The effect of methyljasmonate elicitor on tropan alkaloid production in hairy roots of Atropa belladonna

Document Type : Research Paper

Authors

1 MSc of Agricultural Biotechnology, Agricultural College, Ferdowsi University of Mashhad. Mashhad, Iran.

2 Professor, Biotechnology and plant Breeding Department, Agricultural College, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran.

3 Associate Professor Biotechnology and plant Breeding Department, Agricultural College, Ferdowsi University of Mashhad. Mashhad, Iran.

Abstract

The parasympatholytic tropane alkaloids, Atropine and Scopolamine, accumulated in Atropa belladonna, are of great interest for the pharmaceutical industry.In this research, Atropa belladonna transformed hairy roots were produced by Agrobacterium rhizogenes strain A4 mediated transformation. Effects of different concentrations of methyl jasmonate (0, 150 and 300 Micro molar) were investigated on production of Atropine and Scopolamine in 24 hours treatment. Then the contents of two tropane alkaloids, Atropine and Scopolamine, were assayed by HPLC method. The tropane alkaloids contents were shown to be significantly increased in transformed hairy roots. Results showed Atropine and Scopolamine content in transformed hairy roots reached respectively from 0.12 to 1.715 and 0.0195 to 0.43 of mg in 100 mg of dry weight. Methyl jasmonate dramatically enhanced both tropane alkaloids, Atropine and Scopolamine. Tropane alkaloids content increased in 300 Mµ concentration of methyl jasmonat in comparison with 150 Mµ concentration and control treatment. In conclusion, it is suggested that, hairy root can be used as a replacement of plants in further studies and for tropane alkaloids production in economical and commercial scales.

Keywords


تاثیر محرک متیل­جاسمونات بر تولید آلکالوئیدهای تروپانی در ریشه­های مویین تراریخت گیاه شابیزک (Atropa belladonna)

 

مریم خردمند پروچ1، فرج­الله شهریاری احمدی2*، نسرین مشتاقی3

 

1کارشناسی ارشد بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشکده­ی کشاورزی، دانشگاه فردوسی مشهد. مشهد، ایران.

2استاد گروه بیوتکنولوژی و به­نژادی گیاهی، دانشکده­ی کشاورزی، دانشگاه فردوسی مشهد. مشهد، ایران.

3دانشیار گروه بیوتکنولوژی و به­نژادی گیاهی، دانشکده­ی کشاورزی، دانشگاه فردوسی مشهد. مشهد، ایران.

تاریخ دریافت: 02/09/1395، تاریخ پذیرش: 21/04/1396

چکیده

آلکالوییدهای پاراسمپاتیک آتروپین و اسکوپولامین در شابیزک (Atropa belladonna) تجمع می­یابند و اهمیت زیادی در صنعت داروسازی دارند. در این تحقیق، با استفاده از نژاد  A4باکتری آگروباکتریوم رایزوژنز، ریشه مویین تراریخت در گیاه شابیزک تولید گردید. اثر غلظت­های مختلف متیل­جاسمونات (0، 150 و 300 میکرومولار) بر میزان تولید آتروپین و اسکوپولامین در ریشه­های مویین تراریخت به مدت 24 ساعت مورد بررسی قرار گرفت. سپس مقادیر دو آلکالویید تروپان، یعنی آتروپین و اسکوپولامین به وسیله­ی روش HPLC اندازه­گیری شد. مقدار آلکالویید­های تروپان به طور معنی­داری در ریشه­های مویین افزایش یافت. نتایج نشان داد که مقدار آتروپین و اسکوپولامین در ریشه­های مویین تراریخت به ترتیب از 12/0 به 715/1 و 0195/0 به 45/0 میلی­گرم در 100 میلی­گرم وزن خشک رسید. متیل­جاسمونات به طور چشمگیری هر دو آلکالویید تروپان، آتروپین و اسکوپولامین را افزایش داد. مقدار آلکالویید­های تروپان در غلظت 300 میکرومولار از متیل­جاسمونات در مقایسه با غلظت 150 میکرومولار و نمونه­ی شاهد افزایش یافت. در نتیجه پیشنهاد می­شود که ریشه­های مویین می­توانند به جای گیاهان به منظور مطالعات بیشتر و تولید آلکالویید­های تروپان در ابعاد اقتصادی و تجاری استفاده شوند.

واژه­های کلیدی: آتروپین، اسکوپولامین، آگروباکتریوم، شابیزک، متیل­جاسمونات.

 

 

 

مقدمه

 

آلکالوییدهای تروپانی هیوسیامین و اسکوپولامین به عنوان ترکیبات آنتی­کلینرژیک (بازدارنده عملکرد استیل­کولین) روی سیستم اعصاب پاراسمپاتیک عمل می­کنند که منحصرا بوسیله­ی خانواده سولاناسه نظیر Atropa sp  Datura sp, Dubiosia sp,  Hyocyamus sp وsp  Scopolia تولید می­شوند (Mi Kang et al., 2004). اسکوپولامین یکی از آلکالوئیدهای اولیه تخلیص شده از منابع گیاهی است که توسط آلبرت لادنبورگ (Albert Ladenburg) در سال 1880 توصیف شد و همچنین یکی از با ارزش­ترین آلکالوئیدهای تروپانی است که تقاضای جهانی آن 10 برابر بیشتر از مجموع هیوسیامین (پیش ساز آن) و آتروپین (داروی نیمه سنتتیک) می­باشد (Moyano et al., 2003). گیاه شابیزک (Atropa belladona) متعلق به خانواده سولاناسه است ویکی از منابع اصلی تولید آلکالوئیدهای تروپانی محسوب می­شود. جنس آتروپا حاوی 4 گونه­ی Atropa acuminate Royle ،Atropa belladonna L.،baetica Wilk  Atropa Atropa pallidiflora Schönb-Tem است که درمنطقه­ی مدیترانه، جنوب اروپا و آسیا پراکنده هستند (Maqbool et al., 2014). ریشه­های مویین القا شده به وسیله­ی آگروباکتریوم رایزوژنز (Agrobacterium rhizogenes) یک روش کارآمد جهت تولید ریشه­های تراریخت فراهم می­کند که تولید و ذخیره­سازی متابولیت­های ثانویه، پروتئین­های نوترکیب و همچنین مطالعات مربوط به بیان و فعال­سازی پروموتور و ژن را امکانپذیر می­نماید (Harfi et al., 2015)، علاوه بر آن مهمترین مزیت ریشه­های مویین در توانایی آن­ها برای تولید بیشتر متابولیت­های ثانویه در مقایسه با گیاه مادری است. بسیاری از متابولیت­های ثانویه­ی با ارزش در شرایط طبیعی در ریشه تولید می­شوند و اغلب در ارتباط با تمایز ریشه هستند. در برخی موارد ممکن است متابولیت­های ثانویه فقط در بخش­های هوایی یک گیاه تولید و تجمع یابند اما با القای ریشه­های مویین و بررسی آن­ها مشخص شده است که قادر به تولید و تجمع آن متابولیت­ها هستند به عنوان مثال آرتیمیزین فقط در بخش­های هوایی گیاه annua Artemisia تولید و تجمع می­یابد در چندین بررسی مشخص شده است که ریشه­های مویین القاء شده در این گیاه قادر به تولید آرتیمیزین هستند (Kim et al., 2001). همچنین این ریشه‌ها حاوی آنزیم‌های متنوعی بوده که انواعی از فرآیندهایی نظیر گلوکوزیلاسیون و احیا را با استفاده از مواد موجود در محیط کشت به عنوان سوبسترا انجام می‌دهند. از این ویژگی برای تولید وسیع و پایدار مواد دارویی گرانقیمت با افزودن ترکیباتی با قیمت پایین‌تر به محیط کشت استفاده شده که موجب صرفه‌جویی در هزینه­ی تولید دارو شده است (Banerjee et al., 2012). در پژوهشی Norouzi et al (2016) گزارش کردند که مقدار تولید متابولیت ثانویه­ی رزمارینک­اسید در کشت ریشه­های مویین مریم گلی اصفهانی (Salvia reuterana) برابر 2/52 میلی­گرم به ازای هر گرم وزن خشک بود. همچنان که محتوای آتروپین در ریشه­های مویین تیمار شده گیاه Datura metal با نانوذرات نقره 147/1، 117/1 و 42/2 برابر در مقایسه با نمونه­های شاهد (116/0 %، 119/0% و 107/0%) به ترتیب بعد از 12، 24 و 48 ساعت از تیمار افزایش یافت (Shakeran et al., 2015). مشخص شده است که با اضافه کردن اسید جاسمونیک و مشتقات آن مانند متیل­جاسمونات به کشت سلول­های گیاهی و یا گیاهان کامل موجب تحریک تولید مقدار زیادی از متابولیت­های ثانویه می­شوند (Kuzma et al., 2009). مقدار ماده­ی ضد التهابی asiaticoside (اسیاتیکوساید) در تیمار با 1/0 میلی­مولار محرک متیل جاسمونات در محیط کشت ریشه­های مویین گیاه Centella asiatica (L.) به مدت سه هفته به مقدار زیادی (12/7 میلی­گرم بر گرم وزن خشک) افزایش یافت. همچنین بیان ژن CabAS (β-amyrin synthase) در ریشه­های مویین پس از 12 ساعت تیمار با متیل­جاسمونات به طور معنی­داری متفاوت از نمونه­ی شاهد بود (Kim et al., 2007). در این تحقیق، ریشه­های مویین تراریخت از ریز­نمونه­های برگ گیاه دارویی شابیزک (Atropa belladonna) با استفاده از نژاد A4 آگروباکتریوم رایزوژنز (Agrobacterium rhizogenes) تولید شد و در بخش دیگر این تحقیق سعی شده است اثر غلظت­های مختلف محرک متیل­جاسمونات بر میزان تولید آلکالوییدهای تروپانی بررسی شود.

مواد و روش­ها

بذور گیاه شابیزک از سازمان جنگل­ ها و مراتع تهران تهیه شد. جهت رفع خواب بذر از اسید جیبرلیک[1] (ساخت شرکت کانادایی Merck) با غلظت 500 میلی­گرم در لیتر به مدت 24 ساعت استفاده شد. برای ضدعفونی بذور از الکل 70 درصد (شرکت Merck) و هیپوکلریت سدیم[2] (ساخت شرکت ایرانی پاکسان) یک درصد به ترتیب به مدت یک دقیقه و بیست دقیقه استفاده شد و در نهایت سه مرتبه با آب مقطر استریل شستشو داده شدند. بذور ضد عفونی شده در محیط کشت آب-آگار کشت شده و تحت شرایط تاریکی و دمای 25درجه­ی سانتیگراد برای جوانه زنی نگهداری شدند. بذور بعد از حدود چهار روز جوانه زده و به محیط کشت MS [3]بدون هورمون حاوی 30 گرم در لیتر ساکارز (شرکت Merck) و 8 گرم در لیتر آگار (شرکت Merck) با pH حدود 7/5 انتقال یافته و بعد از آن گیاهچه­های استریل 3 هفته‌ای بدست آمد. باکتری آگروباکتریوم رایزوژنز نژاد A4 که از آزمایشگاه گروه بیوتکنولوژی و به­نژادی گیاهان زراعی دانشگاه فردوسی مشهد تهیه گردید در محیط کشت مایع LB [4] کشت شده و بر روی شیکر (ساخت شرکت انگلیسی Stuart ) در دمای 28 درجه سانتیگراد به مدت 24 ساعت قرار گرفت. در مرحله­ی بعدی به منظور تلقیح، محیط کشت باکتری به فالکون­های استریل 15 میلی­لیتری منتقل و سپس در دمای 4 درجه سانتیگراد با 4500 دور در دقیقه به مدت 5 دقیقه سانتریفوژ (ساخت شرکت آلمانی Sigma) شد. نهایتاً محلول رویی بیرون ریخته شده و به آن محیط کشت مایع MS استریل اضافه شده و بلافاصله ورتکس (ساخت شرکت ایرانی MX-cell) گردید. سوسپانسیون باکتری با استفاده از سرنگ 2 میلی­لیتری به رگبرگ برگ­های استریل تزریق شد. سپس برگ­های تلقیح شده به محیط کشت جامد  B5انتقال داده شدند و به مدت 72 ساعت هم کشتی انجام شد. سپس ریز نمونه­ها با آب مقطر استریل حاوی 300 میلی­گرم در لیتر آنتی بیوتیک سفوتاکسیم (ساخت شرکت داروسازی جابرابن حیان) شستشو داده شدند و دوباره به محیط کشت جامد B5 حاوی 500 میلی­گرم در لیتر آنتی بیوتیک سفوتاکسیم انتقال یافتند. ریشه­های مویین پس از ظهور (حدود 3 هفته بعد) مدتی در محیط کشت جامد باقی ماندند تا به حد کافی از رشد برسند (حدود 2 الی 3 سانتی­متر). سپس هر کلون ریشه مویین از محل رویش روی برگ جدا شده و به محیط کشت مایع B5 14 1 2'>  با سه تکرار منتقل شدند. ارلن­ها بر روی شیکر (ساخت شرکت آلمانی Memmert) با 90 دور در دقیقه و دمای 25 درجه سانتیگراد در شرایط تاریکی نگهداری شدند. برای تایید انتقال ناحیه­ی T-DNA­ی آگروباکتریوم رایزوژنز به ریشه­های مویین، از واکنش زنجیره­ای پلی­مراز و تکثیر یکی از ژن­های موجود در این ناحیه یعنی ژن rol­B استفاده شد. آغازگرهای الیگونوکلئوتیدی که برای تکثیر قطعه­ی 779 جفت بازی ژن  rol­Bاستفاده شد شامل آغازگر رفت با توالی 5̍-ATGGATCCCAAATTGCTATTCCTTCCACGA-3̍ و آغازگر برگشتی با توالی 5̍-TTAGGCTTCTTTCTTCAGGTTTACTGCAGC-3̍ بود. شرایط واکنش زنجیره­ای پلی­مراز به این صورت انجام شد که، واسرشت اولیه­ی در دمای 95 درجه­ی سانتی­گراد به مدت 5 دقیقه و سپس 30 چرخه شامل واسرشت در 94 درجه­ی سانتی­گراد به مدت 35 ثانیه، اتصال آغازگرها در دمای 55 درجه­ی سانتی­گراد به مدت 35 ثانیه و سنتز رشته­ی جدید در دمای 72 درجه­ی سانتی­گراد به مدت 45 ثانیه و بسط نهایی در 72 درجه­ی سانتی­گراد به مدت 5 دقیقه انجام شد (Sedira et al., 2001). پس از یک ماه که ریشه­های مویین به حداکثر رشد خود رسیدند، جهت اعمال تیمار محرک متیل­جاسمونات (شرکت Merck) استفاده شدند. از مقادیر هم وزن از ریشه­های مویین (2 گرم) در محیط­ کشت مایعB5   14 1 2'> بدون هورمون در 3 سطح 0، 150و 300 میکرو مولار جهت اعمال محرک متیل­جاسمونات استفاده شدند. سپس روی شیکر با سرعت 90 دور در دقیقه در دمای 25 درجه سانتی­گراد قرار گرفتند. 24 ساعت پس از اعمال محرک، ریشه­ها جمع آوری شده و توسط آب مقطر شستشو داده شدند و پس از انجماد خشک[5] به منظور استخراج آلکالوئید در فریزر منفی 80 (ساخت شرکت کره­ای IIshin) نگهداری شدند. جهت استخراج آلکالوئید از ریشه­های مویین گیاه شابیزک 100 میلی­گرم از پودر ریشه­ی مویین با 30 میلی­لیتر اتانول 96 (شرکت Merck) درصد سائیده شده و به مدت 15 ساعت در شرایط رفلاکس (تقطیر برگشتی) قرار گرفتند. عصاره حاصل توسط کاغذ صافی (واتمن 1) فیلتر شده و توسط دستگاه Rotary evaporate  (شرکت ژاپنی National) خشک شد. به بقایای عصاره خشک شده، 60 میلی­لیتر مخلوط حاصل از مقادیر مساوی اسید سولفوریک (شرکت Merck) پنج درصد (v/v) و دی اتیل اتر (شرکت Merck) اضافه شد. فاز آبی جمع آوری شده و pH آن به وسیله سود (شرکت Merck) 10 نرمال تا حدود 10 بالا برده شد. به مخلوط حاصل 60 میلی­لیتر کلروفرم (شرکت Merck) در 3 مرحله اضافه شد و فاز کلروفرمی حاوی آلکالوئیدها توسط دستگاهRotary evaporate خشک شد و باقیمانده در 500 میکرولیتر متانول حل شد و جهت HPLC استفاده گردید. (et al., 2010 Ahmadian Chashmi). برای جداسازی و اندازه­گیری میزان آلکالوئیدهای تروپان از دستگاه HPLC به مدل Waters، در پژوهشکده­ی گیاهان دارویی کرج شامل ستون Teknokroma-C18 به طول 25 سانتی­متر و قطر داخلی 46/0 سانتی­متر، پمپ WATERS-600E، سرعت جریان یک میلی­لیتر در دقیقه، فاز متحرک بافر فسفات 50 میلی­مولار(pH= 3) استونیتریل (50-20) استفاده شد. در این آزمایش برای مقایسه­ی میزان آتروپین و اسکوپولامین در ریشه­های نرمال و تراریخت آزمون T با دو تکرار در سطح احتمال 5 درصد انجام شد و همچنین به منظور بررسی اثر غلظت­های مختلف محرک متیل­جاسمونات آزمایش در قالب طرح کاملا تصادفی با دو تکرار انجام شد. برای محاسبات آماری از نرم افزار JMP نسخه­ی 8 استفاده شد و مقایسه­ی میانگین تیمارها با استفاده از آزمون LSD در سطح احتمال 1 درصد انجام گردید. رسم نمودار نیز از طریق نرم­افزار 2010 Excel صورت گرفت.

 

نتایج و بحث

 پس از گذشت دو هفته از هم کشتی همانطور که در شکل 1 (D)، نشان داده شده علایم اولیه کالوس و ریشه­ی مویین از محل صدمه دیده ظاهر و کلون­های ریشه­ی مویین به فاصله 2 تا 4 روز ظاهر شدند. در بررسی ماهیت تراریختی ریشه­های مویین از واکنش PCR استفاده شد و محصول PCR حاصل از تکثیر این ژن­ها بر روی ژل آگارز (شرکت Merck)، اندازه قطعه­ی مورد انتظار ( شکل2) برای ژن rol­B یعنی 779 جفت بازی را نشان دادند. مقایسه­ی مقدار تولید آتروپین و اسکوپولامین در ریشه­های مویین تراریخت و ریشه­های طبیعی نشان داد که تفاوت معنی­ داری از نظر تولید ماده­ی آتروپین و اسکوپولامین وجود دارد. در جداول 1و 2 مقدار آتروپین و اسکوپولامین به ترتیب در ریشه­های طبیعی برابر با 12/0 و 0195/0 میلی­گرم در 100میلی­گرم وزن خشک بود که این مقدار در ریشه­های مویین تراریخت به ترتیب به 715/1 و 43/0 میلی­گرم در 100میلی­گرم وزن خشک رسید.

 

 

 

 

 

 

شکل 1- A) گیاهچه­ی این­ویترو، B) ریز نمونه برگ، (C ریز نمونه­های تلقیح شده، D) ظهور ریشه­ی مویین، E) استقرار ریشه­های مویین در محیط مایع.

Figure 1- A) In­vitro plantlets, B) Leaf Explant, C) Inoculated explants, D) Emergencing of hairy roots E) Establishment of hairy roots in liquid medium.

 

 

بررسی تولید آلکالویید­های تروپان در ریشه­های مویین گیاه شابیزک تحت تاثیر غلظت­های مختلف متیل­جاسمونات (0، 150و 300 میکرومولار) نشان داد که تولید آتروپین و اسکوپولامین در غلظت­های 150 و 300 میکرومولار نسبت به نمونه­ی شاهد به طور چشمگیری افزایش یافت. به طوری که در حضور 150 و 300 میکرومولار متیل­جاسمونات، مقدار آتروپین این ریشه­ها به ترتیب به 39/4 و 455/5 میلی­گرم در 100میلی­گرم وزن خشک رسید که نسبت به نمونه­ی شاهد که مقدار آتروپین آن برابر 715/1 میلی­گرم در 100 میلی گرم وزن خشک بود حدود 5/1 و 1/2 افزایش یافت. همچنین میزان تولید اسکوپولامین در غلظت­های 150 و 300 میکرومولار نسبت به نمونه­ی شاهد افزایش یافت به طوری که در غلظت­های 150 و 300 میکرومولار به 26/0 و 33/0 میلی­گرم در 100 میلی گرم وزن خشک رسید که نسبت به نمونه­ی شاهد که 12/0 میلی­گرم در 100 میلی گرم وزن خشک بود به ترتیب حدود 16/1 و 75/1 افزایش داشت.


 

 

 

شکل 2- نتایج PCR ژن rolB آگروباکتریوم رایزوژنز، (1و8) سایز مارکر kb 1، (2) باند DNA تکثیر شده­ی آگروباکتریوم رایزوژنز (کنترل مثبت)، (3، 4و 5) باند DNA تکثیر شده از ریشه­های مویین، (6) ریشه طبیعی و (7) آب (کنترل منفی).

Figure 2- PCR analysis of rolB gene of A. rhizogenes , (1, 8) 1 kb DNA Ladder, (2) Amplified band in A. rhizogenes , (positive control), (3, 4, 5) Amplified band from the DNA of hairy roots, (6) Normal root and (7) Water (Negative control).

جدول1- مقایسه­ی میزان آتروپین در ریشه­های طبیعی و تراریخت.

Table 1- Comparison of Atropin contents in normal roots and transformed hairy roots (P ≤ 0.05).

Prob > |t|

خطای استاندارد  Standard Error

مقدارآلکالویید (میلی­گرم در 100 میلی­گرم وزن خشک) Alkaloid content (mg/100mg of dry weight)

نوع ریشه Kind of root

*0.0100

0.025

1.715

آتروپین ریشه­های تراریخت

Atropin in transformed hairy roots

 

0.025

0.12

آتروپین در ریشه­های طبیعی

Atropin in normal roots

 

جدول 2- مقایسه میزان اسکوپولامین در ریشه­های نرمال و تراریخت .

Table 2- Comparison of Scopolamine contents in normal roots and transformed hairy roots (P ≤ 0.05).

Prob > |t|

خطای استاندارد  Standard Error

مقدارآلکالویید (میلی­گرم در 100 میلی­گرم وزن خشک) Alkaloid content (mg/100mg of dry weight)

نوع ریشه Kind of root

*0.0147

0.0095

0.43

اسکوپولامین ریشه­های تراریخت

Scopolamine in transformed roots

 

0.0095

0.0195

اسکوپولامین ریشه­های طبیعی

Scopolamine in normal roots

 

 

 


 اگرچه میزان آلکالویید­های تروپانی در غلظت 300 میکرومولار متیل­جاسمونات نسبت به غلظت 150 میکرومولار افزایش می­یابد اما این تفاوت از لحاظ آماری معنی­دار نمی­باشد (شکل3). ریشه­های مویین حاصل از گیاه شابیزک (Atropa belladonna) با رشد سریع و تولید قابل اطمینان آلکالوییدهای تروپان همراه است و شهرت آن­ها به خاطر تولید بالای متابولیت­های ثانویه می­باشد (Bensaddek et al., 2000) در تحقیق حاضر نیز آلکالوییدهای تروپانی تولیدی توسط ریشه­های مویین بیشتر از ریشه­های طبیعی گیاه شابیزک است همچنین افزودن محرک­ها به محیط کشت سلول­های گیاهی از روش­های رایج برای بالا بردن متابولیسم ثانویه می­باشد. اسید جاسمونیک و مشتق فرار آن یعنی متیل­جاسمونات که جمعاً با هم جاسمونات­ها خوانده می­شوند از هورمون­های تنش گیاهی هستند که به عنوان تنظیم کنند­های پاسخ دفاعی عمل می­کنند. القاء انباشتگی متابولیت ثانویه یک پاسخ تنشی مهمی است که وابسته به جاسمونات­ها به عنوان علامت تنظیمی است (Memelink et al., 2011). در تحقیقی که بر روی تولید اسیدرزمارینک در کشت ریشه­ی مویین گیاه ریحان (Ocimum basilicum) انجام شده است، مقدار این ماده­ی آنتی اکسیدان در ریشه­های مویین تراریخت 3 برابر ریشه­های غیر تراریخت گزارش شده است (Bais et al., 2002). برجسته­ترین مثال افزایش متابولیت­های ثانویه در ریشه­های مویین تراریخت گیاه Vitis amurensis گزارش شد که منجر به افزایش 100برابری تولید ماده­ی ضدسرطان رسوراترول (resveratrol) شد (Kiselev et al., 2007). القای ریشه­ی مویین در گیاه Hyoscyamus muticus موجب تولید کلونی کالوس­زا باقابلیت تولید اسکوپولامین بالا (72/2 میلی­گرم برگرم) شد، به نحوی که این میزان برای ریشه­های مویین این گیاه چشم­گیر بود (Zolala, 2002). در تحقیقی که بر روی تولید سولاسودین در کشت ریشه­ی مویین گیاه Solanum trilobatum L انجام شد. مشاهده شد که مقدار این آلکالویید در ریشه­های مویین تراریخت به 3/3 برابر ریشه­های غیر تراریخت رسید. همچنین با اضافه کردن 4 میکرومولار محرک متیل­جاسمونات به مدت دو هفته به محیط کشت تولید این ماده نسبت به نمونه شاهد و ریشه­های غیر­تراریخت به ترتیب به 9/1 و 5/6 برابر افزایش یافت (Shilpha et al., 2015). در بررسی که به منظور مقایسه­ی تأثیر محرک­های متیل­جاسمونات، عصاره­ی مخمر و الیگوگالاکتورونیدها برانباشتگی آلکالوئیدهای لیتورین، هیوسیامین و اسکوپولامین در ریشه­های مویین گیاه Datura stramonium انجام شد، نتیجه گرفتند که در حضور محرک متیل­جاسمونات بیش از عصاره مخمر و الیگوگالاکتورونید (متیل­جاسمونات>عصاره مخمر>الیگوگالاکتورونید) تولید آلکالوئیدهای تروپانی در ریشه­های مویین این گیاه افزایش می­یابد (Zabetaki et al., 1999).


 

 

 

 

 

 

 

a′

 

 

 

 

شکل3- مقایسه میانگین میزان آتروپین و اسکوپولامین بعد از تیمار غلظت­های مختلف متیل­جاسمونات. حروف متفاوت نشان دهنده­ی تفاوت معنی-دار بین میانگین­هاست. (حروف a و b برای اسکوپولامین و حروفa′، b′ برای آتروپین).

Figure 3- The mean comparison of Atropine and Scopolamine contents after treating by different concentrations of methy­jasmonate. Different letters show significant differences between the means (P ≤ 0.01). (a and b letters for Scopolamine and a and bfor Atropine).

جدول 3- تجزیه واریانس مربوط به آتروپین.

Table 3- Variance analysis for Atropin.

میانگین مربعات

Mean of Squares

درجه­آزادی

ِِِِِDegree of freedom

منابع تغییرات

SOV

**7.425

2

غلظت  concentration

0.2337

3

خطا     Error

 

5

کل    Total

** معنی­دار در سطح احتمال 1%.                                                                  Significant difference at 1% level respectively.

 

جدول 4- تجزیه­ی واریانس برای اسکوپولامین

Table 4-Variance analysis for Scopolamine.

میانگین مربعات

Mean of squares

درجه­آزادی

Degree of freedom

منابع تغییرات    

SOV

**0.0229

2

غلظت  concentration

0.0002

3

خطا   Error

 

5

کل   Total

** معنی­دار در سطح احتمال 1%.                                                                 Significant difference at 1% level respectively.

 

 

در پژوهشی Mehrabani et al. (2013) اثرغلظت­های مختلف (0، 50، 10 و 100 میکرومولار) محرک­های اسید سالیسیلیک و متیل جاسمونات را بر کشت کالوس گیاه چای کوهی (Stachys lavandulifolia Vahi) به منظور افزایش فنول کل مورد بررسی قرار دادند. بیشترین میزان فنول مربوط به تیمار 10 میکرو­مولار متیل­جاسمونات، برابر 81/0 میلی­گرم اسید گالیک بر گرم وزن تر بود.محتوی تروپینون، تروپین و سودوتروپین در گیاه Datura stramonium در تیمار با 7-10 و 6-10 مولار متیل جاسمونات افزایش یافت (Deng,2005). بیشترین مقدار اسکوپولامین (بیش از 100% در مقایسه با نمونه شاهد) بعد از 48 ساعت و هیوسیامین (بیش از 700%) بعد از 12 ساعت در تیمار با غلظت دو میلی­مولار متیل­جاسمونات در کشت ریشه­های نابجای گیاه Scopolia parviflora بدست آمد. غلظت یک میلی­مولار متیل­جاسمونات نیز محتوای اسکوپولامین و هیوسیامین افزایش داد اما مقدار آن کمتر از غلظت دو میلی­مولار بود (Mi Kang et al., 2004). در کشت ریشه­های مویین گیاه Salvia miltiorrhiza مقدار رزمارینیک اسید و لیتوسپرمیک اسید در تیمار با 1/0 میلی­مولار محرک متیل­جاسمونات به طور چشم­گیری به ترتیب تقریبا از 25/3 به 02/6 درصد 92/2 و 3/19 درصد وزن خشک افزایش یافت (Xiao et al., 2009) تولید آرتیمیزین (Artemisinin) در ریشه­های مویین Artemisia annua L در تیمار با 2/0 میلی­مولار متیل­جاسمونات و دو میلی­گرم در میلی­لیتر عصاره مخمر به ترتیب 5/1 و 2/0 میکروگرم در میلی­گرم وزن خشک افزایش یافت (Putalun et al., 2007). در تحقیق حاضر نیز در ریشه­های مویین گیاه شابیزک تولید آتروپین و اسکوپولامین در حضور متیل جاسمونات بیشتر از تیمار شاهد است. با توجه به اینکه مقدار تولید آلکالویید­های تروپانی در ریشه­های مویین تراریخت نسبت به ریشه­های طبیعی اختلاف معنی­داری داشت و همچنین کاربرد محرک متیل­جاسمونات در این زمینه موثر بوده است می­توان نتیجه گرفت که تولید ریشه­های مویین به همراه کاربرد محرک­ها برای تولید متابولیت­های با ارزش از جمله آلکالوییدهای تروپانی در ابعاد وسیع قابل توجه می­ باشد.

 

 

 

منابع

Ahmadian Chashami N, Sharifi M, Karimi F, Rahnama H (2010). Differential Production of Tropane Alkaloids in Hairy Roots and in vitro Cultured Two Accessions of Atropa belladonna L. under Nitrate Treatments. Plant Biology 2: 67-73.

Bais HP, Walker TS, Schweizer HP, Vivanco J.M (2002). Root specific elicitation and antimicrobial activity of rosmarinic acid in hairy root cultures of Ocimum basilicum. Plant Physiology and Biochemistry 40: 983-995.

Banerjee S, Singh S, Rahman LU (2012). Biotransformation studies using hairy root cultures — A review. Biotechnology Advances 30: 461-468.

Bensaddek L, Gillet F, Edmundo J, Saucedo N, Fliniaux MA (2001). The effect of nitrate and ammonium concentrations on growth and alkaloid accumulation of Atropa belladonna hairy roots. Journal of Biotechnology 85: 35-40.

Deng F (2005). Effects of glyphosate, chlorsulfuron, and methyl jasmonate on growth and alkaloid biosynthesis of jimsonweed (Datura stramonium L.). Pesticide Biochemistry and Physiology 82: 16-26.

Harfi B, Khelifi-Slaoui M, Bekhouche M, Benyammi R, Hefferon K, Makhzoum A, Khelifi L (2015). Hyoscyamine production in hairy roots of three Datura species exposed to high-salt medium. In Vitro Cellular and Developmental Biology-Plant 52:92-98.

Kim OT, Bang KH, Shin YS, Lee MJ, Jung SJ, Hyun DK, Kim YC, Seong NS, Cha SW, Hwang B (2007). Enhanced production of asiaticoside from hairy root cultures of Centella asiatica (L.) Urban elicited by methyl jasmonate. Plant Cell Reproduction 26:1941–1949.

Kim Y, Wyslouzil B, Weathers P (2001) Secondary of hairy metabolism root cultures in bioreactors- A review. In Vitro Cellular and Developmental. Biology-Plant 38: 1–10.

Kiselev KV, Dubrovina AS, Veselova MV, Bulgakov VP, Fedoreyev SA, Zhuravlev YN (2007). The rolB gene-induced overproduction of resveratrol in Vitis amurensis transformed cells. Biotechnology 128: 681–92.

Kuzma L, Bruchajzer E, Wysokińska H (2009). Methyl jasmonate effect on diterpenoid accumulation in Salvia sclarea hairy root culture in shake flasks and sprinkle bioreactor. Enzyme and Microbial Technology 44: 406-410.

 Maqbool F, Singh S, AKaloo Z, Jan M (2014). Medicinal importance of Genus Atropa Royle -A review. Advanced Research 2: 48-54.

Mehrabani B, Nazeri S, Piri Kh (2013). Evaluation of total produced phenol in Chaei Koohi (Stachys lavandulifolia Vahi) callus culture and possibility of its enhancement using Elicitors. Journal of Agricultural Biotechnology 2: 77-88.

Memelink J, Verpoorte R, W. Kijne J (2001). ORCAnization of jasmonateresponsive gene expression in alkaloid metabolism. Trends in Plant Science 5: 212-218.

Mi Kang S, Young Jonh H, Min Kang Y, Jin Yun D, Dong Bahk J, kyung Yang J, Suk Choi, M (2004). Effects of methyl jasmonate and salicylic acid on the production of tropane alkaloids and the expression of PMT and H6H in adventitious root cultures of Scopolia parviflora. Plant Science 166: 745-751.

Moyano E, Jouhikainen K, Tammela P, Palazon J, Cusido R M, Pinol M T, Oksman‐Caldentey K M (2003). Effect of pmt gene overexpression on tropane alkaloid production in transformed root cultures of Datura metel and Hyoscyamus muticus. Experimental Botany 54: 203-211.

Norouzi R, Babalar M, Mirmasoumi M, Hadian J (2016). Production of rosmarinic acid in hairy root cultures of Salvia reuterana. Journal of Agricultural Biotechnology 1: 126-138.

Putalun W, Luealon W, De-Eknamkul W, Tanaka H, Shoyama Y (2007). Improvement of artemisinin production by chitosan in hairy root cultures of Artemisia annua L. Biotechnology Letter 29:1143–1146.

Sedira M, Holefors A, Welander M (2001). Protocol for transformation of the apple rootstock Jork 9 with the rolB gene and its influence on rooting. Plant Cell Reports 20: 517-524.

Shilpha J, Satish L, Kavikkuil M, Joe Virgin Largia M, Ramesh M (2015). Methyl jasmonate elicits the solasodine production and anti-oxidant activity in hairy root cultures of Solanum trilobatum L. Industrial Crops and Products 71: 54–64.

Shakeran Z, Keyhanfar M, Asghari G, Ghanadian M (2015). Improvement of atropine production by different biotic and abiotic elicitors in hairy root cultures of Datura metel. Biology 39: 111-118.

Xiao Y, Gao Sh, Di P, Chen J, Chen W, Zhang L (2009). Methyl jasmonate dramatically enhances the accumulation of phenolic acids in Salvia miltiorrhiza hairy root cultures Physiologia Plantarum 137: 1–9.

Zabetakis I, Edwards R, O'Hagan D (1999). Elicitation of tropane alkaloid biosynthesis in transformed root cultures of Datura stramonium. Phytochemistry 50: 53-56.

Zolala J (2002). Evaluation of growth characteris of hairy root produced by inoculation of Rhizobium from rhizogenes family in Hyoscyamus muticus plant. Msc. Thesis, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran.

 


The effect of methyljasmonate elicitor on tropan alkaloid production in hairy roots of Atropa belladonna

 

Kheradmand Prouch M. 1, Shahriari Ahmadi F.* 2, Moshtaghi N.3

 

 

1 MSc of Agricultural Biotechnology, Agricultural College, Ferdowsi University of Mashhad. Mashhad, Iran.

2 Professor, Biotechnology and plant Breeding Department, Agricultural College, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran.

3 Associate Professor Biotechnology and plant Breeding Department, Agricultural College, Ferdowsi University of Mashhad. Mashhad, Iran.

 

Abstract

The parasympatholytic tropane alkaloids, Atropine and Scopolamine, accumulated in Atropa belladonna, are of great interest for the pharmaceutical industry. In this research, Atropa belladonna transformed hairy roots were produced by Agrobacterium rhizogenes strain A4 mediated transformation. Effects of different concentrations of methyl jasmonate (0, 150 and 300 Micro molar) were investigated on production of Atropine and Scopolamine in 24 hours treatment. Then the contents of two tropane alkaloids, Atropine and Scopolamine, were assayed by HPLC method. The tropane alkaloids contents were shown to be significantly increased in transformed hairy roots. Results showed Atropine and Scopolamine content in transformed hairy roots reached respectively from 0.12 to 1.715 and 0.0195 to 0.43 of mg in 100 mg of dry weight. Methyl jasmonate dramatically enhanced both tropane alkaloids, Atropine and Scopolamine. Tropane alkaloids content increased in 300 Mµ concentration of methyl jasmonat in comparison with 150 Mµ concentration and control treatment. In conclusion, it is suggested that, hairy root can be used as a replacement of plants in further studies and for tropane alkaloids production in economical and commercial scales.

Keywords: Atropin, Scopolamine, Agrobacterium, Atropa belladonna, Methyl jasmonate.

 

 

 

 

 

 

 

 



* * نویسنده مسئول: فرج­الله شهریاری احمدی                        تلفن: 38805725-051                           Email: shahriari@um.ac.ir

[1] Gibberellic acid

[2]Sodium hypochlorite

[3]Murash& Skoog (1962)

[4] Luria Bertini

[5]Freezdry                                                                                                                                                                                 

 

* Corresponding Author: Shahriari Ahmadi F.            Tel: +985138805725                Email: shahriari@um.ac.ir

Ahmadian Chashami N, Sharifi M, Karimi F, Rahnama H (2010). Differential Production of Tropane Alkaloids in Hairy Roots and in vitro Cultured Two Accessions of Atropa belladonna L. under Nitrate Treatments. Plant Biology 2: 67-73.
Bais HP, Walker TS, Schweizer HP, Vivanco J.M (2002). Root specific elicitation and antimicrobial activity of rosmarinic acid in hairy root cultures of Ocimum basilicum. Plant Physiology and Biochemistry 40: 983-995.
Banerjee S, Singh S, Rahman LU (2012). Biotransformation studies using hairy root cultures — A review. Biotechnology Advances 30: 461-468.
Bensaddek L, Gillet F, Edmundo J, Saucedo N, Fliniaux MA (2001). The effect of nitrate and ammonium concentrations on growth and alkaloid accumulation of Atropa belladonna hairy roots. Journal of Biotechnology 85: 35-40.
Deng F (2005). Effects of glyphosate, chlorsulfuron, and methyl jasmonate on growth and alkaloid biosynthesis of jimsonweed (Datura stramonium L.). Pesticide Biochemistry and Physiology 82: 16-26.
Harfi B, Khelifi-Slaoui M, Bekhouche M, Benyammi R, Hefferon K, Makhzoum A, Khelifi L (2015). Hyoscyamine production in hairy roots of three Datura species exposed to high-salt medium. In Vitro Cellular and Developmental Biology-Plant 52:92-98.
Kim OT, Bang KH, Shin YS, Lee MJ, Jung SJ, Hyun DK, Kim YC, Seong NS, Cha SW, Hwang B (2007). Enhanced production of asiaticoside from hairy root cultures of Centella asiatica (L.) Urban elicited by methyl jasmonate. Plant Cell Reproduction 26:1941–1949.
Kim Y, Wyslouzil B, Weathers P (2001) Secondary of hairy metabolism root cultures in bioreactors- A review. In Vitro Cellular and Developmental. Biology-Plant 38: 1–10.
Kiselev KV, Dubrovina AS, Veselova MV, Bulgakov VP, Fedoreyev SA, Zhuravlev YN (2007). The rolB gene-induced overproduction of resveratrol in Vitis amurensis transformed cells. Biotechnology 128: 681–92.
Kuzma L, Bruchajzer E, Wysokińska H (2009). Methyl jasmonate effect on diterpenoid accumulation in Salvia sclarea hairy root culture in shake flasks and sprinkle bioreactor. Enzyme and Microbial Technology 44: 406-410.
 Maqbool F, Singh S, AKaloo Z, Jan M (2014). Medicinal importance of Genus Atropa Royle -A review. Advanced Research 2: 48-54.
Mehrabani B, Nazeri S, Piri Kh (2013). Evaluation of total produced phenol in Chaei Koohi (Stachys lavandulifolia Vahi) callus culture and possibility of its enhancement using Elicitors. Journal of Agricultural Biotechnology 2: 77-88.
Memelink J, Verpoorte R, W. Kijne J (2001). ORCAnization of jasmonateresponsive gene expression in alkaloid metabolism. Trends in Plant Science 5: 212-218.
Mi Kang S, Young Jonh H, Min Kang Y, Jin Yun D, Dong Bahk J, kyung Yang J, Suk Choi, M (2004). Effects of methyl jasmonate and salicylic acid on the production of tropane alkaloids and the expression of PMT and H6H in adventitious root cultures of Scopolia parviflora. Plant Science 166: 745-751.
Moyano E, Jouhikainen K, Tammela P, Palazon J, Cusido R M, Pinol M T, Oksman‐Caldentey K M (2003). Effect of pmt gene overexpression on tropane alkaloid production in transformed root cultures of Datura metel and Hyoscyamus muticus. Experimental Botany 54: 203-211.
Norouzi R, Babalar M, Mirmasoumi M, Hadian J (2016). Production of rosmarinic acid in hairy root cultures of Salvia reuterana. Journal of Agricultural Biotechnology 1: 126-138.
Putalun W, Luealon W, De-Eknamkul W, Tanaka H, Shoyama Y (2007). Improvement of artemisinin production by chitosan in hairy root cultures of Artemisia annua L. Biotechnology Letter 29:1143–1146.
Sedira M, Holefors A, Welander M (2001). Protocol for transformation of the apple rootstock Jork 9 with the rolB gene and its influence on rooting. Plant Cell Reports 20: 517-524.
Shilpha J, Satish L, Kavikkuil M, Joe Virgin Largia M, Ramesh M (2015). Methyl jasmonate elicits the solasodine production and anti-oxidant activity in hairy root cultures of Solanum trilobatum L. Industrial Crops and Products 71: 54–64.
Shakeran Z, Keyhanfar M, Asghari G, Ghanadian M (2015). Improvement of atropine production by different biotic and abiotic elicitors in hairy root cultures of Datura metel. Biology 39: 111-118.
Xiao Y, Gao Sh, Di P, Chen J, Chen W, Zhang L (2009). Methyl jasmonate dramatically enhances the accumulation of phenolic acids in Salvia miltiorrhiza hairy root cultures Physiologia Plantarum 137: 1–9.
Zabetakis I, Edwards R, O'Hagan D (1999). Elicitation of tropane alkaloid biosynthesis in transformed root cultures of Datura stramonium. Phytochemistry 50: 53-56.
Zolala J (2002). Evaluation of growth characteris of hairy root produced by inoculation of Rhizobium from rhizogenes family in Hyoscyamus muticus plant. Msc. Thesis, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran.