بررسی بیوانفورماتیکی توالی­های EST سنبله گندم چینی بهاره تحت تنش شوری

زهرا زینتی¹، عباس عالم‏زاده*²_، اسماعیل ابراهیمی³

¹استادیار بخش اگرواکولوژی، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی داراب.

²دانشیار بخش زراعت واصلاح نبات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شیراز، شیراز.

³دانشیار پژوهشکده بیوتکنولوژی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شیراز، شیراز.

تاریخ دریافت: 17/06/1394، تاریخ پذیرش: 06/07/1395

چکیده

تغییرات کارکرد ژنوم تحت شرایط تنش می‌تواند راهکاری برای درک بهتر سازوکارهای تحمل به تنش در گیاهان باشد. در این پژوهش سعی شده است تا با بررسی توالی­های EST دو کتابخانه کنترل و تنش شوری در گندم، تغییرات کارکردی ژنوم در تنش شوری و ژن­های مؤثر در تحمل به شوری شناسایی شوند. بدین منظور توالی­های EST از وب­گاه هاروارد و Graingenes دریافت شدند. به منظور دسته‏بندی توالی­های EST، تعیین پروتئین­های مرتبط با یونی­ژن­ها (کانتیگ­ها و سینگل­تون­ها)، تعیین گروه­های کارکردی و آزمون­های آماری، به ترتیب از بانک اطلاعاتی Egassembler، بلاست وب­گاه NCBI، وب­گاه مؤسسه ماکس پلانک و نرم­افزار IDEG6 استفاده شد. نتایج نشان‌دهنده وجود اختلاف معنی­دار بین 20 گروه کارکردی در شرایط کنترل و تنش شوری بود. در هر دو شرایط کنترل و تنش شوری، گروه­های کارکردی پروتئین و RNA بیشترین و گروه­های کارکردی متابولیسم کربوهیدرات اصلی، تبدیل مواد آلی و چرخه کربس کمترین فعالیت کارکردی ژنوم را نسبت به سایر گروه­های کارکردی ژنوم به خود اختصاص دادند. تحت تنش شوری، فعالیت گروه­های کارکردی سنتز  ATP/ انتقال الکترون میتوکندریایی، متابولیسم چربی، اکسایش-کاهش، پروتئین، RNA، DNA و سلول افزایش یافت. بنابراین می‏توان پیشنهاد کرد که این گروه­های کارکردی دارای نقش مهمی در مکانیسم پاسخ به تنش شوری هستند. تجزیه و تحلیل بیان ژن‏ها در شرایط کنترل و تنش شوری نشان داد 271 ژن دارای بیان افتراقی معنی­دار بودند که در 23 گروه کارکردی مختلف قرار گرفتند. ژن­های شناسایی شده در این پژوهش می­توانند جهت دست­ورزی ژنتیکی با هدف بهبود تحمل به تنش شوری در گیاهان زراعی مورد استفاده قرار گیرند.

واژه­های کلیدی: تنش شوری، ژنومیکس کارکردی، سنبله.

مقدمه

در سیستم­های کشاورزی، تنش­های غیر زیستی به ویژه شوری، دمای پائین و خشکی باعث تفاوت عملکرد برداشت شده نسبت به عملکرد بالقوه می­شوند. مطالعات متعددی با هدف کشف مکانیسم­های مورد استفاده در گونه­های متحمل به تنش و عناصری که تحمل را به گیاهان حساس اعطا می­کنند انجام شده است

 (Noctor & Foyer, 1998; Dat et al., 2000). همچنین پژوهش‏های فراوانی در رابطه با تحمل به شوری در گیاهان زراعی انجام شده است اما ماهیت پیچیده و پلی ژنی تحمل به تنش شوری، اصلاح گیاهان برای تحمل به شوری را با مشکل روبرو کرده است (Zhu, 2000). شواهد زیادی وجود دارند که بیانگر تغییر بیان ژن‌های گیاهی در اثر تنش شوری هستند که احتمالاً به دلیل نقش آن­ها در سازوکارهای تحمل می‌باشد. مطالعه گیاهان تراریخته این نظریه را که تغییر بیان ژن­ها می­تواند منجر به افزایش تحمل شود، حمایت می­کند (Van Camp et al., 1996; Shikanai et al., 1998; Apse et al., 1999). هم اکنون روش­های جدیدی برای درک بیشتر ژنتیک تحمل به تنش­های غیر زیستی در دسترس هستند و به ما این امکان را می‏دهند که پیچیدگی­های پاسخ به تنش را از طریق بررسی پروفایل بیان ژن‌ها در سطح کل ژنوم مورد توجه قرار دهیم (Reymond et al., 2000; Richmond & Somerville, 2000). امروزه از فن­آوری­های امیکس[1] برای مطالعه در سطح ترانسکریپتوم[2]، پروتئوم[3]، متابولوم[4] استفاده می­شود. این فن­آوری­ها نحوه کارکرد ژنوم در یک شرایط محیطی خاص، روابط بین ژن­ها، نقش بخش­های رمز کننده و غیر رمز کننده ژنوم و نقاط کلیدی شبکه پاسخ به شرایط درونی و بیرونی گیاه را روشن می­سازند (Fleury et al., 2010; Urano et al., 2010). از جمله روش­های ژنومیکس کارکردی[5]، تولید و تجزیه و تحلیل توالی­های EST [6] ، فن­آوری ریزآرایه[7] و توالی­یابی RNA [8] می­باشند (Ali et al., 2011).

توالی­های EST، توالی­های کوتاه cDNA (میانگین طول 500 جفت باز) می­باشند که به وسیله توالی­یابی انتهای '5 یا '3 همسانه­های cDNA ایجاد می­شوند (Dong et al., 2005). آنالیز توالی­های EST یک روش مؤثر در نقشه­یابی بسیاری از ژن­ها، کشف ژن­های جدید و بررسی بیان ژن­ها در اندام­ها و بافت­های مختلف در مراحل نموی و پاسخ به تنش­ها­ می­باشد (Gueguen et al., 2003; Gruber et al., 2012; Zhuang & Zhu, 2014). Houde  و همکاران (2006) با ایجاد 73521 توالی EST از گندم نان در مراحل مختلف نموی و در معرض تنش­های سرما، شوری و خشکی و ترکیب آن­ها با 196041 توالی EST موجود در بانک­های اطلاعاتی و دسته­بندی آن­ها، به 75488 یونی­ژن[9] (31580 کانتیگ و 43908 سینگل تون) دست یافتند. بیش از 43% از این یونی­ژن­ها مورد آنالیز کارکردی قرار گرفت و گروه­های کارکردی مربوط به آن­ها تعیین شد (Houde et al., 2006). روش EST به منظور پیدا کردن ژن­های جدید و تعیین الگوی‌های بیان در گیاهSuaeda salsa  (Zhang et al., 2001)، Thellungiella halophila (Wang et al., 2004)، Avicennia  (Mehta et al., 2005) و Mesembryanthemum crystallinum  (Kore-eda et al., 2004) در پاسخ به تنش شوری استفاده شده است. در پژوهشی روی گیاه شورپسندAeloropous litorallis، به عنوان گیاهی که می­تواند منبع ژنتیکی ارزشمندی برای ژن­های مقاومت به شوری و خشکی باشد، سه کتابخانه cDNA از بافت­های ریشه و برگ در شرایط مختلف تیمار شوری ایجاد کردند و نهایتاً 1268 توالیEST  را توالی­یابی کردند (Zouari et al., 2007). پس از مقایسه با پایگاه­های داده­ی پروتئینی، 68% از توالی­ها در گروه پروتئین­های با کارکرد مشخص، 12% در گروه توالی­های مشابه ناشناس و 20% در هیچ گروهی قرار نگرفت که می­تواند دلیلی بر جدید بودن آن­ها باشد (Zouari et al., 2007). شناسایی و بررسی کارکرد ژن­های پاسخ­دهنده به تنش شوری به درک مکانیسم­های کلیدی تنش شوری کمک می­کند. در این راستا، در این پژوهش سعی شده است تا با بررسی توالی­های EST کتابخانه­های کنترل و تنش شوری گندم تغییرات کارکرد ژنوم در تنش شوری، ژن­های با بیان افتراقی و ژن‏های دخیل در پاسخ به شوری شناسایی شوند. پس از بررسی ژن­ها می­توان برنامه­هایی در جهت انتقال ژن­های مؤثر در تحمل به تنش شوری از طریق برنامه­های اصلاحی و مهندسی ژنتیک به ژنوم گندم طرح ریزی کرد که در صورت موفقیت به تولید ارقامی با تحمل به شوری بالا خواهد انجامید.

مواد و روش­ها

به منظور مقایسه گروه­های کارکردی و بیان ژن­ها یک کتابخانه گندم چینی بهاره تحت تنش شوری با 14770  توالیEST  تحت عنوان  TA034G1X و یک کتابخانه گندم چینی بهاره در شرایط کنترل با 10544 توالیEST  تحت عنوان  TA019E1X که مربوط به سنبله گندم هستند از وب­گاه‌های GrainGenes[10]  و هاروارد[11]  با فرمت FASTA دریافت شدند. توالی­های EST مربوط به هر کدام از کتابخانه­ها به صورت جداگانه با استفاده از سایت EGassembler[12] (MasoudiNejad et al., 2006) با در نظر گرفتن80% شباهت دسته­بندی و همگذاری شدند. این سایت توالی­های مربوط به وکتور، توالی­های کلروپلاستی و میتوکندریایی، توالی­های تکرار شونده و توالی­های با طول کوتاه­تر از bp100  را حذف می­کند. سپس توالی­های باقیمانده با کیفیت بالا با در نظر گرفتن80% شباهت دسته­بندی و همگذاری شدند. به عبارتی توالی­هایی که به هم شبیه هستند در یک دسته قرار می­گیرند. خروجی این سرویس شامل سه فایل بود.  یک فایل شامل توالی­های منفرد بود که در هیچ دسته­ای قرار نگرفتند و به آن­ها سینگل­تون­ (شامل تنها یک EST) می­گویند. فایل دیگر شامل دسته­هایی بیش از یک توالی بود که به آن­ها کانتیگ (شامل دو یا تعداد بیشتری EST) می­گویند و فایل دیگر شامل صف­بندی توالی­های EST بود. بلاست ایکس برای یونی­ژن­های (کانتیگ­ها و سینگل­تون‏های) هر کتابخانه به منظور تعیین پروتئین­های مرتبط با آن­ها انجام شد. این کار با استفاده از نرم افزار CLC  Protein Workbench version 5.1 صورت گرفت. ماتریس مورد استفاده برای انجام بلاست ایکس Blosum 62 و حداکثر E-value برابر ^5- 10بود. از آن­جا که بانک اطلاعات کارکردی گیاه آرابیدپسیس کامل­ترین بانک گیاهی است، به منظور تعیین گروه­های کارکردی ژنوم تحت شرایط نرمال و تنش شوری، توالی­های پروتئینی آرابیدوپسیس از سایت Tair (https://www.arabidopsis.org) دریافت شدند. سپس بلاست ایکس با استفاده از نرم افزارCLC  Protein Workbench version 5.1 ، برای یونی­ژن­های (کانتیگ­ها و سینگل­تون‏های) هر کتابخانه در مقابل پروتئین­های آرابیدوپسیس انجام شد و کدهای  Tairمربوط به یونی­ژن­­ها دریافت شدند. سپس فهرست کدهای Tair یونی­ژن­های مربوط به هر کتابخانه به عنوان ورودی سرویس Gene Classify در سایت ماکس پلانک[13] (Usadel et al., 2006) و با مرجع قرار دادن ژنوم آرابیدوپسیس در سطح 1 درصد مورد استفاده قرار گرفت. در این تحقیق ESTهای دو کتابخانه به صورت توأم توسط EGassembler بر اساس میزان شباهت 80% شباهت دسته­بندی و همگذاری  شدند. مبنای بررسی و مقایسه بیان ­ژن‏ها در شرایط کنترل و تنش شوری تعداد رونوشت­های هر ژن در هر کدام از کتابخانه­ها می‏باشد. تمام کانتیگ­ها و سینگل­تون‏های مربوط به دسته­بندی و همگذاری ESTهای مربوط به دو کتابخانه با استفاده از نرم افزار  CLC Protein Workbench version 5.1 و توالی­های پروتئینی nr پایگاه NCBI بلاست ایکس شدند. ژن­هایی که در گندم گزارشی در مورد آن­ها وجود ندارد و همچنین توالی­هایی که با هیچ کدام از توالی­های موجود در پایگاه داده شباهتی نداشتند به عنوان نامزدهای ژن­های جدید احتمالی در نظر گرفته شدند. به منظور تعیین گروه­های کارکردی ژن­هایی که تغییر بیان داشتند، کد­های Tair مربوط به هر کدام از آن­ها به صورت جداگانه به عنوان ورودی سرویس Gene Classify در سایت ماکس پلانک مورد استفاده قرار گرفت.

برای یافتن گروه­های کارکردی متفاوت و همچنین تعیین معنی­دار بودن تفاوت بیان ژن­ها در شرایط تحت تنش و کنترل از نرم­افزار تحت وب 6IDEG[14] استفاده شد. این سرویس امکان اجرای شش آزمون آماری مختلف را فراهم کرده است. در این پژوهش از آزمون Audic and Claverie در سطح 5% استفاده شد. این آزمون دقیق­ترین آزمون در مقایسات جفتی می­باشد (Romualdi et al., 2003). آزمون Audic and Claverie کتابخانه­ها را به صورت جفتی و بر پایه محاسبه احتمال شرطی و با فرض یکسان بودن تعداد ژن­ها در هر گروه کارکردی در دو کتابخانه مورد بررسی (Man et al., 2000) و یا یکسان بودن تعداد رونوشت­ها در هر کانتیگ در دو کتابخانه، مقایسه می­کند.

نتایج و بحث

در پژوهش حاضر، به منظور ارزیابی اثر شوری بر پروفایل ترانسکریپتوم سنبله­های گندم و با توجه به نقش پراهمیت توالی­های EST در دستیابی به ژن­های جدید، از تجزیه و تحلیل توالی­های EST استفاده شد. از دسته­بندی توالی­های EST کتابخانه­های گندم تحت شرایط کنترل و شوری با استفاده از سرویس بیوانفورماتیک EGassembler به ترتیب 6919 و 5585 یونی­ژن مجزا تشکیل شد که نتایج همگذاری این توالی­ها در جدول 1 نشان داده شده است. در مجموع، 39/48 درصد کل توالی‏های EST کتابخانه گندم کنترل و 539/79 درصد کل توالی­های EST کتابخانه گندم تحت تنش شوری درون کانتیگ­ها قرار گرفت. علت این امر می­تواند وجود تعداد رونوشت­های بیشتری از یک ژن (یعنی افزایش بیان ژن) در کتابخانه تحت تنش باشد که سبب افزایش تعداد ESTهای تشکیل دهنده هر کانتیگ در کتابخانه تنش می­شود. از آن جا که گروه­های کارکردی گیاه آرابیدوپسیس به طور کامل شناخته شده است جستجوی بلاست برای کانتیگ­ها و سینگل­تون­های دو کتابخانه در برابر بانک اطلاعاتی آرابیدوپسیس با استفاده از نرم افزار CLC Protein Workbench version 5.1 انجام شد. نتایج نشان داد که 96/66 درصد یونی­ژن­های کتابخانه کنترل و 99/69 درصد یونی­ژن­های کتابخانه تنش شوری با پروتئین­های شناخته شده در آرابیدوپسیس و با ^5-10 ≥ value-E شباهت داشتند و به ترتیب 03/33 درصد و 30 درصد یونی­ژن­های کتابخانه­های کنترل و تنش شوری با هیچ پروتئینی در آرابیدوپسیس شباهت نشان ندادند و به عبارتی فاقد hit بودند (جدول 2).

ماهیت شناسی یا آنتالوژی ژن برای تشریح کارکرد ژن و پروتئین استفاده می­شود. ماهیت­شناسی ژن این امکان را فراهم می­آورد که ژن­های مورد بررسی در یک فرایند مشخص بر اساس شباهت در کارکرد و فعالیتشان به گروه­های کارکردی مختلف تقسیم­بندی شوند. این تقسیم­بندی اطلاعات بسیار با ارزشی پیرامون قسمت­های فعال ژنوم طی یک فرایند خاص و همچنین میزان فعالیت این قسمت­ها فراهم می­کند (Rhee et al., 2006; Smith et al., 2003). بنابراین گروه‏های کارکردی مربوط به هر کتابخانه با استفاده از وب­گاه ماکس پلانک تعیین شدند. یونی­ژن­های دارای hit کتابخانه گندم کنترل و کتابخانه گندم تحت تنش شوری به ترتیب در 35 و 34 گروه کارکردی مختلف قرار گرفتند. گروه کارکردی میکرو RNAو آنتی­سنس­های طبیعی[15] هیچ نماینده­ای در کتابخانه کنترل و گروه­های کارکردی چرخه گلی­اکسیلات/ گلوکونئوژنز[16] و چرخه جذب سولفات[17] هیچ نماینده­ای در کتابخانه گندم تحت تنش شوری نداشتند. بنابراین دو کتابخانه در 32 گروه کارکردی مشترک بودند. یکی از اصلی­ترین روش­های تنظیم فرایندهای ژنتیکی از طریق مکانیسم­های مرتبط با میکروRNA است. میکروRNA­­ها مولکول­های کوچک (22 نوکلئوتیدی) و تک رشته­ای هستند که مکمل mRNA یک ژن رمز کننده یک پروتئین می­باشند و می­توانند از بیان یک ژن یا تولید یک پروتئین جلوگیری کنند. از این رو تحقیقات فراوانی در مورد نقش این مولکول­ها صورت گرفته است (Winter & Diederichs, 2011). میکروRNAها نقش‌های مهمی در پاسخ به محرومیت مواد غذایی، تنش­های زیستی و غیر زیستی دارند (Jones-Rhoades & Bartel, 2004; Sunkar & Zhu, 2004; Fujii et al., 2005; Chiou et al., 2006; Navarro et al., 2006; Sunkar et al., 2006; Sunkar et al., 2012; Khraiwesh et al., 2012). حضور گروه کارکردی میکرو RNA در کتابخانه تنش شوری، بیانگر تنظیم بیان بعضی از ژن­ها در پاسخ به تنش شوری­ در سطح پس از رونویسی[18] می­باشد.

آزمون Audio and Claverie در سطح 5 درصد، وجود تفاوت معنی­دار در 20 گروه کارکردی بین دو شرایط کنترل و تحت تنش شوری را نشان داد (شکل 1). چهار گروه کارکردی متابولیسم ثانویه[19]، misc[20] (خانواده­های آنزیمی متفاوت)، پروتئین و سیگنالینگ اختلاف معنی­دار در سطح ٠٠١/٠ بین شرایط کنترل و تنش شوری نشان دادند و بقیه گروه­های کارکردی در سطح 05/0 اختلاف معنی‏دار داشتند.

با توجه به شکل 1 در هر دو کتابخانه کنترل و تنش شوری فعالیت گروه­های کارکردی پروتئین، RNA نسبت به سایر گروه‏های کارکردی ژنوم در بالاترین سطح و در مقابل فعالیت گروه­های کارکردی متابولیسم اصلی کربوهیدرات[21] و تبدیل مواد آلی و چرخه کربس[22] در پائین­ترین سطح قرار داشت. همچنین فعالیت گروه­های کارکردی سنتز  ATP/ انتقال الکترون میتوکندریایی[23]، متابولیسم لیپید[24]، اکسایش - احیا[25]، پروتئین، RNA و DNA سلول در شرایط تنش شوری افزایش و فعالیت گروه­های کارکردی دیگر کاهش یافته است. به عبارتی می­توان گفت تحت تنش شوری فعالیت ژنوم به سمت افزایش سنتز  ATP/ انتقال الکترون میتوکندریایی، متابولیسم لیپید، اکسایش – احیا، پروتئین، RNA و DNA  گرایش پیدا می­کند که می‏تواند بیانگر نقش مهم این گروه­های کارکردی در فرایند تحمل به شوری باشد. به علاوه، شناسایی ژن­های پاسخ دهنده برای درک اساس مولکولی تحمل به شوری ضروری است. در این راستا، به منظور یافتن ژن­های دارای بیان افتراقی، ESTهای دو کتابخانه به طور مجزا توسط EGassembler بر اساس میزان شباهت دسته بندی شدند. طبق نتایج آزمون آماری Audic and Claverie، 271 کانتیگ بین شرایط کنترل و تنش شوری دارای بیان افتراقی معنی­دار در سطح 5% بودند. نتایج نشان داد که 92 کانتیگ تنها در تنش شوری بیان شدند، 101 کانتیگ در تنش شوری افزایش بیان نشان دادند، 22 کانتیگ در تنش شوری کاهش بیان داشتند و 56 کانتیگ تنها در شرایط کنترل بیان شدند.

بر اساس نتایج این پژوهش، فعالیت گروه کارکردی فتوسنتز تحت تنش شوری کاهش یافت. از طرف دیگر بررسی ژن­های دارای بیان افتراقی نشان داد که ژن­هایی که در این گروه کارکردی قرار می­گیرند اغلب کاهش بیان داشتند. از جمله این ژن­ها می­توان به ژن­های رمز کننده  (ABQ52657.1)chloroplast oxygen-evolving enhancer protein 1، (ACO06087.1)chlorophyll a-b binding protein ، (XP_003562323.1)chlorophyll a-b binding protein, chloroplastic-like ، (CAD30025.1) ferredoxin-NADP(H) oxidoreductase، (Q00434.1) Oxygen-evolving enhancer protein 2, chloroplastic، (BAB19814.1) ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase small subunit اشاره کرد. بنابراین، کاهش فعالیت گروه کارکردی فتوسنتز ممکن است ناشی از کاهش بیان این ژن­ها باشد. نقش برخی از این ژن­ها در تنش شوری و سایر تنش­های محیطی به خوبی شناخته شده است. برای مثال بر اساس نتایج پژوهشی با استفاده از روش پروتئومیکس انجام شد، تحت تنش شوری بیان پروتئین Oxygen-evolving enhancer protein 2 در برگ گیاه گندم کاهش یافت (Gao et al., 2011). همچنین oxygen-evolving enhancer protein 1, chloroplast (OEE1) و Oxygen-evolving enhancer protein 2, chloroplastic (OEE2) در کمپلکس آزادسازی اکسیژن در فتوسیستم II نقش ایفا می­کنند و باعث تجزیه آب و آزادسازی اکسیژن می­شوند (de Vitry et al., 1989).

شکل1- مقایسه گروه­های کارکردی در شرایط کنترل و تنش شوری.

Figure 1- Comparison of functional categories between control and salt stress conditions

 PS: فتوسنتز، CHO metabolism major: متابولیسم کربوهیدرات های بزرگ، TCA/ org. Transformation: تری کربوکسیلیک اسید/تبدیل اسیدهای آلی، mitochondrial electron transport / ATP synthesis: انتقال الکترون در میتوکندری/ سنتز ATP، cell wall: دیواره سلولی، lipid metabolism: متابولیسم چربی، amino acid metabolism: متابولیسم اسید آمینه، secondary metabolism: متابولیسم ثانویه، hormone metabolism: متابولیسم هورمونی، stress: تنش، redox: اکسایش- احیا،  misc: خانواده­های آنزیمی متفاوت، RNA: پردازش، رونویسی و تنظیم رونویسی، DNA: سنتز، ساختار کروماتین و ترمیم DNA، protein: سنتز پروتئین، فعال­سازی اسید آمینه، تغییرات پروتئین و تجزیه پروتئین، signaling: علامت­دهی، cell: سازماندهی سلولی،  تقسیم و چرخه سلولی و انتقال وزیکول، development: نمو، transport: انتقال، not assigned: پروتئین­های ناشناخته و فرضی.

در پژوهشی نیز کاهش بیان پروتئین­ OEE2 را در گیاهچه تحت تنش شوری گندم نان مشاهده کردند. آن­ها گزارش کردند که کاهش بیان پروتئین­ OEE2 احتمالاً می­تواند باعث کاهش سطح آزاد سازی اکسیژن شود تا رادیکال­های اکسیژن آزاد کمتری تولید و در نتیجه تخریب کمتری به فتوسیستم II وارد گردد (Maleki et al., 2012). همچنین در گندم دوروم تحت تنش شوری، کاهش بیان پروتئین OEE2 گزارش شده است (Caruso et al., 2008).

بر اساس نتایج مشخص گردید از مجموع 271 کانتیگ ذکر شده 17 کانتیگ هیچ شباهتی با توالی­های موجود در پایگاه داده­ها نداشتند و به عبارتی فاقد hit بودند. چندین احتمال برای توالی­های بدون hit وجود دارد. ممکن است خطاهای توالی­یابی یا همگذاری ESTها منجر به ایجاد چنین توالی­هایی شده باشد. همچنین توالی­های بدون hit ممکن است مختص گونه باشد بنابراین بلاست آن­ها در گونه­های دیگر نتیجه­ای در بر نخواهد داشت. یک احتمال دیگر این است که توالی­های بدون hit ممکن است ژن­های واقعی باشند که هنوز شناسایی نشده­اند و یا در پایگاه­های داده­ها قرار نگرفته‌اند و در نتیجه تعیین کارکرد و نقش آن­ها در تنش شوری باید مورد بررسی بیشتر قرار گیرد. بررسی آنتولوژی و تجزیه و تحلیل الگوی بیان این ژن­ها به شناسایی کارکرد آن­ها کمک می­کنند.

همچنین دسته­بندی ژن­های با بیان افتراقی بر اساس گروه کارکردی که به آن تعلق دارند انجام شد. در مجموع ژن­های با بیان افتراقی در 23 گروه کارکردی مختلف قرار گرفتند که 19 گروه از این 23 گروه با 20 گروه­ کارکردی که بین دو کتابخانه کنترل و تنش اختلاف معنی­دار داشتند، مشترک بوده و 4 گروه باقیمانده که شامل گروه­های کارکردی گلیکولیز[26]، تخمیر[27]، تجزیه زنوبیوتیک­ها[28] و متابولیسم نوکلئوتیدها[29] بودند، اختلاف معنی­داری بین کتابخانه­های کنترل و تنش نشان نداده بودند. این یافته می­تواند بیانگر این مطلب باشد که تنها مطالعه و بررسی گروه­های کارکردی به منظور چنین مقایساتی نمی­تواند اطلاعات کاملی پیرامون تغییرات کارکردی ژنوم به دست دهد و در کنار آن لازم است که به صورت جداگانه بیان ژن­ها و اختلافات احتمالی بین کتابخانه­ها نیز بررسی شود (Shamloo-dashtpagerdi, 2009). توزیع ژن­ها در گروه­های کارکردی نیز متفاوت بود (شکل 2). گروه کارکردی پروتئین با 65 ژن دارای بیان افتراقی، بیشترین تعداد ژن‏ها را به خود اختصاص داد و چهار گروه کارکردی تجزیه زنوبیوتیک­ها، متابولیسم نوکلئوتید، متابولیسم کربوهیدرات اصلی و متابولیسم هورمون[30] هم دارای یک ژن با بیان متفاوت بین دو کتابخانه کنترل و تنش شوری بودند.

نتیجه قابل توجهی دیگری که از داده­کاوی EST به­دست آمد، شناسایی ژن­های جدید مرتبط با پاسخ به تنش شوری می­باشد. در این پژوهش برای نخستین بار، چندین ژن جدید مانند MIKC-type MADS-box transcription factor WM20 (AM502886)، Triticum aestivum alternative splicing regulator (SRp30a) (DQ019639)، ژن رمزکننده پروتئین­ متصل شونده به RNA  whGRP-1[31] (U32310)، در پاسخ به شوری در گندم گزارش شدند. این ژن­ها می‌توانند دارای اثرات بالقوه برای القای تحمل به شوری و منابع با ارزشی برای سیستم­های جدید تحمل به شوری باشند. اهمیت فاکتورهای رونویسی MADS box در شبکه ژنی پاسخ به شوری در برنج نشان داده شده است (Cooper et al., 2003) و طی تحقیقی نشان داده شده است کهSR-rich splicing factorsها در تحمل به تنش شوری مؤثر هستند (Forment et al., 2002). همچنین طی پژوهشی مشخص شده است که فراوانی پروتئین­های متصل شونده به RNA splicing factorها در شرایط تنش افزایش می‌یابد (Agarwal and Grover, 2005). پروتئین­های متصل شونده به RNA در سطوح پردازش، انتقال، پلی­آدنیلاسیون و پایداری RNA بیان ژن را کنترل می­کنند (Higgins, 1991; Dreyfuss et al., 1993). ژنWhGRP-1، ژن رمز کننده پروتئین غنی از گلایسین متصل شونده به RNA در گندم می­باشد که علاوه بر یک موتیف متصل شونده به RNA (موتیف RNP)، یک دومین غنی از گلایسین نیز دارد (Guiltinan & Niu, 1996). گزارش شده است که تعدادی از اعضای خانواده پروتئینی غنی از گلایسین متصل شونده به RNA توسط تنش سرمایی القا می­شوند (Bergeron et al., 1993; Heintzen et al., 1994; Carpenter et al., 1994 ).

افزون بر این، بررسی پروفایل رونوشت­ها، افزایش و کاهش بیان ژن­های ریبوزومی[32] (BK001234.1، AY846832.1،AY846823.1 ، AY846822.1، AY846831.1، EU957356.1، AY846832.1، AJ001161.1، AY846819.1، EU960877.1،AY290723.1 ، X62725.1)، فاکتورهای شروع ترجمه[33] (DQ167203.2) و ادامه ترجمه[34] (M90077.1)، فاکتورهای رونویسی[35] (AY955493.2، AY781352.1، AB272226.1، EU096087، AJ890015.1، AM502886.1)، پروتئین­های متصل شونده به RNA  [36] (U32310.1) و تنظیم کننده اسپلایسینگ جایگزین[37] (DQ019639.1) را در پاسخ به شوری نشان داد و بیانگر آن است که به جز رونوشت­های مربوط به اسمولیت­ها و ترانسپورترهای یونی، رونوشت­های رمز کننده پروتئین­های تنظیمی مرتبط با ماشین رونویسی و ترجمه نیز نقش مهمی در پاسخ به تنش شوری دارند. این نتایج با یافته­های Sahi et al.  (2006) تطابق دارد. آن­ها نشان دادند که پروتئین­های مرتبط با ماشین رونویسی و ترجمه به­ ویژه فاکتورهای رونویسی، پروتئین­های متصل شونده به RNA، ژن­های ریبوزومی و فاکتورهای شروع و ادامه ترجمه در طول تنش شوری اهمیت دارند. بنابراین نیاز جدی برای بررسی کارکرد سلولی این ژن­ها که احتمالاً در تحمل به شوری نقش دارند، وجود دارد (Sahi et al., 2006).

شکل 2- توزیع ژن‏های با بیان افتراقی در گروه­های کارکردی.

Figure 2- Functional categorization of differentially expressed genes.

mitochondrial electron transport / ATP synthesis: انتقال الکترون در میتوکندری/ سنتز ATP، OPP: چرخه اکسیداتیو پنتوز فسفات، fermentation: تخمیر، glycolysis: گلیکولیز، not assigned: پروتئین­های ناشناخته و فرضی، transport: انتقال، development: نمو، cell: سازماندهی سلولی،  تقسیم و چرخه سلولی و انتقال وزیکول، signaling: علامت­دهی، protein: سنتز پروتئین، فعال­سازی اسید آمینه، تغییرات پروتئین و تجزیه پروتئین، DNA: سنتز، ساختار کروماتین و ترمیم DNA، RNA: پردازش، رونویسی و تنظیم رونویسی، misc: خانواده­های آنزیمی متفاوت، Biodegradation of Xenobiotics: تجزیه زنوبیوتیک، nucleotide metabolism: متابولیسم نوکلئوتید، redox: اکسایش- کاهش، stress: تنش، major CHO metabolism: متابولیسم کربوهیدرات­های بزرگ، hormone metabolism: متابولیسم هورمونی، secondary metabolism: متابولیسم ثانویه،  amino acid metabolism: متابولیسم اسید آمینه، lipid metabolism: متابولیسم چربی، PS: فتوسنتز.

به طور کلی مطالعات بیوانفورماتیک می­تواند منجر به شناسایی مسیرهای مرتبط با تنش شوری و فهم مکانیسم­های کنترل کننده تحمل به تنش شود و دید جامع­تری در ایجاد تحمل به شوری ایجاد کند. روش آنالیز EST، راهی سریع و منطقی برای یافتن گروه­های کارکردی فعال ژنوم طی شرایط تنش و شناسایی ژن­های نامزد جدید برای تحمل به تنش­ها می­باشد. از آن­جا که تا کنون گزارشی از نقش این ژن­ها در تحمل به شوری در گندم منتشر نشده است، ژن­های شناسایی شده در این پژوهش از قبیل whGRP-1 (U32310)، MIKC-type MADS-box transcription factor WM20 (AM502886)،  Triticum aestivum alternative splicing regulator (SRp30a) (DQ019639) می­توانند نامزدهای ارزشمندی جهت بررسی بیشتر برای سیستم­های جدید تحمل به شوری باشند. cDNAهای کامل ژن‏های نامزد قابل جداسازی هستند و می­توان با استفاده از تراریزش گیاهان مدل، کارکرد خاص این ژن­ها را در تحمل به شوری بررسی کرد و در نهایت از آن­ها به عنوان ژن­های هدف در مهندسی ژنتیک گیاهان زراعی با هدف بهبود تحمل به تنش شوری استفاده نمود.