Expression study of four gene clones belonging to MADS- box family in the dioecious plant sorrel (Rumex acetosa L.)

Shakib, Alimohammad; Insverce, Charlse

doi:10.22103/jab.2011.163

Expression study of four gene clones belonging to MADS- box family in the dioecious plant sorrel (Rumex acetosa L.)

Articles in Press

Document Type : Research Paper

Authors

10.22103/jab.2011.163

Abstract

Study of genes involved in flower formation could help to increase our understanding of floral organ identity mechanisms. In this research, the expression pattern of four MADS- box gene family including RaA2, RaB17, RaG24 and RaK17 isolated from the dioecious plant Rumex acetosa was studied. RNA extracted from different tissues (inflorescence, stem, leaf and root) of male and female plants, was used for Northern blot analysis. RaA2 and RaB17 genes are expressed in reproductive organs but RaG24 and Ra K17 genes were shown to be expressed in both vegetative and reproductive organs. Alignment of their deduced proteins with other known MADS box proteins showed that they are belongs to distinct subfamily groups. The proteins of RaA2 and RaB17 genes showed the highest similarity to MADS proteins from Malus domestica and CMB1 from Diantus caryophyllus, respectively. The proteins of RaG24 and Ra K17 genes have the highest similarity to TDR3 protein from Lycopersicon esculentum and MADS5 protein from Betula pendula and POTM1 protein from Solanum tuberosum which are expressed in both vegetative and reproductive phases. In Southern blot analysis, there is a difference in hybridisation pattern between male and female. The simple pattern of hybridisation indicated that there is a single copy and small gene family of each gene in the genome

Keywords

Full Text

بررسی بیان چهار همسانه ژنی عضو خانواده MADS- box در گیاه دوپایه ترشک (Rumex acetosa L.)

علی محمد شکیب¹*، چارلز اینزورث²

¹ پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی ایران- کرج

² آزمایشگاه بیولوژی ملکولی گیاهی، امپریال کالج، دانشگاه لندن، انگلستان

چکیده

بررسی ژنهایی که در تشکیل گل دخالت دارند میتوانند ما را در فهم بیشتر مکانیسمهای تعیین جنسیت کمک نماید. در این تحقیق، الگوی بیان چهار ژن از اعضای خانواده ژنی MADS- box شامل RaA2 ، RaB17 ، RaG24 و RaK16 جداسازی شده از گیاه دو پایه ترشک ( Rumex acetosa L.) مورد مطالعه قرار گرفتند. برای استخراج RNA از بافتهای مختلف (گل آذین، ساقه، برگ و ریشه) گیاهان نر و ماده برای آزمون نورترن بلات استفاده گردید. ژنهای RaA2 و RaB17 در اعضای زایشی گیاه بیان میشوند اما ژنهای RaG24 و RaK16 هم در اعضای رویشی و هم در اعضای زایشی بیان میشوند. هم ردیفی توالی پروتئینی این همسانههای ژنی با پروتئینهای MADS- box شناخته شده سایر گیاهان نشان داد که آنها متعلق به زیر خانوادههای مجزایی هستند. توالی پروتئینی ژنهای RaA2 و RaB17 بیشترین تشابه را به ترتیب با پروتئین های MADS- box سیب (Malus domestica) و CMB1 گیاه Diantus caryophyllus نشان دادند. توالی پروتئینی ژنهای RaG24و RaK16 بیشترین تشابه را به ترتیب با پروتئین TDR3 گوجه فرنگی (Lycopersicon esculentum) و پروتئین MADS5 گیاه Betula pendula و پروتئین POTM1 سیب زمینی (Solanum tuberosum) نشان داد که هر دو در مراحل رویشی و زایشی بیان میشوند. در آزمون سادرن بلات الگوی دورگه سازی متفاوتی بین نر و ماده وجود داشت. الگوی دورگه سازی سادرن بلات نشان می دهد که این ژنها به حالت تک کپی و به صورت خانوادههای ژنی کوچک در ژنوم قرار دارند.

کلمات کلیدی: گیاه دو پایه، شناسایی ژن، تمایز جنسی، بیان ژن، MADS- box، Rumex acetosa L

مقدمه

ژنهای MADS- box خانواده ژنی بزرگی هستند که تقریبا در تمام موجودات پر سلولی یافت میشوند (Krogan et al., 2000; Martinez et al., 2003; Singer et al., 2007; Svensson and Engstron, 2002; Tanabe et al., 2005; Tanabe et al., 2003). در بازدانگان، خیلی از ژنهای خانواده MADS- box در مراحل مختلف نمو گل، به ویژه در تعیین هویت مریستم گل و اعضاء گل نقش دارند (Davies et al., 1996; Parenicova et al., 2003; Reiechman and Meyerowitz, 1997 ). بیشتر اعضای این خانواده دارای بخش مشترک بنام MADS- box هستند (Schwarz-Sommer et al., 1990) که به DNA متصل میشوند (Huang et al., 1995; Shiraishi et al., 1993; Shore and Sharrocks, 1995). جداسازی و تعیین نقش ژنهای این خانواده در موجودات مختلف در حال بررسی است (Henschel et al., 2002; Singer et al., 2007; Sevensson and Engestron, 2002). بخش مشترک بین ژنهای MADS- box به عنوان ابزاری برای جداسازی ژنهای این خانواده در گونههای مختلف گیاهی مورد استفاده قرار میگیرد (Kater et al., 1998; Puneli et al., 1991). این روش به ویژه در گیاهانی که جهش یافتههای فنوتیپی در آنها مشاهده نشده است، ارزشمند است. یکی از موضوعات مورد علاقه محققین، مطالعه مکانیزمهای تظاهر جنسیت و نحوه تکامل آن در گونههای گیاهی است (Charlesworth, 2002; Singer et al., 2007; Tanurdzic and Banks, 2004). دو گیاه دو پایهSilene latifolia و Rumex acetosaبه عنوان گیاهان مدل در مطالعات تظاهر جنسیت مورد استفاده قرار میگیرند (Ainsworth et al., 2005). در گیاه دو پایه ترشک (Rumex acetosa L. )، که در آن گلهای نر و ماده به صورت جدا گانه روی گیاهان منفرد تشکیل میشود، مطالعه ژنهای دخیل در تمایز اعضای گل میتواند در فهم مکانیزمهای تعیین جنسیت گیاهان کمک نماید. قبلا با هدف جداسازی ژنهای MADS- box، یک خزانه cDNA ساخته شده از گل آذینهای نر و ماده ترشک با استفاده از دو ژن DEFICIENS و PLENA به عنوان کاوشگر غربال گردیدند (Ainsworth et al., 1995). هفت همسانه با طول کامل انتخاب شدند که سه مورد از این همسانهها به نامهای RAD1 (Rumex acetosa DEFICIENS-like)، RAD2 و RAP1 (Rumex acetosa PLENA-like) مورد بررسی تفصیلی قرار گرفته (Ainsworth et al., 1995) و نشان دادهاند که در پریموردیاهای اعضای جنسی گل در پایههای نر و ماده ترشک بیان میشوند. با اینکه تا به حال چندین ژن از ترشک جداسازی و مشخصات مولکولی آنها تعیین شده اما نقش آنها بدلیل نبود روش انتقال ژن به ترشک تعیین نشده است. تعدادی از ژنهای این خانواده از گونههای گیاهی دیگر جداسازی شده و نقش آنها تعیین گردیده است. هم اکنون تعداد بسیار زیادی توالی ژنی در بانک اطلاعات DNA وجود دارد که میتوان در حد امکان، از آنها برای کسب اطلاعات بیشتر در باره تشابه توالی و پیش بینی کارکرد ژنهای جدیداً جداسازی شده یا ژنهایی که کارکرد ناشناخته دارند، استفاده کرد. این اطلاعات میتواند در بحثهای تکاملی و جنبههای مهندسی ژنتیک کاربرد داشته باشند. در اینجا خصوصیات چهار همسانه ژنی جدا شده از Rumex acetosa شامل: (RaA2)، (RaB17)، (RaG24) و (RaK16)از نظر تشابه توالی و بررسی بیان تشریح شده است.

مواد و روشها

گیاهان نر و ماده ترشک Rumex acetosa L.)) به عنوان مواد گیاهی مورد استفاده قرار گرفتند. بررسیها در آزمایشگاه زیست شناسی مولکولی، امپریال کالج مستقر در وای، انگلستان صورت گرفت.

استخراج DNA، RNA: از برگی گیاهان نر و ماده DNA و از ریشه، ساقه، برگ و گل آذین گیاهان نر و ماده RNA کل به طور جداگانه مطابق روشهای توصیه شده توسط اینزورث و همکاران (Ainsworth et al., 1995; Ainsworth, 1994 ) جداسازی گردیدند.

تهیه کاوشگر: توالی کاوشگرهای مورد استفاده از بخش´3 همسانهها، بدون ناحیه MADS، تهیه شدند. برای همسانه RaA2 یک قطعه 480 جفت بازی با استفاده از برش آنزیمی Sst1 بکار رفت. برای همسانه Ra17 یک قطعه 780 جفت بازی با برش آنزیمهای Kpn1/ EcoR1 و برای همسانه RaG24 و همسانه RaK16 به ترتیب یک قطعه 740 جفت بازی با برش آنزیم HindIIIو یک قطعه 530 جفت بازی با برش آنزیمهای Kpn1/ Xba1 مورد استفاده قرار گرفت. قطعات DNA بالا سپس با ³²P نشاندار شدند.

دورگه سازی سادرن و نوردرن بلات: کل RNA تهیه شده از بافتهای مختلف روی ژل آگارز فرمالدهید 2/1 درصد جداسازی گردید. سپس RNA به غشاء نایلونی منتقل و با کاوشگر نشاندار شده دورگه شد. غشاءها با بافر شستشو با شدت بالا (0.2 x SSC) و دمای ^oC65 شستشو و مجاور فیلم X-ray قرار داده شدند.

نتایج و بحث

توالیهای اسید آمینهای پیش بینی شده برای چهار همسانه MADS- box ترشک با استفاده از جستجویBLAST برای تعیین اینکه آیا شباهتی با توالیهای موجود در بانک اطلاعاتی دارند، مورد مقایسه قرار گرفتند. پیدا کردن شبیهترین توالیها برای همردیفی توالی، با استفاده از برنامه MegAlign انجام و درخت فیلوژنتیک با استفاده از روش کلاستال (Clustal) تهیه گردید. بر اساس این بررسی، پروتئینهای MADS- box ترشک در گروه های اصلی SQUA/AP1، MdMADS1/CMB1، TDR3/SaMADSA و POTM1/SLM5 قرار گرفتند (شکل1). همسانه RaA2 شامل یک cDNA به طول 1113 جفت باز است که یک پروتئین با 243 اسید امینه به وزن 2/28 کیلو دالتون رمز میکند. مقایسه انجام گرفته با استفاده از بانک اطلاعات پروتئین نشان داد که ژن رمز کننده این پروتئین، یعنی RaA2 به گروه SQUA/AP1 نزدیک بوده (شکل1) و تشابه توالی 9/61 درصدی با پروتئین MADS- box از سیب (Malus domestica) (شماره بازیابی (AJ000759 و تشابه توالی 3/61 درصدی با پروتئین (SQUA) SQUAMOSA از گل میمون (Antirrhinum majus) (Huijser et al., 1992) و پروتئین (AP1) APETALA1 ازArabidopsis thaliana (Martinez et al., 2003) دارد. همچنین تشابه توالی 1/60 درصدی با SaMADS C ، هومولوگ AP1، از Sinapis alba (Menzel et al., 1995) و تشابه توالی 3/59 درصدی با پروتئینBoiAP1 ازBrassica oleracea (شماره بازیابی U67451) (Car and Irish, 1997) نشان داد. در این گروه، بالاترین تشابه (3/95 درصد و 5/94 درصد) بین پروتئینی ازB. oleracea با شماره بازیابی U67451 و پروتئینهای AP1 از S. albaو A. thaliana مشاهده گردید. میزان تشابه SQUA و AP1با همدیگر 5/64 درصد می باشد. اعضای این گروه عموما در تعیین هویت مریستم گل دخالت دارند. شکلهای 2 و 3 به ترتیب همردیفی و درصد تشابه توالی پروتئین RaA2 با دیگر پروتئینهای این گروه را نشان میدهد. همسانهRaB17 دارای 1140 جفت باز است که پیش بینی میشود یک پروتئین با 251 اسید آمینه به وزن 8/28 کیلو دالتون با کدون آغاز ترجمه (ATG) در موقعیت 159، از آن رمز شود. مقایسه پروتئین RaB17 با دیگر پروتئینهای MADS نشان داد کهRaB17 میتواند در گروه MdMADS1/CMB1 قرار گیرد (شکل1). در این گروه، RaB17 تشابه توالی 9/63 درصدی با پروتئین CMB1 از Dianthus caryophyllus با شماره بازیابی Q39685 و تشابه توالی 7/54 درصدی با PrMADS1 از Pinus radiata با شماره بازیابی U42399، تشابه توالی 2/52 درصدی با پروتئین MADS- box گل میمون با شماره بازیابی X95467 و تشابه توالی 6/51 درصدی با پروتئین MdMADS1 سیب (Malus domestica) (Sung and An, 1997) دارد. همردیفی توالی پروتئین پیش بینی شده RaB17 با سایر پروتئینهای MADS در شکل4 نشان داده شده است. مانند دیگر پروتئینهای MADSگیاهی تشابه بالایی در بخش MADS بین پروتئین B17با سایر اعضای خانواده MADS و تشابه کمی در توالیهای پائین دست بخش MADS وجود دارد. در این گروه دو پروتئین از سیب (MdMADS8 و MdMADS1) بالاترین تشابه (6/99 درصد) را دارند. پروتئین MADS از گل میمون (با شماره بازیابی X9546) به ترتیب دارای تشابه 7/66 درصدی و 3/66 درصدی با پروتئینهای سیب هستد. پروتئین CMB1 تشابه 9/63 درصدی با PrMADS1 دارد. ژن MdMADS1 در اعضای گل و میوه های جوان بیان میشود (Sung and An, 1997). با اینحال، اطلاعات زیادی در باره الگوی بیان یا کارکرد ژنهای این گروه وجود ندارد.

همسانهRaG24 دارای یک cDNA به طول 1122 جفت باز است که پیش بینی میشود یک پروتئین 214 اسید آمینهای با وزن 4/32 کیلو دالتون رمز کند که از نوکلئوتید 5 آغاز و در نوکلئوتید 646 خاتمه یابد. مقایسه توالی پروتئینRaG24 با دیگر پروتئینهای MADS نشان داد که این پروتئین متعلق به گروه TDR3/SaMADS A میباشد (شکل1). اعضای این گروه عموما در هر دو اعضای رویشی و زایشی بیان میشوند و کارکردهای مختلفی مانند دخالت در تشکیل مریستم گل آذین و گل دارند. پروتئین RaG24 دارای تشابه 2/64 درصدی با TDR3 از گوجه فرنگی (Lycopersicun esculentum) (Pnueli et al., 1991)، تشابه 6/62 درصدی با AGL20از Arabidopsis thaliana (با شماره بازیابی AC003680)، تشابه 9/61 درصدی با TobMADS1 از توتون (Mandel et al., 1994) و تشابه 5/61 درصدی با SaMADS A از Sinapis alba (Menzel et al., 1996) میباشد. در این گروه، AGL20 تشابه 4/94 درصدی با SaMADS Aو TRD3 تشابه 5/95 درصدی با TobMADS1دارند. پائینترین درصد تشابه (3/43 درصد) بین پروتئین PrMADS9 از Pinus radiate (با شماره بازیابی U90344) و پروتئین AGL14 از Arabidopsis thaliana (با شماره بازیابی U20184) میباشد. بررسی همردیفی پروتئین RaG24 با سایر پروتئینهای MADS گیاهی در شکل5 نشان داده شده است.

شکل 1- درخت فیلوژنی بر اساس همردیفی پروتئینهای MADS ترشک (به صورت برجسته) با شبیهترین پروتئینهای MADS با استفاده از روش کلاستال (Clustal). BoiAP1 از Brassica oleracea (شماره بازیابی U67451) (Car and Irish, 1997)، SaMADS C از Sinapis alba (شماره بازیابی X81480) (Menzel et al., 1995)،AP1 ازArabidopsis thaliana (شماره بازیابی S27109) (Mendel et al., 1992)، SQUA از Antirrhinum majus (شماره بازیابی S20886) (Huijser et al., 1992)، پروتئینMADS از Malus domestica (شماره بازیابی AJ000759)، RaA2; ازRumex acetosa ، همسانAGL8 از Solanum commersonii (شماره بازیابی AF002666)،POTM1 ازSolanum tuberosum (شماره بازیابی Q42429) (Kang and Hannapel, 1995)، NAP1 از Nicotiana tabacum (شماره بازیابی AF009126)،MADS5 از Betula pendula (شماره بازیابی X99655)،NAP1 از Nicotiana tabacum (شماره بازیابی AF009126)، SLM5 از Silene latifolia (شماره بازیابی X80492)، (Hardenack et al., 1994)،RaK16 از Rumex acetosa ،MdMADS8 ازMalus domestica (شماره بازیابی AJ001681)،MdMADS1 از Malus domestica (شماره بازیابی U78947) (Sung and An, 1997)، پروتئینMADS از Antirrhinum majus (شماره بازیابی X95467) ،MdMADS1 از Malus domestica (شماره بازیابی U78947)،PrMADS1 از Pinus radiata (شماره بازیابی U42399)، CMB1از Dianthus caryophyllus (شماره بازیابی Q39685)، RaB17; از Rumex acetosa ، TDR3 از Lycopersicon esculentum (شماره بازیابی X60756) )(Pnueli et al., 1991)، TobMADS1 از Nicotiana tabacum (شماره بازیابی X76188) )(Mandel et al., 1994)، پروتئین MADS ازPimpinella brachycarpa (شماره بازیابی AF082531)،AGL20 از Arabidopsis thaliana (شماره بازیابی AC003680)، SaMADS A از Sinapis alba (شماره بازیابی U25696) (Menzel et al., 1996)، RaG24 از Rumex acetosa ،AGL14 از Arabidopsis thaliana (شماره بازیابی U20184) (Rounsley et al., 1995)، PrMADS9 از Pinus radiata (شماره بازیابی U90344)، RAP1 از Rumex acetosa (شماره بازیابی X89107)( Ainsworth et al., 1995)، RAD1 از Rumex acetosa (شماره بازیابی X89113) (Ainsworth et al., 1995).

Figure 1- Phylogenetic tree produced from an alignment of sorrel MADS-box proteins (in bold) with the most similar MADS-box proteins using Clustal method.

شکل 2 – همردیفی توالیهای اسید امینه همسانه ژنی RaA2 ترشک با سایر پروتئنهای MADS. SQUA از Antirrhinum majus(شماره بازیابی S20886) (Huijser et al., 1992)، AP1 از Arabidopsis thaliana (شماره بازیابی S27109)،SaMADS از Sinapis albas (شماره بازیابی X81480) (Menzel et al., 1995)، پروتئین MADS از Malus domestica (شماره بازیابی AJ000759)، BoiAP1 از Brassica oleracea (شماره بازیابی U67451) (Car and Irish, 1997).

Figure 2- Alignment of amino acid sequence of the sorrel RaA2 clone and other MADS-box proteins.

شکل 3- درصد تشابه پروتئین همسانه ژنی RaA2 ترشک با پروتئنهایSQUA ، AP1، SaMADS ، MADSC، پروتئینMADS از M. domestica و BoiAP1 .

Figure 3- Sequence similarity percentage of the sorrel RaA2 clone with other MADS proteins.

شکل 4 – همردیفی توالیهای اسید امینه همسانه ژنی RaB17 ترشک با سایر پروتئنهای MADS. CMB1 از Dianthus caryophyllus (شماره بازیابی Q39685)،PrMADS1 از Pinus radiata (شماره بازیابی U42399)، MdMADS8 از Malus domestica (شماره بازیابی AJ001681) MdMADS1 از Malus domestica (شماره بازیابی U78947) (Sung and An, 1997)، پروتئینMADS از Antirrhinum majus (شماره بازیابی X95467).

Figure 4- Alignment of amino acid sequence of the sorrel RaB17 clone and other MADS-box proteins.

شکل 5 – همردیفی توالیهای اسید امینه همسانه ژنی RaG24 ترشک با سایر پروتئنهای MADS. TDR3 ازLycopersicon esculentum (شماره بازیابی X60756) (Penueli et al., 1991)، پروتئینAGL20 از Arabidopsis thaliana (شماره بازیابی AC003680)،TobMADS1 از Nicotiana tabacum (شماره بازیابی X76188) (Mandel et al., 1994)، SaMADS A از Sinapis alba (شماره بازیابی U25696) (Menzel et al., 1996)، پروتئینMADS از Pimpinella brachycarpa (شماره بازیابی AF082531)، PrMADS9 ازPinus radiata (شماره بازیابی U90344)، AGL14 از Arabidopsis thaliana (شماره بازیابی U20184) (Rounsley et al., 1995).

Figure 5- Alignment of amino acid sequence of the sorrel RaG24 clone and other MADS-box proteins.

همسانه RaK16 ترشک دارای 969 جفت باز است که میتواند پروتئینی با 225 اسید آمینه با وزن 8/25 کیلودالتون را رمز نماید. مقایسه پروتئین RaK16 با سایر پروتئینهای MADS گیاهی نشان داد که این پروتئین به پروتئینهای گروهPOTM1/SLM5 خیلی نزدیک است (شکل1). RaK16 تشابه توالی1/63 درصدی با MADS5 از Betula pendula (با شماره بازیابی X99655) و POTM1 از Solanum tuberosum (Kang and Hannapel, 1995) دارد. پروتئین RaK16 تشابه 2/62 درصدی با NAP1 از توتون Nicotiana tabacum (با شماره بازیابی AF009126) و هومولوگ AGL8 از Solanum commersonii (با شماره بازیابی AF002666) نیز نشان داد. این پروتئین همچنین تشابه 2/60 درصدی با SLM5 از Silene latifolia (Hardenack et al., 1994) دارد. در بین اعضای این گروه، POTM1 بالاترین تشابه (96 درصد) را با پروتئینی از Solanum commersonii و نیز تشابه 3/76 درصدی با NAP1 از N. tabacum دارد. MADS5 تشابه 3/69 درصدی با POTM1 و نیز تشابه 9/66 درصدی با SLM5 دارد.

برای بررسی الگوی بیان همسانههای ژنی ترشک، RNA از بافتهای مختلف شامل ریشه، ساقه، برگ و گل آذین گیاهان نر و ماده استخراج و پس از جداسازی روی ژل به غشاء نایلونی منتقل و غشاءها با کاوشگر مربوطه دورگه سازی شدند. همسانههای RaA2 و RaB17 در نمونههای RNAی بافت گل آذین هر دو گیاه نر و ماده بیان بالایی نشان دادند (شکلهای A6 و B6) ولی بیان آنها در سایر بافتها دیده نشد. با اینحال، در همسانه RaB17 علایم بیان خیلی ضعیفی در بافتهای رویشی دیده شد، که میتواند ناشی از تشابه توالی با دیگر mRNAها باشد. همسانههایRaG24 وRaK16 در همه بافتها بیان شدند (شکلهای C6 و D6). اگرچه بسته به نوع بافت، سطح بیان همسانهها تفاوتهایی نشان داد. بیان RaG24 در بافت گل آذین ماده نسبت به گیاهان نر شدیدتر بود. همه بافتهای گیاهان نر در مقایسه با بافتهای مشابه در گیاهان ماده سطح بیان پائین نشان دادند. سطح بیانRaG24 در ساقه بالاتر از میزان آن در برگها بود و میزان بیان آن در ریشهها کمترین مقدار را داشت. بیان RaK16در بافت ساقه و گل آذین گیاهان ماده بالاتر از سایر بافتها بود.

به منظور تعیین تعداد کپی این ژنها، آنالیز سادرن بلات پس از هضم با آنزیم HindIII یا EcoRI انجام گرفت (شکل7). الگوهای دورگه سازی بین گیاهان نر و ماده تفاوت دارند. این تفاوتها ممکن است مربوط به چند شکلیهایی باشد که معمولا در یک گونه دگرگشن انتظار میرود. الگوی دورگه سازی نشان از وجود یک کپی منفرد و خانواده ژنی کوچک از هر یک از ژنها در ژنوم میدهد.

شکل 6 – نوردرن بلات. مقدار 20 میکروگرم RNA از بافتهای گل آذین، برگ، ساقه و ریشه گیاهان نر (M) و ماده (F) الکتروفورز شده وسپس به غشاء نایلونی منتقل شدند و با کاوشگرهای RaA2 (A) ، RaB17 (B) ، RaG24 (C) و RaK16 (D) دورگه سازی گردید.

Figure 6- Northern blot. 20 µg RNA from inflorescence, leaf, stem and root tissues of male (M) and female (F) plants after electrophoresis were transferred to membrane. Hybridizations were carried out using RaA2 (A), RaB17 (B), RaG24 (C) and RaK16 (D) as probes.

شکل 7 – سادرن بلات. مقدار 10 میکروگرم DNA از گیاهان نر (M) و ماده (F) پس از هضم با HindIII (A، B و C) یا EcoRI (D) برای دورگه سازی مورد استفاده قرار گرفت. کاوشگرهای مورد استفاده شامل RaA2 (A)، RaB17 (B)، RaG24 (C) و RaK16 (D) بودند.

Figure 7- Southern blot. 10 µg DNA from male (M) and female (F) plants after digestion with HindIII (A, B and C) or EcoRI (D) were used for hybridization. RaA2 (A), RaB17 (B), RaG24 (C). and RaK16 (D) were used as probes.

بحث

الگوی بیان ژنهای ترشک و مقایسه توالی پروتئینی آنها با ژنهای شناخته شده از سایر گیاهان بررسی گردید. بر اساس مقایسه توالی پروتئین pRaA2، ترشک تشابه توالی بالایی با پروتئین MADSسیب (Malus domestica)، پروتئین SQUA گل میمون (Antirrhinum majus) و پروتئین AP1 علف تال (Arabidopsis) دارد. در گل میمون، پروتئین SQUA در مریستمهای گل به میزان بالایی بیان می شود و بیان آن تا مراحل بعدی ریخت زایی اعضای گل بجز در تمایز پرچم تداوم مییابد (Huijser et al., 1992). جهش در ژن SQUA باعث ایجاد گلهایی با تعداد زیاد براکت و گلهای تغییر شکل یافته و ناقص میشود (Huijser et al., 1992). در علف تال(Arabidopsis)، ژنAP1 در پریموردیاهای گل و اعضای گل مانند کاسبرگها و گلبرگها بیان میشود. بیان این ژن برای تبدیل مریستم گل آذین به مریستم گل و نیز تعیین هویت کاسبرگ و گلبرگ لازم است (Mandel et al., 1992). محصول ژنRaA2 نیز با پروتئین هومیوتیکBoiAP1 کلم Brassica oleracea (Shiraishi et al., 1993) و پروتئین SaMADS C گیاهSinapis alba (Menzel et al., 1995) مشابهت نشان میدهد. در کلم، ژنBoiAP1 در کاسبرگها، گلبرگها و در پریموردیاهای پرچم بیان میشود. ژن SaMADS C نیز همانند ژنAP1 گیاه S. alba ابتدا در پریموردیاهای گل بیان میشود (Menzel et al., 1995). آزمونهای نوردرن بلات نشان دادند که ژنA2 ترشک به میزان بالایی در گل آذینهای نر و ماده بیان میشود چرا که mRNA مربوط به ژن A2 در ریشهها، ساقهها و برگها قابل ردیابی نبود. بر اساس الگوی بیان و تشابه توالی، به نظر میرسد که ژن RaA2 در مرحله زایشی بیان و احتمالاً کارکردی همانند ژن SQUA داشته باشد. پروتئین RaB17 تشابه توالی بالایی با پروتئینهایCMB1 از Dianthus caryophyllus، PrMADS1 از Pinus radiate، یک پروتئین MADS گل میمون و پروتئینهای MdMADS1 وMdMADS8 از سیب (M. domestica) نشان داده است. ژنMdMADS1 در همه اعضای گل و میوههای جوان بجز در برگها بیان میشود (Sung and An, 1997). بیان بالاتر این ژن در مراحل اولیه نمو گل و میوه دلالت بر آن دارد که این ژن در شروع نمو اعضای زایشی نقش عمدهای ایفا میکند. آنالیز نوردرن بلات نشان داد که ژنRaB17 در زمان نمو گل به شدت بیان میشود و بیان آن در هر دو گیاه نر و ماده بیانگر آن است که این ژن در نمو گل گیاهان نر و ماده نقش دارد. پروتئینRaB17 با بعضی از ژنهای MADS که کارکرد آنها روشن نشده است، تشابه توالی دارد. پروتئین RaG24 با پروتئینهایTDR3 گوجه فرنگی (Lycopersicon esculentum) (Pnueli et al., 1991)،AGL20 علف تال،TobMADS1 توتون (Mandel et al., 1994) و SaMADS A گیاهSinapis alba (Menzel et al., 1996) بیشترین تشابه را دارد. ژنTDR3 در برگها و مریستمهای گل اما نه در اعضای گل گوجه فرنگی بیان میشود (Pnueli et al., 1991). ژنTobMADS1 در هر دو اعضای رویشی و زایشی توتون بیان میشود ولی بیان آن در برگهای بالغ و گلبرگها نسبتا پائین است (Mandel et al., 1994). بیان ژن SaMADS Aپس از القا گلدهی در مریستمهای انتهایی و در مریستمهای گل پس از نمو پریموردیاهای کاسبرگ، مشاهده شده است (Menzel et al., 1996). ژن RaG24 با ژنTobMADS1 فوقالذکر نیز تشابه بالایی دارد. پروتئین این ژن همچنین مشابه پروتئین AGL علف تال (Arabidopsis) میباشد که تشابه بالایی با پروتئین AGL14 داشته و به طور اختصاصی در ریشه بیان میشود (Rounsley et al., 1995). آزمون نوردرن بلات نشان داد که ژن RaG24 در بافتهای مختلف اعضای رویشی و زایشی بیان میشود. معمولا، بیان ژن RaG24در بافتهای گیاه ماده شدیدتر از بافتهای گیاه نر بوده و بالاترین میزان نسخهبرداری را در ساقه و گل آذین نشان میدهد. در گیاه سیلن (White Campion) بیان هر دو ژن SLM4و SLM5 در گلهای گیاه ماده نسبت به گیاه نر بیشتر بود اما میزان بیان ژنهایSLM2 وSLM3 در گلهای نر نسبت به ماده بالاتر بوده است (Hardenack et al., 1994). الگوی بیانی ژنRaG24 در اعضای رویشی و زایشی و تشابه توالی با بعضی از ژنهای خانواده MADS بیانگر آن است که این ژن در هر دو مرحله رویشی و مرحله نمو گل نقش دارد. پروتئین RaK16، همانند پروتئین AGL8، بالاترین تشابه را با پروتئین POTM1 از سیب زمینی (Solanum tuberosum) دارد که بیان آن در اعضای رویشی بالا است (Kang and Hannapel, 1995). پروتئین RaK16 نیز همانندSQUA/AP1 با پروتئین MADS5 گیاه Betula pendula، پروتئینNAP1 توتون و SLM5 سیلن (Silene latifolia) تشابه نشان داد. ژنSLM5 مشابه ژنهای SQUAو AP1 بوده و در تمام مریستم گل، و در ادامه در کاسبرگها و گلبرگها بیان میشود (Kempin et al., 1993). بیان ژن RaK16در اعضای گل دیده نشد و در بافتهای گل آذین، برگ، ساقه و ریشه مشاهده گردید. این نتایج نشان میدهد که این ژن احتمالا کارکردهای مختلفی طی نمو رویشی و زایشی دارد. آنالیز الگوهای بیان و تشابه توالی 4 ژن عضو خانواده MADS- box جدا شده از ترشک نشان داد که ژنهای RaA2 و RaB17 در نمو گل نقش داشته و ژنهای RaG24 و RaK16 در هر دو مرحله رویشی و زایشی کارکردهایی دارند، با این حال، نقش واقعی آنها را فقط میتوان با آنالیز این ژنها در گیاهان جهش یافته یا گیاهان تراریخته تعیین نمود.

منابع

1. Ainsworth C, Rahman A, Parker J, Ewards G (2005) Intersex inflorescences of Rumex acetosa demonstrate that sex determination is unique to each flower. New Phytologist 165: 711-720.
Ainsworth CC (1994) Isolation of RNA from floral tissue of Rumex acetosa (sorrel). Plant Molecular Biology Reporter 12: 198-203.
Ainsworth CC, Crossley S, Buchanan-Wollaston V, Tangavelu M, Parker J (1995) Male and female flowers of the dioecious plant sorrel show different patterns of MADS box gene expression. The Plant Cell 7: 1583-1598.
Carr SM, Irish VF (1997) Floral homeotic gene expression defines developmental arrest stages in Brassica oleracea L. vars. botrytis and italica. Planta 201: 179-188.
5. Charlesworth D (2002) Plant sex determination and sex chromosomes. Heredity 88: 94-101.
Davies B, Di Rosa E, Eneva T, Saedler H, Sommer H (1996) Alteration of tobacco floral organ identity by expression of combinations of Antirrhinum MADS box genes. The Plant Journal 10: 663-677.
Hardenack S, Ye D, Saedler H, Grant S. (1994) Comparison of MADS box gene expression in developing male and female flowers of the dioecious plant white campion. The Plant Cell 6: 1775-1787.
Henschel K, Kofuji R, Hasebe M, Saedler H, Munster T, Theissen G (2002) Two ancient classes of MIKC-type MADS-box genes are present in the moss Physcomitrella patens. Molecular Biology Evolution 19: 801-14.
Huang H, Mizukami Y, Hu Y, Ma H (1995) Isolation and characterisation of the binding sequences for the product of the Arabidopsis floral homeotic gene AGAMOUS. Nucleic Acids Research 21: 4769-4776.

10. Huijser P, Klein J, Lonnig W-E, Meijer H, Saedler H, Sommer H (1992) Bractomania, an inflorescence anomaly, is caused by the loss of function of the MADS box gene SQUAMOSA in Antirrhinum majus. The EMBO Journal 11: 1239-1249.

11. Kang SG, Hannapel DJ (1995) Nucleotide sequences of novel potato (Solanum tuberosum L.) MADS box cDNAs and their expression in vegetative organs. Gene 12: 329-330.

12. Kater MM, Colombo L, Franken J, Busscher M, Masiero S, M (1998) Multiple AGAMOUS homologues from cucumber and petunia differ in their ability to induce reproductive organ fate. The Plant Cell 10: 171-182.

13. Kempin SA, Mandel MA, Yanofsky MF (1993) Conversion of perianth into reproductive organs by ectopic expression of the tobacco floral homeotic gene NAG1. Plant Physiology 103: 1041-1046.

14. Krogan NT, Ashton NW (2000) Ancestry of plant MADS-box genes revealed by bryophyte (Physcomitrella patens) homologues. New Phytologist 147: 505-517.

15. Mandel MA, Gustafson-Brown C, Savidge B, Yanofsky MF (1992) Molecular characterisation of the Arabidopsis floral homeotic gene APETALA1. Nature 360: 273-277.

16. Mandel T, Lutziger I, Kuhlemeier CA (1994) Ubiquitously expressed MADS box gene from Nicotiana tabacum. Plant Molecular Biology 25: 319-321.

17. Martinez-Castilla LP, Alvarez-Buylla ER (2003) Adaptive evolution in the Arabidopsis MADS-box gene family inferred from its complete resolved phylogeny. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 100: 13407-13412.

18. Menzel G, Apel K, Melzer S (1995) Isolation and analysis of SaMADS C, the APETALA1 cDNA homologue from mustard. Plant Physiology 108: 853-854.

19. Menzel G, Apel K, Melzer S (1996) Identification of two MADS box genes that are expressed in the apical meristem of the long-day plant Sinapis alba in transition to flowering. The Plant Journal 9: 399-408.

20. Parenicova L, de Folter S, Kieffer M, Horner D S, Favalli C, Busscher J, Cook H E, Ingram RM, Kater MM, Davies B, Angenent G C, Colombo L (2003) Molecular and phylogenetic analyses of the complete MADS-box transcription factor family in Arabidopsis: new openings to the MADS world. Plant Cell 15: 1538-51.

21. Pnueli L, Abu-Abeid M, Zamir D, Nacken W, Schwarz-Sommer Z, Lifschitz E (1991) The MADS box gene family in tomato: temporal expression during floral development, conserved secondary structures and homology with homeotic genes from Antirrhinum and Arabidopsis. The Plant Journal 1: 255-266.

22. Riechmann JL, Meyerowitz EM (1997) MADS box proteins in plant development. Biological Chemistry 378: 1079-1101.

23. Rounsley SD, Ditta, GS, Yanofsky MF (1995) Diverse roles for MADS box genes in Arabidopsis development. The Plant Cell 7: 1259-1269.

24. Schwarz-Sommer Z, Huijser P, Nacken W, Saedler H, Sommer H (1990) Genetic control of flower development by homeotic genes in Antirrhinum majus. Science 250: 931-936.

25. Shiraishi H, Okada K, Shimura Y (1993) Nucleotide sequences recognised by the AGAMOUS MADS domain of Arabidopsis thaliana in vitro. The Plant Journal 4: 385-398.

26. Shore P, Sharrocks AD (1995) The MADS box family of transcription factors European Journal of Biochemistry 229: 1-13.

27. Singer SD, Krogan NT, Ashton NW (2007) Clues about the ancestral roles of plant MADS-box genes from a functional analysis of moss homologues. Plant Cell Rep 26: 1155-69.

28. Sung SK, An G (1997) Molecular cloning and characterisation of a MADS box cDNA clone of the Fuji apple. Plant Cell Physiology 38: 484-489.

29. Svensson ME, Engström P (2002) Closely related MADS-box genes in club moss (Lycopodium) show broad expression patterns and are structurally similar to, but phylogenetically distinct from, typical seed plant MADS-box genes. New Phytologist 154: 439-450.

30. Tanabe Y, Hasebe M, Sekimoto H, Nishiyama T, Kitani M, Henschel K, Munster T, Theissen G, Nozaki H, Ito M (2005) Characterization of MADS-box genes in charophycean green algae and its implication for the evolution of MADS-box genes. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 102: 2436-41.

31. Tanabe Y, Uchida M, Hasebe M, Ito M (2003) Characterization of the Selaginella remotifolia MADS-box gene. Journal of Plant Research 116:71-95.

32. Tanurdzic M, Banks J A (2004) Sex-determining mechanisms in land plants. The Plant Cell 16: S61-S71.

Expression study of four gene clones belonging to MADS- box family in the dioecious plant sorrel (Rumex acetosa L.)

Shakib A.M.*¹, Ainsworth C.C.²

¹ Agricultural Biotechnology Research Institute of Iran, Karaj.

²Plant Molecular Biology Laboratory, Imperial College, Wye Campus, UK.

Abstract.

Key words: MADS- box, Rumex acetosa L., dioecious plant, gene expression

* نویسنده مسئول: علی محمد شکیب تلفن: 2703536- 0261 E-mail: a_shakib@abrii.ac.ir

* Corresponding Author: Shakib Ali Mohammad Tel: 0261-2703536 E-mail: a_shakib@abrii.ac.ir

References

1. Ainsworth C, Rahman A, Parker J, Ewards G (2005) Intersex inflorescences of Rumex acetosa demonstrate that sex determination is unique to each flower. New Phytologist 165: 711-720.
Ainsworth CC (1994) Isolation of RNA from floral tissue of Rumex acetosa (sorrel). Plant Molecular Biology Reporter 12: 198-203.
Ainsworth CC, Crossley S, Buchanan-Wollaston V, Tangavelu M, Parker J (1995) Male and female flowers of the dioecious plant sorrel show different patterns of MADS box gene expression. The Plant Cell 7: 1583-1598.
Carr SM, Irish VF (1997) Floral homeotic gene expression defines developmental arrest stages in Brassica oleracea L. vars. botrytis and italica. Planta 201: 179-188.
5. Charlesworth D (2002) Plant sex determination and sex chromosomes. Heredity 88: 94-101.
Davies B, Di Rosa E, Eneva T, Saedler H, Sommer H (1996) Alteration of tobacco floral organ identity by expression of combinations of Antirrhinum MADS box genes. The Plant Journal 10: 663-677.
Hardenack S, Ye D, Saedler H, Grant S. (1994) Comparison of MADS box gene expression in developing male and female flowers of the dioecious plant white campion. The Plant Cell 6: 1775-1787.
Henschel K, Kofuji R, Hasebe M, Saedler H, Munster T, Theissen G (2002) Two ancient classes of MIKC-type MADS-box genes are present in the moss Physcomitrella patens. Molecular Biology Evolution 19: 801-14.
Huang H, Mizukami Y, Hu Y, Ma H (1995) Isolation and characterisation of the binding sequences for the product of the Arabidopsis floral homeotic gene AGAMOUS. Nucleic Acids Research 21: 4769-4776.