Identification of retrotransposon-based (IRAP) loci associated with resistance to Sclerotinia stem rot disease (Sclerotinia spp.) in sunflower

Document Type : Research Paper

Authors

1 Department of Plant Breeding and Biotechnology, Urmia University, Urmia, Iran and National Elites Foundation, Tehran, Iran and Assistant Professor, Department of Medicinal Plants, Shahid Bakeri Higher Education Center, Urmia University, Miyandoab, Iran

2 Professor, Department of Plant Breeding and Biotechnology, Urmia University, Urmia, Iran and Institute of Biotechnology, Urmia University, Urmia, Iran

3 M.Sc. Graduate, Department of Plant Breeding and Biotechnology, Urmia University, Urmia, Iran

4 Asistant Professor, Department of Plant Protection, Urmia University, Urmia, Iran

Abstract

Sclerotinia disease is important fungal disease of sunflower inIranthat reduces its growth and yield. In this study, reactions of 100 oily sunflower lines to 6 fungal isolates of Sclerotinia were studied and then 128 retrotransposon-based molecular markers (IRAP) were used to identify genes controlling disease resistance. The results showed that there is high diversity in the studied germplasm for resistance to the Sclerotinia stem rot. Population structure analysis subdivided the studied lines into 3 subpopulations (K=3). Association analysis with general and mixed linear models (GLM and MLM) identified 14 and 11 loci, respectively that are significantly associated (P≤0.01) with Sclerotinia disease resistant genes. Markers LTR 1063-65, LTR 1064-65 and LTR 1062 were commonly associated with resistant to some fungal isolates. The common markers due to facilitating simultaneous selection for resistance to several fungal isolates can be well used in sunflower breeding programs like marker-assisted selection (MAS).

Keywords


شناسایی جایگاه­های رتروترنسپوزونی (IRAP) مرتبط با مقاومت به بیماری پوسیدگی اسکلروتینیایی ساقه (.Sclerotinia spp) در آفتابگردان

 

رقیه نجف­زاده1، رضا درویش­زاده*2، خدیجه موسی­خلیفانی3، مسعود ابرین­بنا4

 

1پسادکتری، گروه اصلاح و بیوتکنولوژی گیاهی، دانشگاه ارومیه، ارومیه و بنیاد ملی نخبگان، تهران و استادیار، گروه گیاهان دارویی، مرکز آموزش عالی شهید باکری، دانشگاه ارومیه، میاندوآب.

2استاد، گروه اصلاح و بیوتکنولوژی گیاهی، دانشگاه ارومیه، ارومیه و استاد، پژوهشکده زیست­فناوری دانشگاه ارومیه، ارومیه.

 3دانش­آموخته کارشناسی­ارشد، گروه اصلاح و بیوتکنولوژی گیاهی، دانشگاه ارومیه، ارومیه.

4استادیار، گروه گیاهپزشکی، دانشگاه ارومیه، ارومیه.

تاریخ دریافت: 13/06/1395، تاریخ پذیرش: 22/08/1395

چکیده

بیماری اسکلروتینیا از بیماری­های قارچی مهم آفتابگردان در ایران می­باشد که باعث کاهش رشد و عملکرد محصول می­شود. در پژوهش حاضر واکنش 100 لاین آفتابگردان روغنی به 6 جدایه قارچ اسکلروتینیا مورد بررسی قرار گرفت و سپس به منظور شناسایی مکان­های ژنی دخیل در مقاومت به بیماری از 128 جایگاه ژنومی تکثیر شده توسط آغازگرهای رتروترنسپوزونی IRAP استفاده شد. نتایج نشان داد که تنوع بالایی در ژر­م­پلاسم مورد مطالعه برای مقاومت به بیماری پوسیدگی اسکلروتینیایی ساقه وجود دارد. بررسی ساختار جمعیت، لاین­های مورد مطالعه را به 3 زیرجمعیت احتمالی (3=K) تقسیم نمود. در تجزیه ارتباط با دو مدل GLM و MLM به ترتیب 14 و 11 مکان ژنومی پیوسته با مقاومت به بیماری (P≤0.01) شناسایی شد. نشانگرهایLTR 1063-65 ،LTR 1064-65  وLTR 1062  با ژن­های کنترل کننده مقاومت به چندین جدایه­ قارچ عامل بیماری پیوسته بودند. نشانگرهای مشترک به دلیل تسهیل گزینش همزمان برای ایجاد مقاومت به چندین جدایه قارچی، می­توانند در برنامه­های به­نژادی آفتابگردان نظیر انتخاب به کمک نشانگر (MAS) بخوبی استفاده شوند.

واژه­های کلیدی: آفتابگردان، بیماری قارچی، نشانگر IRAP، تجزیه ارتباط.

 

مقدمه

 

آفتابگردان (Helianthus annuus L.) متعلق به تیره Compositae می­باشد که زراعت آن در سراسر جهان به دلیل زیبایی گل، مصرف آجیلی و تولید روغن انجام می­گیرد (Vollmann & Rajcan, 2010; Hatami Maleki et al., 2014). ارقام روغنی آفتابگردان به دلیل درصد روغن بالا برای استحصال روغن مورد استفاده قرار می­گیرند و چهارمین منبع تأمین روغن خوراکی در دنیا محسوب می­شوند (Anonymous, 2010). جنس Sclerotinia متعلق به خانواده Sclerotiniaceae (Gulya et al., 1997) می­باشد و سه گونه
S. sclerotiorum، S. minor و S. trifoliorum به علت انتشار گسترده، دامنه میزبانی وسیع و خسارت سنگین، مهم­ترین و شناخته شده­ترین گونه­های این جنس به شمار می­روند (Saharan & Mehta, 2008). دامنه میزبانی وسیع (Boland & Hall, 1994)، توان تولید اندام مقاوم و بقاء طولانی مدت قارچ در خاک (Bardin & Huang, 2001; Bolton et al., 2006) و نیز تنوع ژنتیکی جدایه­های مختلف عامل بیماری (Davar et al., 2011)، این قارچ را در زمره یکی از مهم­ترین بیمارگرهای گیاهی قرار داده است. این بیمارگر در تمامی مراحل رشد آفتابگردان باعث پوسیدگی ریشه، ساقه، یقه و طبق می­گردد و در شرایط آب و هوایی مساعد برای آن، خسارت زیادی
به محصول وارد می­کند (Amoozadeh et al., 2015; Emamgholi et al., 2015). قارچ Sclerotinia sclerotiorum (Lib) de Bary بیش از 400 گونه گیاهی در جهان را تحت تأثیر قرار می­دهد (Rojas, 2014; Sharma et al., 2015).

اسکلروتینیا از بیماری­های قارچی مهم آفتابگردان در ایران می­باشد که رشد و عملکرد محصول را کاهش می­دهد (Ershad, 1995). شیوع و توسعه این بیماری در منطقه شمال­غرب کشور باعث کاهش سطح زیرکشت این محصول شده است. وسعت خسارت در بعضی مواقع به حدی می­رسد که از مزارع تحت کشت، عملاً محصولی برداشت نمی­شود (Emamgholi et al., 2015). استفاده از ارقام مقاوم روش مؤثر برای کنترل بیماری اسکلروتینیا می­باشد (Emamgholi et al., 2015). تاکنون ارقامی با مقاومت کامل
به بیماری پوسیدگی اسکلروتینیایی در آفتابگردان گزارش نشده است. اما ژنوتیپ­های مختلف این محصول، سطوح متفاوتی از مقاومت در برابر این بیماری را نشان می­دهند (Hahn, 2002). از این رو، شناسایی ارقام مقاوم و مکان­های ژنی
کنترل ­کننده مقاومت به بیماری به به­نژادگران گیاهی در پیشبرد برنامه­های به­نژادی برای تولید ارقام هیبرید مقاوم به بیماری کمک شایانی
می­نماید.

مقاومت به بیماری اسکلروتینیا یک صفت کمّی پیچیده (Mestries et al., 1998) و چندژنی می­باشد (Castaño et al., 1993; Gentzbittel et al., 1998; Bert et al,. 2002, 2004; Fusari et al., 2012). به دلیل پیچیدگی صفات کمّی،
به­نژادگران گیاهی اطلاعات کمی از تعداد ژن­ها و جایگاه کروموزومی آن­ها در تظاهر و توزیع فنوتیپی یک صفت کمّی دارند. نقشه­یابی
مکان­های ژنی کمی ([1]QTL) یکی از روش­هایی است که در دهه اخیر برای مطالعه ژنتیکی صفات کمّی توسعه یافته است (Lander & Botstein, 1989). در این روش تفرّق همزمان صفت کمّی و نشانگرهای مولکولی بررسی شده و عوامل مؤثر در کنترل صفت روی ژنوم شناسایی می­شود (Mohan et al., 1997). بنابراین، می­توان از نتایج آن در گزینش به کمک نشانگر ([2]MAS) استفاده نمود (Collard et al., 2005).

برای مکان­یابی جایگاه­های کنترل کننده­ صفات کمّی از دو روش نقشه­یابی پیوستگی[3] و نقشه­یابی ارتباطی[4] (نقشه­یابی عدم تعادل پیوستگی[5]) استفاده می­شود (Breseghello & Sorrells, 2006). در مقایسه با نقشه­یابی پیوستگی، تجزیه ارتباطی دارای مزایای زیادی از جمله وضوح بالای QTL، استفاده از ژرم­پلاسم­های طبیعی و افزایش پوشش آللی می­باشد (Hall et al., 2010; Yu et al., 2006) و به طور همزمان اجازه نقشه­یابی چندین صفت را می­دهد. بنابراین،
در این روش نیاز به ایجاد جمعیت­های دو والدی که خود باعث هزینه اضافی ارزیابی ژنوتیپی و فنوتیپی می­شود، نیست. از این رو به طور گسترده برای گونه­های گیاهی که در آن­ها ایجاد
جمعیت­های در حال تقرق بزرگ غیرممکن است، استفاده می­شود (Dewan et al., 2006). همچنین در این روش کل ژنوم توسط تعداد زیادی نشانگر برای شناسایی QTL­های مرتبط با صفات فنوتیپی خاص مورد بررسی قرار می­گیرد (Rafalski, 2002 a,b; Zhu et al., 2008).
نکته حائز اهمیت این است که ساختار جمعیت، اندازه نمونه و فراوانی آللی خاص ممکن است توانایی این روش را در شناسایی نشانگرهای مرتبط با صفات تحت تأثیر قرار دهد و باعث ایجاد ارتباطات دروغین نشانگر- صفت[6] و نتایج مثبت دروغین شود (Zhang et al., 2012).
از این رو به منظور به حداقل رساندن ارتباطات دروغین، ابتدا ساختار جمعیت[7] و روابط خویشاوندی در جمعیت مورد استفاده ارزیابی می­شود و در تجزیه ارتباط لحاظ می­گردد (Yu & Buckler, 2006; Pritchard et al., 2000). در این تکنیک، ساختار جمعیت با روش بیزین[8] ارزیابی شده و اعضای جمعیت به زیرجمعیت­هایی تقسیم می­شود (Falush et al., 2003; Pritchard et al., 2000).

تاکنون چندین مطالعه برای شناسایی مکان­های ژنی مقاومت به بیماری در آفتابگردان توسط نشانگرهای مولکولی RFLP[9] (Bert et al., 2002; Mestries et al., 1998)، [10]AFLP (Bert et al., 2002; Davar et al., 2010; Rönicke et al., 2005 )، [11]SSR (Amoozadeh et al., 2015; Darvishzadeh, 2012; Davar et al., 2010; Micic et al., 2004; Micic et al., 2005a,b; Rönicke et al., 2005; Yue et al., 2008) و [12]SNP (Amoozadeh et al., 2015; Fusari et al., 2012; Talukder et al., 2014) انجام گرفته است.

اخیراً نشانگرهای مولکولی مبتنی بر رتروترنسپوزون­ها توسعه پیدا کرده­اند که
ویژگی­هایی از قبیل ثبات، پراکندگی، ساختار حفاظت شده، موتیف­های پشت سر هم و تعداد نسخه بالا، آن­ها را به عنوان سیستم­های نشانگری مناسب و کارا، بخصوص برای بررسی تنوع ژنتیکی و تکاملی درون و بین گونه­ای معرفی کرده است (Basirnia et al., 2014, 2016). تاکنون پژوهشی در رابطه با شناسایی مکان­های ژنی مرتبط با بیماری اسکلروتینیا در آفتابگردان با استفاده از نشانگرهای رتروترنسپوزون انجام نگرفته است.

در پژوهش حاضر با استفاده از داده­های ژنتیکی حاصل از نشانگرهای رتروترنسپوزونی[13]IRAP  و داده­های فنوتیپی حاصل از واکنش ژنوتیپ­های مختلف آفتابگردان به جدایه­های مختلف قارچ اسکلروتینیا، مکان­های ژنی مرتبط با مقاومت به بیماری اسکلروتینیا شناسایی می­شوند.

 


مواد و روش­ها

تعداد 100 لاین خالص آفتابگردان روغنی از نقاط مختلف جهان (ایران، فرانسه، امریکا، مجارستان و صربستان) در گلدان­های مستطیلی شکل 60×20 سانتی­متری در محیط پیت ماس در قالب طرح کاملاً تصادفی با 3 تکرار و هر تکرار شامل 6 گیاهچه کشت شدند. گیاهان تا مرحله 8 برگی در شرایط دمایی 1±25 درجه سانتی­گراد، رطوبت %75 و فتوپریود 12 ساعت روشنایی پرورش یافتند.

مشخصات لاین­های مورد مطالعه در جدول 1 آمده است. واکنش حساسیت لاین­ها در مقابل شش جدایه قارچ عامل بیماری اسکلروتینیا مطالعه شد.

جدایه­های مورد مطالعه از مناطق آلوده استان آذربایجان­غربی که کشت آفتابگردان در آنجا مرسوم است، جمع­آوری شدند. شش جدایه­ قارچی مورد مطالعه از نتایج بررسی قدرت بیماری­زایی 30 جدایه اسکلروتینیا (15 جدایهS. minor  و 15 جدایهS. sclerotiorum) روی رقم "فرخ" انتخاب شدند.

 

جدول 1- اسامی لاین­های آفتابگردان روغنی مورد مطالعه و منشاء آن­ها.

Table 1- Names of the studied oily sunflower lines and their origin.

لاین

Line

کشور Country

مرکز تحقیقاتی

Research center

درصد عضویت در زیرجمعیت

Q value

Q1

Q2

Q3

LC1064C

France

ASGROW

0.01

0.02

0.96

DM2

USA

USDA

0.00

0.00

0.99

H156A/RHA274

France

ASGROW

0.01

0.01

0.97

NS-R5

France

NOVARTIS

0.94

0.01

0.04

8A*/LC1064C

France

ASGROW

0.51

0.01

0.47

HAR4

USA

USDA

0.92

0.02

0.05

SDB1

USA

USDA

0.87

0.01

0.11

AS5305

France

ASGROW

0.91

0.07

0.00

RHA274

USA

USDA

0.11

0.06

0.82

SDR18

USA

USDA

0.01

0.02

0.96

RT931

France

RUSTICA

0.98

0.00

0.01

NS-B5

France

NOVARTIS

0.60

0.28

0.10

SDB3

USA

USDA

0.93

0.00

0.06

803-1

Serbia

IFVC

0.03

0.00

0.95

F1250/03

Hungary

-

0.99

0.00

0.00

HA335B

USA

USDA

0.99

0.00

0.00

TMB 51

France

INRAMONT

0.96

0.00

0.03

LP-CSYB

France

ENSAT

0.00

0.47

0.51

PM1-3

USA

USDA

0.03

0.01

0.96

SDR19

USA

USDA

0.85

0.01

0.14

RHA265

France

ASGROW

0.96

0.02

0.02

QHP1

-

-

0.19

0.04

0.76

RT948

France

RUSTICA

0.97

0.01

0.02

ENSAT-283

France

ENSAT

0.97

0.01

0.02

HA337B

USA

USDA

0.99

0.01

0.00

B454/03

Hungary

-

0.87

0.04

0.09

H100B

France

ASGROW

0.97

0.01

0.01

HA304

USA

USDA

0.98

0.01

0.01

AS5304

France

ASGROW

0.13

0.15

0.71

RHA858

USA

USDA

0.01

0.43

0.56

AS5306

France

-

0.06

0.03

0.90

AS3211

France

ENSAT

0.87

0.01

0.11

ENSAT-254

France

ENSAT

0.14

0.03

0.82

ENSAT-270

France

ENSAT

0.03

0.00

0.96

1009329 2(100K)

France

ENSAT

0.97

0.00

0.02

1009337 (100K)

France

ENSAT

0.98

0.01

0.00

100935 0(100K)

France

ENSAT

0.97

0.02

0.01

5DES20QR

France

BRN

0.95

0.03

0.01

7CR13=PRH6

France

C.F

0.98

0.01

0.01

SSD580

France

ASGROW

0.41

0.56

0.03

SSD581

France

ASGROW

0.01

0.95

0.04

ENSAT-699

France

ENSAT

0.03

0.92

0.04

9CSA3

France

Caussade semences

0.50

0.09

0.40

H049+FSB

France

-

0.55

0.08

0.35

5AS-F1/A2×R2

France

ASGROW

0.88

0.09

0.02

8ASB2

France

ASGROW

0.87

0.10

0.03

12ASB3

France

ASGROW

0.95

0.03

0.01

AS3232

France

ENSAT

0.08

0.83

0.08

15038

Hungary

-

0.01

0.93

0.06

15031

France

ASGROW

0.82

0.17

0.00

H158A×LC1064C

France

ASGROW

0.70

0.04

0.24

H543R/H543R

France

ASGROW

0.00

0.48

0.51

H156/H543R

France

ASGROW

0.75

0.11

0.13

H543R

France

-

0.49

0.28

0.22

H100A/RHA274

France

ASGROW

0.10

0.88

0.01

H205A/83HR4

France

ASGROW

0.71

0.25

0.02

H156A/H543R

France

ASGROW

0.00

0.92

0.07

H209A/83HR4

France

ASGROW

0.08

0.91

0.00

H157A/LC1064

France

ASGROW

0.54

0.15

0.30

H100A/LC1064

France

ASGROW

0.01

0.97

0.01

H100A/90R78

France

ASGROW

0.22

0.02

0.74

AF1POPA

France

NOVARTIS

0.94

0.02

0.03

OES

France

INRAMONT

0.99

0.00

0.00

RHA266

USA

USDA

0.98

0.01

0.00

PAC2

France

ENSAT

0.36

0.57

0.06

AS613

France

ASGROW

0.98

0.01

0.00

11×12

Iran

SPII

0.80

0.17

0.02

H603R

France

INRAMONT

0.63

0.34

0.01

NSF1 A4×R5

France

NOVARTIS

0.52

0.45

0.01

4

Iran

SPII

0.03

0.95

0.00

110

Iran

SPII

0.01

0.39

0.59

28

Iran

SPII

0.73

0.23

0.03

703-CHLORINA

France

ENSAT

0.96

0.00

0.03

30

Iran

SPII

0.96

0.02

0.02

36

Iran

SPII

0.88

0.10

0.01

NSF1 A5×R5

France

NOVARTIS

0.02

0.84

0.13

1059

Iran

SPII

0.13

0.36

0.49

38

Iran

SPII

0.92

0.05

0.02

346

Iran

SPII

0.02

0.96

0.02

CAY

France

ENSAT

0.94

0.05

0.01

A CONTROL PLASTIPIC

France

ENSAT

0.02

0.97

0.00

SDB2

France

INRAMONT

0.79

0.20

0.01

1009370 1(100K)

France

ENSAT

0.89

0.06

0.03

1009370 3(100K)

France

ENSAT

0.97

0.02

0.01

H158A/H543R

France

ASGROW

0.12

0.86

0.02

H100A

France

ASGROW

0.02

0.95

0.02

CSWW2X

France

Caussade semences

0.12

0.83

0.03

H209A/H566R

France

ASGROW

0.08

0.89

0.01

BF1POPB

France

NOVARTIS

0.01

0.98

0.00

AS0-1-POP-A

France

ENSAT

0.02

0.97

0.01

AS6305

France

ENSAT

0.12

0.87

0.00

H205A/H543R

France

ASGROW

0.018

0.972

0.011

H209A/LC1064

France

ASGROW

0.95

0.03

0.01

H100A/83HR4

France

ASGROW

0.22

0.76

0.01

D34

France

INRAMONT

-

-

-

sf 076

-

-

-

-

-

sf 022

-

-

-

-

-

sf-109

-

-

-

-

-

sf-105

-

-

-

-

-

sf-023

-

-

-

-

-

 

 

 

 

 

سه جدایه A1،M1  و G2 مربوط به گونهS. minor  و سه جدایه J2، J1 و A37 مربوط به گونه S. sclerotiorum بودند. به منظور تهیه مایه[14] قارچ، جدایه­ها در محیط آگار دکستروز
سیب­زمینی ([15]PDA, 39 gL-1, pH=6) کشت شده و به مدت 5 روز در انکوباتور با دمای 1±25 درجه سانتی­گراد در تاریکی قرار گرفتند. سپس دیسک­های میسیلیومی با قطر سه میلی­متر از حواشی کلنی در حال رشد (با عمر سه روز) بریده شد و در مرحله 8 برگی (مطابق با الگوی طبیعی آلودگی در مزرعه) در ناحیه یقه ساقه گیاهچه­ها قرار گرفتند. جهت حفظ رطوبت، بر اساس روش Price and Colhoun (1975) اطراف ساقه و دیسک میسیلیومی با پارافیلم بسته شد. سه روز پس از مایه­زنی با هر یک از جدایه­های قارچ، درصد قسمت نکروزه در 1 سانتی­متری پایه­ ساقه به صورت مشاهده­ای یادداشت­برداری شد. بازه زمانی 3 روز، بر اساس مطالعات قبلی (Davar et al., 2010; Amoozadeh et al., 2015) و همچنین بررسی درصد آلودگی رقم شاهد "فرخ" انتخاب شد. برای ارزیابی ساختار ژنتیکی لاین­های مورد مطالعه و تجزیه ارتباط،
از 128 جایگاه ژنومی تکثیر شده توسط آغازگرهای رتروترنسپوزونی IRAP (Basirnia et al., 2016) استفاده شد. توالی نشانگرهای مورد استفاده در جدول 2 آمده است.

 

آماره­های توصیفی برای داده­های حاصل از ارزیابی واکنش لاین­ها به هر یک از جدایه­های قارچی در نرم­افزار GenStat 12 محاسبه شد.
به منظور مکان­یابی ارتباطی، ابتدا تجزیه مؤثر ساختار جمعیت و دسته­بندی دقیق لاین­ها به زیرجمعیت­های مناسب با روشBayesian  
در نرم­افزار Structure 2.3.3  انجام گرفت ((Pritchard et al., 2000. مقادیر اولیهK (زیرجمعیت­های فرضی اولیه) بین 1 تا 10
در نظر گرفته شد و جهت افزایش دقت برای
هر کدام از زیرجمعیت­ها 5 تکرار منظور گردید. شبیه­سازی یا طول دوره Burn in 100000 و تعداد تکرار MCMC[16] 100000 در نظر گرفته شد تا نمودار حداکثر درست­نمایی حاصل شود. لازم به ذکر است که نرم­افزار Structure برای هر مقدار K (تعداد واقعی زیرجمعیت­ها) یک ماتریس به نام Qst را محاسبه می­کند که این ماتریس شامل برآورد ضرایب احتمال عضویت هر لاین در هر یک از زیرجمعیت­ها است. پس از شبیه­سازی برای تعیین تعداد بهینه K یا همان تعداد زیرجمعیت­ها، از روش اوانو و همکاران (Evanno et al., 2005) استفاده شد. شناسایی نشانگرهای مرتبط و دارای ارتباط معنی­دار
با صفت مورد ارزیابی با مدل خطی عمومی ([17]GLM) وابسته به ماتریس  Q(ماتریس ضرایب ساختار جمعیت) و مدل خطی مخلوط ([18]MLM) وابسته به ماتریس K+Q (ماتریس ضرایب ساختار جمعیت + ماتریس روابط خویشاوندی جهت جلوگیری از ارتباط کاذب بین نشانگر- صفت)
با نرم­افزار TASSEL 2.1  انجام گرفت. 

 

نتایج و بحث

مقادیر حداقل، حداکثر، میانگین و انحراف معیار ارزش فنوتیپی درصد آلودگی لاین­های آفتابگردان به جدایه­های قارچ اسکلروتینیا
در جدول 3 نشان داده شده است. طبق این نتایج، حداقل درصد آلودگی لاین­ها در پاسخ
به جدایه­های قارچی مورد استفاده 67/30 و حداکثر آلودگی 100 درصد بود. کمترین و بیشترین میانگین درصد آلودگی به ترتیب در پاسخ به جدایه قارچی A37 و J1 از گونه
S. sclerotiorum مشاهده شد. هیچ ­کدام از لاین­ها به جدایه­های قارچیJ1 ، G2 و A1 مقاومتی نشان ندادند. این در حالی است که لاین­های بیشتری به جدایه قارچی A37 از گونه
S. Sclerotiorum مقاومت نشان دادند. لاین­های H543R/H543R، 1059 و 8A*/LC1064C حداقل به دو جدایه قارچی مقاوم بودند.
طبق نتایج حاصل از این پژوهش، ژر­م­پلاسم آفتابگردان روغنی مورد مطالعه از نظر درصد آلودگی به جدایه­های قارچی مورد استفاده تنوع بالایی نشان داد. لاین­هایی با درصد آلودگی پایین همچون لاین 8A*/LC1064C که کمترین درصد آلودگی را در پاسخ به دو جدایه قارچی A37 و M1از دو گونه مختلف قارچ اسکلروتینیا نشان داد، می­توانند در برنامه­های به­نژادی این محصول جهت تولید ارقام مقاوم مورد استفاده قرار گیرند.

در پژوهش حاضر برای ارزیابی ساختار ژنتیکی جمعیت مورد مطالعه، از 128 جایگاه ژنومی تکثیر شده توسط آغازگرهای رتروترنسپوزونی IRAP (Basirnia et al., 2016) استفاده شد. ساختار ژنتیکی جمعیت و دسته­بندی دقیق افراد به زیرجمعیت­های مناسب به روش بیزین و با استفاده از نرم­افزارStructure  انجام گرفت. این روش هر یک از ژنوتیپ­ها را با یک احتمال و طوری به زیرجمعیت­های فرضی منتسب می­کند که در هر زیرجمعیت میزان عدم تعادل پیوستگی حداقل و تعادل مرحله گامتی حداکثر باشد (Pritchard et al., 2000).
بدین منظور ابتدا تعداد K یا زیرجمعیت احتمالی محاسبه و نمودار دو بعدی آن رسم گردید. تعداد زیرجمعیتی که در آن حداکثر درست­نمایی مشاهده شود، به عنوان تعداد مطلوب زیرجمعیت انتخاب می­شود. شکل 1 نمودار دو طرفه تعیین بهینه K را نشان می­دهد. با توجه به این نمودار بهترین K در جمعیت مورد مطالعه اوج منحنی است (K=3) که به عنوان K بهینه در تخمین ساختار جمعیت و محاسبه ماتریس عضویت افراد در هر کلاستر (ماتریس Q) در نظر گرفته شد.

 


جدول 2- اسامی و ساختار توالی آغازگرهای رتروترنسپوزونی مورد استفاده در پژوهش.

Table 2. Names and sequence structure of retrotransposon primers used in the study.

اندازه باند (جفت­­باز)

Band length (bp)

دمای اتصال
(درجه سانتی­گراد)

Annealing temperature (0C)

توالی (5'→3')

Sequence (5'→3')

آغازگرهای IRAP

IRAP primers

-

-

AGAGGGGAATGTGGGGGTTTCC

LTR 1061

750-2500

57

TCTCTATTTATAGCCGGAGAGGTG

LTR 1062

-

-

GATCCGGTTTCACGGGACTTAC

LTR 1063

-

-

CGAAGAACAAACCGAATCACC

LTR 1064

500-3000

56

AGCCTCTGAAAGACTCGTTCG

LTR 1065

500-3000

60

GGTTTAGGTTCGTAATCCTCCGCG

CF

250-1500

58

ACAGACACCAGTGGCACCAAC

CR

300-2500

58

TAACGGTGTTCTGTTTTGCAGG

UF(U81)

1000-3000

56

AGAGGGGAATGTGGGGGTTTCC

UR1(U82)

 

جدول 3- آماره­های توصیفی درصد آلودگی در ژرم­پلاسم آفتابگردان روغنی مورد مطالعه در پاسخ
به جدایه­های قارچ اسکلروتینیا.

Table 3- Descriptive statistics of fungal infection percentage of the studied oily sunflower germplasm in responses to Sclerotinia fungal isolates.

جدایه قارچی

Fungal isolate

گونه

Species  

حداقل
درصد نکروز

Min of necrosis%

حداکثر
درصد نکروز

Max of necrosis%

میانگین
درصد نکروز

Mean of necrosis%

انحراف معیار

STDEV

J1

S. sclerotiorum

90

100

96.83

2.06

M1

S. minor

58.33

100

90.79

8.81

G2

S. minor

64

100

94.23

6.71

J2

S. sclerotiorum

30.67

100

90.25

10.83

A1

S. minor

69.33

100

88.51

8.27

A37

S. sclerotiorum

39.33

100

82.67

14.71

                                                 لاین­های مقاوم Resistant lines         جدایه قارچی Fungal isolate 

J1

-

M1

8A*/LC1064C, ENSAT-699, 1009370 1(100K), H209A/LC1064

G2

-

J2

H543R/H543R, 110, 1059, NSF1 A4×R5

A1

-

A37

8A*/LC1064C, HAR4, RHA274, RT931, F125/03, H049+FSB, ASB28, H543R/H543R, H100A/RHA274, H100A/LC1064, AF1POPA, OES, 1059, H100A/83HR4

STDEV: Standard deviation

 


 

شکل 1- برآورد تعداد زیرجمعیت در ژرم­پلاسم آفتابگردان روغنی مورد مطالعه (3=K) بر اساس نشانگرهای IRAP در نرم­افزار Structure.

Figure 1- Estimation of subpopulation number (K=3) in the studied oily sunflower germplasm according to IRAP markers using Structure software.

 

 

 

بر اساس نتایج ارائه شده در بارپلات از کل ژنوتیپ­های مورد مطالعه با احتمال بیشتر از 70 درصد عضویت لاین­ها، 44 درصد ژنوتیپ­ها
به ساختار اول (قرمز)، 18 درصد به ساختار دوم (سبز) و 12 درصد به ساختار سوم (آبی) و 26 درصد افراد به ساختار مختلط تعلق داشتند
(شکل 2). به طور کلی 74 درصد افراد مورد مطالعه دارای درصد عضویت بیشتر و مساوی 7/0 و 26 درصد افراد دارای سهم عضویت کمتر از 7/0 می­باشند. درصد عضویت لاین­های مورد مطالعه در زیرجمعیت­های شناسایی شده (ماتریس Q) در جدول 1 آمده است.



 

 

شکل 2- بارپلات تجزیه ساختار ژرم­پلاسم آفتابگردان روغنی مورد مطالعه بر اساس 128 مکان ژنی حاصل از نشانگرهای IRAP با استفاده از مدل Bayesian. هر رنگ یک زیرجمعیت یا کلاستر را نشان
می­دهد. اعداد
محور افقی و عمودی به ترتیب بیانگر شماره و ضریب تعلق هر فرد به هر کلاستر می­باشد.

Figure 2- Bar plot of structure analysis of the studied oily sunflower germplasm according to 128 loci of IRAP using Bayesian model. Each color shows one subpopulation or cluster. The numbers on horizontal and vertical axes correspond to the number and the membership coefficient of each individual, respectively.

 

 

ساختار یک جمعیت، در نتیجه انتخاب و در سطوح بالاتر حاصل اختلاط در آن جمعیت
می­باشد و منجر به افزایش عدم تعادل لینکاژی بین نشانگرهای غیرپیوسته می­شود (Cardon & Palmer, 2003; Rostok et al., 2006). آگاهی از ساختار جمعیت به عنوان یک پیش­نیاز
در نقشه­یابی ارتباطی می­تواند برای جلوگیری از ارتباطات مثبت دروغین بین نشانگرها و صفات استفاده می­شود (Pritchard & Donnelly, 2001). در مطالعات تجزیه ارتباط، در حالت ایده­آل نباید ساختاری در جمعیت مورد مطالعه وجود داشته باشد. یعنی جمعیت نباید خود
به لحاظ ساختاری به زیرجمعیت­ها تقسیم شود. زیرا وجود ساختار در جمعیت مورد مطالعه
می­تواند عامل بازدارنده­ای در جهت دستیابی
به نتایج قابل اعتماد باشد. در صورتی­ که اثر عوامل ساختار جمعیت و روابط خویشاوندی در تجزیه ارتباط در نظر گرفته نشود، نتایج مثبت کاذب به وجود خواهد آمد (Breseghello & Sorrells, 2006). تجزیه ساختار جمعیت با
نرم­افزار Structure امکان شکستن کل جمعیت به زیرجمعیت­هایی با ساختارهای متفاوت را فراهم می­سازد و چنانچه لاین­ها به صورت اختلاط یافته باشند، پس از انجام این تجزیه قابل تشخیص خواهند بود (Dadras, 2012).

به منظور شناسایی نشانگرهای پیوسته با مقاومت به جدایه­های قارچ اسکلروتینیا،
تجزیه ارتباطی بر اساس مدل خطی عمومی (GLM) و مدل خطی مخلوط (MLM) انجام گرفت (جدول 4). بر اساس مدل ارتباطیGLM ، 14 نشانگر (مکان ژنی) ارتباط معنی­داری (P≤0.01) با مقاومت به جدایه­های قارچ اسکلروتینیا داشتند.

تعداد 2 نشانگر پیوسته با
ژن­های کنترل کننده مقاومت جزئی به جدایهJ1 ، 2 نشانگر پیوسته با ژن­های کنترل کننده مقاومت جزئی به جدایه M1، 4 نشانگر پیوسته با ژن­های کنترل کننده مقاومت جزئی به جدایه G2،
2 نشانگر پیوسته با ژن­های کنترل کننده مقاومت جزئی به جدایه J2، 3 نشانگر پیوسته با ژن­های کنترل کننده مقاومت جزئی به جدایه  A1و
1 نشانگر پیوسته با ژن­های کنترل کننده مقاومت جزئی به جدایه A37 شناسایی شدند.

نشانگرهای مولکولی شناسایی شده 4/0 تا 10 درصد از واریانس فنوتیپی صفت را توجیه می­نمایند. در مکان­یابی ارتباطی با استفاده از مدلMLM ، 11 نشانگر ارتباط معنی­داری (P≤0.01) با مقاومت به جدایه­های قارچ اسکلروتینیا نشان دادند.

تعداد 1 نشانگر پیوسته با ژن­های کنترل کننده مقاومت جزئی به جدایهJ1 ، 2 نشانگر پیوسته با ژن­های کنترل کننده مقاومت جزئی به جدایهM1 ، 3 نشانگر پیوسته با ژن­های کنترل کننده مقاومت جزئی به جدایهG2 ، 2 نشانگر پیوسته با ژن­های کنترل کننده مقاومت جزئی به جدایه J2، 2 نشانگر پیوسته با ژن­های کنترل کننده مقاومت جزئی به جدایه  A1 و 1 نشانگر پیوسته با ژن­های کنترل کننده مقاومت جزئی به جدایه A37 شناسایی شدند. طبق این نتایج، تمامی نشانگرهای موجود در جدول 4 به جزء نشانگرهایLTR 1063-65 5  و UF 1 در هر دو مدل ارتباطی GLM و MLM ارتباط معنی­داری با مقاومت به جدایه­­های قارچ اسکلروتینیا نشان دادند.

 

 


 

جدول 4- نشانگرهای IRAP پیوسته با مقاومت به بیماری پوسیدگی اسکلروتینیایی ساقه در ژرم­پلاسم آفتابگردان روغنی مورد مطالعه بر اساس مدل خطی عمومی (GLM) و مدل خطی مخلوط (MLM).

Table 4- IRAP markers associated with resistance to Sclerotinia stem rot disease in
the studied oily sunflower germplasm according to general linear model (GLM) and mixed linear model (MLM).

مدل خطی مخلوط  

Mixed linear model (MLM)

مدل خطی عمومی

General linear model (GLM)

نشانگر

Marker

صفت

Trait

P-value

F

P-value

0.0095

7.0735

0.04

0.006

LTR 1063-65 2

جدایه  J1

J1 isolate

-

-

0.07

0.0073

LTR 1063-65 5

0.0011

11.4684

0.003

0.0011

CF-CR 10

جدایه  M1

M1 isolate

0.0024

10.0328

0.01

0.0024

LTR 1062 6

-

-

0.004

0.0011

LTR 1063-65 5

 جدایه G2

G2 isolate

0.0016

10.6745

0.005

0.0016

LTR 1061-65 7

0.0053

8.1602

0.05

0.0053

CR-UR1 5

0.008

7.5125

0.09

0.0082

LTR 1062 5

0.0041

8.7418

0.02

0.0042

LTR 1063-65 4

 جدایه J2

J2 isolate

0.006

7.9608

0.07

0.006

LTR 1064-65 4

0.0051

8.2473

0.01

0.0028

CR 3

جدایه  A1

A1 isolate

-

-

0.03

0.0049

UF 1

0.0095

7.0362

0.07

0.0066

CR 9

0.0088

7.1946

0.10

0.0087

LTR 1064-65 10

جدایه  A37

A37 isolate

 

 

 

به طور کلی برای مکان­یابی ارتباطی دو روش­ GLM و MLM پیشنهاد شده­ است. امروزه روش آماری MLM به طور گسترده­ای برای تجزیه ارتباط در گیاهان استفاده می­شود (Ghavami et al., 2011).

در مطالعه­ایSaeed et al.  (2014) در مکان­یابی ارتباطی تحمل به شوری در ژرم­پلاسم پنبه گزارش کردند که استفاده از مدل MLM باعث کاهش ارتباطات کاذب نشانگر- صفت می­شود.

همچنینYu and Buckler  (2006) در شناسایی نشانگرهای پیوسته با تغییرات فنوتیپی در صفات آگروموفولوژیک ذرت از مدل MLM به منظور بهبود نتایج و کاهش نتایج مثبت دروغین استفاده نمودند و بر اساس اظهار محققین نتایج دقیق­تری در مقایسه با مدل­ GLM بدست آمد. به نظر می­رسد مدل MLM برای مکان­یابی ارتباطی مدل قابل اطمینانی ­باشد.

طبق نتایج حاصل از پژوهش حاضر، نشانگرهایLTR 1063-65 ،LTR 1064-65  وLTR 1062  با ژن­های کنترل کننده مقاومت
به چندین جدایه­ قارچی عامل بیماری اسکلروتینیا پیوسته بودند. وجود نشانگرهای مشترک می­تواند ناشی از اثرات پلیوتروپی و یا پیوستگی نواحی ژنومی دخیل در کنترل مقاومت باشد (Jun et al., 2008). شناسایی نشانگرهای مشترک اهمیت زیادی در به­نژادی گیاهان دارد، زیرا گزینش همزمان چند صفت را امکان­پذیر می­سازد (Tuberosa et al., 2002; Hittalmamni et al., 2003).

تاکنون چندین مطالعه برای شناسایی مکان­های ژنی مقاومت به بیماری در آفتابگردان توسط نشانگرهای مولکولی مختلف انجام شده است.Mestries et al.    (1998) سه جایگاه ژنی مقاومت به پوسیدگی طبق را در آفتابگردان با استفاده از نشانگرهای RFLP شناسایی کردند که 3/12 تا 5/17 درصد از واریانس فنوتیپی صفت را توجیه می­نمودند. در پژوهشیBert et al.   (2002) سه جایگاه ژنی روی گروه­های پیوستگی 6، 8 و 13 برای مقاومت به گسترش میسلیومی قارچ اسکلروتینیا روی برگ آفتابگردان با استفاده از نشانگرهای RFLP شناسایی کردند که 56 درصد از واریانس فنوتیپی صفت را توجیه می­نمودند. این جایگاه­های ژنی با گروه­های پیوستگی 13، 9 و 1 در نقشه ژنتیکی Tang et al.  (2002) مطابقت دارند.

همچنینMicic et al.   (2004) با استفاده از نشانگرهای SSR هفت جایگاه ژنی برای مقاومت جزئی به پوسیدگی ساقه روی گروه­های پیوستگی 2، 3، 4، 6، 8، 15 و 16 از نقشه مرجع Tang et al.  (2002) شناسایی کردند. این جایگاه­های ژنی 3/3 تا 7/36 درصد از تنوع فنوتیپی صفت را توجیه می­نمودند.

در پژوهشی  Rönicke et al. (2005) با استفاده از نشانگرهای SSR پنج جایگاه ژنی برای مقاومت به پوسیدگی طبق مکان­یابی کردند که 6/10 تا 1/17درصد از واریانس فنوتیپی صفت را توجیه می­نمودند. همچنینMicic et al.   (2005 a,b) با استفاده از نشانگرهای SSR دو جایگاه ژنی روی گروه­های پیوستگی 8 و 16 و سه QTL برای مقاومت جزئی به پوسیدگی ساقه روی گروه­های پیوستگی 4، 10 و 17 شناسایی کردند. در پژوهشی دیگر Yue et al.  (2008) با استفاده از نشانگرهای SSR هفتQTL  برای مقاومت جزئی به بیماری اسکلروتینیای آفتابگردان شناسایی کردند که 4/8 تا 5/34 درصد از تغییرات داده های مربوط به شدت بیماری را توجیه می­نمودند.

همچنین Davar et al.  (2010) با استفاده از نشانگرهای SSR هفت QTL برای مقاومت جزئی به پوسیدگی اسکلروتینیایی ساقه روی گروه­های پیوسته 1، 2، 4، 6، 8، 14 و 17 شناسایی کردند. در پژوهشی دیگر Fusari et al.  (2012) در بررسی ارتباط بین داده­های حاصل از واکنش لاین­های خالص آفتابگردان در برابر قارچ اسکلروتینیا و پروفیل مولکولی افراد بر اساس نشانگرهای SNP و ژن­های کاندید با مدلMLM  ژن کاندیدی (HaRIC-B) شناسایی کردند که 20 درصد از تغییرات داده­های فنوتیپی را توجیه
می­نمود.

همچنین Talukder et al.  (2014) در بررسی ارتباط بین داده­های حاصل از ارزیابی واکنش لاین­های آفتابگردان در مقابل قارچ عامل بیماری اسکلروتینیا و پروفیل مولکولی افراد با نشانگرهای SNP و ژن­های کاندید حاصل از آرابیدوپسیس، با دو مدلMLM  و GLM 27 نشانگر SNP با ارتباط معنی­دار با مقاومت
به بیماری شناسایی کردند.

در پژوهش آن­ها ژن­های HaCOI1-1 و HaCOI1-2 که 4/7 درصد تغییرات فنوتیپی را توجیه می­نمودند، برای اصلاح مقاومت به پوسیدگی اسکلروتینیایی انتخاب شدند. در پژوهشی تجزیه ارتباطی صفات فنوتیپی لاین­های آفتابگردان مورد استفاده در این تحقیق نیز انجام شده است.

در پژوهشی Sahranavard Azartamar et al. (2015) در تجزیه ارتباط برای 12 صفت اگرومورفولوژیک در لاین­های آفتابگردان روغنی مورد استفاده در این تحقیق بر اساس نشانگرهای SSR و مدل­هایGLM  و MLM به ترتیب 9 و 16 مکان شناسایی نمودند که تغییرات قابل توجهی از صفات فنوتیپی را توجیه می­نمودند.

در پژوهشی Jannatdoust et al. (2015) به منظور نقشه­یابی 9 صفت مورفولوژیک مهم مرتبط با دانه در 48 توده مختلف آفتابگردان آجیلی تحت شرایط نرمال، تنش ملایم و شدید خشکی از 12 آغازگر مبتنی بر رتروترنسپوزون استفاده نمودند.

طبق نتایج آن­ها با مدل GLM
به ترتیب 2، 5 و 12 مکان و با مدل MLM 2، 5 و 11 مکان ژنی مرتبط با صفات مورد ارزیابی شناسایی شد.

تکنیک نقشه­یابی ارتباطی در سایر گیاهان زراعی مانند گندم (Liu, 2011)، جو (Wang et al., 2012) و ذرت (Anderson et al., 2007) نیز استفاده شده است.

 

نتیجه­گیری

نتایج نشان داد تنوع بالایی در ژر­م­پلاسم آفتابگردان مورد مطالعه در پاسخ به بیماری اسکلروتینیا وجود دارد. طبق این نتایج، لاین­های H543R/H543R، 1059 و 8A*/LC1064C
به دو جدایه قارچ عامل بیماری اسکلروتینیا مقاوم بودند.

لاین 8A*/LC1064C به دلیل اینکه کمترین درصد آلودگی را در پاسخ به دو جدایه قارچ دو گونه مختلف اسکلروتینیا نشان داد،
از پتانسیل بالایی برای استفاده در پروژه­های
به­نژادی برخوردار است.

بررسی ساختار جمعیت با 128 مکان رتروترنسپوزونی IRAP، لاین­ها را به 3 زیرجمعیت احتمالی (3=K) تقسیم نمود.
در تجزیه ارتباطی با استفاده از مدل MLM و GLM به ترتیب 11 و 14 نشانگر با ارتباط
معنی­دار با مناطق ژنومی درگیر در مقاومت جزئی به جدایه­های اسکلروتینیا شناسایی شدند.

نتایج حاصل، کارایی استفاده از روش تجزیه ارتباطی را در شناسایی نشانگرهای مرتبط با مقاومت به بیماری در لاین­های آفتابگردان نشان می­دهد.

طبق نتایج حاصل از این پژوهش، نشانگرهایLTR 1063-65 ،LTR 1064-65  وLTR 1062  با ژن­های کنترل کننده مقاومت
به چندین جدایه­ قارچی عامل بیماری اسکلروتینیا پیوسته بودند. شناسایی نشانگرهای مشترک به دلیل اینکه گزینش همزمان مقاومت به چند جدایه قارچی را امکان­پذیر می­سازد، در پیشبرد
برنامه­های به­نژادی این محصول اهمیت دارد.


مناطق ژنومی پیوسته با عوامل کنترل کننده مقاومت به بیماری پس از اعتبارسنجی[19] و
نقشه­یابی دقیق[20] می­توانند در برنامه­های به­نژادی آفتابگر دان برای انتخاب به کمک نشانگر و تولید ارقام مقاوم به این بیماری مفید واقع گردد.

 

سپاسگزاری

از دانشکده کشاورزی و پژوهشکده
زیست­فناوری دانشگاه ارومیه و بنیاد ملی نخبگان ریاست جمهوری به خاطر فراهم­نمودن امکانات لازم برای انجام این پژوهش، تشکر و قدردانی می­گردد­. از انستیتو تحقیقات آگرونومی تولوز فرانسه نیز به خاطر در اختیار قراردادن بذور لاین­های آفتابگردان تشکر می­گردد.


منابع


Amoozadeh M, Darvishzadeh R, Davar R, Abdollahi-Mandoulakani B, Haddadi P, Basirnia A (2015). Quantitative trait loci associated with isolate specific and isolate non-specific partial resistance to Sclerotinia sclerotiorum in sunflower. Journal of Agricultural Science and Technology 17: 213–226.

Andersen JR, Zein I, Wenzel G, Krützfeldt B, EderJ, Ouzunova M, Lübberstedt T (2007). High levels of linkage disequilibrium and associations with forage quality at a Phenylalanine Ammonia Lyase locus in European maize (Zea mays L.) inbreds. Theoretical and Applied Genetics 114: 307–319.

Anonymous (2010). Agribusiness handbook: sunflower crude and refined oil. FAO/EBRD.

Bardin SD, Huang HC (2001). Research on biology and control of Sclerotinia diseases
inCanada. Canadian Journal of Plant Pathology 23: 88–98.

Basirnia A, Darvishzadeh R, Abdollahi Mandoulakani B (2016). Retrotransposon insertional polymorphism in sunflower (Helianthus annuus L.) lines revealed by IRAP and REMAP markers. Plant Biosystems 150(4): 641-652.

Basirnia A, Darvishzadeh R, Abdollahi Mandoulakani B, Nabipur A (2014). Assessment of genetic diversity in Iranian confectionary sunflower (Helianthus annuus L.) populations using retrotransposon based IRAP markers. Journal of Agricultural Biotechnology
6: 19-33 (In Persian).

Bert P, Jouan F, Tourvieille de Labrouhe D, Seere F, Nicolas P, Vear F (2002). Comparative genetic analysis of quantitative traits in sunflower (Helianthus annuus L.) 1. QTL involved in resistance to Sclerotinia sclerotiorum and Diaporthe helianthi. Theoretical and Applied Genetics 105: 985-993.

Bert PF, Dechamp-Guillaume G, Serre F, Jouan I, Tourvieille de Labrouhe D, Nicolas P, Vear F (2004). Comparative genetic analysis of quantitative traits in sunflower (Helianthus annuus L.) 3. Characterisation of QTL involved in resistance to
Sclero­tinia sclerotiorum
and Phoma macdonaldi. Theoretical and Applied Genetics 109: 865-874.

Boland GJ, Hall R (1994). Index of plant hosts of Sclerotinia sclerotiorum. Canadian Journal of Plant Pathology 16: 93-108.

BoltonMD, Thomma BP, Nelson BD (2006). Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary: biology and molecular traits of a cosmopolitan pathogen. Molecular Plant Pathology 7: 1-16.

Breseghello F, Sorrells ME (2006). Association mapping of kernel size an milling quality
in wheat (Triticum aestivum L.) cultivars. Genetics 172: 1165-1177.

Cardon LR, Palmer LJ (2003). Population stratification and spurious allelic association. Lancet 361: 598-604.

Castaño F, Vear F, Tourvieille de Labrouhe D (1993). Resistance of sunflower inbred lines to various forms of attack by Sclerotinia sclerotiorum and relations with some morphological characters. Euphytica 68: 85-98.

Collard BCY, Jahufer MZZ, Brouwer JB, Pang ECK (2005). An introduction to markers, quantitative trait loci (QTL) mapping and marker-assisted selection for crop improvement: The basic concepts. Euphytica 142: 169-196.

DadrasAR(2012). Evaluation of genetic diversity of tobacco (Nicotiana tabacum L.) cultivars using AFLP molecular markers. M.Sc. Thesis.ShahibBahonarUniversity ofKerman,Kerman,Iran.

Darvishzadeh R (2012). Association of SSR markers with partial resistance to Sclerotinia sclerotiorum isolates in sunflower (Helianthus annuus L.). Australian Journal of Crop Science 6: 276-282.

Davar R, Darvishzadeh R, Majd A (2011). Genotype-isolate interaction for resistance to Sclerotinia sclerotiorum in sunflower. Phytopathologia Mediterranea 50: 442-449.

Davar R, Darvishzadeh R, Majd A, Ghosta Y, Sarrafi A (2010). QTL mapping of partial resistance to basal stem rot in sunflower using recombinant inbred lines. Phytopathologia Mediterranea 49: 330-341.

Dewan A, Liu M, Hartman S, Zhang SSM, Liu DT, Zhao C, Barnstable C (2006). HTRA1 promoter polymorphism in wet age-related macular degeneration. Science 314: 989-992.

Emamgholi A, Zaefizadeh M, Imani A (2015). The proteomic analysis of resistance to Sclerotinia Sclerotiorum fungus in sunflower seedling stage. Trend in Life Science
4: 2319-5037.

Ershad J (1995). Fungi of Iran. Agricultural Research, Education and Extension Organization (AREEO) Publisher, Tehran, Iran.

Evanno G, Regnaut S, Goudet J (2005). Detecting the number of clusters of individuals using the software STRUCTURE: a simulation study. Molecular Ecology 14: 2611-2620.

Falush D, Stephens M, Pritchard JK (2003). Inference of population structure using multilocus genotype data: linked loci and cor­related allele frequencies. Genetics 164: 1567-1587.

Fusari CM, Di-Rienzo JA, Troglia C, Nishinakamasu V, Moreno MV, Maringolo C, Quiroz F, Álvarez D, Escande A, Hopp E, Heinz R, Lia VV Paniego NB (2012). Association mapping in sunflower for sclerotinia head rot resistance. BMC Plant Biology.
Doi: 10.1186/1471-2229-12-93.

Gentzbittel L, Mouzeyar S, Badaoui S, Mestries E, Vear F, Tourvieille De Labrouhe D, Nicolas P (1998). Cloning of molecular mark­ers for disease resistance in sunflower, Helianthus annuus L. Theoretical and Applied Genetics 96: 519-525.

Ghavami F, Elias EE, Mamidi O, Ansari M, Sargolzaei T, Adhikari M, Mergoum-Kianian SF (2011). Mixed model association mapping for Fusarium head blight resistance in Tunisian-derived durum wheat population. G3:Genes/Genomes/Genetics: 1: 209-218.

Gulya TJ K, Rashid Y, Masirevic SN (1997). Sunflower diseases, In: sunflower technology and production.Madison,Wisconsin,USA, pp. 263–379.

Hahn V (2002). Genetic variation for resistance to Sclerotinia head rot in sunflower inbred lines. Field Crop Research, 77: 153-159.

Hall D, Tegström C, Ingvarsson PK(2010). Using association map­ping to dissect the genetic basis of complex traits in plants. Briefings in Functional Genomics 9: 157-165.

Hatami Maleki H, Darvishzadeh R, Mohseni Z (2014). Evaluation of genetic diversity and classification of advanced sunflower lines using ISSR Markers. Journal of Agricultural Biotechnology 6: 33-44 (In Persian).

Hittalmani S, Huang N, Courtois B, Venuprasad R, Shashidhar HE, Zhuang JY, Zheng KL, Liu GF, Wang GC, Sidhu JS, Srivantaneeyakul S, Singh VP, Bagali PG, Prasanna HC, McLaren G, Khush GS (2003). Identification of QTL for growth and grain yield-related traits in rice across nine locations of Asia. Theoretical and Applied Genetics 107:
679-90.

Jannatdoust M, Darvishzadeh R, Ziaeifard R, Azizi H, Gholinezhad E (2015). Association mapping for grain quality related traits in confectionery sunflower (Helianthus annuus L.) using retrotransposon markers under normal and drought stress conditions. Crop Biotechnology 9: 15-28.

Jun TH, Van K, Kim MY, Lee SH,Walker DR(2008). Association analysis using SSR markers to find QTL for seed protein content in soybean. Euphytica 62: 179-191.

Lander ES, Botstein D (1989). Mapping Mendelian factors underlying quantitative traits using RFLP linkage maps. Genetics 121: 185-199.

Liu L, Wang L, YaoJ, Zheng Y, Zhao C (2010). Association mapping of six agronomic traits on chromosome 4A of Wheat (Triticum aestivum L.). Molecular Plant Breeding 1: 1-10.

Mestries E, Gentzbittel L, Tourvieille de Labrouhe D, Nicolas P, Vear F (1998). Analysis of quantita­tive trait loci associated with resistance to Sclerotinia sclerotiorum in sunflowers (Helianthus annuus L.) using molecular markers. Molecular Breeding
4: 215-226.

Micic Z, Hahn V, Bauer E, Scho¨n CC, Knapp J, Tang S, Melchinger AE (2004). QTL mapping of Sclerotinia midstalk-rot resistance in sunflower. Theoretical and Applied Genetics 109: 1474-1484.

Micic Z, Hahn V, Bauer E, Schon CC, Melchinger AE (2005a). QTL mapping of resistance to Sclerotinia mid-stalk rot in RIL of sunflower population NDBLOSsel×CM625. Theoretical and Applied Genetics 110: 1490–1498.

Micic Z, Hahn V, Bauer E, Melchinger AE, Knapp SJ, Tang S, Schön CC (2005b). Identification and validation of QTL for Sclerotinia mid-stalk rot resistance in sunflower by selective genotyping. Theoretical and Applied Genetics 111: 233-242.

Mohan M, Nair S, Bhagwat A,KrishnaTG, Yano M, Bhatia CR, Sasaki T (1997). Genome mapping, molecular markers and marker-assisted selection in crop plants. Molecular Breeding 3: 87-103.

Price K, Colhoun J (1975). A study of variability of isolates of Sclerotinia sclerotiorum (Lib) de Bary from different hosts. Journal of Phytopathology 83: 159-166.

Pritchard JK, Stephens MN, RosenbergN, Donnelly P (2000). Asso­ciation mapping in structured populations. The American Journal of Human Genetics 67: 170-181.

Pritchard JK, Donnelly P (2001). Case control studies of association in structured or admixed populations. Theoretical Population Biology 60: 227-237.

Rafalski A (2002a). Applications of single nucleotide polymorphisms in crop genetics.
Current Opinion in Plant Biology 5: 94.

Rafalski JA (2002b). Novel genetic mapping tools in plants: SNPs and LD-based approaches. Plant Science 162: 329-333.

Rojas EV (2014). Physiological, anatomical and molecular characterization of partial resistance against Sclerotinia sclerotiorum in soybean. Ph.D Thesis.University of Guelph,Canada.

Rönicke S, Hahn V, Vogler A, Friedt W (2005). Quantitative trait loci analysis of resistance to Sclerotinia sclerotiorum in sunflower (Helianthus annuus L.). Phytopathology
95: 834-839.

Rostok N, Ramsay L, MacKenzie K, Cardle L, Bhat PR (2006). Recent history of artificial outcrossing facilitates whole-genome association mapping in elite inbred crop varieties. Proceedings of theNationalAcademyof Sciences of theUnited States of America103: 18656-18661.

Saeed M, Wangzhen G, Tianzhen Z (2014). Association mapping for salinity tolerance in cotton (Gossypium hirsitum L.) germplasm from US and diverse regions of China. Australian Journal of Crop Science 8(3): 338-346.

Saharan GS, Mehta N (2008). Economic importance. Sclerotinia Diseases of Crop Plants: Biology, Ecology and Disease Management. Springer Publisher.

Sahranavard-Azartamar F, Darvishzadeh R, Ghadimzadeh M, Azizi H, Aboulghasemi Z (2015). Identification of SSR loci related to some important agromorphological traits
in different oily sunflower (Helianthus annuus L.) lines using association mapping. Crop Biotechnology 10: 73–87.

Sharma R, Meena PD, Verma PR, Saharan GS, Naresh M, Singh D, Arvind-Kumar A (2015). Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary causing Sclerotinia rot in oilseed Brassicas:
A review. Journal of Oilseed Brassica 6: 1-44.

Talukder ZI, Hulke BS, Qi L, Scheffler BE,  Pegadaraju V, McPhee K, Gulya Tj (2014). Candidate gene association mapping of Sclerotinia stalk rot resistance in sunflower (Helianthus annuus L.) uncovers the importance of COI1 homologs. Theoretical and Applied Genetics 127: 193-209.

Tang S, Yu JK, Slabaugh MB, Shintani DK, Knapp SJ (2002). Simple sequence repeat map of the sunflower genome. Theoretical and Applied Genetics 105: 1124-1136.

Tuberosa R, Salvi S, Sanguineti MC, Landi P, Maccaferri M, Conti S (2002). Mapping QTLs regulating morphophysiological traits and yield in drought stressed maize: case studies, shortcomings and perspectives. Annals of Botany 89: 941-963.

Yu JM, Buckler ES (2006). Genetic association mapping and genome organization of maize. Current Opinion in Biotechnology 17: 155-160.

Yu J, Pressoir G, Briggs WH, Vroh Bi I, Yamasaki M, Doebley JF, McMullen MD, Gaut BS, Nielsen DM, Holland JB, Kresovich S, Buckler ES (2006). A unified mixed-model method for asso­ciation mapping that accounts for multiple levels of relatedness.
Nature Genetics 38: 203-208.

Yue B, Radi SA, Vick BA, Cai X, Tang S, Knapp SJ, Gulya TJ, Miller JF, Hu J (2008). Identifying quantitative trait loci for resistance to Sclerotinia head rot in two USDA sunflower germplasms. Phytopathology 98: 926-931.

Vollmann J, Rajcan I (2010). Oil Crop Breeding & Genetics, In: Vollmann J, Rajcan I (Eds.), Oil Crops. Springer,New York, pp. 1-30.

Wang M, Jiang N, Jia T, Leach L, Cockram J, Comadran J, Shaw P, Waugh R, Luo Z (2012). Genome-wide association mapping of agronomic and morphologic traits in highly structured populations of barley cultivars. Theoretical and Applied Genetics
124: 233-46.

Zhang Q, Wu C, FY, Ren FY, and Zhang C (2012). Association analysis of important agronomical traits of maize inbred lines with SSRs. Australian Journal of Crop Science
6: 1131–1138.

Zhu C, Gore M, Buckler ES, Yu J (2008). Status and prospects of asso­ciation mapping
in plants. Plant Genome 1: 5-20.


Identification of retrotransposon-based (IRAP) loci associated with resistance
to Sclerotinia stem rot disease (Sclerotinia spp.) in sunflower

 

Najafzadeh R.1,Darvishzadeh R.*2, Musa-Khalifani Kh.3, Abrinbana M.4

 

1Postdoctoral, Department of Plant Breeding and Biotechnology, Urmia University, Urmia, Iran and National Elites Foundation, Tehran, Iran and Assistant Professor, Department of Medicinal Plants, Shahid Bakeri Higher Education Center, Urmia University, Miyandoab, Iran.

2Professor,Department of Plant Breeding and Biotechnology, Urmia University, Urmia, Iran and Institute of Biotechnology, Urmia University, Urmia, Iran.

3M.Sc. Graduate, Department of Plant Breeding and Biotechnology,UrmiaUniversity,Urmia,Iran.

4Asistant Professor, Department of Plant Protection,UrmiaUniversity,Urmia,Iran.

 

Abstract

Sclerotinia disease is important fungal disease of sunflower inIranthat reduces its growth and yield. In this study, reactions of 100 oily sunflower lines to 6 fungal isolates of Sclerotinia were studied and then 128 retrotransposon-based molecular markers (IRAP) were used to identify genes controlling disease resistance. The results showed that there is high diversity in the studied germplasm for resistance to the Sclerotinia stem rot. Population structure analysis subdivided the studied lines into 3 subpopulations (K=3). Association analysis with general and mixed linear models (GLM and MLM) identified 14 and 11 loci, respectively that are significantly associated (P≤0.01) with Sclerotinia disease resistant genes. Markers LTR 1063-65, LTR 1064-65 and LTR 1062 were commonly associated with resistant to some fungal isolates. The common markers due to facilitating simultaneous selection for resistance to several fungal isolates can be well used in sunflower breeding programs like marker-assisted selection (MAS).

Keywords: Associated analysis, Fungal disease, IRAP marker, Sunflower.

 

 

 

 

 

 

 

 



* نویسنده مسئول: رضا درویش­زاده                                  تلفن: 09149734458Email: r.darvishzadeh@urmia.ac.ir                   

[1] - Quantitative trait loci (QTL)

[2] - Marker assisted selection (MAS)

[3] - Linkage mapping

[4] - Association mapping (AM)

[5] - Linkage disequilibrium (LD) mapping

[6] - False marker- trait associations

[7] - Structure

[8] - Bayesian

[9] - Restriction fragment length polymorphism

[10] - Amplified fragment length polymorphism

[11] - Simple sequence repeats

[12] - Single nucleotide polymorphism

[13] - Inter-retrotransposon amplified polymorphism

[14] - Inoculum

[15] - Potato dextrose agar

[16] - Markov Chain Monte Carlo

[17] - General linear model

[18] - Mixed linear model

[19] - Validation

[20] - Fine mapping

* Corresponding Author: Darvishzadeh R.   Tel: 09149734458                 Email: r.darvishzadeh@urmia.ac.ir

Amoozadeh M, Darvishzadeh R, Davar R, Abdollahi-Mandoulakani B, Haddadi P, Basirnia A (2015). Quantitative trait loci associated with isolate specific and isolate non-specific partial resistance to Sclerotinia sclerotiorum in sunflower. Journal of Agricultural Science and Technology 17: 213–226.
Andersen JR, Zein I, Wenzel G, Krützfeldt B, EderJ, Ouzunova M, Lübberstedt T (2007). High levels of linkage disequilibrium and associations with forage quality at a Phenylalanine Ammonia Lyase locus in European maize (Zea mays L.) inbreds. Theoretical and Applied Genetics 114: 307–319.
Anonymous (2010). Agribusiness handbook: sunflower crude and refined oil. FAO/EBRD.
Bardin SD, Huang HC (2001). Research on biology and control of Sclerotinia diseases
inCanada. Canadian Journal of Plant Pathology 23: 88–98.
Basirnia A, Darvishzadeh R, Abdollahi Mandoulakani B (2016). Retrotransposon insertional polymorphism in sunflower (Helianthus annuus L.) lines revealed by IRAP and REMAP markers. Plant Biosystems 150(4): 641-652.
Basirnia A, Darvishzadeh R, Abdollahi Mandoulakani B, Nabipur A (2014). Assessment of genetic diversity in Iranian confectionary sunflower (Helianthus annuus L.) populations using retrotransposon based IRAP markers. Journal of Agricultural Biotechnology
6: 19-33 (In Persian).
Bert P, Jouan F, Tourvieille de Labrouhe D, Seere F, Nicolas P, Vear F (2002). Comparative genetic analysis of quantitative traits in sunflower (Helianthus annuus L.) 1. QTL involved in resistance to Sclerotinia sclerotiorum and Diaporthe helianthi. Theoretical and Applied Genetics 105: 985-993.
Bert PF, Dechamp-Guillaume G, Serre F, Jouan I, Tourvieille de Labrouhe D, Nicolas P, Vear F (2004). Comparative genetic analysis of quantitative traits in sunflower (Helianthus annuus L.) 3. Characterisation of QTL involved in resistance to
Sclero­tinia sclerotiorum
and Phoma macdonaldi. Theoretical and Applied Genetics 109: 865-874.
Boland GJ, Hall R (1994). Index of plant hosts of Sclerotinia sclerotiorum. Canadian Journal of Plant Pathology 16: 93-108.
BoltonMD, Thomma BP, Nelson BD (2006). Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary: biology and molecular traits of a cosmopolitan pathogen. Molecular Plant Pathology 7: 1-16.
Breseghello F, Sorrells ME (2006). Association mapping of kernel size an milling quality
in wheat (Triticum aestivum L.) cultivars. Genetics 172: 1165-1177.
Cardon LR, Palmer LJ (2003). Population stratification and spurious allelic association. Lancet 361: 598-604.
Castaño F, Vear F, Tourvieille de Labrouhe D (1993). Resistance of sunflower inbred lines to various forms of attack by Sclerotinia sclerotiorum and relations with some morphological characters. Euphytica 68: 85-98.
Collard BCY, Jahufer MZZ, Brouwer JB, Pang ECK (2005). An introduction to markers, quantitative trait loci (QTL) mapping and marker-assisted selection for crop improvement: The basic concepts. Euphytica 142: 169-196.
DadrasAR(2012). Evaluation of genetic diversity of tobacco (Nicotiana tabacum L.) cultivars using AFLP molecular markers. M.Sc. Thesis.ShahibBahonarUniversity ofKerman,Kerman,Iran.
Darvishzadeh R (2012). Association of SSR markers with partial resistance to Sclerotinia sclerotiorum isolates in sunflower (Helianthus annuus L.). Australian Journal of Crop Science 6: 276-282.
Davar R, Darvishzadeh R, Majd A (2011). Genotype-isolate interaction for resistance to Sclerotinia sclerotiorum in sunflower. Phytopathologia Mediterranea 50: 442-449.
Davar R, Darvishzadeh R, Majd A, Ghosta Y, Sarrafi A (2010). QTL mapping of partial resistance to basal stem rot in sunflower using recombinant inbred lines. Phytopathologia Mediterranea 49: 330-341.
Dewan A, Liu M, Hartman S, Zhang SSM, Liu DT, Zhao C, Barnstable C (2006). HTRA1 promoter polymorphism in wet age-related macular degeneration. Science 314: 989-992.
Emamgholi A, Zaefizadeh M, Imani A (2015). The proteomic analysis of resistance to Sclerotinia Sclerotiorum fungus in sunflower seedling stage. Trend in Life Science
4: 2319-5037.
Ershad J (1995). Fungi of Iran. Agricultural Research, Education and Extension Organization (AREEO) Publisher, Tehran, Iran.
Evanno G, Regnaut S, Goudet J (2005). Detecting the number of clusters of individuals using the software STRUCTURE: a simulation study. Molecular Ecology 14: 2611-2620.
Falush D, Stephens M, Pritchard JK (2003). Inference of population structure using multilocus genotype data: linked loci and cor­related allele frequencies. Genetics 164: 1567-1587.
Fusari CM, Di-Rienzo JA, Troglia C, Nishinakamasu V, Moreno MV, Maringolo C, Quiroz F, Álvarez D, Escande A, Hopp E, Heinz R, Lia VV Paniego NB (2012). Association mapping in sunflower for sclerotinia head rot resistance. BMC Plant Biology.
Doi: 10.1186/1471-2229-12-93.
Gentzbittel L, Mouzeyar S, Badaoui S, Mestries E, Vear F, Tourvieille De Labrouhe D, Nicolas P (1998). Cloning of molecular mark­ers for disease resistance in sunflower, Helianthus annuus L. Theoretical and Applied Genetics 96: 519-525.
Ghavami F, Elias EE, Mamidi O, Ansari M, Sargolzaei T, Adhikari M, Mergoum-Kianian SF (2011). Mixed model association mapping for Fusarium head blight resistance in Tunisian-derived durum wheat population. G3:Genes/Genomes/Genetics: 1: 209-218.
Gulya TJ K, Rashid Y, Masirevic SN (1997). Sunflower diseases, In: sunflower technology and production.Madison,Wisconsin,USA, pp. 263–379.
Hahn V (2002). Genetic variation for resistance to Sclerotinia head rot in sunflower inbred lines. Field Crop Research, 77: 153-159.
Hall D, Tegström C, Ingvarsson PK(2010). Using association map­ping to dissect the genetic basis of complex traits in plants. Briefings in Functional Genomics 9: 157-165.
Hatami Maleki H, Darvishzadeh R, Mohseni Z (2014). Evaluation of genetic diversity and classification of advanced sunflower lines using ISSR Markers. Journal of Agricultural Biotechnology 6: 33-44 (In Persian).
Hittalmani S, Huang N, Courtois B, Venuprasad R, Shashidhar HE, Zhuang JY, Zheng KL, Liu GF, Wang GC, Sidhu JS, Srivantaneeyakul S, Singh VP, Bagali PG, Prasanna HC, McLaren G, Khush GS (2003). Identification of QTL for growth and grain yield-related traits in rice across nine locations of Asia. Theoretical and Applied Genetics 107:
679-90.
Jannatdoust M, Darvishzadeh R, Ziaeifard R, Azizi H, Gholinezhad E (2015). Association mapping for grain quality related traits in confectionery sunflower (Helianthus annuus L.) using retrotransposon markers under normal and drought stress conditions. Crop Biotechnology 9: 15-28.
Jun TH, Van K, Kim MY, Lee SH,Walker DR(2008). Association analysis using SSR markers to find QTL for seed protein content in soybean. Euphytica 62: 179-191.
Lander ES, Botstein D (1989). Mapping Mendelian factors underlying quantitative traits using RFLP linkage maps. Genetics 121: 185-199.
Liu L, Wang L, YaoJ, Zheng Y, Zhao C (2010). Association mapping of six agronomic traits on chromosome 4A of Wheat (Triticum aestivum L.). Molecular Plant Breeding 1: 1-10.
Mestries E, Gentzbittel L, Tourvieille de Labrouhe D, Nicolas P, Vear F (1998). Analysis of quantita­tive trait loci associated with resistance to Sclerotinia sclerotiorum in sunflowers (Helianthus annuus L.) using molecular markers. Molecular Breeding
4: 215-226.
Micic Z, Hahn V, Bauer E, Scho¨n CC, Knapp J, Tang S, Melchinger AE (2004). QTL mapping of Sclerotinia midstalk-rot resistance in sunflower. Theoretical and Applied Genetics 109: 1474-1484.
Micic Z, Hahn V, Bauer E, Schon CC, Melchinger AE (2005a). QTL mapping of resistance to Sclerotinia mid-stalk rot in RIL of sunflower population NDBLOSsel×CM625. Theoretical and Applied Genetics 110: 1490–1498.
Micic Z, Hahn V, Bauer E, Melchinger AE, Knapp SJ, Tang S, Schön CC (2005b). Identification and validation of QTL for Sclerotinia mid-stalk rot resistance in sunflower by selective genotyping. Theoretical and Applied Genetics 111: 233-242.
Mohan M, Nair S, Bhagwat A,KrishnaTG, Yano M, Bhatia CR, Sasaki T (1997). Genome mapping, molecular markers and marker-assisted selection in crop plants. Molecular Breeding 3: 87-103.
Price K, Colhoun J (1975). A study of variability of isolates of Sclerotinia sclerotiorum (Lib) de Bary from different hosts. Journal of Phytopathology 83: 159-166.
Pritchard JK, Stephens MN, RosenbergN, Donnelly P (2000). Asso­ciation mapping in structured populations. The American Journal of Human Genetics 67: 170-181.
Pritchard JK, Donnelly P (2001). Case control studies of association in structured or admixed populations. Theoretical Population Biology 60: 227-237.
Rafalski A (2002a). Applications of single nucleotide polymorphisms in crop genetics.
Current Opinion in Plant Biology 5: 94.
Rafalski JA (2002b). Novel genetic mapping tools in plants: SNPs and LD-based approaches. Plant Science 162: 329-333.
Rojas EV (2014). Physiological, anatomical and molecular characterization of partial resistance against Sclerotinia sclerotiorum in soybean. Ph.D Thesis.University of Guelph,Canada.
Rönicke S, Hahn V, Vogler A, Friedt W (2005). Quantitative trait loci analysis of resistance to Sclerotinia sclerotiorum in sunflower (Helianthus annuus L.). Phytopathology
95: 834-839.
Rostok N, Ramsay L, MacKenzie K, Cardle L, Bhat PR (2006). Recent history of artificial outcrossing facilitates whole-genome association mapping in elite inbred crop varieties. Proceedings of theNationalAcademyof Sciences of theUnited States of America103: 18656-18661.
Saeed M, Wangzhen G, Tianzhen Z (2014). Association mapping for salinity tolerance in cotton (Gossypium hirsitum L.) germplasm from US and diverse regions of China. Australian Journal of Crop Science 8(3): 338-346.
Saharan GS, Mehta N (2008). Economic importance. Sclerotinia Diseases of Crop Plants: Biology, Ecology and Disease Management. Springer Publisher.
Sahranavard-Azartamar F, Darvishzadeh R, Ghadimzadeh M, Azizi H, Aboulghasemi Z (2015). Identification of SSR loci related to some important agromorphological traits
in different oily sunflower (Helianthus annuus L.) lines using association mapping. Crop Biotechnology 10: 73–87.
Sharma R, Meena PD, Verma PR, Saharan GS, Naresh M, Singh D, Arvind-Kumar A (2015). Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary causing Sclerotinia rot in oilseed Brassicas:
A review. Journal of Oilseed Brassica 6: 1-44.
Talukder ZI, Hulke BS, Qi L, Scheffler BE,  Pegadaraju V, McPhee K, Gulya Tj (2014). Candidate gene association mapping of Sclerotinia stalk rot resistance in sunflower (Helianthus annuus L.) uncovers the importance of COI1 homologs. Theoretical and Applied Genetics 127: 193-209.
Tang S, Yu JK, Slabaugh MB, Shintani DK, Knapp SJ (2002). Simple sequence repeat map of the sunflower genome. Theoretical and Applied Genetics 105: 1124-1136.
Tuberosa R, Salvi S, Sanguineti MC, Landi P, Maccaferri M, Conti S (2002). Mapping QTLs regulating morphophysiological traits and yield in drought stressed maize: case studies, shortcomings and perspectives. Annals of Botany 89: 941-963.
Yu JM, Buckler ES (2006). Genetic association mapping and genome organization of maize. Current Opinion in Biotechnology 17: 155-160.
Yu J, Pressoir G, Briggs WH, Vroh Bi I, Yamasaki M, Doebley JF, McMullen MD, Gaut BS, Nielsen DM, Holland JB, Kresovich S, Buckler ES (2006). A unified mixed-model method for asso­ciation mapping that accounts for multiple levels of relatedness.
Nature Genetics 38: 203-208.
Yue B, Radi SA, Vick BA, Cai X, Tang S, Knapp SJ, Gulya TJ, Miller JF, Hu J (2008). Identifying quantitative trait loci for resistance to Sclerotinia head rot in two USDA sunflower germplasms. Phytopathology 98: 926-931.
Vollmann J, Rajcan I (2010). Oil Crop Breeding & Genetics, In: Vollmann J, Rajcan I (Eds.), Oil Crops. Springer,New York, pp. 1-30.
Wang M, Jiang N, Jia T, Leach L, Cockram J, Comadran J, Shaw P, Waugh R, Luo Z (2012). Genome-wide association mapping of agronomic and morphologic traits in highly structured populations of barley cultivars. Theoretical and Applied Genetics
124: 233-46.
Zhang Q, Wu C, FY, Ren FY, and Zhang C (2012). Association analysis of important agronomical traits of maize inbred lines with SSRs. Australian Journal of Crop Science
6: 1131–1138.
Zhu C, Gore M, Buckler ES, Yu J (2008). Status and prospects of asso­ciation mapping
in plants. Plant Genome 1: 5-20.