Evaluation of the phenotypic and genotypic diversity of the bacterial species causing gummy spike blight of wheat and barley

Nik Akhtar, Sahar; Rahimian, Heshmat Allah; Baba Zad, Vali Allah

doi:10.22103/jab.2016.1424

Evaluation of the phenotypic and genotypic diversity of the bacterial species causing gummy spike blight of wheat and barley

Document Type : Research Paper

Authors

10.22103/jab.2016.1424

Abstract

Gummy spike blight is a disease of wheat (Triticum aestivum) in several cereal growing areas of Iran. Rathayibacter iranicus, as the causative agent of the disease of wheat and barley ,appears to be confined to Iran. To evaluate possible phenotypic and genotypic diversity of strains infecting wheat and barley, infected spikes were collected from East Azarbaijan , Ilam, Isfahan, Fars and Khuzestan provinces and the associated bacteria were isolated from the spikelets and characterized. Fifteen strains were selected as representatives of groups displaying one or a few differences in phenotypic features or total protein electrophoretic patterns and were used in genotypic comprisons. DNA was extracted from these isolates and from the type strains of Rathayibacter spp. To evaluate the genetic diversity of the studied strains, minisatellite marker, with primers M13 and (GTG)₅, was used. Fragments of the genes for 16S rDNA, ITS, gyrase (gyrB) and recombinase (recA) were amplified and sequenced. Combined PCR fingerprints obtained with the minisatellite primers indicated identity of the strains isolated from wheat with R. iranicus. Strains isolated from barley formed a distinct branch closer to that of R. iranicus and furthest from those of the other Rathayibacter species including R. tritici and R. rathayi. R. toxicus and other Rathayibacter species formed a distinctly different branch. Comparison of the sequences of the ITS, 16S rDNA, gyrB and recA genes with those deposited in GenBank, verified, further, the identity of the strains isolated from wheat and barley as R. iranicus.

Keywords

20.1001.1.22286705.1395.8.1.10.4

Full Text

ارزیابی فنوتیپی و ژنوتیپی برخی جدایه‌های باکتری عامل بیماری خوشه صمغی گندم و جو در ایران

سحر نیک اختر*¹، حشمت الله رحیمیان²، ولی الله بابایی زاد³

¹ دانشجوی سابق کارشناسی ارشد بیماری شناسی گیاهی، دانشگاه کشاورزی و منابع طبیعی ساری

² استاد گروه گیاهپزشکی، دانشگاه کشاورزی و منابع طبیعی ساری

³ استادیار گروه گیاهپزشکی، دانشگاه کشاورزی و منابع طبیعی ساری

تاریخ دریافت: 12/02/1394، تاریخ پذیرش: 03/05/1394

چکیده

بیماری خوشه صمغی از بیماری‌های گندم در مناطق متعددی از کشت این محصول در ایران می‌باشد. گونه Rathayibacter iranicus به عنوان عامل این بیماری بر روی گندم و جو تاکنون فقط از ایران گزارش شده است. به منظور ارزیابی تنوع احتمالی جدایه‌های گونه‌ی R. iranicus و نیز مشخص‌تر نمودن موقعیت تاکسونومیکی جدایه‌های عامل بیماری در جو نمونه‌هایی از استان‌های آذربایجان شرقی، ایلام، اصفهان، فارس و خوزستان جمع آوری و کشت شد. بر اساس نتایج آزمون‌های بیوشیمیایی و نقوش الکتروفورزی پروتئین‌های سلولی، پانزده جدایه به عنوان نماینده برای بررسی‌های ژنوتیپی انتخاب شدند. برای تعیین میزان تنوع و ارتباط ژنتیکی جدایه‌ها، DNA ژنومی نماینده‌ها با آغازگرهای ریز ماهواره‌ای M13 و ₅(GTG) تکثیر شد. قطعه‌ ژن‌های خانه دار شامل 16S rDNA، recA و gyrB و همچنین ناحیه ITS تعدادی از جدایه‌ها تکثیر و توالی یابی شد. نتایج تعدادی از آزمون‌های افتراقی فنوتیپی با آنچه در منابع قبلی ذکر شده بود مطابقت نداشت. نتایج حاصل از بررسی تنوع ژنتیکی به وسیله‌ی ریز ماهواره‌ها حاکی از وجود تنوع در بین جدایه‌ها بود. مقایسه‌ی ترکیبی نقوش حاصل از این آغازگرها شباهت بالایی را بین جدایه‌ها و جدایه‌ی مرجع R. iranicus نشان داد. جدایه‌های جو نیز در شاخه‌ای مجزا ولی نزدیک به گروه جدایه‌ی R. iranicus و در فاصله‌ای دور از دو گونه‌ی R. tritici و R. rathayi قرار گرفتند. مقایسه توالی‌های به دست آمده از ژن‌های ITS، 16SrDNA، gyrB و recA با توالی‌های موجود در ژن بانک نشانگر بیشترین شباهت جدایه‌های گندم و جو به R. iranicus بود.

واژه‌های کلیدی: خوشه صمغی، Rathayibacter، ریز ماهواره، ژن‌های خانه داری.

مقدمه

عوامل ایجاد کننده بیماری خوشه صمغی گندم دو گونه‌ی Rathayibacter iranicus و R. tritici معرفی شده‌اند (Zgurskaya, 1993). از علائم شاخص این بیماری تراوش‌ صمغ یا شیرابه‌ی زرد رنگ روی سنبلچه‌ها و یا سنبله‌ی گندم است (Riley & Ophel, 1992). این بیماری در ایران برای اولین بار از مراغه (Scharif, 1961) و سپس از مناطق مختلف کشور گزارش شده است (Amani, 1969; Rahimian, 1993; Babaeizad & Rahimmian, 2002). جدایه‌هایی از باکتری عامل بیماری برای اولین بار از سنبله جوهای دارای علائم خوشه صمغی از استان ایلام جداسازی و بر اساس خصوصیات بیوشیمیایی به عنوان گونه‌ای از جنس Rathayibacter شناسایی شدند (Soltani et al., 2010). گونه‌ی Rathayibacter iranicus و نیز باکتری عامل خوشه صمغی جو تا کنون فقط از مزارع آلوده ایران جدا شده‌اند و ویژگی‌های فنوتیپی و ژنوتیپی و دامنه‌ی تفاوت‌ها یا سطوح تنوع ویژگی‌های آن‌ها هنوز به خوبی مشخص نشده است. در این بررسی جدایه‌های به دست آمده از گندم و جو آلوده به بیماری خوشه صمغی مناطق مختلف کشور مورد بررسی‌های فنوتیپی و مقایسه‌ی الکتروفورزی پروتئین‌های سلولی (SDS-PAGE) قرار گرفتند. سپس با تکثیر نواحی مختلف ژنی از جمله ITS [1] (16S-23S rDNA) ، 16S rRNA (RNA ریبوزومی)، gyrB (ژن کد کننده‌ی DNA جیراز زیر واحد β)، recA (ژن کد کننده‌ی رکامبیناز) و توالی یابی[2] این نواحی، عامل این بیماری شناسایی شد. با استفاده از آغازگرهای ریز ماهواره‌ای M13 و GTG₅ تنوع ژنتیکی جدایه‌ها بررسی شد. هدف از بررسی حاضر شناسایی دقیق عامل خوشه صمغی در جو و بررسی خصوصیات فنوتیپی و ژنوتیپی و در نهایت توصیف دقیق‌تر آن‌هاست.

مواد و روش‌ها

نمونه برداری از بوته‌های گندم دارای علائم خوشه صمغی (جدول 1) انجام شد. جدایه‌ها از کشت خطی بذور آلوده روی محیط حاوی آگار غذایی دارای عصاره مخمر و سوکروز (YNAS)[3] به دست آمدند. جدایه‌هایی از کلکسیون آزمایشگاه باکتری شناسی دانشگاه کشاورزی ساری نیز برای بررسی با انتخاب تک کلونی خالص و تکثیر شدند.

جدول 1- مناطق جمع آوری نمونه‌های سنبله گندم و جو دارای علائم خوشه صمغی و شماره‌های اختصاص یافته به جدایه‌های باکتری.

Table 1- Geographical areas from where samples of gummy spike blight disease on wheat and barley were collected and the numbers assigned to the strains isolated from.

استان – شهر Location	میزبان Host	شماره جدایه Isolate number
اصفهان، شهربابک Isfahan, Sahrebabak	گندم Wheat	1,2
اصفهان، مبارکه Isfahana, Mobarakeh	گندم Wheat	3,4,5
اصفهان، لنجان Isfahan, Lenjan	گندم Wheat	6,7,8
آذربایجان شرقی، شبستر East Azarbaijan, Shabestar	گندم Wheat	9,10,11,12
ایلام Ilam	گندم Wheat	13,14
ایلام Ilam	جوBarley	15,16,17,18
گلستان Golestan	گندم Wheat	19,20,21
خوزستان، ایران شهر Khuzestan, Iranshahr	گندم Wheat	22,23
فارس، زرقان Fars, Zarghan	گندم Wheat	28,29,30,31,32,Z₁
فارس، رامجرد Fars, Ramjerd	گندم Wheat	33,34,35,36,37
فارس، فیروز آباد Fars, Firouzabad	گندم Wheat	38
کرمان Kerman	گندم Wheat	K

جدایه‌های مرجع Rathayibacter toxicus ICMP 9525، R. iranicus IBSBF 636، R.rathayi IBSBF 635 و R.tritici IBSBF 632 برای انجام کارهای مقایسه‌ای از کلکسیون‌های کشت نیوزلند[4] و برزیل[5] تهیه شدند.

واکنش گرم به روش .Suslow et al (1982)، تولید گاز سولفید هیدروژن از سیستئین، پپتون و تیوسولفات سدیم، تحمل نمک طعام، هیدرولیز اسکولین و آربوتین و رشد روی محیط CNS به روش Schaad et al. (2001)، آزمون تولید‌ متیل رد و استوئین به روش دای (Dye, 1986) و آزمون‌های هیدرولیز توئین 60 و 80 به روش میثاقی و گروگان (Misaghi & Grogan, 1969) انجام شد. آزمون استفاده از کربوهیدرات‌ها به عنوان تنها منبع کربن بر اساس روش Schaad et al. (2001) و با استفاده از محیط کشت پایه Ayer et al. (1919) ولی با افزودن عصاره‌ی مخمر به میزان 5/0 گرم در لیتر انجام شد.

پس از استخراج پروتئین (Babaeizad & Rahimian, 2002) الکتروفورز در جریان 20 میلی آمپر و با رسیدن رنگ برم فنول بلو (Bromphenol blue) به انتهای ژل پایان پذیرفت (Ausubel et al., 1992; Ahmadvand & Rahimian, 2005). بر اساس نتایج آزمون‌های بیوشیمیایی و نقوش الکتروفورزی پروتئین‌های سلولی، پانزده جدایه به عنوان نماینده برای بررسی‌های ژنوتیپی انتخاب شدند.

پس از استخراج DNA به روش توصیف شده (Babaeizad & Rahimian, 2002) انگشت نگاری DNA ژنومی با روش rep-PCR[6] با استفاده از آغازگرهای M13 (5′-GAGGGTGGCGGTTCT-3′) و ₅(GTG) انجام شد. واکنش‌ها به حجم 25 میکرولیتر شامل 5/2 میکرولیتر PCR buffer 10X، 5/ 0میلی مولار MgCL₂، 2/ 0میلی مولار از مخلوط dNTP، 2 میکرولیتر آغازگر، 2 میکرولیتر DNA (90 نانوگرم) و 3/0 واحد آنزیم تک پلیمراز (شرکت سیناژن) انجام شد. تکثیر با برنامه دمایی 10 دقیقه در C˚95 سپس 35 چرخه C˚94 به مدت 1 دقیقه دمای اتصال C˚48 به مدت 1 دقیقه و دمای گسترش C˚72 به مدت 3 دقیقه انجام شد. طویل شدن نهایی رشته‌های DNA به مدت 5 دقیقه در C˚72 صورت گرفت. الکتروفورز در ژل آگارز 5/1 درصد انجام گرفت.

گروه بندی جدایه‌ها با مقایسه نقوش قطعات DNA در ژل و نمره دهی بر پایه وجود یا عدم وجود قطعات همسان و تعیین ضریب تشابه جاکارد صورت گرفت. درخت فیلوژنی با روش مقایسه جفت‌ها از طریق میانگین‌های بی وزن (UPGMA) و با استفاده از نرم افزار NTYSYS 2.02 ترسیم شد.

تکثیر تعدادی از نواحی ژنی (ژن‌های خانه دار[7]) با استفاده از جفت آغازگرهای ITS (Gurtler et al., 1996)، gyrB (Richert et al., 2004)، 16S rDNA (F (5ˊ- GCTCGTAGGCGGTTTGTC - 3΄، (5ˊ- GGTATCGCAGCCCTTTGT - 3ˊ) R و RecA F (5ˊ- GTCTTGGCAGCGACGAAC-3)، R (5ˊ- CGGACGGAGGCGTAGAA-3ˊ)

با PCR انجام شد. این واکنش‌ها به حجم 25 میکرولیتر شامل 5/2 میکرولیتر بافر 10X PCR، 4/0 میلی مولار MgCL₂، 2/ 0میلی مولار از مخلوط dNTP، 5/2 میکروگرم DNA الگو، 3/0 واحد آنزیم تک پلیمراز و 5/0 میکرولیتر از جفت آغازگرها انجام شد. برنامه زمانی و دمایی شامل مرحله‌ی واسرشت سازی اولیه C˚94 به مدت 5 دقیقه، 35 چرخه شامل واسرشت سازی C˚94 به مدت 1 دقیقه، دمای اتصال C˚50 (برای آغازگرهای ITS و 16S rDNA) و C˚58 (برای آغازگرهای RecA و gyrB) و دمای گسترش C˚72 به مدت 2 دقیقه انجام شد. مرحله گسترش نهایی رشته‌ها در دمای C˚72 به مدت 3 دقیقه به کار برده شد. پس از تکثیر قطعه مورد نظر، قطعه‌ها برای توالی یابی به شرکت Bioneer کره جنوبی فرستاده شدند. توالی‌ها با استفاده از نرم افزار BioEdit ver. 7.0.9.0 اصلاح شده و با استفاده از نرم افزاربلاست (Blast)[8] موجود در بانک ژن NCBI همسانی توالی‌ها با توالی‌های موجود در بانک ژن مقایسه شد و سپس در این پایگاه ثبت شدند (جدول 3). با استفاده از توالی‌های به دست آمده و توالی‌های موجود در بانک ژن NCBI درخت فیلوژنی به دو روش الحاق به نزدیک‌ترین همسایه[9] و حداکثر صرفه جویی[10] با به کارگیری نرم افزار MEGA 5.05 با درجه اعتبارسنجی[11] 1000 رسم شد.

نتایج

جداسازی و تعیین ویژگی‌های فنوتیپی

تک کلونی‌های حاصل از کشت خطی، بعد از 8-4 روز کرم رنگ تا زرد رنگ و به صورت برجسته تا محدب بودند. میزبان، استان مورد نمونه برداری و شماره جدایه‌های به دست آمده در جدول 1 آورده شده است. نتایج حاصل از بررسی خصوصیات فنوتیپی (جدول 2) نشان داد که ممکن است همه یا اکثر جدایه‌های به دست آمده از گندم متعلق به گونه‌ی R. iranicus باشند. جدایه‌های به دست آمده از جو از نظر بیشتر خصوصیات به R .iranicus شباهت داشتند و فقط از نظر چند خصوصیت، مقداری از آن متمایز بودند. همچنین برخی از خصوصیات تعیین شده برای گونه‌ی R. iranicus با آنچه در توصیفهای قبلی گونه منعکس شده بود مطابقت نداشت.

جدول 2- خصوصیات مورفولوژیک، بیوشیمیایی و تغذیه‌ای گونه‌های Rathayibacter.

Table 2- Morphological, biochemical and physiological characteristics of the Rathayibacter species.

ویژگی Characteristic	جدایه‌های به دست آمده از Isolate from		R. iranicus^*	R. tritici*	R. rathayi*
ویژگی Characteristic	گندم Wheat	جو Barley	R. iranicus^*	R. tritici*	R. rathayi*
رنگ کلونی (Color)	کرم – زرد Crem-Yellow	کرم Crem	زرد Yellow	زرد Yellow	زرد Yellow
واکنش گرم (Gram reaction)	+	+	+	+	+
درصد تحمل نمک طعام (NaCL tolerance)	2-4	<2	2	4	2
رشد روی محیط TTC (Growth on TTC medium)	-	-	-	-	-
واکنش متیل رد Methyl red (MR) reaction	-	-	-	-	-
تولید استوئین (Production of acetoin)	-	-	-	-	-
تولید H₂S از تیوسولفات سدیم (H₂S from sodium thiosulfate)	40	-	-	-	-
تولید H₂S از سیستئین (H₂S from cysteine)	30	-	-	-	-
تولید H₂S از پپتون (H₂S from peptone)	45	-	-	+	+
هیدرولیز Tween 80 (Hydrolysis of Tween 80)	60	-	+	+	-
هیدرولیز Tween 60 (Hydrolysis of Tween 60)	+	+	+	+	+
هیدرولیز آربوتین (Hydrolysis of arbutin)	+	+	+	+	+
تولید اسید از Acid production from
د- گلوکز (D-Glucose)	+	+	+	+	+
سلوبیوز (Cellobiose)	+	+	+	+	+
د- لاکتوز (D- lactose)	85	+	+	+	+
سوکروز (Sucrose)	90	+	+	-	-

	ادامه جدول 2
ویژگی Characteristic		جدایه‌های به دست آمده از Isolate from		R.iranicus^*	R.tritici*	R.rathayi*
ویژگی Characteristic		گندم Wheat	جو Barley	R.iranicus^*	R.tritici*	R.rathayi*
مالتوز (Maltose)		+	+	+	+	+
رافینوز (Raffinose)		-	-	-	-	-
فروکتوز (Fructose)		+	-	+	-	+
د- ریبوز (D-Ribose)		+	+	+	-	-
ملزیتوز (Melezitose)		25	+	-	-	+
استفاده از (Utilization of)
استات سدیم (Sodium acetate)		+	+	+	+	+
پکتات (Pectate)		-	-	-	-	-
سباسیک اسید (Sebacic acid)		+	-	+	-	+
آمیگدالین (Amygdalin)		-	-	-	-	-
اینولین (Inulin)		60	+	+	+	+
ال – آسپاراژین (L-Asparagine)		+	+	+	+	+
ال – اورنیتین (L- Ornithine)		-	-	-	-	-
پروپیونات (Propionate)		-	-	-	-	-
د – تارتارات (D-Tartrate)		-	-	-	-	-
ال – گلوتامیک اسید (L-Glutamic acid)		-	-	-	-	-

^*: جدایه‌های مرجع، + : همه جدایه‌ها دارای واکنش مثبت یا توانایی مصرف داشته‌اند، - : همه جدایه‌ها واکنش منفی و یا عدم توانایی مصرف داشته‌اند. اعداد نشان دهنده‌ی درصد واکنش مثبت میان جدایه‌ها هستند.

^* Standard isolates, +: Positive reaction or growth, -: negative reaction or no growth. Numbers are positive percent.

مقایسه الگوی پروتئین‌های سلولی

در بررسی نقوش حاصل از الکتروفورز پروتئین‌های سلولی (شکل 1)، شباهت زیادی میان جدایه‌ها‌ی گندم و جدایه R.iranicus استاندارد مشاهده شد اما جدایه‌های جو در موقعیت و مقدار نسبی چندین باند بالایی و میانی با سایر جدایه‌های گندم متفاوت بودند. باندهای حاصل از دو جدایه استاندارد R.tritici و R.rathayi در دو الی سه باند با یکدیگر و با جدایه‌های گندم متفاوت بودند.

شکل 1- الگوی پروتئین های سلولی جدایه های Rathayibacter به دست آمده از گندم و جو آلوده به بیماری خوشه صمغی و جدایه های مرجع در ژل پلی اکریل آمید. نام و محل جداسازی جدایه ها در جدول 1 آورده شده است. ir.، tr. و ra. به ترتیب جدایه ها‌ی مرجع R.iranicus، R.tritici و R.rathayi می‌باشند.

Figure 1- Comparison of electrophoretic pattern of cell proteins of the isolates of Rathayibacter species from wheat and barley spikes with symptoms of gummy spike blight in several provinces of Iran and reference strains of Rathayibacter spp., codes of the isolates have been given in Table 1.

انگشت نگاری با آغازگرهای ریزماهواره‌ای

در الگوی نقوش به دست آمده با آغازگر ₅(GTG) طول قطعات تکثیر شده 100 تا 1600 جفت باز بودند (شکل 2). درخت فیلوژنی حاصل جدایه‌های نماینده را در سطح تشابه 67 درصد به 7 گروه تقسیم کرد. در این سطح تشابه جدایه های 5، 6، 8 (گندم اصفهان) و 14 (گندم ایلام) با جدایه مرجع R.iranicus در یک گروه قرار گرفتند. جدایه مرجع toxicus . Rدر گروه کاملاً جداگانه‌ای قرار گرفت. طبق درخت فیلوژنی ترسیمی اساس اثر انگشت نگاره ژنی حاصل از تکثیر با آغازگر M₁₃ جدایه‌ها در سطح تشابه 67 درصد به 12 گروه تقسیم شدند. در این سطح تشابه جدایه‌های 21 (گندم گلستان)، 6 (لنجان اصفهان) و 38 (فیروزآباد) با جدایه مرجع R.iranicus در یک گروه قرار گرفتند. جدایه مرجع toxicus .R نیز در گروه کاملاً جدایی قرار گرفت. طول قطعات تکثیر شده در این روش 100 تا 1800 جفت باز بود. در نقوش به دست آمده با تجمیع دو آغازگر، جدایه‌ها در سطح تشابه 67 درصد به 11 گروه تقسیم شدند (شکل 3).

بررسی توالی ژن‌های خانه دار

تکثیر نواحی ITS، 16S rDNA، gyrB و RecA جدایه‌های 16 (جو)، 22 (گندم خوزستان)، Z₁(گندم زرقان فارس) و K (گندم کرمان، فقط برای ناحیه‌ی ITS) انجام شد. طول تقریبی قطعات برای این نواحی به ترتیب حدود 500، 700، 500 و 600 جفت باز تخمین زده شد (شکل 4). پس از مقایسه توالی‌ها در بانک ژن NCBI همه‌ی جدایه‌ها بیشترین شباهت را به R. iranicus داشتند. پس از ثبت توالی‌ها در بانک ژن درخت فیلوژنی توالی جدایه‌ها و برخی از توالی‌های دو جنس Rathayibacter و Clavibacter موجود در بانک ژن به دو روش الحاق به نزدیک‌ترین همسایه‌ (شکل‌ 5) و حداکثر احتمال با درجه اعتبار سنجی 1000 رسم شد.

شکل 2- اثر انگشت ژنتیکی DNA ژنومی جدایه‌های عامل خوشه صمغی گندم و جو در برخی از استان‌های ایران با استفاده از توالی ₅(GTG) (قسمت بالا) و M13 (قسمت پایین) در ژل آگارز 2/1 درصد. to.، ra.، tr. و ir. به ترتیب جدایه‌های مرجع Rathayibacter toxicus،R.rathayi ، R.tritici و R.iranicus هستند. مشخصات شماره‌های جدایه‌ها در جدول 1 آمده است.

Figure 2- Electrophoresis gel of PCR fingerprinting with the primer (GTG)₅ and M13 for the isolates of Rathayibacter species from wheat and barley spikes with symptoms of gummy spike blight in several provinces of Iran and reference strains of Rathayibacter spp., codes of the isolates have been given in Table 1.

شکل 3- درخت فیلوژنی ارتباط ژنتیکی با آنالیز ترکیبی داده‌های حاصل از تکثیر به وسیله‌ی آغازگرهای M13 و ₅(GTG) میان جدایه‌های عامل خوشه صمغی گندم و جو و جدایه‌های مرجع به روش .UPGMA

Figure 3- Dendrogram showing the relationship among Rathayibacter spp. isolated from gummy spike infected wheat and barley based on PCR tests employing primers M13 and (GTG)₅. Cluster analysis was performed by using UPGMA algoritm.

شکل 4- موقعیت قطعات تکثیر شده با PCR، به ترتیب از چپ به راست ژن‌های ITS و gyrB (A) و ژن‌های recA و rDNA 16S (B) جدایه‌های باکتری عامل خوشه صمغی گندم و جو پس از الکتروفورز در ژل آگارز 2/1 درصد در 80 ولت و رنگ آمیزی ژل با اتیدیوم بروماید. ستون M نشانگر DNA با جرم مولکولی 1 کیلو بازی شرکت فرمنتاس (Fermentas,Lithuania) است.

Figure 4- Fragments from ITS, gyrB, recA and 16S rDNA genes of the gummy spike blight isolates in 1.2% Agarose gel stained with etidium bromide. M: 1 Kb DNA ladder.

بحث

گونه‌ی R. iranicus و نیز باکتری عامل خوشه صمغی جو تا کنون فقط از مزارع آلوده ایران جدا شده‌اند و ویژگی‌های فنوتیپی و ژنوتیپی و دامنه تفاوت‌ها یا سطوح تنوع ویژگی‌های آن‌ها هنوز به خوبی مشخص نگردیده است. برای تعیین خصوصیات مهم افتراقی گونه‌های Rathayibacter و ویژگی‌های دقیق R. iranicus آزمون‌های افتراقی روی جدایه‌ها انجام شد. بر پایه‌ی نتایج آزمون‌های فنوتیپی و بیوشیمیایی به نظر می‌رسد که همه یا اکثر جدایه‌های به دست آمده از گندم متعلق به گونه‌ی R. iranicus باشند.

در بررسی حاضر تعدادی از نتایج آزمون‌های فنوتیپی با نتایج حاصل از بررسی‌های قبلی (Zgurskaya et al., 1993; Babaeizad & Rahimian, 2002; Soltani et al., 2010) همخوانی نداشت (جدول 4). در بررسی نقوش حاصل از الکتروفورز پروتئین، شباهت زیادی میان جدایه‌های R. iranicus وجود داشت اما جدایه‌های جو از نظر موقعیت یا میزان نسبی چندین باند از سایر جدایه‌ها متمایز بودند. نتایج حاصل از ارزیابی تنوع ژنتیکی در PCR با آغازگر‌های ₅(GTG) و M13 موید وجود تنوع در بین جدایه‌ها بود. مقایسه‌ی ترکیبی نقوش حاصل از این آغازگرها نشانگر وجود شباهت بالا بین جدایه‌های گندم و جو و جدایه‌ی مرجع R. iranicus بود. جدایه‌های جو در شاخه‌ای مجزا ولی نزدیک به گروه جدایه‌ی مرجع R.iranicus و در فاصله‌ی دورتری از دو گونه‌ی R. tritici و R. rathayi قرار گرفتند. جدایه مرجع R. toxicus هم در گروه مجزایی قرار گرفت. جدایه‌های مرجع R. tritici و R. rathayi در نقوش حاصل از آغازگر (GTG)₅ شباهت‌هایی را با جدایه‌های R. iranicus (جدایه‌های گندم) نشان دادند. اما در نقوش حاصل از تکثیر در PCR با آغازگر M13 و نیز در درخت فیلوژنی ترکیبی نتایج حاصل از این دو آغازگر، گونه‌ها در گروه‌های جداگانه جای گرفتند.

نتایج بررسی نشانگر مفید بودن این ریز ماهواره‌ها در تفکیک گونه‌ها و جدایه‌های داخل گونه است. نتایج حاصل از تکثیر ناحیه ITS و همچنین قسمتی از نواحی ژنی 16S rDNA،gyrB و recA شباهت بالای اکثر جدایه‌های عامل خوشه صمغی به دست آمده در سال‌های اخیر از مناطق مختلف ایران را با گونه R. iranicus نشان داد. نتایج بررسی حاضر نشانگر کارایی بالای توالی‌یابی این ژن‌ها در تفکیک و شناسایی جدایه‌های Rathayibacter در سطح گونه می‌باشد.

درخت فیلوژنی ترسیمی بر اساس توالی قطعاتی از ژن‌های خانه‌داری یاد شده در گونه‌های‌ Rathayibacter مورد بررسی و توالی‌های Rathayibacter و Clavibacter موجود در بانک ژن، نشان داد که این ژن‌ها توانایی تفکیک گونه‌های Rathayibacter و نیز Clavibacter را دارند. چنین نتیجه‌ای در پژوهش‌های پیشین (Richert et al., 2005; Stackebrandt et al., 2007) نیز مشاهده شده است.

در پاره‌ای از ویژگی‌های فنوتیپی، برخی از جدایه‌ها شباهت‌هایی را با جدایه مرجع R.tritici نشان داده و دارای ویژگی‌های بینابین این گونه و R.iranicus بودند ولی شباهت بالایی را در توالی ژن‌های خانه‌داری با گونه R. iranicus نشان دادند؛ لذا تعلق آن‌ها به گونه R. iranicus تایید شده و این تفاوت‌ها در ویژگی‌های فنوتیپی می‌تواند منعکس کننده تنوع در جمعیت‌های R. iranicus به حساب آید. بررسی‌های محققین در گذشته در زمینه ویژگی‌های فنوتیپی R. iranicus محدود به تنها یک جدایه استرین تیپ موجود در کلکسیون‌های نگهداری کشت‌ها مانند (R. iranicus type strain DSM 7484=CFB 807=LMG 3677= ICMP 3496) بوده است. با توجه به نتایج دو بررسی فنوتیپی قبلی (Babaeizad & Rahimian, 2002; Soltani et al., 2010) که به شکل نسبتاً گسترده روی تعداد قابل توجهی از جدایه‌های R. iranicus از نواحی مختلف ایران صورت گرفته است و بررسی فتوتیپی و ژنوتیبی حاضر، می‌توان ادعا نمود که ویژگی‌های فنوتیپی گونه R. iranicus و به ویژه دامنه تفاوت‌ جمعیت‌ها در این ویژگی‌ها با درجه اطمینان بالایی تعیین گردیده است. البته تفاوتهایی که درپاره‌ای از ویژگی‌ها در جمعیت R. iranicus در چند بررسی اخیر مشاهده شده ممکن است توارثی نبوده و تفاوت‌ها ناشی از تفاوت در محل و زمان آزمون‌ها[12] و خطای آزمایش‌ها باشد چنین تفاوت‌هایی که عمدتاً ناشی از کندی رشد و کندی متابولیسم به ویژه در مصرف بعضی از کربوهیدرات‌ها است در بررسی‌های سایر محققین روی این گروه از باکتری‌ها نیز مشاهده شده است (Davis et al., 1984). این تردید، تکرار بررسی‌های فنوتیپی گسترده‌تر روی تعداد بیشتری از جدایههای R. iranicus را اجتناب ناپذیر می‌نماید. در حال حاضر می‌توان ویژگی‌های مهم فنوتیپی و افتراقی گونه‌های Rathayibacter را به شکلی که در جدول 4 خلاصه شده است پیشنهاد نمود.

شکل 5- درخت فیلوژنی حاصل از توالی نوکلئوتیدی ژن‌های 16S rDNA (A)، ITS (B)، gyrB (C) و recA (D) جدایه های عامل خوشه صمغی گندم () و جو () و توالی جدایه‌های منتخب ثبت شده در بانک ژن با روش اتصال همسایه‌ها (Neighbor joining). گونه‌ی Vibrio cholerae به عنوان برون گروه در نظر گرفته شده است.

Figure 5- NJ dendrograms of comprising the 16S rDNA (A), ITS (B), gyrB (C) and recA (D) nucleotid sequence data of isolated from gummy spike infected wheat () and barley () and some strains available in GenBank with Vibrio cholerae as the out group.

جدول 3- شماره دسترسی قطعات توالی یابی و ثبت شده از عوامل ایجاد کننده بیماری خوشه صمغی گندم.

Table 3- GenBank Accession numbers of the sequences of the gummy spike blight agents on wheat and barley.

شماره دسترسی (Accession number)				کد جدایه (Isolate number)
ITS	recA	gyrB	16S rDNA	ITS
KF443784.1	KP768445.1	KF922386.1	KF922382.1	16
KF443785.1	KP768444.1	KF922387.1	KP768446.1	22
KF443786.1	KF922384.1	KF922388.1	KF922383.1	Z₁

جدول 4- ویژگی‌های فنوتیپی پیشنهادی در شناسایی و تفکیک گونه‌های Rathayibacter، با تاکید بیشتر روی تمایز گونه R.iranicus.

Table 4- Differentiating characters of the Rathayibacter species.

Dye & Kemp, 1977

Zgurskaya, 1993

Dorofeeva et al., 2002

Babaeizad & Rahimian, 2002

Soltani et al., 2010

بررسی حاضر

(Our study)

ویژگی یا آزمون (Characteristic)

III

3-4

درصد تحمل نمک طعام (NaCL tolerance)

تولید H₂S از تیوسولفات سدیم (H₂S from sodium thiosulfate)

هیدرولیز Tween 80

(Hydrolysis of Tween 80)

تولید اسید از (Acid production from)

سوکروز (Sucrose)

ملزیتوز (Melezitose)

د- ریبوز (D-Ribose)

د- لاکتوز (D-lactose)

استفاده از (Utilization of)

سباسیک اسید (Sebacic acid)

اینولین (Inulin)

Ι: جدایه‌های جو، II: R.iranicus، III: R.tritici

+ : واکنش جدایه‌ها مثبت، - : واکنش جدایه‌ها منفی V: برخی از جدایه‌ها پاسخ مثبت و برخی پاسخ منفی داده‌اند.d : نتایج مختلف یک جدایه در دو محیط کشت

Table 4. Ι: Barley strains, II: R.iranicus, III: R.tritici

+: positive reaction, -:Negative reaction, V: Some strains positive, d: Different results either between culture or when repeated

منابع

Ahmadvand R, and Rahimian H (2005). Study on phenotypic and electrophoretic diversity of Pectobacterium species infecting maize in Mazandaran. Iranian Journal of Plant Pathology 41: 271-289.

Amani B (1969). Gummy spike blight disease. Iranian Journal of Plant Pathology 1:15-24.

Ayers SH, Rupp P, Johnson WT )1919(. A study of the alkali-forming bacteria in milk. US Department of Agriculture Bulletin, Washington (DC): USDA.

Babaeizad V, Rahimian H (2002). Identity and distribution of Rathayibacter species cousing gummy spike blight of wheat in some wheat growing areas of Iran. Iranian Journal of Plant Pathology 38:47-55.

Bradbury JF. (1986). Guide to Plant Pathogenic Bacteria. Common wealth Agricultural Bureaux International Mycological Institute, Kew. UK.

Davis MJ, Gillaspi AG, Vidaver AK, Harris RW (1984). Clavibacter: a new genus containing some phytopathogenic coryneform bacteria, including Clavibacter xyli subsp. xyli sp. nov., subsp. nov. and Clavibacter xyli subsp. cynodontis subsp. nov., pathogens that cause ratoon stunting disease of sugarcane and Bermudagrass stunting disease. International Journal of Systematic Bacteriology 34: 107-117.

Dorofeeva LV, Evtushenko LI, Krausova VI, Karpov AV, Subbotin, SA, Tiedje JM, (2002). Rathayibacter carisis sp. nov. and Rathayibacter festucae sp. nov. isolated from the phyllosphere of Carex sp. and the leaf gall induced by the nematode Anguina graminis on Festuca rubra L., respectively. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 52: 1917-1923.

Dye DW (1986). A taxonomic study of the genus Erwinia, I. The “Amylovora” group. New Zealand Journal of Science 12: 590-607.

Dye DW, Kemp WJ (1977). A taxonomic study of plant pathogenic Corynebacterium species. New Zealand Journal of Agricultural Research 20: 563-582.

Gurtler V, Stanisich VA (1996). New approaches to typing and identification of bacteria using the 16S-23S rDNA spacer region. Microbiology 142: 3-16.

Missaghi L, Grogan RG (1969). Nutritional and biochemical comparisons of plant pathogenic and saprophytic fluorescent Pseudomonas. Phytopathology 59: 1436-1450.

Rahimian H (1993). Characteristics of strains causing gummy spike blight of wheat in Fars province. Proc. of 11^thCongrees of the Plant Protection. Aug. 25-29, 1993. Guilan, Iran. p. 35.

Richert K, Brambilla E, Stackebrandt E (2005). Development of PCR primers speciﬁc for the ampliﬁcation and direct sequencing of gyrB genes from microbacteria order Actinomycetales. Current Microbiology 60: 115–123.

Riley IT, Ophel KM (1992). Clavibacter sp. nov., The bacterium responsible for annual ryegrass toxicity in Australia. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 42: 64-68.

Schaad NW, Jones JB, Chun W (2001). Laboratory Guide for Identification of Plant Pathogenic Bacteria. American Phytopathological Society Press, Minnesota. USA.

Scharif G 1961. Corynebacterium iranicum sp. nov. on wheat (Triticum aestivum) in Iran and a comparative study of it with C. tritici and C. rathayi. Entomology and Phytopathology 19:1–4.

Soltani M, Fuladvand A, Rahimian H, Babaeizad V (2010). Proc. of 19^thCongrees of the Plant Protection. Aug. 24-27, 2010. Tehran, Iran. P. 429

Stackebrandt E, Brambilla E, Richert K (2007). Gene sequence phylogenies of the family Microbacteriaceae. Current microbiology 55: 42-46.

Suslow TV, Schroth MN, Isaka M (1982). Application of a rapid method for gram differentiation of plant pathogenic and saprophytic bacteria without staining. Phytopathology 72: 917-918.

Zgurskaya HI, Evtushenko LI, Akimov VN, Kalakoutskii LV (1993). Rathayibacter gen. nov., including the species Rathayibacter rathayi comb. nov., Rathayibacter tritici comb. nov., Rathayibacter iranicus comb. nov., and six strains from annual grasses. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 43: 143-149.

Evaluation of the phenotypic and genotypic diversity of the bacterial species causing gummy spike blight of wheat and barley

Nikakhtar S.*¹, Rahimian H.², Babaeizad V.³

¹Former MSc student of Plant Pathology, Agricultural sciences and Natural Resources University, Sari, Iran.

² Department of Plant Protection, Agricultural sciences and Natural Resources University, Sari, Iran.

³ Department of Plant Protection, Agricultural sciences and Natural Resources University, Sari, Iran.

Abstract

Key words: Gummy spike blight, Rathayibacter, minisatellite, housekeeping gene

* نویسنده مسئول: سحر نیک اختر تلفن: 09129457984 Email: Shr_nikakhtar@yahoo.com

1Internal trancribed spacer

2Sequencing

3 Yeast extract nutrient agar sucrose

1 International Collection of Microorganisms from Plants (ICMP)

[5] Biological Institute Culture Collection of Phytopathogenic Bacteria (IBSBF)

1 Repetitive extragenic palindromic, rep

2 House keeping

1 Basic local alignment search tool

[9] Neighbor-Joining

[10] Maximum parsimony

[11] Bootstrap

[12] Time and Space

* Corresponding Author: Nikakhtar S. Tel: 09129457984 Email: Shr_nikakhtar@yahoo.com

References