Document Type : Research Paper
Authors
Abstract
Keywords
موفقیت های کشاورزی مولکولی (Molecular farming) در ایران
مختار جلالی جواران1*، مهدی محبالدینی1، اسد معصومی اصل1، حیدر سیفی نبی آباد1، هوشنگ علیزاده4، فریدون مهبودی3، احمد اسماعیلی1، حمید رجبی معماری1، احمد معینی1، حسین هنری4، خدیجه باقری1، محمد مهدی یعقوبی5، علیرضا زبرجدی9، محمد جواد رسایی2، علی محمد شکیب6، فاطمه رهبری زاده2، حسین معصومی7، مهدی فروزنده مقدم2، غلامرضا شریفی سیرچی7، سبا دیمیاد1، سید احمد سادات نوری8، ندا ویشلقی1، اکبر حسینی پور7، نازنین طاهری جوان1، شهلا رزمی1، پویا رحیمی فر8، بابک لطیف1، مریم عبدلی نسب1، حامد اژدری1، مسلم پورخالقی7، آرش رزمی1، حسین خسروی1، هادی کاظمی1
1 گروه اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه تربیت مدرس
2 گروه بیوتکنولوژی، دانشکده پزشکی، دانشگاه تربیت مدرس
3 گروه بیوتکنولوژی پزشکی، انستیتو پاستور ایران
4 گروه زراعت و اصلاح نباتات، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه تهران
5 مرکز بین المللی علوم، تکنولوژی پیشرفته و علوم محیطی کرمان
6 پژوهشگاه بیوتکنولوژی کشاورزی کرج
7 دانشکده کشاورزی، دانشگاه شهید باهنر کرمان
8 پردیس ابوریحان، دانشگاه تهران
9 دانشکده کشاورزی، دانشگاه رازی کرمانشاه
چکیده
با بهره گیری از تکنولوژی زراعت ملکولی (Molecular farming) توانستهایم گیاهان را به بیوراکتور، برای تولید پروتئینهای نوترکیب ارزان قیمت، با ارزش افزوده بالا تبدیل کنیم. این تکنولوژی موفقیتهایی در زمینه تجاریسازی چند محصول اولیه بدست آورده و محصولات نوترکیب متعدد دیگری فازهای نهایی تولید را میگذرانند. طی ده سال گذشته بیش از 100 پروتئین نوترکیب در گیاهان تراریخت تولید شده و یا در حال تولید میباشد. گیاهان دارای مزایای زیادی نسبت به سایر سیستمهای بیانی، بویژه از نظر اقتصادی، ایمنی، عملیات اجرایی و تولید میباشند. اما به هر حال مشکلاتی هم در پیش رو جهت استفاده از گیاهان به عنوان رآکتورهای زیستی وجود دارد که باید بر طرف شوند. از جمله این عوامل مهم: کیفیت محصول نهایی، تخلیص و فرآوری ماکرومولکول های دارویی مشتق شده از گیاهان و همچنین ایمنی زیستی میباشد. در این بررسی سعی شده علاوه بر مرور زراعت مولکولی در جهان، به مواردی از موفقیتهای حاصل شده در این زمینه در ایران اشاره گردد. طی بیش از 8 سال تحقیق در زمینه کشاورزی ملکولی در ایران به ویژه در دانشگاه تربیت مدرس، می توان به بخشی از این موفقیت ها اشاره نمود که عبارتند از: 1- تولید آنتی بادی تک دومینی VHH در گیاهان توتون و کلزا 2- تولید پروتئین نوترکیب tPA در توتون 3- بیان ژن اینترفرون گامای انسانی در کلزا و توتون 4- انتقال ژن لوسیفراز کرم شبتاب به کلزا، توتون، بنفشه آقریقایی و ... مواردی از موفقیتهای حاصل است. پروژههای ارزشمند دیگری در زمینه انتقال ژن به کلروپلاست گیاهانی مانند توتون و کاهو در حال اجرا است که بحمدا... به موفقیتهای اولیه خوبی رسیده اند. در پروژه انتقال ژن پروانسولین به کلروپلاست، پس از تهیه سازه کلروپلاستی حاوی ژن پروانسولین، با استفاده از روش بیولستیک ژن هدف به کلروپلاست گیاه توتون منتقل گردید. سلولهای تراریخت روی محیط اسپکتینومایسین باززایی و گیاه کامل بدست آمد. گیاهان حاصله با استفاده از آغازگرهای اختصاصی و روش PCR بررسی شدند که اکثر گیاهان باززایی شده تراریخت بودند.
کلمات کلیدی: کشاورزی مولکولی، گیاهان تراریخت، پروتئین های نوترکیب، بیوراکتور.
مقدمه
هزاران سال است که بشر از گیاهان به عنوان یک منبع مواد خام و انواع داروهای گیاهی استفاده میکند. همزمان با شکل گیری اولین تمدن ها بشر از عصاره های گیاهی جهت درمان بیماری ها و تسکین دردها استفاده کرده است. از اواخر قرن هفدهم تعداد زیادی پروتئین های دارویی ارزشمند از طریق تحقیقات زیست شناسی مولکولی و پزشکی مولکولی کشف شدند. اما تاکنون تولید این مولکول ها به علت عوامل متعددی مانند عملکرد پایین تولید، کیفیت نامناسب تولید، ظرفیت پایین تولید و... گسترش نیافته است. در اواخر دهه 80 میلادی تکنولوژی تولید پروتئین وDNA نوترکیب در گیاهان، باعث کشف سیستم های بیان گیاهی شد که قادر به تولید پروتئین های دارویی ارزان تر و ایمنتر بودند. تولید زیست داروها و پروتئین های مهم کاربردی از طریق گیاهان را اصطلاحاً زراعت مولکولی " Molecular farming" گویند. کشاورزی مولکولی دارای پتانسیل بالایی در تولید نامحدود آنتی بادی های نوترکیب، واکسن ها، جایگزین های خوبی، فاکتورهای رشد و آنزیم ها میباشد (Schillberg & Fischer, 1999). هم اکنون با رشد شدید تقاضا برای پروتئین های دارویی و تشخیصی مواجه هستیم اما ظرفیت و امکانات موجود جوابگوی نیازهای مورد نظر نیست. به نظر می رسد که در سال های آینده جایگزینی بیوراکتورهای گیاهی به جای سایر سیستم ها تولید پروتئینهای نوترکیب ضروری گردد.
گیاهان تراریخت به عنوان بیورآکتورهای مفید و جالب برای تولید ارزان و فراوان یک درشت مولکول[1] نوترکیب و فعال مثل ترکیبات خونی، واکسن ها، فاکتور های رشد، آنتی بادی ها و آنزیم ها مطرح می باشند (Fischer et al., 2004). چندین پروتئین دارویی مختلف تا بحال از طریق گیاهان تراریخت تولید و تجاری شده است (Fischer & Emans, 2000; Giddings, 2001). با این وجود باید توجه کرد که پتانسیل بالای تولید پروتئین های دارویی در گیاهان فقط در صورتی محقق میشود که محصولات بدست آمده، استانداردهای کیفی لازم را داشته باشند تا بتواند از مراجع نظارتی مجوز های لازم را کسب و در آزمایش های بالینی و درمان مورد استفاده قرار گیرند. برای رسیدن به این اهداف باید فناوری های مربوط به بهبود عملکرد را از نظر کمی توسعه داده، از کیفیت و پایداری محصولات مطمئن گردیده و مراحل تخلیص و پردازش فراورده را نیز به خوبی انجام داد
.(Strasser et al., 2004)
مختصری از تاریخچه کشاورزی مولکولی
رزاعت مولکولی از زمانی مطرح گردید که اولین بار گیاهان عالی با موفقیت تراریخت شدند (Fraley et al.,1983). اولین گزارش از تولید آنتی بادی های انسانی در گیاه در سال 1988 و توسط دورینگ با عنوان بیان لیزوزیم T4 و آنتی بادی مونوکلونال در گیاهان توتون گزارش گردید (During 1988) که بعداً هیات و همکاران این آنتی بادی را به صورت ترشحی بیان کردند (Hiatt et al., 1989). اولین پروتئین دارویی نوترکیب نیز سرم آلبومین انسانی در گیاه تراریخت توتون بود (Stoger et al., 2002). البته امروزه تعداد بسیاری از آنتی بادی ها و پروتئین های نوترکیب دارویی در گیاهان بیان شده اند که برخی به مرحله تجاری سازی رسیده و برخی دیگر در مراحل اولیه (یک و دو) تولید می باشند. از جمله آویدین که در ذرت های تراریخت بیان و توسط شرکت سیگما به فروش می رسد (A8706:sigma). پروتئین
β-گلوکورونیداز (Gus) در ذرت تراریخت تولید شده G 2035: sigma و (Witcher et al., 1998) و تریپسین نیز در بذر ذرت تولید شده و هم اکنون به فروش می رسند (Woodard et al., 2005).
از مهمترین فعالیتهای انجام گرفته در زمینه رزاعت مولکولی در ایران می توان به بیان آنتی بادی منوکلونال VHH در توتون و کلزا (Rajabi-Memari et al., 2006; Ismaili et al., 2006; Dymyad, 2007)، بیان اینترفرون گامای انسانی در برگ و بذر کلزا (Bagheri, 2009; Taheri javan, 2008; Rahimi Far, 2008)، بیان پروتئین نوترکیب t-PA انسانی در توتون (Masoumi Asl, 2009) استخراج و تخلیص t-PA نوترکیب انسانی از گیاهان تراریخت توتون (Seifi Nabi Abad, 2009) اشاره کرد.
اهمیت کشاورزی مولکولی
کشاورزی مولکولی پتانسیل بالایی در تولید نامحدود پروتئین های نوترکیب (آنتی بادی ها، واکسن ها، جایگزین های خونی، فاکتورهای رشد و آنزیم ها) دارد. در حال حاضر در جهان یک پذیرش عمومی برای تولید پروتئین های نوترکیب در گیاهان بوجود آمده است
(Julian et al., 2003). هم اکنون در ایالت کنتاکی آمریکا، گیاهان توتون به کارخانههای تولید داروهای ضد سرطان تبدیل شدهاند (Julian et al., 2003). در ایالت ویرجینیا، ذرت برای معالجه بیماری Cystic Fibrosis برداشت میشود و در نبراسکا محققین امیدوارند که در مزارع، محصولاتی جهت درمان بیماری ایدز تولید کنند (Fischer & Stoger, 2004). این فعالیت ها بیش از یک دهه است که انجام میشود، اما محصولات ذکر شده مراحل نهایی فرآوری خود را به پشت سر گذاشته و وارد آزمایشات کلینیکی و فرایند تجاری شدن گردیدهاند. در حال حاضر، تعدادی از بیماران مقادیری از این گیاهان را به عنوان دارو استفاده میکنند (Gidding et al., 2000). امروزه آنتی بادیهای نوترکیب حدود 30% از تولید پروتئینهای بیولوژیک را به خود اختصاص دادهاند (Joosten et al., 2003). فروش جهانی پروتئینهای داروئی نوترکیب در سال 1995 بالغ بر 10 میلیارد دلار و در سال 2005 این رقم 16 میلیارد دلار بوده است (Fischer & Stoger, 2004). در حال حاضر حدود 20 پروتئین نوترکیب در بازار وجود دارد که 60% فروش آنها مربوط به شش پروتئین داروئی است (Ma & Hiatt, 1996). این شش پروتئین نوترکیب داروئی عبارتند از: اریتروپویتین، عامل محرک کلونی گرانولوسیت، واکسن هپاتیت B، هورمون رشد انسانی، انسولین و اینترفرون آلفا.
بیوراکتورهای گیاهی میتوانند تا 10 کیلوگرم آنتیبادی در هکتار تولید کنند. قیمت تمام شده آنتیبادی در گیاهان در مقایسه با تولید آن در بیوراکتورهای دیگر حدود یک دهم تا یک هزارم است (Gidding et al., 2000; Daniel, 2003).
مزایا و معایب تولید پروتئین های نوترکیب در گیاهان تراریخت
هزینه های تولید: مزیت عمده گیاهان تراریخت جهت تولید پروتئین های نوترکیب با هزینه پایین، تولید در حجم بالا در مقیایسه با سایر سیستمهای تولیدی می باشد. هزینه های ثابت و متغیر تولید در گیاهان به صورت معنی داری پایین تر از سیستم های تولید محصول از طریق میکروارگانیسم ها و کشت سلول های حیوانی می باشد، زیرا در سیستم های بیانی گیاهی به فرمانتور و اشخاص با تخصص و مهارت بالا برای کار با این فرمانتورها نیازی نیست (Twyman et al., 2003). تخمین زده می شود که هزینه تولید پروتئین های نوترکیب در گیاهان 10-2 درصد هزینه سیستم های میکروبی و 1/0 درصد کشت های سلولی پستانداران باشد Giddings 2001)). به طور متوسط حدود 1-1/0 درصد از پروتئین های محلول کل گیاهی مربوط به پروتئین نوترکیب مورد نظر میباشد (Hood, 2002). برای تولید و تخلیص فعال کننده پلاسمینوژن بافتی انسانی (t-PA) از گیاهان تراریخت توتون، نتایج تحقیقات ما در دانشگاه تربیت مدرس نشان داد که حدود 16/0 درصد از پروتئین های کل برگی را t-PA نوترکیب تشکیل می دهد (Seifi Nabi Abad, 2009). در هر سیستم بیانی، مقیاس پذیری یک مزیت تجاری مهم محسوب می شود. سیستم های فرمنتاسیون و حیوانات تراریخت از این نظر پتانسیل محدودی دارند، در حالی که میزان تولید از طریق گیاهان را می تواند به راحتی و با توجه به تقاضای بازار، با کم و زیاد کردن سطح زیر کشت محصولات تراریخت به سادگی تنظیم نمود (Twyman et al., 2003). سرعت بالا بردن مقیاس تولید نیز مهم است، مثلا برای افزایش 10 برابری مقیاس تولید در گله های گوسفند تراریخت (با استفاده از چرخه های اصلاحی مرسوم) زمان زیادی لازم است، در حالیکه سطح زیر کشت گیاهان تراریخت را میتوان در یک فصل زراعی تا بیشتر از 1000برابر افزایش داد (Schillberg et al., 2002).
هزینه های تولید پروتئین های نوترکیب با میزان درجه خلوص آن پروتئین در زمان مصرف ارتباط معنی داری دارد، زیرا بیش از ٪85 هزینه های تولید پروتئین های نوترکیب در گیاهان به تخلیص و فعالیت های پایین دستی آن اختصاص دارد (Twyman et al., 2003). البته برای پروتئین های دارویی که نیاز به درجه خلوص بالایی دارند، برای کاهش هزینه های پایین دستی میتوان راهکارهای زیادی اعمال کرد. از جمله این روش ها می توان به هدف گیری یا بیان پروتئین نوترکیب در یک بافت خاص مانند بذر اشاره کرد (Bagheri, 2009). هزینه های تخلیص با غلظت پروتئین نوترکیب در مواد خام رابطه معکوس دارد (Ziegelhoffer et al., 2001; Stoger et al., 2000). به عنوان مثال اگر پروتئین نوترکیب به عنوان یک ساختار همجوش دارای دامین داخل غشایی گیرنده سلول T انسانی، در گیاه بیان شود، پروتئین نوترکیب در غشاء پلاسمایی تجمع یافته و میتواند در یک حجم کوچک و با استفاده از بافرها و شوینده های مناسب استخراج شود (Twyman et al., 2003). راهکار دیگر شامل به کارگیری قابلیت برخی از بافت ها مثل ریشه و برگ برای ترشح پروتئین نوترکیب در ترشحات آنها میباشد (Borisjuk et al., 1999; Komarnytsky, 2000; Drake et al., 2003).
کیفیت پروتئین نوترکیب تولید شده در گیاهان
استفاده از گیاهان برای تولید پروتئین های دارویی نسبت به سیستم های میکروبی و حیوانی ایمن تر میباشد (Jalali Javaran et al., 2008). زیرا معمولاً گیاهان فاقد عوامل بیماریزای انسانی، توالی های DNA انکوژن و اندوتوکسین ها می باشند (Commandeur et al., 2003). به هر حال لازم است که ایمنی ذاتی پروتئین های انسانی تولید شده از طریق گیاهان مورد توجه قرار گیرد، زیرا صحت ساختاری این پروتئین ها برای فعالیت های درون سلولی (in vivo) بسیار مهم می باشد (Strasser et al., 2004). مسیر سنتز پروتئین در گیاهان و حیوانات مشابه می باشد طوری که گیاهان قابلیت بسته بندی[2] و سرهم کردن[3] پروتئین های نوترکیب انسانی را دارا می باشند (Twyman et al., 2003)، اما در باکتری ها این فعالیت ها به خوبی صورت نگرفته و موجب تشکیل انکلوژن بادی های غیر محلول می شود. این قابلیت گیاهان زمانی مشخص شد که گیاهان تراریخت قادر به تولید آنتی بادی های سرم فعال (شامل چهار زنجیر پلی پپتیدی که به صورت پیوند کوالانسی دی سولفیدی به هم وصل شده اند) گردیدند (Stoger et al., 2002; Schillberg et al., 2005). گرچه مسیر سنتز پروتئین ها در حیوانات و گیاهان یکسان است اما تغییرات پس از ترجمه مقداری متفاوت می باشد، که عمده این تفاوت ها در ساختار زنجیره گلیکان[4] می باشد. پروتئین های نوترکیب تولید شده از طریق گیاهان معمولاً دارای گروه های کربوهیدرات β(1-2)Xylase و α(1-3)-Fucose می باشند که این نوع زنجیره های قندی در پستانداران وجود ندارد (Twyman et al., 2003). بعلاوه پروتئین های نوترکیب تولید شده از طریق گیاهان فاقد گالاکتوز و اسید سیالیک انتهایی (که در گلیکوپروتئین های انسانی به صورت طبیعی) می باشند. تفاوت های خیلی کوچک در ساختارهای گلیکان می تواند در فعالیت و پایداری پروتئین اثر گذاشته و حتی اگر پروتئین نوترکیبی که در گیاه تولید می شود به صورت صحیح (شکل انسانی) آن گلیکوزیله نشود، بعد از مصرف می تواند به صورت ایمونوژنیک عمل کرده و اثرات مخربی داشته باشد.
راهکارهای مناسب برای دستکاری مسیر گلیکوزیلاسیون به منظور تولید پروتئین های نوترکیب مشابه با انواع انسانی در گیاهان وجود دارد (Warner, 2000). مهمترین این روش ها عبارتند از: 1- استفاده از آنزیم های تخلیص شده β(1-4) گالاکتوزیل ترانسفراز[5] و سیالیل ترانسفراز[6] برای ایجاد تغییرات درون شیشه (in vitro) در پروتئین های نوترکیب حاصله از گیاهان تراریخت (Blixt et al., 2002). 2- بیان همزمان β(1-4) گالاکتوزیل ترانسفراز انسانی با تراریختی مورد نظر در گیاهان تراریخت (Twyman et al., 2003). افزودن برخی گروه های کربوهیدراتی دارای اسید سیالیک (سیالیلاسیون) در شرایط درون سلولی برای گیاهان سخت تر می باشد، زیرا گیاهان پیش سازهای متابولیکی که قادر به تولید این گروه های کربوهیدراتی باشند، را ندارند. برای حل این مشکل معمولاً گروه های کربوهیدراتی را مستقیم اضافه می کنند. البته مشکل برداشتن کربوهیدرات های ویژه گیاهی همچنان وجود دارد. با استفاده از آنتی بادی ها، ریبوزیم ها و یا RNAi (مداخله گر) می توان مشکل بازدارندگی آنزیم های فکوزیل ترانسفراز[7] و زایلیل ترانسفراز[8] را حل کرد (Twyman et al., 2003).
راهکارهای مناسب دیگر برای دستکاری مسیر گلیکوزیلاسیون و جلوگیری از اضافه شدن N - گلیکان های ایمنی زا به پروتئین های داروئی تولید شده در گیاه، ذخیره پروتئین داروئی درون شبکه آندوپلاسمی است. کارائی این استراتژی اخیرا اثبات شده است که از طریق افزودن سیگنال KDEL به انتهای کربوکسی ژن بوده است (Masoumi Asl et al., 2009).
افزایش میزان بیان پروتئین های نوترکیب در گیاهان
از مهمترین فاکتورهایی که تجاری بودن کشاورزی مولکولی را تعیین می کنند، رسیدن به یک عملکرد مناسب جهت تولید پروتئین های نوترکیب میباشد (Jalali Javaran et al., 2008; Jalali Javaran et al., 2009)، برای بالا بردن عملکرد تولید پروتئین های نوترکیب در گیاهان میتوان از روشهای زیر استفاده کرد:
الف-بالا بردن بیان ژن منتقل شده برای رسیدن به این هدف معمولاً سعی می شود از پیش برنده های قوی استفاده شود. برای گیاهان دو لپه ی اغلب از پیش برنده 35S ویروس موزاییک گل کلم (CaMv 35s) استفاده می شود Christensen & Quail, 1996)). در غلات پیشبرنده CaMv 35S فعالیت کمتری دارد، بنابر این از پیشبرنده یوبی کویتین-1[9](ubi-1) ذرت استفاده می شود (Christensen & Quail, 1996). همچنین میزان رونویسی در غلات با افزودن یک اینترون به ژن منتقل شده افزایش می یابد. این پدیده، افزایش بیان بواسطه – اینترون نامیده می شود (Vain et al., 1996). پیشبرنده های تنظیمی نسبت به انواع پیوسته از لحاظ عملکردی و ایمنی ارجحیت دارند. به عنوان مثال اگر چه پیشبرنده های با بیان مداوم موجب ذخیره پروتئین های نوترکیب زیادی در بذر می شود، با این حال پروتئین در همه بخش های گیاهی شامل برگ، ریشه و گرده نیز بیان می شود. در این حالت ممکن است گیاهخواران، حشرات گرده افشان و میکروارگانیسم های تحت تاثیر این پروتئین های نوترکیب قرار گیرند. محدود کردن این پروتئین ها در بذر از این خطرات می کاهد (Commandeur et al., 2003; Stoger et al., 2002 Bagheri, 2009;). همچنین می توان پیشبرنده های القایی را به کار گرفت تا بیان پروتئین فقط بعد از برداشت محصول صورت گیرد (Zuo & Chua, 2000; Cramer et al., 1999).
ب-هدف گیری پروتئین نوترکیب به بافت مشخص
گر چه از هدف گیری پروتئین بیشتر به عنوان تسهیل کننده تخلیص پروتئین های نوترکیب یاد می شود، اما تکنیک هدف گیری پروتئین نوترکیب می تواند برای افزایش عملکرد پروتئین های نوترکیب هم استفاده شود. در این روش با ذخیره شدن پروتئین نوترکیب در اجزای سلولی فرایند های بسته بندی، سرهم شدن و تغییرات پس از ترجمه آنها هم تحت تاثیر قرار می گیرد که در نهایت همه این فاکتورها پایداری پروتئین و در نتیجه عملکرد را تحت تاثیر قرار می دهد (Schillberg et al., Bagheri, 2009; 2002). آزمایشات هدفگیری به صورت مقایسه ایمونوگلوبولین های با اندازه کامل و قطعات Fv تک زنجیره ای نشان داد که مسیر ترشحی نسبت به ذخیره سیتوزولی برای بسته بندی پروتئین ها مناسب تر بوده و برای ذخیره پروتئین در سطح بالا مزایای بیشتری دارد (Zimmermann et al., 1998; Schillberg et al., 1999 ). بسیاری از پروتئین های نوترکیب تولیدی از طریق گیاهان تراریخت از نوع پروتئین های انسانی می باشند و این پروتئین ها در بدن خود انسان معمولاً از سیستم غشاء داخلی عبور می کنند، از این اصل برای تولید پروتئین های نوترکیب از طریق گیاهان هم استفاده می شود. شبکه اندوپلاسمی (ER) محیطی اکسید کننده (Oxidizing) با مقدار زیادی از پروتئین های چاپرونی می باشد که میزان پروتئازها در آن پایین می باشد. آنتی بادی هایی که از سیستم ترشحی گیاهان تراریخت عبور می کنند با چاپرون های مثل انواع Bip عکس العمل نشان می دهند (Nuttall et al., 2002). بنابراین توالی اسیدآمینه ای H/KDEL به انتهای C پروتئین نوترکیب افزوده می شود تا پروتئین با داشتن این سیگنال پپتیدی در شبکه اندوپلاسمی باقی بماند. این روش موجب انباشت 10-2 برابری پروتئین در مقایسه با زمانی که این سیگنال استفاده نشده است، گردید (Conrad & Fiedler, 1998). از مزایای دیگر سیگنال پپتیدی و انباشت پروتئین ها در شبکه اندوپلاسمی ERاین است که پروتئین نوترکیب در اجسام گلژی تغییری پیدا نمی کند (Conrad & Fiedler, 1998).
ج- بیان ژن پروتئین های نوترکیب در کلروپلاست گیاهان
یکی از اهداف انتقال ژِن به کلروپلاست افزایش بیان پروتئین های نوترکیب می باشد (Daniell et al., 2002). انتقال ژن به کلروپلاست در مقایسه با انتقال ژن به هسته توتون مشاهده گردید که میزان تولید بسیار بالاتر می باشد. به منظور تولید هورمون رشد انسانی، مشاهده گردید که با انتقال ژن به کلروپلاست، هورمون رشد تا ٪8 پروتئین های محلول کل را تشکیل می دهد. در گزارش دیگری، توکسین Tetanus بیشتر از ٪25 پروتئین های محلول را تشکیل می داد (Daniell et al., 2001; Tregoning et al., 2003 ). اما باید توجه کرد که استفاده از کلروپلاست و یا در کل اندامک های پلاستیدی برای کشاورزی مولکولی محدودیت هایی دارد، ازجمله اینکه کلروپلاست قادر به انجام تغییرات پس از ترجمه نیست (Daniell et al., 2002). همچنین نگرانی های ایمنی زیستی مثل انتقال افقی ژن از کلروپلاست به باکتریها نیز در شرایط آزمایشگاهی وجود دارد (Kay et al., 2002). به همین علت راهکاری که می توان اعمال کرد این است که انتقال ژن به هسته صورت گیرد اما از یک توالی سیگنالی جهت هدف گیری پروتئین به کلروپلاست استفاده شود (Jobling et al., 2003).
ایمنی زیستی کشاورزی مولکولی در مقایسه با سیستم های سنتی
خطری که معمولاً هنگام تولید محصول در سایر سیستم ها از قبیل باکتری و حیوانات تراریخت وجود دارد، عوامل بیماریزای مشترک بین انسان و گیاه وجود ندارد.
معمولاً خطرات گیاهان تراریخت را به دو دسته تقسیم می کنند (Commanderur et al., 2003). اول خطراتی که متوجه محیط زیست و سایر ارگانیسم ها می باشد. دوم خطراتی است که خود انسان را بطور مستقیم تحت تاثیر قرار می دهند.
الف- مشکلات آلودگی تراریخت ها آلودگی تراریختی به معنی گسترش تراریخت ها به خارج از میزبان های بواسطه مکانیسم های طبیعی است که به آن، جریان ژن(Gene folwe) اطلاق می شود این جریان می تواند به اعضاء غیر تراریخت همان گونه و یا حتی گونه های وابسته وحشی صورت گیرد. این پدیده خیلی مهم می باشد چون از طرفی با ورود تراریختی به سایر موجودات می تواند اثرات مخربی روی محیط زیست داشته باشد و از طرف دیگر باعث به هم خوردن ژنوم گونه های آلوده (بویژه بهم زدن ژنوم گونه های وحشی) شود. همچنین احتمال گسترش ژن های نشانگر انتخابی وجود دارد. مثلاً ژن های انتخابگر مقاومت به علف کش از گیاهان تراریخت به گونه های علف هرز وارد شود و یا ژن های انتخابی مقاومت به آنتی بیوتیک ها وارد پاتوژن های انسانی و حیوانی شوند (Commanderur et al., 2003). برای کاهش این مشکلات یکی از راه های پیشنهادی؛ استفاده از نوترکیبی اختصاصی- جایگاه [10] برای حذف ژن های نشانگر انتخابی می باشد تا بعد از انجام تراریختی این ژن ها حذف شوند. مکانیسم ساده آن هم بدین صورت است که از سیستم Cre-loxP استفاده می شود. در این روش Cre یک آنزیم نوترکیب می باشد که یک توالی نوکلئوتیدی کوتاه به نام loxPرا تشخیص می دهد. اگر دو جایگاه loxP یک جهت داشته باشند، آنزیم Cre هر نوع توالی بین آنها را خارج می سازد. بنابراین اگر هنگام انتقال ژن، ساختار ژنی[11] به گونه ای طراحی شود که ژنهای انتخابگر بین دو جایگاه loxP همسو قرار گیرند و نیز خود ژن Cre را نیز وارد گیاه کنیم، می تواند ژن های انتخابگر را حذف کند (Gleave et al., 1999).
پروتئین های انسانی نوترکیب که از طریق گیاهان تولید می شوند، می توانند اثرات منفی روی سایر ارگانیسم ها مثل حشرات، حیوانات و میکروارگانیسم ها داشته باشند. این اثرات می تواند سمیت مستقیم باشد یا اینکه این پروتئین ها در زنجیره غذایی انباشته شده و موجوداتی را هم که تماس غیر مستقیم با گیاهان تراریخت دارند را آلوده سازد (Commanderur et al., 2003). راه کارهای غلبه بر این مشکل عبارتند از: 1- کنترل بیان ژن: برای مثال از پیشبرندهای اختصاصی بذر یا میوه استفاده شود تا از مصرف پروتئین توسط موجوداتی که از بافت های سبز استفاده می کنند جلوگیری کند و یا استفاده از تراریختها القایی به گونه ی که فقط وقتی تراریخت تحت یک ماده شیمیایی خاص قرار گرفت بیان شود (Zuo & Chua, 2000). 2- کنترل فعالیت پروتئین نوترکیب: به این منظور پیشنهاد می شود که پروتئین های نوترکیب به صورت پیش سازهای غیر فعال تولید شوند. در این روش بعد از تخلیص، پروتئین های نوترکیب تولید شده با تغییراتی مثل هضم پروتئولیتیک می توانند فعال شوند.
ب- ایمنی محصول نوترکیب
مطالب قبل بیشتر بر اثرات مخرب پروتئین های نوترکیب بر میزبان های غیر هدف آنها اشاره داشت. اما زمانی که این پروتئین ها (بویژه انواع دارویی آنها) مصرف می شوند ممکن است بر خود انسان اثرات سوئی داشته باشند. به عنوان مثال پروتئین تخلیص شده دارای آلودگی هایی مثل توکسین ها و مواد حساسیت زای گیاهی باشد. همچنین خود پروتئین به دلیل ویژگی های ذاتی آن می تواند مضر باشد. زیرا پروتئینی که از طریق گیاه تولید شده چون شرایط تولید آن مقداری با بدن انسان فرق می کند، پروتئین ممکن است ویژگی های اصلی خودش را نداشته باشد. مثلاً اگر پروتئین به درستی گلیکوزیله نشود می تواند سیستم ایمنی فرد را تحریک کند (chargelegue et al., 2000).
فرایندهای استخراج و استحصال پروتئین های نوترکیب
این فرایندها عمدتاً شامل تخلیص و فرآوری پروتئین نوترکیب تولید شده می باشد. گر چه همه پروتئین های نوترکیب تولید شده در گیاهان تراریخت به تخلیص نیاز ندارند، اما آنهایی هم که باید تخلیص شوند بسته به نوع کاربرد، حداقل درصد متفاوتی از خلوص را باید داشته باشند (Schillberg et al., 2005). در مورد پروتئین هایی که به صورت تزریق داخل رگی مصرف می شوند (مثل t-PA) این خلوص حتی تا 100 درصد هم ضروری است. گرچه بیان پروتئین در سطح بالا برای عملکرد مناسب سیستم های بیانی گیاهی ضروری است، اما تخلیص پروتئین های نوترکیب نیز بایستی بهینه شود (Ficher et al., 2004). روش های مختلفی برای تخلیص وجود دارد که عمدتاً بر پایه تکنیک های کروماتوگرافی می باشند. در این میان استفاده از کروماتوگرافی تمایلی[12] اختصاصیت بیشتری دارد. به همین علت باید با مطالعه دقیق بیوشیمیایی پروتئین مورد نظر لیگاندهای تمایلی مناسب را طراحی کرد. به عنوان مثال برای تخلیص t-PA نوترکیب از توتون (با توجه به خاصیت تمایلی t-PA به اسید آمینه لیزین) از ستون های کروماتوگرافی لیزین سفارز استفاده کردیم که کارایی خیلی خوبی را نشان داد (Seifi Nabi Abad, 2009). البته امروزه برای راحتی کار از روش های همجوشی بهره می گیرند (Schillberg et al., 2005). عمده این روش ها، استفاده از همجوشی 6 اسیدآمینه هیستیدینی[13] با پروتئین مورد نظر هنگام انتقال ژن می باشد که در نهایت از کروماتوگرافی نیکل سفارز برای تخلیص استفاده می شود (Schillberg et al., 2005).
برخی از مهمترین فعالیت های انجام شده در زمینه کشاورزی مولکولی در ایران
الف- بیان آنتی بادی مونوکلونال VHH علیه آنتی ژن MUC1 در گیاهان توتون
تولید آنتی بادی و یا قطعات آنتی بادی از طریق گیاهان تراریخت توسط آزمایشگاه های متعددی گزارش شده است (Larich et al., 2001; Hood et al.,2002; Schilberg et al., 2002; Srogert et al., 2002b; Rajabi-Memari et al., 2006; Ismaili et al., 2006). با توجه به کاربردهای گسترده تشخیصی و درمانی آنتی بادیهای مونوکلونال، تولید آنها از منابع دائمی، ایمن و ارزان حائز اهمیت می باشد. از جمله، می توان به آنتی بادی مونوکلونال تک دومنی(VHH) با منشاء شتری اشاره نمود که به دلیل دارا بودن ویژگی هایی از جمله: تشابه بسیار بالا با زنجیره سنگین آنتی بادیهای انسانی، حلالیت، تمایل و اتصال اختصاصی به آنتی ژن، بر دیگر انواع آنتی بادیها ترجیح داده می شود. آنتی بادی مونوکلونال علیه آنتی ژن MUC1 در سال 2004 از منشأ شتر یک و دو کوهانه تهیه گردید (Rahbarizadeh et al., 2004). این آنتیبادی تک دومنی دارای خواص حلالیت، اتصال اختصاصی به آنتیژن و تمایل (Affinity) خوبی می باشد. با توجه به اهمیت آنتی بادی تک دومنی VHH در تشخیص و درمان بسیاری از بیماری های سرطانی و هزینه بسیار بالای تولید آن با استفاده از سایر روشها (از جمله حیوانات تراریخته، سلولهای هیبریدوما و ...)، تولید آن در گیاهان مورد توجه قرار گرفت و در گیاه توتون با موفقیت انجام شد (Rajabi-Memari et al., 2006; Ismaili et al., 2006).
در این مطالعه، آنتی بادی تک دومنی VHH بر علیه آنتی ژن MUC1 در گیاهان توتون به عنوان یک سیستم بیانی مناسب و اقتصادی تولید شد. این ژن تحت کنترل پیشبرنده CaMV 35S و خاتمه دهنده NOS قرار گرفت. توالی افزایش دهنده (Kozak) برای بالا بردن بیان به انتهای '5 ژن VHH با منشاء شتر یک کوهانه (Camelus dromdarius) اضافه شد. سازه ساخته شده ) (pBIVHHبه اگروباکتریوم منتقل و سپس ژن VHH بواسطه اگروباکتریوم وارد ژنوم توتون گردید. آنالیز گیاهان تراریخت با PCR، الایزا و وسترن بلات صورت پذیرفت و مشخص گردید که ژنVHH در گیاهان تراریخت توتون در حال بیان است. میزان بیان ٪63/1-12/1 از کل پروتئین های محلول را تشکیل می دهد. این مطالعه، اولین گزارش از تولید این آنتی بادی در توتون بود (Rajabi-Memari et al., 2006).
همچنین ژن VHH با منشاء شتر دو کوهانه (Camelus bactrianus) به گیاهان توتون منتقل شد. آنالیز گیاهان تراریخت با PCR ، الایزا و وسترن بلات نشان می داد که ژنVHH در گیاهان در حال بیان است. بعلاوه نتایج الایزا با آنتی ژن های MUC1 و ایمونوسیتوشیمی با لاین های سلولی سرطانی فعالیت آنتی بادی تولید شده را تایید کرد. نتایج همچنین نشان داد که فعالیت و تمایل آنتی بادی VHH بیان شده در گیاهان نسبت به آنتی بادی تولید شده در باکتری و مخمر بالاتر می باشد (Ismaili et al., 2006).
ب- بیان آنتی بادی مونوکلونال VHH علیه آنتی ژن MUC1 در گیاه کلزا
(Brassica napus L.)
در این پژوهش، سازه حاوی ژن VHH با استفاده از آگروباکتریوم نژاد LBA4404 به گیاهان کلزا منتقل گردید و گیاهان تراریخت بر روی محیط کشت انتخابی حاوی آنتیبیوتیکهای کانامایسین باززایی شدند. آنالیز ملکولی بر روی DNA ژنومی گیاهان تراریخت با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن VHH و تکنیک PCR صورت گرفت. این پژوهش اولین گزارش از انتقال ژن آنتیبادی نوترکیب به کلزا و فراهم نمودن زمینه مناسب در جهت تولید سایر پروتئینهای نوترکیب در این گیاه می باشد (Dymyad, 2007).
ج- بیان ژن اینترفرون گامای انسانی(IFNγ) در بذر کلزای تراریخت
پروتئین IFNγ برای درمان بیماران با نقص مادرزادی و همچنین عوامل عفونی درون سلولی مانند لیشمانیا (Assreury et al., 1994) و سالمونلا تیفوموریوم (Nauciel & Espinasse-Maes, 1992) کاربرد دارد. از آن در درمان سرطان های مختلف از جمله نوروبلاستوما استفاده گردید (Seeger et al., 1998) و ملانوما (Abdel-Wahab et al., 1997) نیز کاربرد گسترده ای پیدا کرده است. همان طور که قبلاً اشاره شد هدف گیری پروتئین به بافت یا اندامک خاص در بهبود عملکرد و افزایش کارایی تخلیص راهکار مهمی می باشد. در همین راستا انتقال ژن IFNγ به اجسام روغنی بذر گیاهان کلزا صورت گرفت (Bagheri, 2009). زیرا با توجه به مقدار بالای تری اسیل گلیسروئید (TAGs) در اجسام روغنی، این بخش به راحتی با استفاده از سانتریفوژ از دیگر پروتئین های بذر و اجزای سلولی جدا میشود (Murphy, 1990). در ارزیابی کارآیی این روش مشخص شده که بیش از 90% از پروتئین های بذری حذف میشوند. به این ترتیب خالصسازی پروتئین نوترکیب با هزینه کمتر و سهولت بیشتری صورت میگیرد (Boothe, 1997). به منظور تولید پروتئین نوترکیب اینترفرون گاما در کلزا و ذخیره آن در بذر سه نوع سازه ساخته شد(Bagheri, 2009):
الف- طراحی و ساخت سازه ترکیبی اولئوسین - اینترفرون گاما و انتقال آن به بذر گیاه کلزا: استفاده از ژن اولئوسین گیاهی یک روش مطلوب به منظور استخراج راحت تر تولید پروتئین نوترکیب در مقیاس زیاد و ارزان تر می باشد. اتصال اولئوسین به ژن مورد نظر و استفاده از پیشبرنده اختصاصی بذر Napin، موجب هدف گیری پروتئین نوترکیب به اجسام روغنی در بذر می شود. در این تحقیق، سازه ترکیبی اینترفرون گاما- اولئوسین برای تولید پروتئین اینترفرون گامای انسانی در بذر گیاه کلزا طراحی و ساخته شد. برای این منظور ابتدا ژن اولئوسین با استفاده از آغازگرهای اختصاصی از ژنوم گیاه کلزا جداسازی شده و در ناقل بیانی گیاهی pBI121 همسانه سازی شد. سپس ژن اینترفرون گاما در پائین دست ژن اولئوسین قرار داده شد و بین این دو ژن توالی برشی پروتئولایتیکی جهت جداسازی دو پروتئین بعد از مراحل تخلیص تعبیه گردید. مجموعه این دو ژن تحت کنترل پیشبرنده بذری Napin قرار گرفت. ناقل pBI121 حاوی سازه مورد نظر با استفاده از اگروباکتریوم سویه LBA4404 برای تراریختی گیاه کلزا با بهره گیری از ریزنمونه های کوتیلدون استفاده شد. گزینش نوساقه های باززایی شده در محیط انتخابی حاوی کانامایسین انجام شد. آنالیز بذور تراریخته نسل اول (T0) با PCR بیانگر انتقال ژن IFN γ و آزمون RT-PCR) نشان دهنده رونویسی ژن IFN γبود (Bagheri, 2009).
ب- طراحی و تهیه سازه حاوی ژن اینترفرون گاما و توالی KDEL و بیان آن در بذر گیاه کلزا: در این سازه ژن اینترفرون گاما بدون اولئوسین و فقط تحت پیشبرنده Napin به گیاهان کلزا منتقل شد. در این تحقیق برای بیان اینترفرون گامای انسانی در بذر گیاه کلزا و قرار گرفتن آن در شبکه آندوپلاسمی از پیشبرنده اختصاصی بذر (Napin) و توالی KDEL در انتهای کربوکسیلی ژن اینترفرون گامای انسانی استفاده شد. ژن اینترفرون گاما ابتدا در ناقل pGEM®-T Easy کلون و پس از تایید صحت آن با استفاده از روش PCR، هضم آنزیمی و توالی یابی، قطعه مورد نظر در ناقل بیانی گیاهی pBI121 ساب کلون گردید. ناقل نوترکیبpBI IFNγ با روش انجماد و ذوب به اگروباکتریوم سویه LBA4404 انتقال و این باکتری برای تراریختی گیاه کلزا از طریق ریزنمونه های کوتیلدونی مورد استفاده قرار گرفت. گزینش نوساقه های باززائی شده در محیط انتخابی حاوی آنتی بیوتیک (کانامایسین) انجام شد. آنالیز گیاهان تراریخت در سطح DNA با استفاده از PCR و در سطح پروتئین با استفاده از SDS-PAGE، دات بلات و وسترن بلات بیانگر انتقال موفقیت آمیز ژن IFNγ و بیان پروتئین نوترکیب بود. همچنین حضور پروتئین اینترفرون تولید شده در گیاهان با تست ELISA تائید شد (Bagheri, 2009).
ج- بیان ژن اینترفرون گامای انسانی در گیاه کلزا: در این سازه ژن اینترفرون گاما بدون اولئوسین و فقط تحت پیشبرنده Napin به گیاهان کلزا منتقل شد. ژن اینترفرون گاما ابتدا در ناقل pGEM®-T Easy کلون و پس از تایید صحت آن با استفاده از روش PCR، هضم آنزیمی و توالی یابی، قطعه موردنظر در ناقل بیانی گیاهی pBI121 ساب کلون گردید. ناقل نوترکیبpBI IFNγ با روش انجماد و ذوب به اگروباکتریوم سویه LBA4404 انتقال و این باکتری برای تراریختی گیاه کلزا از طریق ریزنمونه های کوتیلدونی مورد استفاده قرار گرفت. گزینش نوساقه های باززائی شده در محیط انتخابی حاوی آنتی بیوتیک (کانامایسین) انجام شد. آنالیز گیاهان تراریخت در سطح DNA با استفاده از PCR و در سطح پروتئین با استفاده از SDS-PAGE بیانگر انتقال موفقیت آمیز ژن IFNγ و بیان پروتئین نوترکیب بود (Taheri Javan, 2008).
د- انتقال ژن اینترفرون گامای انسانی (به همراه Kozak )در گیاه کلزا: در این سازه ژن اینترفرون گاما بدون اولئوسین و فقط تحت پیشبرنده Napin به همراه توالی Kozak به گیاه کلزا منتقل شد. در این تحقیق برای افزایش بیان اینترفرون گامای انسانی در گیاه کلزا توالی Kozak در مجاورت ژن اینترفرون گامای انسانی قرار داده شد. ژن اینترفرون گاما ابتدا در ناقل pGEM®-T Easy کلون و پس از تایید صحت آن با استفاده از روش PCR، هضم آنزیمی و توالی یابی، قطعه موردنظر در ناقل بیانی گیاهی pBI121 ساب کلون گردید. ناقل نوترکیبpBI IFNγ با روش انجماد و ذوب به اگروباکتریوم سویه LBA4404 انتقال و این باکتری برای تراریختی گیاه کلزا از طریق ریزنمونه های کوتیلدونی مورد استفاده قرار گرفت. گزینش نوساقه های باززائی شده در محیط انتخابی حاوی آنتی بیوتیک (کانامایسین) انجام شد. آنالیز گیاهان تراریخت در سطح DNA با استفاده از PCR بیانگر انتقال موفقیت آمیز ژن IFNγ بود (Rahimi Far, 2008).
ر- انتقال ژن اینترفرون گامای انسانی به گیاه توتون: در این سازه ژن اینترفرون گاما بدون اولئوسین و فقط تحت پیشبرنده CaMV 35S به همراه توالی افزایش دهنده بیانی Kozak و توالی HisTag به گیاه توتون منتقل شد. در این تحقیق برای افزایش بیان ژن اینترفرون گامای انسانی در گیاه توتون از توالی Kozak و برای راحتی تخلیص از توالی HisTag استفاده شد. سازه فوق در ناقل بیانی گیاهی pCAMBIA1304 همسانه سازی شده و سپس صحت آن با استفاده از روش PCR، هضم آنزیمی و توالی یابی قطعه موردنظر تایید گردید. ناقل نوترکیبpCAMBIA1304 IFNγ با روش انجماد و ذوب به اگروباکتریوم سویه LBA4404 انتقال و این باکتری برای تراریختی گیاه توتون از طریق ریزنمونه های برگی مورد استفاده قرار گرفت. گزینش نوساقه های باززائی شده در محیط انتخابی حاوی آنتی بیوتیک (هیگرومایسین) انجام شد. آنالیز گیاهان تراریخت در سطح DNA با استفاده از PCR بیانگر انتقال موفقیت آمیز ژن IFNγ بود (Azhdari, 2009).
بیان ژن انسانی فعال کننده پلاسمینوژن بافتی (tPA) در گیاه توتون
بیماری های قلبی- عروقی مثل سکته، حمله میوکاردیال حاد و ترومبوامبولیسم وریدی احتمالا اصلی ترین عامل مرگ و میر در جمعیت انسانی می باشند. مهمترین عامل موثر در این شرایط، اغلب انسداد لخته ای در رگ های خونی مهم می باشد که موجب نرسیدن خون به اندام های حیاتی مانند قلب و مغز می گردد. یک دیدگاه درمانی ترومبوز، تزریق داخل وریدی فعال کننده های پلاسمینوژن به عنوان داروی حل کننده لخته خون می باشد (Collen & Lijnen, 1991). مشخص شده است که فعال کننده های پلاسمینوژن نقش مهمی در سیستم فیبرینولیتیک دارند. این آنزیم ها قادر به تبدیل پلاسمینوژن به فرم فعال کاتالیتیک آن (پلاسمین) می باشند که شبکه فیبرینی همراه با لخته های خونی را تخریب می کند(Brown & Tyrell, 1985; Mosher, 1990). پروتئین tPA، فعال کننده اصلی پلاسمینوژن در خون می باشد که موجب باز شدن لخته های خونی داخل رگها می شود و به همین علت یکی از داروهای مهمی می باشد. بدلیل قیمت بسیار بالا و کمبود این دارو در ایران، تصمیم گرفته شد تا امکان تولید آن در گیاهان با همکاری دانشگاه تربیت مدرس و انستیتو پاستور ایران بررسی شود. در یک پروژه تحقیقاتی cDNA ژن t-PA انسانی تحت کنترل پیشبرنده CaMV 35S و خاتمه دهنده NOS قرار گرفت. توالی افزایش دهنده Kozak و ترادف رمز کننده پپتید نشانه (KDEL)، به ترتیب به دو انتهای آمینی و کربوکسیلی ژن tPA اضافه شدند. سازه تهیه شده(pBI(tPA به روش انتقال ژن مبتنی بر اگروباکتریوم به ژنوم گیاه توتون منتقل و گیاهان تراریخت روی محیط حاوی کانامایسین انتخاب شدند. ارزیابی گیاهان تراریخت با استفاده از روش های RT-PCR، SDS-PAGE ، زیموگرافی و وسترن بلات انجام شده و کلیه این آزمایش ها نشان داد که نه تنها ژن هدف (tPA) به گیاهان توتون منتقل شده، بلکه به نحو مطلوب و فعالی در گیاهان تراریخت بیان می شود (Masoumi Asl et al., 2007). پس از اطمینان از بیان t-PA در گیاهان تراریخت نسل T0، در مطالعه دیگری گیاهان تراریخت نسل T1هم آنالیز شدند. در نهایت بعد از مطالعات خصوصیات بیوشیمیایی t-PA، اقدام به تخلیص پروتئین نوترکیب tPA از گیاهان توتون تراریخت گردید. فرایند تخلیص با طراحی ستون های کروماتوگرافی تمایلی لیزین سفارز و در ادامه با استفاده از کروماتوگرافی فیلتراسیون ژلی صورت گرفت. با استفاده از ژل SDS-PAGE بیان اولیه ژن و با استفاده از آزمون زیموگرافی فعالیت tPAتخلیص شده از گیاهان تراریخت توتون تعیین گردید. نتایج بیانگر تخلیص مناسب tPA فعال از گیاهان توتون تراریخت بود که اولین گزارش از تولید و تخلیص tPA از طریق گیاهان تراریخت می باشد (Seifi Nabi Abad, 2009).
تظاهر ژن PA از Bacillus antracis در کاهوی ایرانی
سیاه زخم بیماری مهلک مشترک بین دام و انسان بوده و ژن PA (Protective Antigene) از Bacillus antracis دارای بیشترین پتانسیل برای تهیه واکسن علیه سیاه زخم می باشد. گیاه کاهو با توجه به نوع مصرف و وزن تازه آن دارای پتانسیل مطلوب برای تبدیل شدن به یک بیوراکتور جهت تولید پروتئین های نوترکیب و واکسن های خوراکی است. هدف از این تحقیق ایجاد بستر لازم برای تولید واکسن در گیاه کاهو بود که ابتدا شرایط بهینه کشت بافت و باززایی این گیاه را بدست آورده و سپس با استفاده از اگروباکتریوم و تفنگ ژنی ژن های گزارشگر و سازه های هسته ای و کلروپلاستی به این گیاه انتقال داده شد. بیان ژن گزارشگر Gus و ژن های PAو nptII در گیاهان نسل های اول و دوم با استفاده از PCR و RT-PCR بررسی و نشان داده شد که حداقل یک نسخه از ژن های Gus و PA به ژنوم گیاه کاهو منتقل شده است. بیان ژن PAبا استفاده از تکنیک الایزا(ELISA) مورد تایید قرار گرفت (Honari, 2008).
با اطمینان از تراریختی در گیاه کاهو از قطعات همولوگ (rbcL-accD) و پیش برنده Prrn و خاتمه دهنده psbA برای ژن Gus همراه قطعه ژنی aadA مقاومت به اسپکتینومایسین به همراه پیشبرنده 16Srrn و خاتمه دهنده psbA گیاه توتون برای ساخت ناقل pcL96-39 (پلاسمید کلروپلاستی رقم TN-96-39 کاهوی ایرانی) استفاده گردید. ژن هدف با استفاده تفنگ ژنی به گیاه کاهو منتقل و به وسیله آزمون هیستوشیمیایی مورد تایید قرار گرفت. با توجه به طراحی و ساخت ناقل پلاستیدی بومی pcL96-39 دو تا از چهار ژن PA همراه با قطعه ژنی aadA به همراه پیش برنده 16Srrn و خاتمه دهنده psbA بوسیله تفنگ ژنی به گیاه کاهو منتقل گردید. میزان پروتئین محلول PA از کل موجود (TSP) در برگ های تازه 7 % بدست آمد و با استفاده از تکنیک وسترن بلات مورد تایید قرار گرفت (Honari, 2008).
تولید پروانسولین انسانی در گیاه کاهو
استفاده از واکسن ها به صورت تزریقی معمولاً پاسخ ایمنی مناسبی در بافت های مخاطی (Mucosal) دریافت کننده واکسن ایجاد نمی کند. سطوح مخاطی از جمله دهان و مجاری تناسلی ورودی های اصلی ارگانیسم های بیماریزا به بدن می باشند. به همین علت به تولید واکسن های خوراکی روی آوردند که نشان داده شد پاسخ ایمنی این بافت ها را به خوبی تحریک می کنند.(Carter & Langridge, 2002; Streatfield & Howard, 2003). واکسن های خوراکی مزایای خیلی زیادی از نظر تولید دارند که به عنوان مثال از آنجایی که دیگر نیازی به تخلیص وجود ندارد بنابراین هزینه های تولید خیلی کاهش می یابد و فرد با مصرف روزانه مقداری میوه یا سبزیجات داروی مورد نیاز را دریافت می کند. از جمله این گزارش ها تولید واکسن علیه ویروس ایدز(HIV) در ذرت بود(Horn et al., 2004).
در قالب پروژه دیگری دانشگاه تربیت مدرس تولید پروانسولین در گیاهان به عنوان واکسن تزریقی و همچنین به عنوان واکسن خوراکی مد نظر می باشد. انسولین یک پلی پپتید 51 اسید آمینه ای است که دارای دو زنجیره مجزا (α , β) می باشد. اما در سلول های بتای پانکراس انسان، انسولین به صورت یک زنجیره پلی پپتیدی منفرد ساخته می شود که به این زنجیره پلی پپتیدی پروانسولین گفته می شود. پیشساز پروانسولین، پری پروانسولین می باشد که به عنوان ماده اولیه تولید پروانسولین در این سلول ها ساخته می شود(Farinas et al., 2007). استفاده اصلی پروانسولین جهت درمان بیماری دیابت می باشد که شیوع بسیار بالایی دارد. دو پروژه جداگانه در همین راستا در حال انجام می باشد:
الف- همسانهسازی و انتقال ژن پروانسولین انسانی به ژنوم هستهای کاهو (Lactuca sativa L.) و توتون (Nicotiana tabacum) و همسانهسازی آن در ناقل کلرپلاستی pKCZ و انتقال به کلروپلاست توتون (Nicotiana tabacum): در این تحقیق ژن پروانسولین انسانی توسط آغازگرهای مناسب که در دو انتهای خود دارای محل برشی مناسب برای آنزیمهای برشی بود با استفاده از تکنیک PCR از روی ناقل جداسازی شد. قطعه جداسازی شده در معرض آنزیمهای برشی قرار داده شد. قطعه برش یافته بوسیله آنزیم لیگاز به ناقل بیانی گیاهیpCAMBIA1304 متصل و سازواره pCAMINS ساخته شد. با استفاده از تکنیکهای مختلف (کلونیPCR ، PCR، هضم آنزیمی و توالییابی) همسانه سازی ژن پروانسولین انسانی در ناقل pCAMBIA1304 تایید شد. در مرحله بعد با استفاده از بافتهای کوتیلدونی گیاه کاهو و ریز نمونه های برگی گیاه توتون، ژن پروانسولین با استفاده از اگروباکتریوم به گیاهان توتون و کاهو منتقل شد و گیاهان تراریخت حاصل از کشت بافت با استفاده از PCR تایید شد (Mohebodini et al., 2009).
به منظور انتقال ژن پروانسولین به کلروپلاست توتون، همسانهسازی این ژن در ناقل کلروپلاستی pKCZ انجام شد. ناقل مورد استفاده در این مطالعه برای همسانهسازی ژن پروانسولین، pKCZ (به طول تقریبی kb5/6 ) بود که دارای ژنهای مقاومت به آنتیبیوتیکهای آمپیسیلین برای ایجاد مقاومت در باکتری و اسپکتینومایسین جهت ایجاد مقاومت در گیاه میباشد. با توجه به اینکه در حالت معمولی mRNAهای هستهای گیاه تک سیسترونی میباشند و در مقابل اکثر ژنهای کلروپلاستی بصورت RNAهای پلیسیسترونی نسخهبرداری میشوند و بعداً برای تشکیل نسخههای قابل ترجمه پردازش میشوند. در پروژه کلرپلاستی، ژن پروانسولین انسانی برای بیان به صورت دی سیسترونی با ژن مقاومت به آنتیبیوتیک اسپکتینومایسین در ابتدای این ژن مقاومت به آنتیبیوتیک همسانهسازی شد. برای این منظور با استفاده از آنزیم برشی NcoI قطعه ژن پروانسولین که در دو انتهای خود دارای سایت برشی برای این آنزیم بود برش داده شد و در ناقل pKCZ در محل برش آنزیم NcoI (مابین پیشبرنده و ژن مقاومت به اسپکتینومایسین) همسانهسازی شد. ناقل ساخته شده (pKCZINS) با استفاده از هضم آنزیمی و توالییابی تایید شد. (Mohebodini et al., 2010) در حال حاضر انتقال این ژن با استفاده از روش بیولستیک به کلروپلاست انجام شده و وجود ژن پروانسولین در ژنوم کلروپلاستی در سطح PCR با استفاده از آغازگرهای اختصاصی نایید شد.
ب- همسانه سازی ژن اینترفرون گاما در ناقل کلروپلاستی pKCZ: ژن اینترفرون گاما داخل پلاسمید pRset دریافت شد. سپس ژن اینترفرون گاما با استفاده از یک پیشبرنده اختصاصی که حاوی سایت برشی آنزیم NcoI و His Tag بود تکثیر و سپس این ژن در ناقل TA همسانه سازی شد. با استفاده از آنزیم برشی NcoI قطعه ژن پروانسولین که در دو انتهای خود دارای سایت برشی برای این آنزیم بود بریده شده و در ناقل pKCZ در محل برش آنزیم NcoI (بین پیشبرنده و ژن مقاومت) همسانهسازی شد. ناقل ساخته شده (pKCZINF) با استفاده از روشهای هضم آنزیمی و توالییابی تایید شد(Razmi et al., 2009). در حال حاضر مراحل انتقال این ژن با استفاده از روش بیولستیک به کلروپلاست گیاه در حال انجام است.
بحث
گیاهان مزایای زیادی برای تولید پروتئین های نوترکیب در حجم انبوه و قیمت ارزان دارند، اما هنوز هم چالش ها و مشکلات زیادی پیش روی کشاورزی مولکولی (Molecular farming) وجود دارد که باید برای تولید بهینه و با کیفیت بالا از میان برداشته شوند. تعداد معدودی از مواد بیولوژیک تولید شده در گیاهان تراریخت به صورت تجاری در آمده اند (Ficher et al., 2004) که با توجه به پتانسیل های بیوتکنولوژی، این میزان ناچیز بوده و باید تلاش های بیشتری صورت پذیرد.
امروزه با رشد روز افزون تقاضای برای پروتئین های دارویی مواجه می باشیم، اما ظرفیت کافی برای پاسخ به این تقاضا بویژه در کشورهای فقیر و در حال توسعه وجود ندارد. به گونه ی که برخی از داروهای مهم یا در این کشورها اصلاً وجود ندارد و یا با هزینه های گزاف وارد می شود که فقط اقشار ثروتمند قادر به تهیه و استفاده از آنها می باشند. سیستم های تولید سنتی پروتئین های نوترکیب داروئی که از فرمنتاسیون های میکروبی، کشت سلول های حشرات و پستانداران و حیوانات تراریخت استفاده می کنند، از لحاظ هزینه، سطح تولید، ایمنی تولید و درستی محصول اشکالاتی دارند(Ma & Jevnikar, 1999). پژوهش هایی در دست انجام است تا امکان جایگزینی سیستم گیاهی بجای سایر سیستمها را مورد بررسی قرار میدهند. بنابراین استفاده از بیورآکتورهای گیاهی در طی چند سال خیر بویژه سال های آتی جهت تولید این داروها با کیفیت و کمیت مناسب ضروری می باشد تا با بالا بردن حجم تولید موجب کاهش قیمت این پروتئین ها شود. البته مطالعات آتی علاوه بر بیان پروتئین های مختلف و آزمون سیستم های میزبانی و بیانی مختلف، باید مطالعات بیشتر روی مسائل تخلیص و فرآوری محصولات نوترکیب تمرکز یابد. همچنین باید با استفاده از تکنیک های مهندسی پروتئین (مثل جهش زایی مستقیم جایگاه ها) با دستکاری توالی های اسید آمینه ای پروتئین های نوترکیب، خصوصیاتی از قبیل پایداری، فعالیت و اختصاصیت که در کاربرد این پروتئین های دارویی بسیار مهم می باشد بهینه شود. چالش اصلی و جدید کشاورزی مولکولی در زمینه تولید زیست داروها، ترکیب روشهای مهندسی ژنتیک جهت افزایش بیان با روشهای تخلیص اقتصادی و در نهایت رسیدن به یک روش تولیدی مناسب می باشد. باید توجه داشت که عملیات تخلیص پروتئین های نوترکیب تحت شرایط آزمایشگاهی که با استفاده از بافرها و افزودنی های گرانقیمت صورت می گیرد، ممکن است که در مقیاس آزمایشگاهی توجیه پذیر باشد اما در مقیاس وسیع نیاز به تحقیق و کار بیشتر در زمینه تخلیص پروتئین نوترکیب دارد. برای حل این مشکلات، باید ضمن بکارگیری روش های جدید برای افزایش بیان پروتئین های نوترکیب، روش های تخلیص جدید که علاوه بر ارزان بودن، مقیاس پذیری داشته باشند نیز مورد ارزیابی و اصلاح قرار گیرد. با کمال خوشبختی طی یک دهه گذشته اقدامات مطلوبی در زمینه کشاورزی ملکولی در ایران شده است. مهمترین دستاوردهای کشاورزی ملکولی در ایران که عمدتا در دانشکده کشاورزی دانشگاه تربیت مدرس حاصل شده است عبارتند از: تولید آنتی بادی تک دمنی VHH در توتون و کلزا، پروتئین نوترکیب tPA در توتون، بیان ژن اینترفرون گامای انسانی در کلزا و پروانسولین در کاهو و توتون. در زمینه انتقال ژنهای انسانی (مانند: پروانسولین، tPA، اینترفرون گاما) به کلروپلاست، سازه های آنها تهیه شده، مراحل انتقال به کلروپلاست و بررسی بیان آنها در حال انجام است.
سپاسگزاری
نظر به این که بیشتر پروژه های انجام گرفته در زمینه کشاورزی مولکولی (Molecular farming) در ایران به صورت همکاری مشترک بین دانشگاه تربیت مدرس و سایر مراکز پژوهشی ( مانند: انستیتو پاستور ایران، سازمان صنایع نوین، دانشکده کشاورزی دانشگاه تهران و ...) صورت گرفته است لذا از کلیه عزیزانی که در انجام پروژه های تحقیقاتی به هر نحوی ما را یاری نموده اند تشکر و قدر دانی بعمل می آید.
منابع
The success of molecular farming in Iran
Jalali Javaran M.*1, Mohebodini M1., Masoumi Asl A1., Saifi Nabi Abad H1., Alizadeh H4., Mahbodi F3., Ismail A1., Rajabi Memari H1., Moini A1., Honari H4., Bagheri Kh1., Yaghobi M.M5., Zebarjadi A.R9., Rasai M.J2., Shakib A.M6., Rahbarizadeh F2., Masoumi H7., Forozandeh Moghadam M2., Sharifi-Sirchi G.R7., Dymyad S1., Sadat Noori S.A8., Vishlaghi N1., Hosseini Pour A7., Taheri Javan N1., Razmi Sh1., Rahimi Far P8., Latif B1., Abdolinasab M1., Azhdari H1., Poorkhaleghi M7., Razmi A1., Khosravi H1., Kazemi H1.
Abstract
By using molecular farming, plants are used as a bio-reactor for producing low cost recombinant proteins. This technology had been successful in the production of primary products in the commercial field. Other recombinant products are in final steps of production. In the last 10 years, up to 100 different recombinant proteins are produced in transgenic plants. Plants have many advantages in comparison with other expression systems, especially in economic, safety, operations and production aspects. However, there are some problems for using plants as a bio-reactor with the goal of recombinant proteins production that should be considered. Some of these problems are: the quality of final product, extraction and the processing of plant derived pharmaceutical macromolecules and bio-safety. In this study, we will review the global view of molecular farming and some successful cases in Iran. During 8 years of research in the field of molecular farming in Iran, especially in Tarbiat Modarres University, different kinds of recombinant proteins such as VHH single domain antibody in tobacco and canola and tPA protein in tobacco were expressed. The human gamma interferon in canola and tobacco and also the luciferase enzyme in tobacco, African violet and canola were produced. Also, useful projects are executed in the field of transplastomic plants in order to express the mentioned genes in the chloroplast. In transferring the human pro-insulin gene to chloroplast genome, this gene was bombarded onto tobacco leaf ex-plants using a particle delivery system. Leaf ex-plants produced adventitious shoots when cultured on shoot-inducing medium containing spectinomycin. The results of PCR confirmed that the pro-insulin gene was present in the chloroplast genome.
Keyword: Molecular farming, transgenic plant, recombinant protein, bioreactor.
* نویسنده مسئول: مختار جلالی جواران تلفن: 09123091917 Email: m_jalali@modares.ac.ir
3 Macro molecule
[2] Follding
[3] Assembling
[4] Glycan
[5] Galactosyltransferase
[6] Sialyltransferase
[7] Fucosyltransferase
[8] Xylyltransferase
[9] Ubiquitin-1
[10] Site -specific recombination
[11] Construct
[12] Affinity chromatography
[13] His-tag
* Corresponding author: Mokhtar Jalali Javaran tel: 09123091917 Email:M_jalali@modares.ac.ir