Ca Transporter gene Isolation and Analysis of Its Expression Pattern in Soybean

جداسازی ژن (GmNARK) ناقل کلسیم و بررسی الگوی بیانی آن در سویا

علی ایزدی دربندی*¹، مارک کینکما²، پیتر گرشوف²، بهمن یزدی صمدی³، منصور امیدی ³

¹ عضو هیأت علمی گروه علوم زراعی و اصلاح نباتات، پردیس ابوریحان، دانشگاه تهران

² اعضای هیأت علمی موسسه عالی تحقیقات تلفیقی حبوبات (CILR)، دانشگاه کوینزلند استرالیا

³ اعضای هیأت علمی گروه زراعت و اصلاح نباتات، پردیس کرج، دانشگاه تهران

چکیده

برخی گیاهان از طریق تثبیت زیستی قادر به استفاده از نیتروژن هوا هستند. در سویا گره­های تثبیت نیتروژن حاصل از اثر متقابل بین باکتریBradyrhizobium japonicum  و ریشه گیاه است.  از این همزیستی هر دو موجود سود می برند باکتری قند و گیاه، نیتروژن احیاء شده به دست می آورد. خود تنظیمی گره زایی حاصل از بیان ژن GmNARK در برگ سویا، مهمترین سازوکار ژنتیکی تنظیم این فرایند است. این سازوکار یک شبکه پیام­رسانی دوردست می باشد که پس از آغاز گره­زایی از حالت بیش افزایی آن جلوگیری می­شود. آزمایش­های ریزآرایه افیمتریکس و Real time RT-PCR روی برگ انواع وحشی و جهش­یافته GmNARK  یا فوق گره­زایی، سویا نشان داد که بیان ژن با شناسه افیمتریکس GmaAffx.32318.1 در تیپ وحشی نسبت به جهش یافته در بافت برگی با رفتاری مستقل از آلودگی ریزوبیومی کاهش یافته است. نتایج همسانه­سازی و تعیین توالی نشان داد که این ژن نامزد رمز کننده یک ناقل کلسیمی است. توالی حاصل با 2460 جفت باز شامل بخش رمز کننده و قسمتی از نواحی بالادست و پایین دست ژن بوده  است.  پروتئین پیش بینی شده شامل 202 اسید آمینه و دارای 5 دومین بین غشایی است که می­تواند نقش گیرنده سلولی یا ناقل مولکولی را داشته باشد که دارای 70 درصد همسانی با هترولوگوس ناقل کلسیمی خود در آرابیدوپسیس است.

کلمات کلیدی: سویا، خود تنظیمی گره­زایی، ناقل کلسیم، همسانه سازی، ژنهای تثبت ازت و PCR کمی.

مقدمه

نیاز گیاهان به نیتروژن، بیشترین محدودیت غذایی آنها محسوب می شود. تامین این عنصر از طریق کودهای شیمیایی علاوه بر هزینه­های هنگفت، آثار منفی زیست محیطی جبران ناپذیری دارد. تثبیت زیستی نیتروژن به روش همزیستی یک سری از باکتری­های خاک به نام ریزوبیوم و ریشه این گیاهان (مانند سویا، نخود، لوبیا، شبدر و...) صورت می­گیرد. در این همزیستی، اندام جدیدی به نام گره تشکیل می شود و هر دو موجود از همدیگر سود می­برند؛ باکتری قند و گیاه نیتروژن احیا شده اتمسفر را به دست می­آورد. این همیاری منحصر به فرد، موجب شده است تا حبوبات از جنبه کشاورزی پایدار با تامین کود زیستی نیتروژنه، فوق­العاده مفید و مورد توجه قرار گیرند. افزون بر این، تشکیل گره از جنبه نموی نیز مهم می­باشد. (Gresshoff, 2004). برخلاف اطلاعات موجود درباره تشکیل گره، آگاهی کمی از حوادث مولکولی درگیر در تنظیم گره زایی وجود دارد. تنظیم گره زایی در حبوبات برای برقراری توازن بین فواید تثبیت نیتروژن با رشد و نمو گیاه لازم است (Gresshoff et al., 1986; Caetano-Anollés et al., 1991). مسیر اصلی کنترل گره زایی تحت عنوان خود تنظیمی گره زایی یا AON[1] خوانده می شود. خود تنظیمی گره زایی شامل پیام رسانی دوردست[2] بین ریشه و ساقه است، به طوری که رخدادهای آغازین گره زایی حالت بازدارنده برای مراحل بعدی تشکیل گره دارد (Gresshoff, 2003). بیشتر جهش یافته های AON که دارای فنوتیپ فراگرهزایی یا بیش گرهزایی هستند، از نظر گره زایی متحمل به نیترات هستند (Carroll  et al., 1985a & b). همسانه کردن یکی از ژن های مسئول فنوتیپ فوق گرهزایی[3] در سویا به نام [4]GmNARK یا گیرنده کینازی خود کنترلی گرهزایی (Searle et al., 2003)، در  Lotus معروف به فراگرهزایی و ریشه های غیر نرمال یا  HAR1[5] (Krusell et al., 2002; Nishimura et al., 2002)  و در یونجه به نام SUNN[6]  یا تعداد گره فوق العاده، نشان داد که یک پروتئین شبه گیرنده کینازی غنی از لوسین و بین غشایی، نقش کلیدی را در مسیر پیام رسانی AON بر عهده دارد. یک جهش نقطه ای در این ژن­ها عامل فنوتیپ جهش یافته است. اگر چه رونوشت های GmNARK، HAR1 و SUNN در دو بافت ریشه و ساقه به صورت فعال دیده می شود (Yamamoto et al., 2000; Schnabel et al., 2005)، آزمایش های پیوند زدن نشان داده است که فنوتیپ گرهزایی توسط ساقه کنترل می شود. در سازوکار AON، پیام ریشه ای حاصل از تحریک ریزوبیومی، به فعال شدن گیرنده شبه کینازی غنی از LRR در شاخه می انجامد (Caetano-Anollés et al., 1991; Delves et al., 1986). در ادامه فعالیت این گیرنده شبه کینازی منجر به تولید یک بازدارنده از ساقه گردیده که تعداد گره در ریشه را تنظیم می کند. تاکنون ماهیت پیام های ریشه و ساقه شناخته نشده است و معلوم نیست که چگونه گیرنده شبه کینازی LRR پیام رسانی دوردست را موجب می شود. جهش یافته های AON، با تغییرات دیگری در رشد ریشه (Day et al., 1986; Schnabel et al., 2005; Szczyglowski et al., 1998)، افزایش میکوریزا
(Solaiman et al., 2000; Meixner et al., 2005) و مقاومت نماتدی (Mitra et al., 2004a) همراه است. جهش یافته­های Gmnark،har1 و sunn در شرایط عدم تلقیح ریزوبیومی، نسبت به تیپ وحشی دارای ریشه های کوتاهتر و یا تعداد ریشه های جانبی بیشتر هستند. پیوند بین تیپ وحشی Lotus japonicus و جهش یافته فوق گره زایی har1 نشان داد که ژنوتیپ ساقه می تواند فوق گره زایی و همچنین انگیزش ریشه کوتاه یا افزایش ریشه های جانبی را باعث گردد.  مشخص شده که ژنوتیپ ریشه، موجب تغییر در فنوتیپ ریشه ای غیر همزیست جهش یافته har1 نیز می گردد (Buzas et al., 2006; Day et al., 1986; Jiang &            Gressoff, 2002; Schnabel et al., 2005;Szczyglowski, 1998 ). جهش­یافته har1 به آلودگی نماتد ریشه نیز بسیار حساس است، بنابراین می توان گفت که HAR1 در سازوکار دفاعی علیه عوامل بیماریزای گیاهی نیز درگیر است. پیوند ساقه گیاه فوق گره زایی سویا به ریشه تیپ وحشی موجب پیدایش فنوتیپ فراگرهزایی گردید، در حالی که پیوند وارونه موجب پیدایش حالت نرمال گرهزایی شد (Delves et al., 1986). اگر چه این گیرنده های شبه کینازی در مسیرهای همزیستی و غیرهمزیستی دارای نقش مشخص می باشند، با این حال سازوکار های پایین دست آنها شناسایی نشده است (Lohar et al., 2003).

بررسی­های زیادی با روش ژنتیک مستقیم جهت شناسایی ژن­های درگیر در گره­زایی انجام شده است (Kinkema et al., 2006; Stacey et al., 2006). این ژن­ها به عنوان گیرنده­های آغازین پیام ریزوبیومی، پیش ­بینی شده­اند که می­توانند یک گیرنده شبه کینازی، دومینLysM- (Nakamura et al.,  2003; Lohar et al., 2003)، گیرنده شبه کینازی غنی از لوسین LRR (Nishimura et al., 2002)، کانال­های کاتیونی غشای پلاسمایی (Kanamori et al., 2006)، کیناز کالمادولین وابسته به کلسیم (Lévy et al., 2004; Mitra et al., 2004a  )، عامل­های رونویسی (Smit et al.,2005) و ناقل­های سولفاتی (Krusell et al., 2002) باشند. عامل­های گره­زایی توسط گیرنده­های کینازی نوع LysM در غشای پلاسمایی دریافت می­شوند (Radutoiu et al., 2003). در سویا ژن­های NRF1 و NRF5 این نقش را بر عهده دارند (Lohar & Bird, 2003) که جهش در اینها یا همسانه های آنها در نخود فرنگی و M.trancatula موجب عدم گره­زایی می­شود. در ادامه یک گیرنده NBS-LRR، به نام های GmNORK، LjNORK، MsSYMRK، MtDM12 و PsSYM19 به ترتیب از سویا، لوتوس، یونجه، شبدر و نخود اثر نموده و موجب تحریک کانال­های یونی غشایی، نوکلئوپروتئین ها و پروتئین کینازهای کالمادولین وابسته به کلسیم می گردند(Capoenet al., 2005; Endr´e et al., 2002  Mitra et al., 2004a;). نشانه ناشناخته ریشه­ای Q، موجب پیام­رسانی برگ می­شود که در اثر بیانGmNARK  در برگ سرانجام علامت بازدارندگی برگی (SDI) به ریشه می­آید که اثر بازدارندگی بر گره­زایی دارد.

تجزیه و تحلیل های بانک اطلاعاتی مشخص کرد که پروتئین های پیش بینی شده برای GmNARK، HAR1، SyM29 و SUNN بسیار مشابه گیرنده شبه کینازی LRR آرابیدوپسیس CLAVATA1(At CLV1) است، که تکثیر سلول های مریستمی ریشه و ساقه را کنترل می کند (Clark et al., 1997). پیام رسانی AtCLA1، همانند دیگر مسیرهای انتقال پیام وابسته به گیرنده، منجر به تنظیم رونویسی ژن های ویژه ای می گردد (Dievart & Clark 2004; Schoof et al., 2000). بررسی الگوی بیانی همراه با همسانه سازی و تعیین ویژگی­های ژن های موثر در سازوکار خودتنظیمی گره­زایی، می­تواند بینش درستی از فرایند گره زایی و دست­ورزی ژنتیکی را فراهم نماید. ژن ناقل کلسیمی از پیام رسان­های مهم زیستی می­باشد و تصور می­شود اهمیت ویژه ای در کنترل گره زایی داشته باشد.  

مواد و روش­ها

رشد گیاهان و استخراج RNA: بذور گیاهان سویا به مدت 24 ساعت (درون اتاقک محتوی گاز کلرین: 100 میلی لیترمحلول با 5/3 میلی لیتر از 32 درصد اسید هیپوکلریک و 2/4 درصد سدیم هیپوکلریت)، ضدعفونی سطحی گردیدند. اتاقک های رشد دارای شرایط ثابت دمایی ^oC28 روز و ^oC25 شب با رطوبت 80 درصد و 16 ساعت روشنایی بودند. به منظور استخراج RNA سه روز پس از کشت ریشه های گیاهچه ها با باکتری Bradyrhizobium japonicum سویه CB1809 تیمار شدند. برگ های گیاهان رقم جهش یافته nts1007 و ایزوژن وحشی Bragg آن (شامل مریستم انتهایی سویا) دو و پنج روز پس از تلقیح جمع آوری شدند. برگ و ریشه نمونه های تلقیح شده در دو تیمار زیستی (ایجاد آلودگی در گیاهچه های متفاوت و در زمان متفاوت ) جمع آوری گردید و نمونه های غیر تلقیح شده به دلیل نبود تغییرات ناشی از تلقیح ریزوبیومی، فقط از یک تیمار زیستی جدا شدند. استخراج RNA برای آزمایش های ریزآرایه با کیت نوکلئوزپین (شرکت Macherey-Nagel) انجام و غلظت آنها با بیوآنالیزر 2001 تعیین شد.

آزمایش های QRT-PCR[7]: آزمایش های تجزیه و تحلیل بیان ژن با روش QRT-PCR از نمونه های برگی با سه تیمار زیستی و برای ریشه در دو شرایط تلقیح (ده روز پس از کشت بذر) و عدم تلقیح با ریزوبیوم درون گلخانه با شرایط ^oC 28 و 16 ساعت روشنایی صورت گرفت. ریشه و برگ گیاهان مورد نظر در 0، 1، 2، 3، 5 و 7 روز پس از تلقیح با ریزوبیوم جمع آوری شدند و استخراج RNA به روش ترایزول (Trizol) صورت گرفت. واکنش PCR با رونویسی معکوس Real time دو مرحله ای شامل سنتز cDNA در مرحله اول و انجام واکنش PCR کمی Real time در مرحله دوم به شرح ذیل انجام شد.

یک میکروگرم از RNA هر یک از نمونه های آزمایشی با DNase تیمار گردید و فرآورده هضم در دو واکنش مجزا یکی برای سنتز cDNA با آنزیم Superscript III و دیگری برای کنترل حذف آلودگی DNA نمونه ها، طبق دستورالعمل شرکت اینویتروژن (Invitrogen) با یک سری تغییرات انجام گردید. نمونه های cDNA  به صورت 1:10 رقیق شدند. 5 میکرولیتر از cDNA های رقیق شده به همراه 20 میکرو لیتر از محلول پایه SYBR green PCR و µM 25/0 از هر آغازگر در چاهک های 96 تایی با استفاده از ABI PRISM 7000 وارد واکنش گردیدند. برنامه واکنش، ^oC95 به مدت 10 دقیقه و سپس با 40 چرخه از ^oC95 برای 10 ثانیه و ^oC60 برای یک دقیقه ادامه یافت. الگویابی منحنی ذوب از 60 تا ^oC95 در پایان واکنش برای هر PCR جهت تشخیص اختصاصیت واکنش انجام گردید. برای هر نمونه دو تکرار وجود داشت که عموما" تفاوت در مقدار چرخه آستانه[8]، یا ct آنها کمتر از 5/0 بود. متوسط مقادیر ct وارد محاسبات ارزیابی کمی بیان نسبی ژن گردید. تجزیه و تحلیل داده ها با روش کمی سنجی نسبی بیان ژن ها انجام شد. در این روش یکی از نمونه های آزمایشی (WTU) به عنوان کالیبراتور[9] یا نمونه x1 انتخاب شد. مقادیر نرمال شده هر یک از نمونه ها ( ct ژن نرمال کردن  ct  ژن هدفct= Δ) به   ctΔ-₂ تبدیل گردید تا برآوردی از میزان فرآورده حاصل و مقدار اولیه آن در نمونه آزمایشی باشد، هر یک از این مقادیر پس از تبدیل به درصد، تقسیم بر اندازه برآوردی نمونه کالیبراتور شد تا میزان بیان نسبی محاسبه شد (Marisa et al., 2005). طراحی آغازگر برای انجام واکنش Real Time با نرمافزارP
rimer Express با رعایت پیش فرض های آن و استفاده از توالی جزیی cDNA ژن­های نامزد در بانک اطلاعاتی و یا توالی جدید حاصل از همسانه سازی آنها انجام شد. آغازگرهای مورد استفاده برای ژن­های مورد مطالعه به شرح جدول 1 هستند. برای تأیید درستی داده های ریزآرایه و یافتن الگوی بیانی با جزئیات بیشتر از ژن نامزد، تجزیه و تحلیل بیان ژن با QRT-PCR در چندین دوره زمانی و شرایط متفاوت از آزمایش های ریزآرایه صورت گرفت. اول اینکه گیاهان برخلاف آزمایش های ریزآرایه به جای رشد در کیسه­های رشد درون اتاقک رشد، درون گلخانه و در گلدان های محتوی ورمیکولیت روییدند. همچنین تیمار گیاهچه با ریزوبیوم به جای سه روز پس از کشت بذر، 10 روز پس از کشت بذر صورت گرفت، زیرا ژن هایی که تحت تاثیر GmNARK قرار می­گیرند، بایستی دارای بیان مشابه در شرایط رشدی متفاوت باشند. از آنجا که AON در هر دو زمان 3 و 10 روز پس از کشت القاء می­گردد (Solaiman et al., 2000)، بنابراین، ژن های نامزد بایستی بیان متفاوت در هر دو شرایط نشان دهند. دوم اینکه آزمایش های QRT-PCR مربوط به هر نمونه در 6 مقطع زمانی متفاوت و در سه تکرار زیستی صورت گرفت. علاوه بر این، دو جهش یافته با آلل های متفاوت GmNARK را در تیمارهای زیستی (دو تیمار با nts1007 و یک تیمار با nts382) وارد شد تا مطمئن شویم که تغییرات در بیان ژن تحت تاثیر موتاسیون ثانویه (Searle et al., 2003) درون بخش تنظیمی ژن های نامزد قرار نگرفته است.

PCR معکوس[10] و تعیین توالی: نقشه برشی توالی جزیی (564 نوکلئوتید) موجود از ژن مورد مطالعه، بر اساس بانک اطلاعاتی EST، تعیین شد و سپس هضم DNA ژنومی با آنزیم های برشی نزدیک دنباله '3 توالی هدف، برای امکان تکثیر آن در جهت '5 و بر عکس صورت گرفت. بدین منظور µg10 از DNA ژنومی با 5/10 واحد از آنزیم برشی مورد نظر و بافر مناسب با حجم نهایی µl100 در طول شب و دمای ^oC37 هضم گردید. به مخلوط واکنش µl100 آب و µl100 فنل/کلروفرم افزوده شد و به مدت 5 دقیقه در 13000 دور سانتریفوژ گردید، سپس به مایع فوقانی، یک حجم استات سدیم M3 (2/5=pH) و دو حجم اتانول 96 درصد افزوده شد و در دمای ^oC20- به مدت 2 ساعت قرار داده شدند و در ادامه به مدت 20 دقیقه در ^oC4 سانتریفوژ گردید. رسوب DNA حاصل پس از شستشو با اتانول 70 درصد در µl50 آب حل و تعیین غلظت گردید. خود الحاقی DNA ژنومی هضم شده توسط 5/10 واحد DNA لیگاز T4 در بافر لازم و حجم کل µl100 در دمای ^oC16 به مدت 18 ساعت انجام شد و برای حذف آنزیمی محصول واکنش با تیمار دمایی ^oC75 به مدت 15 دقیقه صورت گرفت. آزمایش های PCR، با استفاده از آغازگرهای آشیانه ای[11] با مقادیر 1 تا µl 5 از  DNAالحاقی یا محصول حاصل از PCR اولیه انجام شدند. ژن نامزد پس از همسانه سازی مکرر فراورده های حاصل از IPCR، 5́RACE (تکثیر دنباله های cDNA) با کیت RLM-RACE)، تعیین توالی شدند.

          تجزیه و تحلیل توالی: تجزیه و تحلیل توالی­های ژنومی و cDNA توسط نرم افزار Clone Manager صورت گرفت و چارچوب قرائت آزاد و توالی اسید آمینه ای ژن­های مورد مطالعه تعیین شد. جستجو در سطح پروتئین برای توالی­های موجود و هم­ردیفی توالی­ها با استفاده از
ClustalW (EMBL-EBI) انجام شد. بخش­های اگزون و اینترون توالی ژنومی با مقایسه الگوی اسید آمینه­ای حاصل و هم­ردیفی با توالی پروتئین های شناخته شده، تعیین گردید. الگوها و پیش­بینی موتیف­های پروتئین­ها توسط ScanProsit سیستم پیشرفته تجزیه و تحلیل پروتئین (ExPASY) به دست آمد. تعیین محل احتمالی قرار گرفتن پروتئین­های حاصل توسط نرم افزار Target1.1 مرکز تجزیه و تحلیل زیستی (CBI) صورت گرفت و پیش بینی عناصر تنظیمی Cis یا همسو در توالی راه­انداز با برنامه تعیین علامت عناصر تنظیمی Cis در DNA گیاهی[12] (PLACE) انجام گرفت.

نتایج و بحث

الف) نتایج آرایه ژنی: در تجزیه و تحلیل آرایه های ژنی  از طریق مقایسه های دو تایی با نرم افزار Dchip و روش سری غیر متغیر نرمال شدند، تعداد معدودی ژن در برگ شناسایی شدند  که با رفتاری مستقل از آلودگی ریزوبیومی، توسط GmNARK تنظیم می گردند. بیان ژن نامزد با شناسه GmaAffx.32318.1 (ناقل کلسیم) در [13]WT نسبت به nts کمتر بود. بیان این ژن در آزمایش­های ریزآرایه با حالتی مستقل از آلودگی ریزوبیومی در WT نسبت به تیپ جهش یافته، مطابق جدول 2 کاهش داشت.

جدول 1- توالی آغازگرهای مورد استفاده در آزمایشات PCR کمی.

Table 1- The sequences of primers used in QRT-PCR experiments.

جدول 2- تغییرات میزان بیان (کاهش) ناقل کلسیمی تحت کنترل ژن  GmNARK در تیپ وحشی نسبت به جهش­یافته در آزمایش­های ریزآرایه افیمتریکس.

* علامت منفی بیانگر کاهش در بیان ژن و اعداد لازم معرف چند برابر مورد نظر است.

Table 2- The expression changes (decreasing rate) of Ca transporter that is under the control of GmNARK gene, in wild type related to mutant in affymetrix microarray experiments.

شکل 1- بیان نسبی ژن ناقل کلسیم در تیپ وحشی  (WT)و جهش یافته (M) سویا در حالت­های تلقیح شده (I) و تلقیح نشده با ریزوبیوم.

Figure 1- The relative expression of Ca transporter gene in wild type and mutant soybeans at inoculated and uninoculated condition with Rhizobium.

ب) تائید نتایج آرایه ژنی

آنالیز PCR کمی ژن با شناسه GmaAffx.32318.1 یا ناقل کلسیم نشان داد که بیان این ژن از روز دوم به بعد در برگ تیپ وحشی تلقیح شده با ریزوبیوم یا WTI[15] نسبت به کالیبراتور (تیپ وحشی قبل از آلودگی یا [16]WTU در روز صفر آلودگی) 2 تا 4 برابر افزایش یافت، این روند افزایشی برای خود WTU در روزهای بعدی نسبت به پیش از آلودگی آن، 2 تا 10 برابر گردید (شکل 1). بیان نسبی این ژن در جهش یافته تلقیح شده یا MI[17] دارای روند افزایشی بوده و تا 7 برابر  شاهد رسید. بیان نسبی در جهش یافته تلقیح نشده یا MU، در سطحی بالاتر از همه نمونه ها قرار گرفت و تا 12 برابر شاهد رسید. مشاهده می شود که بیان نسبی این ژن در تیپ WTI نسبت به MI، مشابه آزمایش های ریزآرایه کاهش داشته است، ولی بیان نسبی آن در WTU از روز پنجم بعد از آلودگی MI بیشتر گردید (ناشی از اثر یک تیمار زیستی). روند افزایشی بیان این ژن در روزهای پس از آلودگی، می تواند ناشی از رابطه مستقیم آن با جریان نمو گرهزایی باشد. گمان می رود پس از تلقیح ریزوبیومی، القای سازوکار خودتنظیمی در تیپ وحشی موجب شده است تا بیان این ژن در این تیپ نسبت به جهش یافته در سطحی پائین تر قرار گیرد و نبود این سازوکار در تیپ جهش یافته موجب حذف ویژگی بازدارندگی آن شده است. بیان متوسط این ژن در هر یک از تیپ های گیاهی تلقیح نشده بالاتر از حالت تلقیح شده آن است (این روند حداقل در دو تیمار زیستی دیده شد).

ج) همسانه سازی و تعیین توالی

فرآورده های PCR معکوس و 5'RACE ژن ناقل کلسیم پس از همسانه سازی با روش [18]TA، تعیین توالی شدند. برای این ژن از همسانه سازی فرآورده­های PCR معکوس، حاصل از هضم های آنزیمی جداگانه Hind III، Dra I و Nco I  یک توالی ژنومی به طول 2460 جفت باز به دست آمد (شکل 2). این توالی دارای سه چارچوب قرائت آزاد یک اینترون به طول 82 نوکلئوتید از نوع GT..AG، درون چارچوب قرائت آزاد دوم تا قبل از چارچوب قرائت آزاد اول می باشد. این دو چارچوب در بانک اطلاعاتی، مشابه ژن ناقل کلسیمی بودند و برای توالی چارچوب قرائت سوم هیچ مشابهت کارکردی پروتئینی در بانک اطلاعات یافت نشد. این توالی شامل بخش رمز کننده و قسمتی از نواحی بالا دست و پائین دست ژن است. تعیین توالی فرآورده حاصل از 5'RACE، انتهای5' cDNA یا شروع بخش رمز کننده را تعیین نمود (شکل 3). توالی cDNA فاقد بخش اینترونی ذکر شده بود و شامل تمام چارچوب قرائت آزاد اول بخش پایین دست و جزیی از توالی حدواسط ناحیه اینترونی با چارچوب اول  و بخش عمده ای از چارچوب دوم می باشد، اما حضور یک توالی 6 جفت بازی (ATGAAA) در انتهای این cDNA که متفاوت از توالی ژنومی این ژن است می تواند از وقوع یک ویرایش[19] و جایگزینی توالی مکمل آن یعنی UACUUU باشد که از ویژگی های ویرایش، جایگزینی قطعات غنی از اوراسیل می باشد
(Gott  and Emerson, 2000). با مقایسه توالی ژنومی و cDNA بخش بالادست تعیین توالی شده به طول 1136 جفت باز که بالاتر از کدون شروع است به عنوان جزء راه­انداز ژن  محسوب گردید و پیش بینی عناصر تنظیمی Cis یا همسو در توالی راه­انداز تعداد زیادی جعبه توالی مورد توافق مانند  CAATBOX1 مخصوص ژن لگ هموگلوبین[20]، جعبه WRKY71OS دخیل در تداخل میزبان و میکروب، جعبه BIHD1OS مربوط به مقاومت در برابر بیماری­ها، جعبه NODCON2GM ویژه خانواده ژن های دخیل در گره­زایی سویا و تعدادی جعبه TATA می­باشد. بنابراین، انتظار می­رود راه انداز این ژن در دریافت پیام­های سلولی و علایم تنظیمی گره­زایی و پاسخ به بیماری ها نقش کارکردی داشته باشد. پروتئین پیش­بینی شده آن (شکل4) دارای 5 دومین بین غشایی بوده که می تواند نقش گیرنده سلولی یا ناقل مولکولی را داشته باشند (Lévy et al., 2004; Sanders et al., 2004).

شکل 2- نقشه برشی DNA ژنومی مربوط به ژن همسانه سازی شده ناقل کلسیم سویا با مشخص کردن آنزیم های برشی هدف، توالی اولیه موجود در بانک اطلاعات، بخش های بالا دست و پایین دست تکثیر شده با IPCR و اینترون و چارچوب های قرائت آزاد آن.

Figure 2- The genomic DNA restriction map of soybean Ca transporter gene that has been cloned using IPCR, containing of its up/downstreams, Introns and ORFs.

شکل 3- نقشه برشی cDNA مربوط به ژن همسانه سازی شده ناقل کلسیم سویا از طریق 5’RACE با نمایش محل آغازگرهای درونی استفاده شده بر روی توالی اولیه و بخش بالادستی توالی­یابی شده آن.

Figure 3- The cDNA restriction map of soybean Ca transporter gene that has been cloned using 5’RACE, containing of its Outer/inner primers on initial sequence with its sequenced upstream part.

شکل4- توالی پیش­بینی شده پروتئین ژن ناقل کلسیم سویا و تعیین دومین­های کارکردی آن با (ExPASY PredictProtein) ، M: غشایی، i: درون حفره سلولی، T: بین غشایی، O: بیرون حفره­ای.

Figure 4- the protein predicted sequence for soybean Ca transporter gene and detection of its functional domains using ExPASY PredictProtein. M: membranal, i: inner lumen, T: Trans membranal, O:outer lumen. 

جستجوی بانک اطلاعاتی نشان داد که توالی این پروتئین حدود 70 درصد مشابهت با ناقل کلسیم آرابیدوپسیس دارد. این پروتئین نسبت به ناقل کلسیمی آرابیدوپسیس حدود 150 اسید آمینه از ابتدا کمبود دارد که احتمال می­رود پدیده ویرایش به عنوان یک عامل تغییرات پس از رونویسی، عامل این کمبود در سطح پروتئین باشد. در کل الگوی بیانی ژن نامزد در این بررسی در آزمایش های ریزآرایه و PCR کمی رفتار واحدی را نشان دادند و همسانه سازی این ژن با کاربرد دو روش IPCR و 5’RACE با تعیین ویژگی­های ساختاری و پیش بینی کارکردهای آن می تواند مقدمه مناسبی برای مطالعات ژنتیک برگشتی باشد.

سپاسگذاری

بدینوسیله از دانشگاه تهران، دانشگاه کوینزلند و موسسه عالی تحقیقات تلفیقی حبوبات (CILR)  کشور استرالیا، به دلیل تامین هزینه های پژوهشی و همه اعضای CILR به ویژه دکتر آتیلا کرست به دلیل راهنمایی های ارزشمندشان در انجام این طرح سپاسگزاری می شود.