با دمای کنترل شده 2±28 درجه ­سانتی­گراد به مدت 7 روز با دوره نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی و رطوبت نسبی 60 درصد قرار داده شدند. گیاهچه های 7 روزه از محیط کشت خارج و پس از شست و شو با آب مقطر استریل جهت آزمایشات بعدی مورد استفاده قرار گرفتند.

بررسی اثر یون­ها بر فعالیت آنزیم میروزیناز و بازآرایی قطعه آگلیکون

به منظور بررسی اثر یون­ها بر فعالیت آنزیم میروزیناز و بازآرایی قطعه آگلیکون از روش تغییر یافته Liang و همکاران (2006)، استفاده شد. به طور خلاصه، مقدار 2 گرم از گیاهچه­های 7 روزه از محیط کشت خارج و بعد از شستشو با آب مقطر استریل در داخل هاون به صورت کامل ساییده شدند. در مرحله بعد یک میلی­لیتر از محلول حاوی یون­های سولفات مس و سولفات روی با غلظت­های مختلف (صفر به عنوان شاهد، 4 ،  8  و 16 میکرومولار) در pH خنثی به بافت­های ساییده شده اضافه گردید. سپس مخلوط حاصل به مدت دو ساعت در دمای 2±42 درجه ­سانتی­گراد قرار داده شد. در ادامه مخلوط حاصل به دو بخش کاملاً مساوی جهت تعیین غلظت سولفارافان و تعیین غلظت گلوکز تقسیم شدند.

تعیین غلظت سولفارافان

جهت تعیین مقدار سولفارافان تولید شده تحت شرایط آزمایش، از روش Liang  و همکاران (2006) با اندکی تغییرات استفاده شد. به یک میلی­لیتر از مخلوط بدست آمده (اشاره شده در قسمت قبل)،  5 میلی­لیتر استونیتریل اضافه و سپس به مدت 3 دقیقه سونی­کیت شد. در ادامه، مخلوط حاصله با دور rpm 10000 به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی­گراد سانتریفوژ شد. محلول رویی برداشته و پس از فیلتراسیون با استفاده از  فیلتر سر سرنگی 2/0 میکرومتری،  به ستون C18 (25 × 0.46 cm) دستگاه HPLC (Agilent 1100 series, USA )  تزریق گردید. از طول موج nm 254 جهت شناسایی سولفارافان استفاده شد. از محلول استاندارد سولفارافان (سیگما) برای تعیین زمان نگه­داری نمونه در ستون و همچنین تعیین مقدار سولفارافان تولید شده استفاده گردید.

تعیین غلظت گلوکز

جهت تعیین غلظت گلوکز، به منظور بررسی فعالیت آنزیم میروزیناز از روش تغییر یافته Wilkinson  و همکاران استفاده شد (Wilkinson et al., 1984). به این منظور، به یک میلی­لیتر از مخلوط بدست آمده (اشاره شده در قسمت قبل)،  مقدار 3 میلی­لیتر آب مقطر استریل اضافه و سپس به مدت 5 دقیقه با دور rpm  8000 در دمای اتاق سانتریفوژ گردید. در نهایت محلول رویی برداشته و پس از فیلتراسیون با استفاده از فیلتر سر سرنگی µm 2/0، جهت سنجش میزان گلوکز از دستگاه بیواسکن (Bioscan Metrohm, Switzerland) استفاده شد. همچنین از غلظت­های مختلف گلوکز جهت ترسیم منحنی استاندارد استفاده گردید.

آنالیز آماری

تمامی آزمایش­ها با 3 تکرار مستقل و در قالب یک طرح کاملاً تصادفی انجام شدند. میانگین داده­ها با استفاده از نرم افزار SAS توسط آزمون دانکن (Duncan test) و با در نظر گرفتن سطح اطمینان P≤0.05 مورد تجزیه واریانس یک عاملی (One way ANOVA) قرار گرفتند.

نتایج

تعیین غلظت سولفارافان

از استاندارد سولفارافان جهت تعیین زمان نگه­داری نمونه در ستون استفاده شد. همانطور که در شکل 2 قابل مشاهده است، 7 دقیقه بعد از تزریق نمونه استاندارد به ستون، پیک نمونه خارج شد. همچنین پیکی مشابه در همین زمان برای نمونه­های شاهد و تیمار شده نیز مشاهده گردید (شکل مربوطه نشان داده نشد).

اثر یون­های روی و مس بر فعالیت آنزیم میروزیناز

در حالی­که پایین­ترین غلظت روی (4 میکرومولار) بر فعالیت آنزیم میروزیناز تاثیر نداشت، فعالیت آنزیم در حضور غلظت 8  میکرومولار روی به طور معنی­داری نسبت به نمونه شاهد افزایش نشان داد. ولی با افزایش غلظت این یون در محیط، کاهش معنی­داری در فعالیت آنزیم نسبت به نمونه شاهد مشاهده گردید (شکل 3، A). همانطور که در شکل 3، B قابل مشاهده است، فعالیت این آنزیم در حضور غلظت­های مختلف یون مس نسبت به نمونه شاهد به طور معنی­داری افزایش یافته است. بیشترین میزان فعالیت آنزیم در حضور غلظت 4 میکرومولار یون مس مشاهده گردید و با افزایش غلظت این یون در محیط، میزان فعالیت آن نسبت به غلظت 4 میکرومولار به طور معنی داری کاهش نشان ­داد. اطلاعات مربوط به تجزیه واریانس نتایج حاصله در جدول 1 نشان داده شده است.

اثر یون­های روی و مس بر بازآرایی قطعه آگلیکون بسمت تولید سولفارافان

تشکیل سولفارافان در تیمار با یون روی به طور معنی­داری نسبت به نمونه شاهد کاهش یافت ولی تفاوت قابل توجهی بین تولید سولفارافان در تیمار با غلظت­های مختلف این یون مشاهده نشد (شکل 4، A). تشکیل سولفارافان در حضور یون مس نیز نسبت به نمونه شاهد کاهش یافت. در حالیکه میزان کاهش در غلظت 4 میکرومولار در مقایسه با نمونه شاهد معنی­دار نبود، کاهش معنی­دار مقدار سولفارافان در غلظت­های بالاتر این یون مشاهده گردید و بیشترین مقدار کاهش در غلظت 8 میکرومولار رخ داد (شکل 4، B). اطلاعات مربوط به تجزیه واریانس نتایج حاصله در جدول 2 نشان داده شده است.

شکل 2- کروماتوگرام مربوط به نمونه استاندارد سولفارافان. زمان نگه­داری نمونه در ستون هفت دقیقه پس از تزریق می­باشد.

Figure 2- HPLC chromatogram of the solforaphane standard.  Retention time of sample is around 7 minutes after injection.

جدول 1- تجزیه واریانس فعالیت آنزیم میروزیناز (آزادسازی گلوکز) تحت تاثیر یون­های­ روی و مس.

Table 1- Variance analysis of myrosinase enzyme activity (liberation of glucose) under the influence of zinc and copper ions.

شکل 3- فعالیت آنزیم میروزیناز در حضور غلظت­های مختلف یون­های روی ( A) و مس (B). حروف متفاوت بیانگر تفاوت معنی­دار در سطح 5 درصد می­باشد.

Figure 3- Myrosinase activity in presence of different concentrations of Zn (A) and Cu (B) ions. Different letters show a significant difference at p≤0.05.

شکل 4- محتوی سولفارافان تولید شده در حضور غلظت­های مختلف یون­های روی (A) و مس (B). حروف مختلف بیانگر تفاوت معنی­دار در سطح 5 درصد می­باشد.

Figure 4- Content of produced sulforaphane in presence of different concentrations of Zn (A) and Cu (B) ions. Different letters show a significant difference at p≤0.05.

جدول 2- تجزیه واریانس تولید سولفارافان تحت تاثیر یون­های روی و­ مس.

Table 2- Variance analysis of sulforaphane production under the influence of Zinc and copper ions.

بحث

سولفارافان، ایزوتیوسیانات مشتق شده از گلوکوزینولات­­ گلوکورافانین است که به دلیل خواص ضد سرطانی بسیار مورد توجه قرار گرفته است (Shapiro et al., 1998). سوبسترای این ماده به وفور در گیاهان بروکلی، ازمک و تربچه وجود دارد (West et al., 2004). برخلاف  اغلب جنس­های این خانواده گیاه ازمک (L. draba) به طور عمده حاوی دو نوع گلوکوزینولات گلوکورافانین و گلوکوسینالبین است بنابراین تخلیص گلوکورافانین از این گیاه راحت­تر می­باشد (Powell et al., 2005). با توجه به اینکه این گیاه، جاذب مناسبی برای فلزات روی و مس می­باشد (Chehregani et al., 2007)، در این مطالعه اثر غلظت­های مختلف یون­های مس و روی بر فعالیت آنزیم میروزیناز مورد بررسی قرار گرفت. با توجه به اینکه آنزیم میروزیناز پیوند تیوگلوکوزید موجود در گلوکوزینولات­ها را می­شکند و گلوکز آزاد می­شود، مقدار گلوکز آزاد شده به عنوان معیاری جهت سنجش اثر فلزهای مذکور بر فعالیت آنزیم میروزیناز در مقایسه با نمونه شاهد مورد ارزیابی قرار گرفت (Liang et al., 2006). همانطور که در شکل 3، A مشاهده می­شود، فعالیت این آنزیم تحت تاثیر یون­های مذکور قرار گرفت. یون مس تاثیر بیشتری بر فعالیت آنزیم میروزیناز در مقایسه با یون روی دارد. همانطور که در نتایج نشان داده شده است یون روی تا غلظت­ 8 میکرومولار فعالیت آنزیم میروزیناز را افزایش داده و در بالاترین غلظت سبب کاهش معنی­دار فعالیت آنزیم شده است. بیشترین فعالیت آنزیم در تیمار با یون روی در تیمار با غلظت 8 میکرومولار مشاهده گردید که تقریباً 5/1 برابر نمونه شاهد بود.  Liang و همکاران (2006) مشاهده کردند که یون روی تا غلظت mM 10 بر فعالیت آنزیم میروزیناز (تولید گلوکز) دانه­های بروکلی اثر تحریکی دارد. در مقابل، Prakash و همکاران اثر منفی یون­ روی را بر فعالیت آنزیم میروزیناز جداسازی شده از گیاه بروکلی مشاهده کردند. آنها دلیل احتمالی مهار فعالیت آنزیم در حضور یون روی را به بلوکه شدن جایگاه اتصال سوبسترا و یا ناپایداری کمپلکس آنزیم-سوبسترا نسبت دادند (Prakash et al., 2013).

فعالیت آنزیم میروزیناز در حضور تمامی غلظت­های یون مس به طور معنی­داری نسبت به نمونه شاهد افزایش نشان داد. بیشترین اثر یون مس در پایین­ترین غلظت (4 میکرومولار) آن مشاهده شد بطوریکه فعالیت آنزیم تقریباً دو برابر نمونه شاهد افزایش یافته بود. این مشاهدات با نتایج گزارش شده توسطLiang  و همکاران (2006) و Prakash و همکاران (2013) که اثر یون مس را به ترتیب بر روی میروزیناز دانه­های بروکلی و تخلیص شده از گیاه بروکلی ارزیابی می­کردند مغایرت دارد. تفاوت نتایج حاصله می­تواند به ساختار و همچنین شرایط آزمایش مرتبط باشد. علاوه بر این، غلظت یون و همچنین زمان درمعرض قرار گرفتن آنزیم با یون می­تواند بر تفاوت نتایج حاصله موثر باشد (Prakash et al., 2013). از طرف دیگر، یکی از محصولات بدست آمده ناشی از تجزیه گلوکوزینولات­ها تحت هیدرولیز آنزیمی میروزیناز، قطعه آگلیکون می­باشد که ناپایدار بوده و تحت شرایط محیط می­تواند به ترکیبات مختلفی تبدیل شود. با توجه به حضور قابل توجه گلوکورافانین در گیاه ازمک draba) L.) (Powell et al., 2005) و توانایی تبدیل آن به ایزوتیوسیانات سولفارافان، مقدار این ترکیب به عنوان معیاری برای بررسی اثر یون­های مس و روی بر بازآرایی قطعه آگلیکون در جهت تولید ایزوتیوسیانات در مقایسه با نمونه شاهد ارزیابی گردید­. همانطور که در شکل 4 قابل مشاهده می­باشد اثر این یون­ها بر بازآرایی قطعه آگلیکون به سمت ایزوتیوسیانات سولفارافان مهاری بوده است.

کاهش محتوی سولفارافان در دانه­های بروکلی در حضور یون مس توسطLiang  و همکاران (2006) نیز گزارش شد که با نتایج بدست آمده کاملاً مطابقت دارد. در مقابل کاهش محتوی سولفارافان در گیاه ازمک در حضور یون روی (شکل 4)، افزایش تولید آن در دانه­های بروکلی در حضور این یون مشاهده گردید (Liang et al., 2006). تاثیر متفاوت این یون بر تولید سولفارافان در دو گیاه می­تواند ناشی از تفاوت غلظت و زمان درمعرض قرار گرفتن یون با قطعه آگلیکون مرتبط باشد. اگر چه مطالعات بیشتری لازم است تا اطلاعات دقیقتری در ارتباط با فعالیت و ساختار آنزیم میروزیناز در گیاه ازمک بدست آید، از نتایج بدست آمده چنین استنباط می­شود که یون­های مس و روی به ویژه در غلظت­های پایین اثر تحریکی بر فعالیت آنزیم میروزیناز دارند در حالیکه اثر آن­ها بر بازآرایی قطعه آگلیکون به سمت ایزوتیوسیانات­ها مهاری می­باشد. با توجه به مطالعات گذشته که نشان داده است تشکیل نیتریل­ درحضور یون دو ظرفیتی آهن (Fe²⁺) تسهیل می­شود (Butcher et al., 1984)، چنین به نظر می­رسد که در حضور یون­های دوظرفیتی مس و روی نیز بازآرایی قطعه آگلیکون به سمت نیتریل می­باشد تا ایزوتیوسیانات. در مجموع مس اثر مثبت­تری بر فعالیت آنزیم میروزیناز در مقایسه با یون­های روی دارد. اهمیت این مطالعه در بهینه­سازی شرایط برای افزایش تولید سولفارافان از این گیاه دارویی بسیار حائز اهمیت می­باشد.