Assessment of diversity and genetic relationships in Pomegranate genotypes using AFLP marker

Document Type : Research Paper

Authors

Abstract

Pomegranate (Punica granatum L.) is native to Iran with several ecotypes which have been adapted to various climatic conditions and diseases.  Although it is one of the important exported fruits, there is not a precise identification criteria to determine the authenticity of genetic inheritance and proprietary rights in the country. In the present study the genetic relationships of 47 pomegranate genotypes, including 9 cultivated genotypes (from the collection of Yazd) and 38 wild genotypes (from Mazandaran, Gilan and Golestan provinces), were investigated with AFLP markers. Using 10 primer combinations, 825 bands were obtained of which 697 showed polymorphism. Among the primers, primer combination of M-CTT and E-ACG showed the highest number of bands (148) and primer combination of E-ACC, M-CTG produced the lowest number of bands (40). The average value for PIC was 0.21, while Average Marker Index (MI) was 17.33 that the highest one belonged to primer combination of M-CAC and E-AAG. Maximum genetic similarity belonged to Bahnamir with Shirin Kan Tehran samples and the minimum genetic similarity observed between Berenjestanak and Khosh Darreh. Principal component analysis showed that 57% of the total variance was explained by first three components. The identified primer combinations in this study could be used as a powerful tool for determination of genetic relationships between Pomegranate genotypes

Keywords


ارزیابی تنوع و روابط ژنتیکی ژنوتیپ­های انار با استفاده از نشانگر AFLP

 

رضا نظیفی گلیردی1، غفار کیانی2*، علی دهستانی کلاگر3، سید حمیدرضا هاشمی3

 

1دانشجوی سابق بیوتکنولوژی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری

2استادیار گروه بیوتکنولوژی و اصلاح نباتات، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری

3پژوهشکده ژنتیک و زیست فناوری کشاورزی طبرستان، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری

 

تاریخ دریافت: 13/10/1393، تاریخ پذیرش: 11/02/1395

چکیده

انار (Punica granatum L.) گیاهی بومی ایران می­باشد. به رغم اینکه انار از مهمترین محصولات صادراتی ایران به شمار می­رود، اما شناسنامه دقیقی برای تعیین اصالت ژنتیکی و حفظ حقوق مالکیت این ذخیره توارثی گران‏بها در کشور وجود ندارد. در پژوهش حاضر برای بررسی روابط ژنتیکی 47 ژنوتیپ انار، شامل 9 ژنوتیپ زراعی (از کلکسیون انار یزد) و 38 ژنوتیپ وحشی (از استان­های مازندران، گیلان و گلستان)، از نشانگر AFLP استفاده گردید. با استفاده از 10 ترکیب آغازگری تعداد 825 نوار (باند) بدست آمد، که تعداد 697 نوار  چند­شکلی نشان دادند. از بین آغازگرهای مورد استفاده، ترکیب آغازگری M-CTT و E-ACG   با 148 نوار بیشترین تعداد نوار و ترکیب آغازگری   E-ACC و  M-CTGبا 40 نوار کمترین تعداد نوار را تولید کردند. مقدار متوسط محتوای اطلاعات چند­ شکلی (PIC) برای آغازگرها برابر با 21/0 بدست آمد. متوسط شاخص نشانگر (MI) 33/17 بدست آمد که بیشترین آن مربوط به ترکیب آغازگری M-CAC و E-AAG می‏باشد. بیشترین شباهت ژنتیکی بین نمونه های بهنمیر و شیرین‏کن تهران و کمترین میزان شباهت بین نمونه‏های برنجستانک و خوش دره دیده شد. تجزیه به مولفه های  اصلی نشان داد که 3 مولفه در مجموع 57 درصد واریانس کل را توجیه می نماید. از ترکیب­های آغاز‏گری شناخته شده در این پژوهش می توان به عنوان ابزار قدرتمندی در تعیین روابط ژنتیکی در بین ژنوتیپ‏های انار استفاده نمود.

کلمات کلیدی: انار، تنوع ژنتیکی، نشانگر AFLP، تجزیه به مولفه های اصلی.



مقدمه

انار با نام علمی Punica granatum L.  یکی از قدیمی ترین میوه های خوراکی شناخته شده است که به صورت درختچه‏ای پر شاخ و برگ با پاجوش‏های زیاد و ارتفاعی بین پنج تا هشت در هر نوع اقلیمی از نظر آب و هوا و خاک رشد می کند. از نظر گیاهشناسی انار از خانواده Punicaceae با سطح کروموزومی 2n=2x=16 می‏باشد (Moslemi et al., 2010). شواهد تاریخی دال بر این است که انار بومی ایران و کشورهای هم‏جوار می‏باشد و به طور طبیعی به آذربایجان ، ترکیه و حوزه مدیترانه گسترش یافته است (Tehranifar et al., 2010). در حدود 800 رقم انار از استان های مختلف ایران در مجموعه انار یزد جمع آوری شده است. آگاهی از تنوع ژنتیکی یک گونه می‏تواند به اصلاحگر برای چگونگی جمع آوری و استفاده از منابع ژنتیکی مختلف و پیش بینی فواید ژنتیکی بالقوه، در برنامه‏های اصلاحی کمک کند. امروزه تعیین اصالت ژنتیکی محصولات باغی از سطح مورفولوژی و فنولوژی فراتر رفته و بوسیله روش‏های نوین بیوتکنولوژی در سطح ژنوتیپ گیاه (DNA) صورت می‏گیرد. استفاده از روش‏های جدید در برنامه‏های شناسایی ارقام، فرایند شناسایی را بوسیله انگشت نگاری هر ژنوتیپ در هر مرحله رشدی و بطور مستقل از فاکتورهای محیطی تسریع می‏کند.

نشانگر چندشکلی طول قطعات حاصل از تکثیر (AFLP) توسط  Vos et al. (1995) معرفی شد. آنان مدعی بودند که نشانگر مذکور علاوه بر دارا بودن مزایای RFLP مثل دقت و تکرارپذیری، دارای ویژگی‏های مثبت روش های مبتنی بر واکنش زنجیره‏ای پلیمراز نیز می‏باشد. این نشانگر ابزاری موثر برای مطالعه تنوع و ارتباط ژنتیکی میان افراد گونه‏ها و اعضای سلسله گیاهی به شمار می‏رود افزون بر این، این روش کارایی زیادی برای مطالعات فیلوژنی، نقشه یابی پیوستگی ژن ها و شناسایی ارقام دارد. از جمله تحقیقاتی که تا کنون در این رابطه بر روی انار صورت گرفته می توان به موارد زیر اشاره کرد:

 روابط ژنتیکی 11 ژنوتیپ کاملا نزدیک انار ایران با استفاده از نشانگر AFLP مورد ارزیابی قرار گرفت (Rahimi et al., 2005). 10 ترکیب آغازگری متفاوت برای تشخیص روابط ژنوتیپ‏های انار در دو منطقه اصفهان و یزد با اسامی مشابه مورد استفاده قرار گرفت. بیشترین شباهت بین ارقام پوست سیاه و آمنه خاتونی (3/20 درصد) وجود داشت. پس از برش خوشه بندی داده های حاصل از AFLP در فاصله 64/0، هفت رقم در دو گروه جای گرفتند چهار رقم باقی مانده هر کدام یک گروه را تشکیل دادند. علی رغم سطح چند شکلی پایین در ارقام مورد مطالعه، تفاوتهایی در الگو های نوار بندی در بین ژنوتیپ‏های با اسامی مشابه و همچنین بین دو منطقه جغرافیایی مشاهده گردید.

در پژوهشی Sarkhosh et al.  (2006) با استفاده از نشانگر مولکولی RAPD سطح تنوع موجود بین 24 ژنوتیپ انار ایرانی را بررسی کردند. تعداد 100 آغازگر تصادفی در انجام واکنش PCR بر روی نمونه‏ها آزمایش شد که از بین آنها 16 آغازگر در بین ژنوتیپ‏ها چندشکلی نشان دادند. بالاترین و پایین‏ترین میزان تشابه بین ژنوتیپ‏ها به ترتیب 89/0 و 29/0 بود و در تشابه 60% ژنوتیپ‏ها به 4 زیر شاخه تقسیم شدند. در پژوهشی دیگرAvamleh et al.  (2009) از 8 آغازگری AFLP برای بررسی تنوع ژنتیکی 12ژنوتیپ انار که از 3 منطقه در اردن جمع‏آوری شده بود استفاده کردند. که از این تعداد 15 ژنوتیپ وحشی، 34 ژنوتیپ نیمه وحشی و 14 ژنوتیپ زراعی بودند. 8 آغازگر RAPD و 4 آغازگر DAMD استفاده شده الگوهای چندشکلی مجزایی در بین ژنوتیپ‏ها نشان دادند.بیشترین و کمترین فاصله‏ی ژنتیکی در ژنوتیپ‏های زراعی 12/0 و 9/0، در ژنوتیپ‏های نیمه وحشی 24/0 و 97/0 و در مورد ژنوتیپ‏های وحشی 38/0 و 95/0 بود. نتیج این تحقیق نشان داد که سطح بالایی از تنوع ژنتیکی در میان ژنوتیپ‏ها وجود دارد و هر دو روش RAPD و DAMD برای بررسی ژنتیکی انار مفید می‏باشد.

در مطالعه‏ای DNA ژنومی 31 ژنوتیپ مختلف انار متعلق به هفت استان ایران با استفاده از هفت ترکیب آغازگری AFLP مورد بررسی قرار گرفت. نتایج حاصل از تجزیه خوشه‏ای حاکی از وجود شباهت بسیار بالا بین ژنوتیپ‏ مورد مطالعه بود. نتایج بدست آمده نشان داد که ژنوتیپ‏ها عموما مستقل از خاستگاه جغرافیایی و نام‏گذاریشان گروه‏بندی شدند (Nemati et al., 2012). تکنیک  AFLP بر اساس هضم DNA ژنومی و تحت تاثیر قرار گرفتن جایگاه شناسایی آنزیم برشی به علت حذف، اضافه و جهش در این جایگاه حاصل می­آید که نتیجه آن چند­شکلی در قطعات حاصل AFLP می­باشد (Witkowicz et al., 2003). در این تحقیق کارایی روش AFLP برای بررسی تنوع ژنتیکی و برآورد فاصله ژنتیکی47 نمونه وحشی و زراعی انار 3 استان مازندران، گیلان، گلستان و 9 رقم زراعی مورد بررسی قرار گرفت و انتظار می‏رود از ترکیب آغاز‏گری شناخته شده در این پژوهش بتوان به عنوان ابزار قدرتمندی در شناسایی روابط و خویشاوندی موجود در بین ژنوتیپ‏های انار استفاده نمود.

 

مواد و روش‏ها

مواد گیاهی و استخراج DNA

در این تحقیق از 47 نمونه انار شامل 38 نمونه وحشی و 9 رقم زراعی استفاده شد. نمونه های وحشی از مناطق مختلف استان مازندران، گیلان و گلستان جمع‏آوری و نمونه های زراعی نیز از کلکسیون انار یزد جمع آوری گردید (جدول 1). استخراج DNA از برگ به روش CTAB انجام گرفت. بررسی کیفیت و کمیت DNA حاصل با استفاده از سه روش سپکتروفوتومتری و الکتروفورز ژل آگارز صورت گرفت.

اجرای مراحلAFLP

آزمایشات AFLP بر اساس روش Vos et al.  (1995) انجام گرفت. واکنش هضم با استفاده از دو آنزیم برشیEcoRI و Tru91 (با جایگاه برشی مشابه MseI) ساخت شرکت Roche انجام شد. برای اطمینان از انجام عمل هضم مقدار 5 میکرولیتر از مخلوط، با استفاده از ژل آگارز 5/1 درصد با بافر TBE 1X الکتروفورز شد و از انجام عمل هضم اطمینان حاصل آمد. پس از برش  DNA توسط آنزیم­های برشی سازگارسازهای (آداپتور) الیگونوکلئوتیدی دو رشته­ای به هر دو انتهای قطعه­های برشی چسبنده اضافه شدند. مرحله تکثیر پیش انتخابی با استفاده از آغازگرهایی که کاملاً مکمل توالی سازگارسازها به همراه تعدادی نوکلئوتید اضافی (0 تا 4 عدد) بودند انجام شد. در مرحله تکثیر انتخابی مجدداً مجموعه کوچکتری از قطعات مرحله پیش‌انتخابی برای تکثیر، انتخاب شدند. در این مرحله از آغازگرهایی که دارای 3 نوکلئوتید انتخابی در انتهای 3 خود هستند استفاده شد. تعداد بیش از 16 ترکیب آغازگری مختلف با 3 نوکلئوتید در انتهای 3 مورد آزمون (primer selection) قرار گرفت. از بین این تعداد ترکیب آغازگری، تعداد 10 ترکیب، که دارای بهترین کیفیت نوار با کمترین حالت در پس­زمینه و بیشترین مقدار چند­شکلی بود، انتخاب شد (جدول 2).

تکثیر قطعات با استفاده از Touch Down PCR انجام گرفت. به این ترتیب که در 12 سیکل ابتدایی دمای اتصال به مقدار 7/0 درجه سانتیگراد در ابتدای هر سیکل کاهش داده ‏شد. محصولات PCR به منظور تفکیک آللی  قبل از  بارگذاری، واسرشته شد، که به این منظور مقدار 8 تا 10 میکرولیتر از بافر بار­گذاری حاوی فرم­آمید[1] به 20 میکرولیتر محصول PCR اضافه شد. سپس کلیه نمونه­ها را به مدت 6 دقیقه در دمای 95 درجه سانتیگراد در ترموسایکلر قرار داده و بلافاصله بر روی یخ منتقل شد، تا برای بارگذاری بر روی ژل پلی­اکریلامید 6% آماده شود. دستگاه (Sequi-Gen GT, BIO-RAD,USA) برای جداسازی قطعات تکثیری بکار رفت. قطر ژل مورد استفاده 25/0 میلیمتر و ابعاد آن 30 × 38 سانتیمتر با حجم 55 میلی­لیتر بود. الکتروفورز به مدت 2 ساعت با استفاده از بافر 1x TBA و ولتاژ 1200 ولت انجام و رنگ آمیزی به روش نیترات نقره صورت گرفت (Bassam et al., 1991). تجزیه و تحلیل داده­ها: هر یک از قطعات تکثیر شده به عنوان یک صفت در نظر گرفته شد و حضور و عدم حضور آنها به ترتیب با اعداد یک و صفر نمایش داده شد. در مرحله بعد داده­های امتیازدهی شده با استفاد­ه از نرم­افزار Excel به یک ماتریس منتقل گردید. سپس با استفاده از نرم افزار NTYSY ver2.02 ماتریس تشابه بر اساس ضریب تشابه جاکارد و الگوریتم UPGMA ترسیم گردید.


 

 

جدول1- ژنوتیپ های جمع آوری شده انار از مناطق مختلف.

Table 1- Collected genotypes of pomegranates from different regions.

ترتیب نمونه

Sample order

محل جمع‏آوری

Location

ترتیب نمونه

Sample orde

محل جمع‏آوری

Location

ترتیب نمونه

Sample orde

محل جمع‏آوری

Location

ترتیب نمونه

Sample orde

محل جمع‏آوری

Location

G1

قوشی چشمه

Ghoushi Cheshmeh

G13

بهنمیر

Bahnamir

G26

رامسر

Ramsar

G38

طوالش

Tavalesh

G2

جنگل گلستان

Golestan Forest

G14

قائم شهر

Ghaem Shahr

G27

رودسر

Roudsar

G39

آستارا

Astara

G3

کلاله

Kalaleh

G15

برنجستانک

Berenjestanak

G28

املش

Amlash

G40

ملس ساوه

Malas Saveh

G4

گنبدکاووس

Gonbad Kavous

G16

خوش دره

Khosh Darreh

G29

لاهیجان

Lahijan

G41

رباب نیریز

Robab Neiriz

G5

مینودشت

Kinoudasht

G17

زیراب

Zirab

G30

آستانه اشرفیه

Astaneh Ashrafiyeh

G42

الک ساوه

Alak Saveh

G6

آق قلا

Agh Ghala

G18

بابل

Babol

G31

رودبار

Roudbar

G43

شاهوار شیرین سروستان

Shahvar Shirin Sarvestan

G7

بندر ترکمن

Bandar Torkman

G19

محمود آباد

Mahmoud Abad

G32

منجیل

Manjil

G44

شیرین‏پوست کلفت

Shirin Poust Koloft

G8

علی آباد کتول

Aliabad Katoul

G20

آمل

Amol

G33

لوشان

Loshan

G45

بی هسته شیرین

Bihasteh Shirin

G9

هزار پیچ

Hezar Pich

G21

نور

Nour

G34

رشت

Rasht

G46

شیرین کن تهران

Shirin Kan Tehran

G10

کرد کوی

Kord Kouy

G22

نوشهر

Noshahr

G35

فومن

Foman

G47

فردوس

Ferdous

G11

میانکاله

Mian Kaleh

G23

چالوس

Chalous

G36

بندر انزلی

Bandar Anzali

   

G12

فرح آباد

Farah Abad

24

تنکابن

Tonekabon

G37

رضوانشهر

Rezvan Shahr

   

 

 

جدول 2- ترکیبات آغازگری مورد استفاده در مرحله تکثیر انتخابی.

Table 2- Primer combinations used for selective amplification stage.

شماره

Number

آغازگرهای مربوط به MseI

Primers related to MseI

آغازگرهای مربوط به EcoRI

Primers related to EcoRI

1

MseI Selective Primer+CTG

EcoRI Selective Primer+AGG

2

MseI Selective Primer+CAT

EcoRI Selective Primer+AGC

3

MseI Selective Primer+CTA

EcoRI Selective Primer+AAG

4

MseI Selective Primer+CTC

EcoRISelective Primer+GGA

5

MseI Selective Primer+CTT

EcoRI Selective Primer+GGA

6

MseI Selective Primer+CAA

EcoRI Selective Primer+GGA

7

MseI Selective Primer+CTT

EcoRISelective Primer+GTG

8

MseI Selective Primer+CAA

EcoRI Selective Primer+GTG

9

MseI Selective Primer+CAT

EcoRI Selective Primer+GGA

10

MseI Selective Primer+CCT

EcoRI Selective Primer+GTG

 

 

 


علاوه بر تجزیه خوشه ای تجزیه به مولفه­های اصلی با استفاده از نرم افزار NTYSY ver2.02 انجام شد و نمودار دوبعدی و سه بعدی جهت گروه بندی و بررسی روابط بین ژنوتیپ ها رسم شد.

 

نتایج و بحث

انار یک گونه چند ساله با عمر طولانی و دگر‌گشن (گرده افشانی به کمک حشرات) است که این صفت بیولوژیکی به ایجاد و حفظ سطح بالای تنوع ژنتیکی مشاهده شده کمک می کند. در این مطالعه از مجموع 10 ترکیب آغازگری که برای بررسی انتخاب شد، در مجموع 825 باند تولید شد، که 764 باند آن چند­شکلی نشان داد. تعداد باندهای تولید شده توسط هر ترکیب آغازگری در دامنه بین 40 باند برای ترکیب آغازگری E-ACC, M-CTG تا 148 باند برای ترکیب آغازگری E-ACG, M-CTT متغیر بود (شکل 1) . متوسط باند کل و باند چندشکل برای هر ژنوتیپ به ترتیب 5/82 و 7/67 باند بود.

محتوای اطلاعات چند‌شکلی (PIC) برای قدرت تشخیص مکانهای ژنی AFLP محاسبه شد، با توجه به نتایج جدول 3 متوسط PIC بدست آمده برای 10 ترکیب آغازگری 21/0 بود. بیشترین مقدار PIC به ترکیب آغازگری E-AAG M-CAC با 28/0 و کمترین میزان آن مربوط به ترکیب آغازگری E-AGG, M-CTT با متوسط 11/0 تعلق داشت. پایین بودن میزان PIC نشان دهنده سطح پائین تمایز می­باشد.

 

 

 

 

 

شکل 1- پروفایل ژل اکریلامید مربوط به ترکیب آغازگری E-ACG, M-CTT.

Figure 1- Profile of acrylamide gel for primer combination of E-ACG, M-CTT.

 

 

میانگین شاخص نشانگر AFLP بر پایه تعداد نوارهای چند­شکل در این تحقیق 33/17 بود که بیشترین و کمترین میزان آن به ترتیب به ترکیب آغازگرهای M-CAC, E-AAG با 47/23 و  E-ACC, M-CTG با 59/7 مربوط بود که بالا بودن میزان شاخص نشانگر نشان دهنده توان جداسازی بالای ترکیب در مقایسه با دیگر ترکیب­های آغازگری است. شاخص نشانگر (MI) که یکی از شاخص‏ها در قدرت  تفکیک یک نشانگر می‏باشد نشان می‏دهد تفاوت این شاخص زمانی ملموس‏تر می‏شود که در بررسی بین گونه‏ایی به کار گرفته شوند. بر اساس شاخص شائون نیز ترکیب آغازگری (M-CTG 19/0±66/0) و ترکیب آغازگری E-AAA, M-CCC (14/0±14/0) بیشترین و کمترین تنوع را حاصل کردند. دندروگرام مربوط به داده­های حاصل از نشانگر AFLP با استفاده از 764 باند پلی مورف در شکل 2 نشان داده شده است. بر اساس این دندروگرام ژنوتیپ های انار در 5 گروه کاملا مجزا قرار گرفتند. گروه اول شامل نمونه‏های فردوس و شیرین‏کن تهران بودند. گروه دوم شامل نمونه‏های بندر انزلی، رضوانشهر، منجیل، لوشان، رشت، فومن، طوالش، آستارا،ملس‏ساوه، رباب نیریز، قچاق‏قم، الک ساوه، شهوار شیرین سروستان، شیرین پوست کلفت وبی هسته شیرین بود.

 

 

 


جدول 3- نتایج حاصل از بررسی تنوع 47 ژنوتیپ انار با استفاده از نشانگر AFLP.

Table 3- Results of diversity study in 47 pomegranate genotypes using AFLP marker.

 

 

تعداد کل نوار No. total bands

تعداد نوارهای چند­شکل

No. polymorphic bands

درصد نوارهای چندشکل

Polymorphism percent

PIC

شاخص نشانگر

Marker index

شاخص پراکندگی

diversity index

شاخص شانون

Shannon index

E-AAC, M-CAC

113

95

84.07

0.263

22.11

0.13 ± 0.17

0.29 ± 0.19

E-ACC, M-CTG

40

23

57.50

0.132

7.59

0.17 ± 0.13

0.66 ± 0.19

E-ACC, M-CAT

50

43

86

0.227

19.52

0.10 ± 0.16

0.16 ± 0.23

E-ACG, M-CTA

72

63

87.50

0.158

13.82

0.16 ± 0.15

0.27 ± 0.21

E-ACT, M-CTC

126

111

88.10

0.236

20.79

0.11 ± 0.14

0.20 ± 0.19

E-AGT, M-CTC

43

33

76.74

0.195

14.96

0.14 ± 0.10

0.26 ± 0.16

E-ACG, M-CTT

148

127

85.81

0.256

21.96

0.14 ± 0.16

0.24 ± 0.22

E-AGG, M-CTT

46

37

80.43

0.116

9.32

0.17 ± 0.14

0.30 ± 0.20

E-AAA, M-CCC

65

54

83.08

0.238

19.77

0.07 ± 0.10

0.14 ± 0.15

E-AAG M-CAC

122

111

90.98

0.285

23.47

0.18±.014

0.30 ± 0.19

میانگین

Mean

82.5

67.7

82.02

0.210

17.33

 

 

 

 

نمونه‏های خوش دره،‏ زیرآب، بابل، محمود آباد، آمل، نوشهر، نور، چالوس، تنکابن، رودسر، رامسر، املش، لاهیجان، آستانه اشرفیه و رودبار در گروه سوم قرار گرفتند. نمونه‏های کلاله، گنبد کاووس، مینودشت، فرح آباد، بندرترکمن، علی آباد کتول، هزار پیچ، کردکوی، میانکاله، فرح آباد، بهنمیر، قائم‏شهر و برنجستانک در گروه چهارم قرار گرفتند و گروه پنجم شامل نمونه‏های قوشی چشمه و جنگل گلستان بود. بیشترین ژنوتیپ ها در گروه دوم و سوم و کمترین آنها در گروه اول و پنجم بودند. بیشترین شباهت ژنتیکی بین نمونه های بهنمیر و شیرین‏کن تهران و کمترین میزان شباهت بین نمونه‏های برنجستانک و خوش دره دیده شد. با توجه به نتایج تجزیه کلاستر می توان گفت تقسیم بندی ناحیه‏ای و جغرافیایی تاثیری در تنوع ایجاد شده بین نمونه‏ها نداشته اما تنوع درون ناحیه‏ای مشهود است، بدین معنی که ژنوتیپ‏های درون گروهی هر استان تنوع ژنتیکی بالایی از خود نشان دادند که علت این امر عواملی چون جهش و قدرت تفکیک بالای نشانگرهای بکار رفته در تحقیق (Sunil Kumar, 1999)، و نحوه نمونه برداری (شرایط محیطی منطقه) مانند پستی و بلندی از سطح دریا، مناطق جنگلی، مناطق کوهستانی و حتی ساحلی است.


 

 

 

شکل 2- گروه­بندی ژنوتیپ­های گیاه انار با استفاده از نشانگر AFLP.

Figure 2- Clustering of Pomegranate genotypes using AFLP marker.

 

 

نتایج تجزیه به‏مولفه­های اصلی شامل مقادیر ویژه، نسبت واریانس توجیه شده توسط هر مولفه و واریانس تجمعی سه مولفه اول در جدول 4 نشان داده شده است. نتایج تجزیه به‏مولفه­های اصلی نشان داد، سه مولفه اول در مجموع 57 درصد واریانس کل را توجیه می­کنند که سهم مولفه اول 95/48 درصد، مولفه دوم 48/4 درصد و مولفه سوم 65/3 درصد از تغییرات کل می­باشد. این امر نشان دهنده این می‏باشد که نشانگر AFLP (با ترکیبات به کار رفته در این تحقیق) پوشش نسبتاً خوبی در سطح ژنوم دارد. در بررسی تنوع ژنتیکی با استفاده از داده‏های مربوط به نشانگرهای DNA بهترین حالت آن است که نشانگرها توزیع یکنواخت و مناسبی در ژنوم داشته باشند و بتوانند از تمام ژنوم نمونه برداری کنند. بنابراین در صورتی که نشانگرها از بخش‏های مختلف ژنوم انتخاب شوند و همبستگی آنها کم باشد تعداد مؤلفه‏های بیشتری برای توجیه کل تغییرات لازم است. اطلاعات بدست آمده از تجزیه مؤلفه‏های اصلی مؤید این مطلب است که این ترکیبات آغازگری پراکندگی نسبتاً خوبی در سطح ژنوم دارند.

 

جدول 4- تجزیه به مولفه­های اصلی داده های مربوط به AFLP.

Table 4- Principle component analysis for AFLP data. 

مولفه

component

مقادیر ویژه

Egent values

واریانس

Variance

واریانس تجمعی

Cumulative variance

مولفه اول

first component

23.01

48.95

48.95

مولفه دوم

second component

2.10

4.48

53.44

مولفه سوم

third component

1.67

3.56

57.00

 

 

در شکل ‏3 ‏نمایش سه بعدی پراکنش افراد پیرامون مؤلفه‏های اصلی نشان داده شده است. تجمع افراد در یک نقطه از پلات نشان دهنده تشابه ژنتیکی آن افراد می­باشد. همان طور که در این شکل­ مشاهده می­شود سهم سه مؤلفه اول در توجیه تغییرات بسیار بالا می­باشد 5 گروه حاصل از دندوگرام نیز در تجزیه به مولفه های اصلی قابل رویت است بنابراین نمودار سه بعدی تجزیه به‏مولفه­های اصلی گروه‏بندی انجام شده را توجیه می‏کند.

 

 

 

شکل 3- دیاگرام سه بعدی تجزیه به مولفه­های اصلی بر اساس سه مولفه اول داده­های نشانگر AFLP.

Figure 3- Three dimension diagram of principle component analysis based on first three components of AFLP data. 

 

در کل نتایج نشان داد که چندشکلی مطلوبی بین نمونه‏های وحشی انار در سه استان وجود دارد که این نشان دهنده غنای زیاد پایه‏ی ژنتیکی انار در ایران است. در زمینه بررسی تنوع ژنتیکی انار با استفاده از نشانگرهای مولکولی گزارشات متعددی وجود دارد (Rahimi et al., 2005; Avamleh et al., 2009; Nemati et al., 2012; Zamani et al., 2007; Durgac et al., 2008; Narzary et al., 2009). این تنوع ژنتیکی می‏تواند منبع قابل استفاده برای کمک به برنامه اصلاحی انار برای اهداف مختلف باشد. با توجه به نتایج این تحقیق می توان گفت که تقسیم بندی ناحیه‏ای و جغرافیایی تاثیری در تنوع ایجاد شده بین نمونه‏ها نداشته اما تنوع درون ناحیه‏ای مشهود است. اینگونه نتایج توسط Yuan et al.  (2007) و نیز Narzary et al.  (2009) روی جمعیت­های وحشی انار گزارش شده است که نشان­دهنده این موضوع است که الگوی مشخصی در تمایز ارقام انار با توجه به مناطق جغرافیایی وجود ندارد.

 

 

 

منابع

Avamleh H, Hassawi D, Migdadi H, Brake M (2009). Molecular characterization of pomegranate (punica granatum L.) landraces grown in Jordan using amplified fragment length polymorphism markers. Biotechnology 8: 316-322.

Bassam BJ, Caetano-Anollés G, Gresshoff PM (1991). Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels. Annals of Biochemistry 196: 80-83.

Durgac C, Ozgen M, Simsek O, Kacar YA, Kiyaga Y, Celebi S, Gunduz K, Serce S (2008). Molecular and pomological diversity among pomegranate (punica granatum L.) cultivars in Eastern Mediterranean region of Turkey. African Journal of Biotechnology 7: 1294-1301.

Moslemi M, Zahravi M, Bakhshi Khaniki Gh (2010). Genetic diversity and population genetic structure of pomegranate (Punica granatum L.) in Iran using AFLP marker. Scientia Horticulturae 126: 441-447.

Narzary D, Kamalesh SM, Rana TS, Ranade SA (2009). Analysis of genetic diversity among wild pomegranates in Western Himalayas, using PCR methods. Scientia Horticulturae 121: 237-242.

Nemati Z, Tehranifar A, Farsi M, Mirshamsikakhki A, Nemati H, Kayyat M (2012). Evaluation of genetic diversity of Iranian Pomegranate cultivars using fruit morphological characteristics and AFLP markers. Notulae Botanicae Horti Agrobotanici Cluj-Napoca 1:261-268.

Rahimi T, Seyed Tabatabai B, Sharif nabi B, Ghobadi S (2005). The study of genetic relationship of some of pomegranate from Iran by AFLP marker. Agronomy Science Journal 36: 1373-1379.

Sarkhosh A, Zamani Z, Fatahi R, Ebadi A (2006). RAPD markers revealed polymorphism among (Punica granatum L.) genotypes. Scientia Horticulturae 111:24-29.

Sunil Kumar L (1999). DNA markers in plant improvement. Biotechnology Advances 17: 143-182.

Tehranifar A, Zarei M, Nemati Z, Esfandiyari B, Vazifeshenas MR (2010). Investigation of physicochemical properties and antioxidant activity of twenty Iranian pomegranate (Punica granatum L.) cultivars. Scientia Horticulturae 126: 180–185.

Vos P, Hogers R, Bleeker M, Reijans M, van de Lee T, Hornes M, Frijters A, Pot J, Peleman J, Kuiper M, et al. (1997). AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research 23: 4407–4414.

Witkowicz J, Urbanczyk-Wochniak E, Przybecki Z (2003). AFLP marker polymorphism in cucumber (Cucumis sativus L.) near isogenic lines differing in sex expression. Cellular and Molecular Biology Letters 8: 375-381.

Yuan Z, Yin Y, Qu J, Zhu L, Li Y. (2007). Population genetic diversity in Chinese Pomegranate (Punica granatum L.) cultivars revealed by fluorescent-AFLP markers. Journal of Genetics and Genomics 34: 1061-1071.

Zamani Z, Sarkhosh A, Fatahi R, Ebadi A (2007). Genetic relationships among pomegranate genotypes studied by fruit characteristics and RAPD markers. Journal of Horticultural Sciences and Biotechnology 82: 11-18.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


Assessment of diversity and genetic relationships in Pomegranate genotypes using AFLP marker

 

Nazifi-Gelirdi R.1, Kiani G.*2, Dehestani-Kolagar A.3, Hashemi S.H.R. 3

 

1MSc student of Biotechnology, Sari University of Agricultural Sciences and Natural Resources, Sari, Iran.

2Department of Biotechnology and Plant Breeding, Sari University of Agricultural Sciences and Natural Resources, Sari, Iran.

3Genetics and Agricultural Biotechnology Institute of Tabarestan.

 

Abstract

Pomegranate (Punica granatum L.) is native to Iran with several ecotypes which have been adapted to various climatic conditions and diseases.  Although it is one of the important exported fruits, there is not a precise identification criteria to determine the authenticity of genetic inheritance and proprietary rights in the country. In the present study the genetic relationships of 47 pomegranate genotypes, including 9 cultivated genotypes (from the collection of Yazd) and 38 wild genotypes (from Mazandaran, Gilan and Golestan provinces), were investigated with AFLP markers. Using 10 primer combinations, 825 bands were obtained of which 697 showed polymorphism. Among the primers, primer combination of M-CTT and E-ACG showed the highest number of bands (148) and primer combination of E-ACC, M-CTG produced the lowest number of bands (40). The average value for PIC was 0.21, while Average Marker Index (MI) was 17.33 that the highest one belonged to primer combination of M-CAC and E-AAG. Maximum genetic similarity belonged to Bahnamir with Shirin Kan Tehran samples and the minimum genetic similarity observed between Berenjestanak and Khosh Darreh. Principal component analysis showed that 57% of the total variance was explained by first three components. The identified primer combinations in this study could be used as a powerful tool for determination of genetic relationships between Pomegranate genotypes.

 

Keywords: Pomegranate, Genetic diversity, AFLP markers, Principal component analysis.


 



* نویسنده مسئول: غفار کیانی                                    تلفن: 01133687569                                                    Email: ghkiani@gmail.com

[1]Formamide

* Corresponding Author: Kiani G.            Tel: 01133687569                    Email: ghkiani@gmail.com

Avamleh H, Hassawi D, Migdadi H, Brake M (2009). Molecular characterization of pomegranate (punica granatum L.) landraces grown in Jordan using amplified fragment length polymorphism markers. Biotechnology 8: 316-322.
Bassam BJ, Caetano-Anollés G, Gresshoff PM (1991). Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels. Annals of Biochemistry 196: 80-83.
Durgac C, Ozgen M, Simsek O, Kacar YA, Kiyaga Y, Celebi S, Gunduz K, Serce S (2008). Molecular and pomological diversity among pomegranate (punica granatum L.) cultivars in Eastern Mediterranean region of Turkey. African Journal of Biotechnology 7: 1294-1301.
Moslemi M, Zahravi M, Bakhshi Khaniki Gh (2010). Genetic diversity and population genetic structure of pomegranate (Punica granatum L.) in Iran using AFLP marker. Scientia Horticulturae 126: 441-447.
Narzary D, Kamalesh SM, Rana TS, Ranade SA (2009). Analysis of genetic diversity among wild pomegranates in Western Himalayas, using PCR methods. Scientia Horticulturae 121: 237-242.
Nemati Z, Tehranifar A, Farsi M, Mirshamsikakhki A, Nemati H, Kayyat M (2012). Evaluation of genetic diversity of Iranian Pomegranate cultivars using fruit morphological characteristics and AFLP markers. Notulae Botanicae Horti Agrobotanici Cluj-Napoca 1:261-268.
Rahimi T, Seyed Tabatabai B, Sharif nabi B, Ghobadi S (2005). The study of genetic relationship of some of pomegranate from Iran by AFLP marker. Agronomy Science Journal 36: 1373-1379.
Sarkhosh A, Zamani Z, Fatahi R, Ebadi A (2006). RAPD markers revealed polymorphism among (Punica granatum L.) genotypes. Scientia Horticulturae 111:24-29.
Sunil Kumar L (1999). DNA markers in plant improvement. Biotechnology Advances 17: 143-182.
Tehranifar A, Zarei M, Nemati Z, Esfandiyari B, Vazifeshenas MR (2010). Investigation of physicochemical properties and antioxidant activity of twenty Iranian pomegranate (Punica granatum L.) cultivars. Scientia Horticulturae 126: 180–185.
Vos P, Hogers R, Bleeker M, Reijans M, van de Lee T, Hornes M, Frijters A, Pot J, Peleman J, Kuiper M, et al. (1997). AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research 23: 4407–4414.
Witkowicz J, Urbanczyk-Wochniak E, Przybecki Z (2003). AFLP marker polymorphism in cucumber (Cucumis sativus L.) near isogenic lines differing in sex expression. Cellular and Molecular Biology Letters 8: 375-381.
Yuan Z, Yin Y, Qu J, Zhu L, Li Y. (2007). Population genetic diversity in Chinese Pomegranate (Punica granatum L.) cultivars revealed by fluorescent-AFLP markers. Journal of Genetics and Genomics 34: 1061-1071.
Zamani Z, Sarkhosh A, Fatahi R, Ebadi A (2007). Genetic relationships among pomegranate genotypes studied by fruit characteristics and RAPD markers. Journal of Horticultural Sciences and Biotechnology 82: 11-18.