Document Type : Research Paper
Authors
1 M. Sc. Student, Department of Biotechnology and Plant Breeding, Department of Biotechnology and Plant Breeding, Faculty of Agriculture, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran.
2 Assistant professor, Department of Biotechnology and Plant Breeding, Faculty of Agriculture, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran.
3 Professor, Department of Chemistry, Faculty of Science, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran.
4 Associate professor, Department of Biotechnology and Plant Breeding, Faculty of Agriculture, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran.
Abstract
Keywords
1دانشجوی سابق کارشناسی ارشد بیوتکنولوژی، گروه بیوتکنولوژی و به نژادی گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه فردوسی مشهد، ایران.
2استادیار گروه بیوتکنولوژی و به نژادی گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه فردوسی مشهد، ایران.
3استاد گروه شیمی، دانشکده علوم، دانشگاه فردوسی مشهد، ایران.
4دانشیار گروه بیوتکنولوژی و به نژادی گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه فردوسی مشهد، ایران.
تاریخ دریافت: 11/10/1395، تاریخ پذیرش: 22/04/1396
اهمیت اقتصادی قابل توجه و طیف وسیع کاربرد آمیلازهای مقاوم به حرارت در صنایع، نیاز برای تولید آمیلازها با خصوصیات مطلوب صنعتی را بطور چشمگیری افزایش داده است. فلور باکتریایی چشمه‌های آبگرم به واسطه تحمل بالا به حرارت و پایداری در pHهای متفاوت می‌توانند به عنوان منابع جدیدی برای تولید α-آمیلاز مورد استفاده قرار گیرند. در این پژوهش چشمه آبگرم هیپرترمال قینرجه برای شناسایی فلور باکتریایی آبگرم به لحاظ میزان تولید α-آمیلاز مورد بررسی قرار گرفت. کلون‌های باکتریایی احتمالی تولید کننده آمیلاز براساس ویژگی‌های بیوشیمیایی و همچنین روش‌های مولکولی شناسایی شدند. در مرحله بعد شرایط رشد باکتری ایزوله شده و تولید آنزیم آمیلاز نیز مورد بهینه سازی قرار گرفت و در نهایت بعد از تخلیص آنزیم از کلون‌های باکتریایی شناسایی شده خصوصیات بیوشیمیاییα -آمیلاز از لحاظ کاربرد در صنعت بررسی گردید. نتایج این تحقیق نشان داد که کلون باکتری جدا شده از جنس Bacillus بوده و به لحاظ خصوصیت یک آنزیم آمیلاز مقاوم به حرارت و غیر وابسته به یون کلسیم می باشد. بطوری که آنزیم آمیلاز تخلیص شده در دمای 80 درجه سانتیگراد و 8~pH حداکثر فعالیت خود را نشان داده و در محدوده دمایی 50-70 درجه سانتیگراد 80% از فعالیت هیدرولیزی خود را حفظ می‌کند. همچنین نتایج نشان داد که آنزیم در طیف وسیعی از pH قلیایی و اسیدی (5/3-10) فعال و پایدار می‌باشد. بطور کلی براساس نتایج حاصل، این سویه باکتری می‌تواند منبع مناسبی جهت تولید آنزیم آمیلاز متحمل به حرارت با پایداری عملکردی بالا جهت کاربرد در صنعت باشد.
واژه کلیدی: آمیلاز، چشمه آب گرم، مقاوم به حرارت،یون کلسیم.
امروزه آنزیم‌ها کاربرد بسیاری در صنایع غذایی، شوینده‌ها، کاغذ سازی، نساجی و حذف آلاینده‌های شیمیایی و نفتی دارند (Hmidet et al., 2008; Suman & Ramesh, 2010; Asoodeh et al., 2013). از میان آنزیم‌های صنعتی، آنزیم‌های آمیلولیتیک، گروه بزرگی از هیدرولاز‌های نشاسته و آنزیم‌های خویشاوند را تشکیل می‌دهند. این آنزیم‌ها روی نشاسته، پولولان، گلیکوژن و دیگر الیگو و پلی ساکارید‌های مربوطه فعال اند و تقریبا 30% از بازار تجاری آنزیم‌ها را به خود اختصاص داده
اند (Pandey et al., 2000; Janecek, 2009; Kikani & Singh, 2011).
α-آمیلازها شناخته شده‌ترین آنزیم‌های آمیلولیتیک و متعلق به خانواده 13 (GH13) گلیکوزید هیدرولاز‌ها هستند (Sivaramakrishnan et al., 2006; Janecek et al., 2014). اعضای خانواده α-آمیلازها پروتئین‌های چند قلمرو[1] هستند. قلمرو A حاوی قلمرو کاتالیتیکی اصلی در فرم بشکه (β/α)8 است و به قلمرو B ختم می‌شود. قلمرو B، دومین کوچکی است در برگیرنده لوپ سوم در محل اتصال رشته β3 به هلیکس α3، است. قلمرو C، دومین ساندویچ-β را شامل می‌شود. تیپ بشکه‌ای α-آمیلاز در تمام اعضا خانواده α-آمیلاز تایید شد که ساختار سه بعدی آنها در حال حاضر مشخص شده است (Nielsen & Borchert, 2000;Van der Maarel et al., 2002; Janecek, 2009; Souza et al., 2010). a-آمیلاز (EC 3.2.1.1) شناخته شده‌ترین اندوآمیلاز است و سبب کاهش سریع ویسکوزیته محلول نشاسته می‌شود (Horváthová et al., 2000). این آنزیم هیدرولیز پیوندهای داخلی a-1و4-O-گلیکوزیدی در پلی ساکاریدها با حفظ ساختار a-آنومریک در محصولات را کاتالیز می‌کند (Mollania et al., 2010; Janecek et al., 2014). اکثر α-آمیلازهای شناخته شده دارای یون کلسیم حفاظت شده هستند، که برای داشتن یک آنزیم پایدار و فعال ضروری شناخته می‌شود. گزارش شده است که یون کلسیم سبب افزایش فعالیت و پایداری حرارتی آنزیم و ایجاد یک ساختار فشرده می‌شود (Janecek et al., 2000; Nielsen & Borchert, 2000 Sivaramakrishnan et al., 2006).
گسترده‌ترین کاربرد α-آمیلاز در صنایع نشاسته برای هیدرولیز نشاسته در فرآیند مایع سازی نشاسته به شربت‌های فروکتوز و گلوکز می‌باشد. در اکثر مراحل فرآوری نشاسته دمای بسیار بالا (بیش از 90 درجه سانتیگراد) مورد نیاز است (Kikani & Singh, 2011). اگرچه باکتری‌های متعلق به جنس Bacillus برای تولید تجاری آمیلاز مقاوم به حرارت با نیم عمر و پایداری عملکردی بالا مورد استفاده قرار می‌گیرند (Bertoldo & Antranikian, 2002; Rasooli, 2008). اما، در مرحله هیدرولیز آنزیمی نشاسته که بلافاصله بعد از ژلاتینه شدن صورت می‌گیرد، pH دوغاب نشاسته در حدود 5/4 است؛ درحالیکه pH بهینه بسیاری از a-آمیلازهای صنعتی تقریبا 6-7 است و در pHهای اسیدی ناپایدارند(Hassan et al., 2011; Asoodeh et al., 2013). در سال‌های اخیر، تلاش جهت یافتن a-آمیلازهای مقاوم به حرارت و فعال در pH پایین که امتیازاتی برای افزایش کارایی فرآوری نشاسته است، انجام گرفته است (Kaneko et al., 2005; Sajadi et al., 2005; Hmidet et al., 2008; Mollania et al., 2010; Bai et al., 2012; Asoodeh et al., 2013).
در تحقیق حاضر، خالص سازی و بررسی خصوصیات بیوشمیایی a-آمیلاز متعلق به Bacillus sp. جدا شده از چشمه آبگرم قینرجه با هدف شناسایی آنزیم α-آمیلاز با خصوصیات مطلوب مورد مطالعه قرار گرفته است.
مواد و روش‌ها
|
شکل 6:(A) تاثیر تغییراتpHبر فعالیت نسبی آنزیم. (B) تغییرات میزان پایداری آنزیم در pHهای مختلف. (C) تاثیر دما بر فعالیت آنزیم (D) و بررسی پایداری آنزیم در دماهای مختلف در حضور و عدم حضور یون کلسیم. Figure 6: (A) Effect of pH on relative activity of enzyme (B) Effect of pH on enzyme stability (C) Effect of temperature on enzyme activity (D) and effect of temperature on enzyme stability in the presence and absence of Ca2+ ion.
|
نمونه‌های آب از چشمه آبگرم قینرجه واقع در استان اردبیل در 15 کیلومتری جنوب غربی شهرستان مشکین شهر و در ارتفاع 1240متری دامنه شمالی سبلان )۱۷َ º۳۸عرض شمالی و ۱۴َ º۴۷ طول شرقی(، جمع آوری شد. نمونه‌ها در محیط کشت LB[2] آگار حاوی 1/0% (w/v) تریپتون یا پپتون، 5/0% (w/v) NaCl و 5/0% (w/v) عصاره مخمر و 5/1% (w/v) آگار کشت شدند و در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 24 ساعت انکوبه شد. سپس کلون‌های باکتریایی جهت سنجش فعالیت a-آمیلازی در محیط کشت نشاسته آگار حاویLB آگار به همراه یک درصد نشاسته (1% w/v) در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 24 ساعت کشت شدند. بعد از گذشت 24 ساعت، بر روی محیط کشت محلول لوگول (معرف نشاسته) ریخته شد. سپس براساس قطر هاله سفید رنگ که نشان‌دهنده هیدرولیز شدن نشاسته و تولید آنزیم توسط کلون است، کلون‌ها جداسازی و انتخاب شدند
در ابتدا شناسایی باکتری تولید کننده آمیلاز با استفاده دستورالعمل برگی به روش بیوشیمیایی انجام گرفت (Bergey & Holet, 1996). سپس جهت تایید شناسایی باکتری توالی ژن رمزکننده 16S rDNA مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. ژن 16S rDNA باکتری تولید کننده آمیلاز توسط آغازگر‌های عمومی
8F:5´-AGTTTGATCCTGGCTCAG-3´ و 1492R:5´-GGTTACCTTACGACGACTT-3´ تکثیر شد (Asoodeh et al., 2010). جهت آنالیز روابط فیلوژنی، توالی مورد نظر در بانک ژن NCBI مورد جستجو و آنالیز BLAST قرار گرفت. در انتها، با استفاده از نرم افزار MEGA 5 و الگوریتم UPGMA درخت فیلوژنی ترسیم شد.
جهت تعیین دمای بهینه برای رشد باکتری و تولید آنزیم سه دمای 37، 42 و 50 درجه سانتیگراد و همچنین، برای انتخاب محیط کشت بهینه چهار محیط کشت مختلف شامل: (M1) LB مایع، نشاسته 1% (w/v)؛ (M2) LB مایع ، نشاسته 1% (w/v)، پپتون 1% (w/v)، فروکتوز 1% (w/v)؛ (M3) نشاسته 1% (w/v)، پپتون 1% (w/v)، مالتوز 1% (w/v)؛ (M4) نشاسته 1% (w/v)، پپتون 1% (w/v)، مالتوز 1% (w/v)، عصاره مخمر 1 (w/v)مورد ارزیابی قرار گرفتند. به منظور بررسی شرایط بهینه رشد در دوره های زمانی هر 4 ساعت به مدت 84 ساعت از محیط کشت حاوی باکتری نمونه گیری انجام قرائت OD در طول موج 600 نانومتر انجام گرفت. برای تعیین دما و محیط کشت بهینه برای تولید آنزیم، ابتدا نمونه به مدت 15 دقیقه با دور rpm 12000 در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شد و روشناور جهت سنجش فعالیت آنزیم مورد بررسی قرار گرفت (Aiyer et al.2004; Vahidi et al., 2005).
برای این منظور، سولفات آمونیوم (85%) به عصاره آنزیم خام افزوده شد و به مدت 24 ساعت در دمای 4 درجه سانتیگراد نگه داری شد. رسوب حاصل از غلظت اشباع 85 درصدی سولفات آمونیوم در کمترین مقدار بافر Tris-HCl 20 میلی مولار با 4/7 ~pH (بین 2 تا 4 میلی‌لیتر) حل و درون کیسه الترافیلتراسیون با توانایی نگهداری 12 کیلودالتون دیالیز گردید (Asoodeh & et al., 2013). محلول دیالیز شده از ستون کروماتوگرافی تبادل یونی، از نوع Q-sepharose (5 14أ—'>2 سانتی متر) که یک تبادل کننده قوی آنیونی است، عبور داده شد. سپس این ستون با بافر Tris-HCl 20 میلی مولار با 4/7 ~pH به pH مورد نظر رسید. پس از بارگیری نمونه، ستون با بافر Tris-HCl 20 میلی مولار با غلظت های 1/0-8/0 مولار NaCl شست شو داده شد. تمامی فرکشن‌های خروجی ستون جمع آوری شد و OD280 آنها برای بررسی فعالیت حضور پروتئین خوانده شد. همچنین در نهایت این فرکشن‌ها از لحاظ وجود آنزیم ارزیابی شدند (Asoodeh et al., 2010, 2013).
جهت سنجش فعالیت آنزیم، در هر مرحله از روند خالص سازی از روش Bernfeld (1955) تغییر یافته توسط Sigma-Aldrich™، استفاده شد. برای سنجش میزان فعالیت آنزیم در هر مرحله، آنزیم تخلیص شده به بافر فسفات با 5/6 ~pH حاوی نشاسته محلول 1% اضافه شد. در ادامه فعالیت آنزیم با روش DNS[3] سنجیده شد که مبتنی بر غلظت قند احیاء شده است. همچنین به منظور اطلاع از غلظت پروتئین در هر مرحله از روند خالص‌سازی، از روش تغییر یافته برادفورد استفاده شد (Bradford, 1976) و سپس با استفاده از غلظت‌های مختلف سرم آلبومن گاوی (BSA) (غلظت های بین 1-03/0) نمودار استاندارد رسم گردید.
به منظور بررسی میزان پروتئین‌های حذف شده یا رسوب کرده در طی مراحل خالص‌سازی آنزیم، اطمینان از خالص‌سازی کامل نمونه در کروماتوگرافی و تعیین وزن مولکولی نمونه آنزیم تخلیص شده، از روش الکتروفورز پلی آکریل آمید-سدیم دودسیل سولفات[4] استفاده شد. بافر‌های الکتروفورز SDS-PAGE بر طبق سیستم بافر لائملی (Laemmli, 1970) اجراشد. در این تحقیق از ژل جداکننده 12 درصد و ژل متراکم‌کننده 2 درصد استفاده شد. سپس فراکشن‌های حاوی آنزیم به نسبت 1:4 با بافر نمونه حاوی: 9/3 میلی‌لیتر آب مقطر دیونیزه، 0/1 میلی‌لیتر Tris base 5/0 مولار با 8/6 ~pH، 8/0 میلی‌لیتر گلیسرول، 6/1 میلی‌لیتر SDS 10درصد، 4/0 میلی‌لیتر 2-مرکاپتواتانول و 4/0 میلی‌لیتر برموفنل بلو یک درصد مخلوط گردید. این مخلوط به مدت 10 دقیقه در بن ماری در دمای 100 درجه سانتیگراد حرارت داده شد و سپس بر روی ژل بارگذاری شد. ژل با محلول حاوی 400 میلی‌لیتر متانول، 100 میلی‌لیتر اسید استیک، 500 میلی‌لیتر آب دیونیزه، یک گرم کوماسی بلو R-250 رنگ آمیزی شد. زایموگرام طبق دستور العمل تغییر یافته لیم و همکاران (2003) انجام گرفت. جهت زایموگرام ژل جداکننده 12 درصد به همراه یک درصد نشاسته تهیه شد (Asoodeh et al., 2013). پس از پایان الکتروفورز، برای حذف اثر SDS، ژل در بافر رناتوراسیون (شامل بافر Tris- HCl 20 میلی‌مولار با 7/4~pH و محلول ترایتون X-100 5/2 درصد) قرار گرفت. در انتها ژل برای رنگ آمیز ژل در محلول لوگول قرار داده شد.
برای بررسی اثر pH های مختلف بر فعالیت آنزیم محدوده pHهای 10-3 انتخاب شدند. برای این کار سه سیستم بافری زیر آماده شد: بافر استات سدیم 50 میلی‌مولار (pH تقریبی 5-3)، بافر فسفات 50 میلی‌مولار (pH تقریبی5/7-5/5)، بافر Tris-HCl 50 میلی‌مولار (pH تقریبی 10-8). برای اندازه‌گیری پایداری pH آنزیم با بافر‌های فوق که حاوی یک درصد نشاسته در دمای 42 درجه سانتیگراد انکوبه شدند. برای بررسی اثر دما، فعالیت آنزیم در محدوده دمایی 30- 95 درجه سانتیگراد در فواصل دمایی 5 درجه در pH اپتیمم آنزیم انجام گرفت. حداکثر فعالیت آنزیم به عنوان 100 درصد در نظر گرفته شد و بر اساس آن درصد فعالیت آنزیم در دماهای متفاوت اندازه‌گیری شد. جهت بررسی پایداری دمایی آنزیم محدوده دمایی فوق در نظر گرفته شد. آنزیم به مدت 45 دقیقه درون بن ماری در pH اپتیمم قرار گرفت.
به منظور بررسی وابستگی و عدم وابستگی فعالیت آنزیم به یون کلسیم، تست پایداری آنزیم در حضور غلظت 5 میلی مولار از یون کلسیم (CaCl2) انجام شد. برای این منظور آنزیم خالص شده در سیستم بافری مشابه با غلظت 5 میلی مولار از یون کلسیم (CaCl2) دیالیز شد و سپس روند سنجش مشابه مرحله قبل بدون یون کلسیم انجام و نتیجه برای وابستگی یا عدم وابستگی به یون کلسیم بررسی شد (Asoodeh et al., 2013).
نتایج آنالیز بیوشیمیایی و بررسی میکروسکوپی نشان داد که باکتری مورد نظر گرم مثبت به فرم باسیل (میله‌ای شکل) بوده و فعالیت آمیلازی قابل توجهی دارا می‌باشد و با توجه به این اصل که اکثر باکتری‌های باسیلوس گرم مثبت بوده و به لحاظ مورفولوژی میله‌ای شکل و استوانه‌ای شکل می‌باشند، احتمالاً باکتری مورد نظر نیز از گونه‌های جنس باسیلوس است (شکل 1). همچنین نتایج نشان داد که توالی 1021 جفت بازی تکثیر شده مربوط به ناحیه 16S rDNA با قطعات این ژن از منابع باکتریایی مختلف همولوژی دارد. با توجه به همولوژی 98 درصدی توالی 16S rDNA بدست آمده با توالی های مربوط به گونه Bacillus cereus، باکتری مورد نظر نیز به این گونه تعلق دارد (شکل 2).
شکل 1 -(A) بررسی قابلیت تولید آنزیم آمیلاز کلنی باکتریایی جدا شده روی محیط کشت LB آگار حاوی به یک درصد نشاسته (w/v) و محلول لوگول در دمای 37 درجه سانتیگراد بعد از 24 ساعت؛ (B) تصویر میکروسکوپی باکتری باسیلوس گرم مثبت جدا سازی شده با مورفولوژی میله‌ای شکل.
Figure 1:(A) Screening of bacterial isolate for capability of amylase production was done by starch hydrolysis plate assay method on agar medium with 1% (w/v) starch and lugol's solution at 37°C after 24-h incubation; (B) Microscopic image of gram-positive, rod shaped Bacillus bacterium.
شکل 2- درخت فیلوژنی و مقایسه همولوژی توالی 1021 جفت بازی 16S rDNA باکتری جدا شده با سایر توالی های ثبت شده درپایگاه NCBI. درخت فیلوژنی رسم شده با استفاده از الگوریتم UPGMA و نرم افزار MEGA5. درخت رسم گردیده است. علامت پیکان موجود در شکل توالی مورد بررسی را نشان می‌دهد.
Figure 2- Phylogenetic tree showing the relationship of 16S rDNA sequences cloned sample (Red arrow) compared with previously described bacterium species 16S rDNA sequences deposited in databases using UPGMA algorithm and MEGA5 software.
نتایج بررسی اثر دما نشان داده است که باکتری در هر سه دما رشد مطلوبی دارد ولی دمای 42 درجه سانتیگراد به علت میزان و سرعت اولیه رشد بیشتر نسبت به دمای 37 درجه و عدم اختلاف معنی دار با دمای 50 درجه سانتی گراد، مورد استفاده قرار گرفت (شکل3). در مطالعات جداگانه، نتایج مشابهی در مورد باکتری sp. Ferdowsicous Bacillus جدا شده از چشمه آبگرم فردوس و باکتری Bacillus sp. DR90جدا شده از چشمه آبگرم دیگ رستم بدست آمد، بطوریکه باکتری های جنس باسیلوس مورد مطالعه بیشترین سرعت رشد را در دمای 42 درجه سانتی گراد نشان دادند (Asoodeh et al., 2010, 2013). با این حال در مطالعه دیگر دمای اپتیمم رشد برای باکتریB. subtilis DR8806 ، 60 درجه سانتی گراد گزارش شده است (Asoodeh & Lagzian, 2012). همچنین نحوه رشد باکتری و میزان تولید آنزیم مورد بررسی در محیط کشت نشان داد که محیط کشت حاوی LB، نشاسته یک درصد، پپتون یک درصد و فروکتوز یک درصد، محیط کشت مناسب تری برای تولید آنزیم است. در این محیط کشت زمان فاز سکون به طور نسبی در مقایسه با سایر محیط‌های کشت، کاهش داشته است و سرعت رشد باکتری افزایش یافت. همچنین واحد فعالیت آنزیم یا در واقع میزان تولید آنزیم در این محیط کشت نسبت به سایر محیط کشت‌ها افزایش پیدا کرده بود (شکل 4).آسوده و همکاران (2013) نشان دادند که باکتری Bacillus sp. DR90 در محیط کشت حاوی نشاسته یک درصد، پپتون یک درصد، مالتوز یک درصد و عصاره مخمر یک درصد بیشترین سرعت رشد را دارا بوده؛ اما به لحاظ تولید آنزیم نتایج اختلاف معنی داری با محیط کشت M2 نشان نداد (Asoodeh et al., 2013). در تحقیق دیگر بیشترین میزان تولید آنزیم توسط باکتریBacillus sp. در محیط کشت M2 گزارش شد (Asoodeh et al., 2010).
به منظور بررسی خصوصیات بیوشیمیایی، تخلیص آنزیم با استفاده کروماتوگرافی انجام شد. نتایج حاصل نشان داد نمونه آنزیمی بدست آمده از ستون کروماتوگرافی نسبت به عصاره خام حاوی آنزیم در طی اجرای مراحل خالص سازی تقریبا 33 برابر خالص‌تر شده، و آنزیم 15/47% از فعالیت خود را طی مراحل خالص سازی حفظ کرده است (جدول 1). نتایج الکتروفورز SDS-PAGE آنزیم تخلیص شده تک باند با وزن مولکولی 35/68 کیلو دالتون را مشخص نمود (شکلA5). همچنین زایموگرام در Native-PAGE12% درستی باند انتخاب شده به عنوان باند حاوی آنزیم را مورد تایید قرار داد (شکل B5). آنزیم‌های مشابه‌ای در سایر باکتری‌ها طی مراحل خالص سازی به میزان متفاوتی نسبت به عصاره خام آنزیم خالص شدند. آنزیم آلفا-آمیلاز Geobacillus sp. LH8 6/13 برابر با عملکرد 10% (Mollania et al., 2010)، آنزیم آلفا-آمیلاز Bacillus amyloliquifaciens TSWK1-1 3/13 برابر با عملکرد 71/45% (2012 Kikani & Singh,)، آنزیم آلفا-آمیلاز Bacillus sp. Ferdowsicous 23 برابر با عملکرد 61% (Asoodeh et al., 2010)، آنزیم آمیلاز باکتری Bacillus sp. DR90 با عملکرد 2/4% (Asoodeh et al., 2013) خالص سازی شدند.
شکل 3- اثر دما (37، 42 و 50 درجه سانتی گراد) بر رشد باکتری.
Figure 3- Effect of temperature (37, 42 and 50°C) on the bacterial growth.
شکل 4- تاثیر چهار محیط کشت مختلف بر سرعت رشد و میزان فعالیت آنزیمی. (M1) LB مایع، نشاسته 1% (w/v)؛ (M2) LB مایع ، نشاسته 1% (w/v)، پپتون 1% (w/v)، فروکتوز 1% (w/v)؛ (M3) نشاسته 1% (w/v)، پپتون 1% (w/v)، مالتوز 1% (w/v)؛ (M4) نشاسته 1% (w/v)، پپتون 1% (w/v)، مالتوز 1% (w/v)، عصاره مخمر %1 (w/v).
Figure 4- Effects of four different media on the enzyme activity and bacterial growth. (M1) LB broth + 1% starch; (M2) LB broth + 1% starch, peptone, and
fructose; (M3) 1% starch + 1% peptone and 1% maltose; (M4) 2% yeast extract + 0.1% maltose, 1% starch and 1% peptone.
جدول 1- مراحل خالص سازی آنزیم آمیلاز از باکتری Bacillus cereus
Table 1- Steps involved for the purification of amylase enzyme from Bacillus cereus.
|
مراحل خالص سازی Purification steps |
غلظت پروتئین Total protein (mg/ml) |
فعالیت Total activity (u/ml) |
فعالیت ویژه Specific activity (u/mg) |
ضریب خالص سازی Purification fold |
|
عصاره خام Crude extract |
82 |
1.4 |
0.017 |
1 |
|
محلول سوپر ناتانت رسوب %85 سولفات آمونیوم Supernatant solution with 85% ammonium sulfate |
0.007 |
0 |
0 |
0 |
|
دیالیز رسوب 85 درصد سولفات آمونیوم Dialysis of 85% ammonium sulfate precipitation |
3.5 |
0.947 |
0.270 |
15 |
|
نمونه حاصل از کروماتوگرافی Sample of chromatography |
1.2 |
0.66 |
0.56 |
33 |
به علاوه در مطالعات مختلف، وزن مولکولی آنزیم‌های آمیلاز بین 10 تا 210 کیلو دالتون گزارش شده است (Souza et al., 2010; Saranraj & Stella, 2013).بررسی اثر pHبر
بررسی اثرPH بر فعالیت و پایداری آنزیم
در بررسی اثرpH بر فعالیت آنزیم مشخص گردید که آنزیم دارای حداکثر فعالیت در8pH~ است (8 pHopt) و در دامنه وسیعی از pH برابر با 3 تا 10 دارای فعالیت قابل اندازه‌گیری و قابل ملاحظه‌ای است.
همچنین نتایج نشان داد فعالیت نسبی در دامنه pH 3 تا 5 رو به افزایش است و کاهش اندک در فعالیت آنزیم در محدوده pH 5/5 – 7 احتمالا به علت تغییر بافرpH ایجاد شده است. روند افزایشی فعالیت آنزیم تا رسیدن به بیشترین فعالیت در pH بهینه (8 pHopt) ادامه یافته و در نهایت به علت خارج شدن از محدوده pH بهینه، فعالیت آنزیم رو به کاهش می‌رود. بطورکلی در بررسی پایداری آنزیم در pHهای مختلف همانطور که مورد انتظار است، آنزیم در pH بهینه خود بیشترین پایداری را داشته و 100 درصد فعالیت خود را حفظ می‌کند. همچنین نتایج نشان می دهد که آنزیم در pH های اسیدی 3 و 5/3 فعالیت نسبی مناسبی داشته، با این حال آنزیم در این دامنه از pH پس از گذشت زمان 60 دقیقه از انکوباسیون پایداری خود را از دست می‌دهد. در محدوده pH های 5/9-8، آنزیم بصورت پایدار 70 درصد از فعالیت آنزیمی خود را حفظ می‌کند (شکل B6، A6).
|
شکل 5-(A) ژل الکتروفورز SDS-PAGE 12% برای آنزیم آمیلاز باکتری Bacillus cereus. چاهک 1،سایز مارکر پروتئین PS11؛ چاهک 4. آنزیم آمیلاز تخلیص شده با روش کروماتوگرافی، این باند با فلش قرمز مشخص شده است؛ چاهک6.محلول رویی رسوب سولفات آمونیوم 85 درصد؛ چاهک 8. نمونه رسوب دیالیز شده. (B) زایموگرام آنزیم خالص شده. باند نمونه آنزیم خالص شده که به رنگ آبی روشن در شکل دیده می‌شود نشان دهنده هیدرولیز شدن نشاسته در آن منطقه و در نتیجه فعال بودن آنزیم است. 1و2. نمونه دیالیز رسوب 85درصد سولفات آمونیوم 3. نمونه فرکشن حاصل از کروماتوگرافی.
Figure 5- (A) SDS-PAGE Electrophoresis on 12% polyacrylamide gel of α-amylase from Bacillus cereus. Lane 1: size marker, PSI1; Lane 4: purified amylase (Coomassie blue staining) from Q-Sepharose (Red arrow); lane 6: 85% ammonium sulfate supernatant; lane 8: dialyzed α-amylase sample. (B) Native-PAGE of the purified enzyme. Lane 1,2: dialyzed 85% ammonium sulfate sediment. Lane 3: purified amylase from Q-Sepharose chromatography.
با توجه به خصوصیات ذکر شده، این آنزیم جزء آنزیم‌های قلیایی محسوب می‌شود. هم چنین این آنزیم در دامنه وسیعی از pH اسیدی یا قلیایی (3-10) فعال است که در کمتر آنزیم آمیلازی گزارش شده است. در مطالعات مختلف، آنزیم آلفا-آمیلاز اسیدی از ترمواسیدوفیل Alicyclobacillus sp. A4 با pH بهینه 5/4 (Bai et al., 2012)؛ آنزیم آمیلاز متعلق به Geobacillus sp. LH8 با pH بهینه 7-5 (Mollania et al., 2010)؛ آنزیم آمیلاز متعلق به Bacillus sp. DR90 با pH بهینه 4 (Asoodeh et al., 2013)؛ آنزیم آمیلاز استخراج شده از باکتری B. amyloliquifaciens TSWK1-1 نیز با pH بهینه 7 (Kikani & Singh, 2012) گزارش شده است. در پژوهشی نیز با مطالعه فعالیت آمیلازی سویه باکتریاییBacillus sp. KR-8104 نشان دادند که آنزیم بیشترین پایداری خود را درpH های اسیدی دارد. آنزیم آمیلاز خالص شده در تحقیق حاضر در محدوده pH 5/9-5/8 بیش از 75 درصد از فعالیت خود را حفظ می‌کند(Sajadi & et al., 2005). نتایج مشابهی در مطالعه‌ی آمیلاز متعلق به Bacillus sp. isolate A3-15 بدست آمده است به طوری که آنزیم دارای pH بهینه 11 می‌باشد (Burhan, 2008).
تمامی این آنزیم‌ها به جهت فعال و پایدار بودن در pH های شدیدا اسیدی و بازی باید به لحاظ ساختار پروتئینی از ویژگی‌های مشابهی برخوردار باشند. عدم وجود عواملی نظیر تشکیل خودبخودی ساکینیمید‌های[5] پپتیدی بین توالی‌هایAsp-Gly و Asn-Gly، دفن گروه‌های یونیزه و نیروی الکترواستاتیک همراه شده با بار خالص بزرگ پروتئین می تواند از دلایل پایداری این پروتئین ها باشد (Creighton, 1993; Yang et al., 1993; Declerck et al., 2002). اگر آلفا-آمیلازی در دامنه وسیعی از pH فعال است، ممکن است به علت تغییر مقدار pKa نوکلئوفیل یا دهنده پروتون باشد. همچنین شبکه پیوندهای هیدروژنی محلی و دسترسی گروه‌های قابل تیتراسیون و دیگر گروه‌های باردار به حلال، نیروی الکترواستاتیک تحت تاثیر قرار می‌دهند. در نتیجه هر گونه تغییراتی در pKa نوکلئوفیل یا دهنده پروتون می تواند منجر به تغییر در پروفایل فعالیت pH گرددNielsen & Borchert, 2000; Declerck et al, 2002) ).
نتایج نشان داد که آنزیم در دمای 80 درجه سانتیگراد حداکثر فعالیت خود را دارا بوده و در محدوده دمایی 50 تا 70 درجه سانتیگراد نیز بیش از 80 درصد فعالیت خود را حفظ کرده است (شکل C6). در بررسی اثر دما بر پایداری آنزیم، مشاهده شد که از دمای 35 تا 65 درجه سانتیگراد تقریبا بیش از 90 درصد فعالیت خود را و در دامنه دمایی 70 تا 85 درجه سانتیگراد تا 70 درصد فعالیت خود را حفظ می‌کند و در نهایت آنزیم در دمای 90 درجه سانتیگراد فعالیت خود را از دست می‌دهد. همچنین پس از دیالیز شدن آنزیم با بافر حاوی یون کلسیم (CaCl2) با غلظت 5 میلی مولار، هیچ گونه تاثیر قابل ذکر و محسوسی بر روی پایداری آنزیم مشاهده نشد.بر این اساس احتمالا یون کلسیم در پایداری آنزیم تاثیری ندارد (شکل D6). با توجه به این نکته، آنزیم خالص شده جزء آنزیم‌های مقاوم به حرارت دسته بندی می‌گردد. آنزیم آمیلاز متعلق به باکتری Alicyclobacillus sp. A4 در دمای 75 درجه سانتی گراد از حداکثر فعالیت برخوردار است (Bai et al., 2012). آمیلاز متعلق به Bacillus sp. Ferdowsicous دارای دمای بهینه 70 درجه سانتی گراد است و در دمای 75 درجه سانتی گراد بیش از 75 درصد از فعالیت خود را حفظ می‌کند (Asoodeh et al., 2010).
در گزارشی دیگر، آمیلاز مقاوم به حرارت فلور باکتریایی چشمه‌های آبگرم متعلق به گونهAnoxybacillus beppuensis TSSC-1، در دمای 80 درجه سانتیگراد از حداکثر فعالیت برخوردار است (Kikani & Singh, 2012). در آمیلاز مورد تحقیق عدم وابستگی به یون کلسیم مشاهده شده است، این خصوصیت از مزایای آنزیم محسوب می‌گردد، در اندکی از آمیلازهای مقاوم به حرارت مشاهده شده است از این جمله می‌توان به آمیلاز Geobacillus sp. LH8، Alicyclobacillus sp. A4،Bacillus sp. Ferdowsicous وB. amyloliquifaciens TSWK1-1 اشاره کرد (Asoodeh et al., 2010; Mollania et al., 2010; Bai et al., 2012; Kikani & Singh, 2012). تمامی آنزیم‌های پایدار به حرارت از مکانیسمهای مختلفی جهت ایجاد پایداری استفاده می‌کنند. مکانیسمهای ایجاد کننده پایداری حرارتی شامل حضور یون‌های فلزی به ویژه کلسیم، جایگاه یون کلسیم، حضور اسید آمینه پرولین، دآمیداسیون، عدم اکسیداسیون و وجود اسید آمینه‌های خاص در موقعیت‌های ویژه است (Nielsen & Borchert, 2000).
با توجه به خصوصیات ذکر شده برای آنزیم آمیلاز خالص شده که شامل فعال بودن در دامنه وسیعی از pH و پایداری در pHهای قلیایی، فعالیت و پایدار بودن در دماهای بالا به طوریکه بیش از 70 درصد از فعالیت خود را در محدوده دمایی 70 تا 85 درجه سانتی گراد حفظ می کند. هم چنین، عدم وابستگی به یون کلسیم این آنزیم را به آنزیمی مطلوب جهت کاربرد در صنعت به ویژه صنایع غذایی و شوینده تبدیل کرده است.
شکل 6-(A) تاثیر تغییراتpHبر فعالیت نسبی آنزیم. (B) تغییرات میزان پایداری آنزیم در pHهای مختلف. (C) تاثیر دما بر فعالیت آنزیم (D) و بررسی پایداری آنزیم در دماهای مختلف در حضور و عدم حضور یون کلسیم.
Figure 6- (A) Effect of pH on relative activity of enzyme (B) Effect
of pH on enzyme stability (C) Effect of temperature on enzyme activity (D) and effect of temperature on enzyme stability in the presence and absence of Ca2+ ion.
Aiyer PV (2004). Effect of C:N ratio on α-amylase production by Bacillus lichenifomis SPT 27. African Journal of Biotechnology 3: 519-522.
Asoodeh A, Alemi A, Heydari A, Akbari J (2013). Purification and biochemical characterization of an acidophilic amylase from a newly isolated Bacillus sp. DR90. Extremophiles 17: 339–348.
Asoodeh A, Chamani J, Lagzian M (2010). A novel thermostable, acidophilic a-amylase from new thermophilic “Bacillus sp. Ferdowsicous” isolated from Ferdows hot mineral spring in Iran:Purification and biochemical characterization. International Journal of Biological Macromolecules 46: 289–297.
Asoodeh A, Lagzian M (2012). Purification and characterization of a new glucoamylopullulanase from thermotolerant alkaliphilic Bacillus subtilis DR8806 of a hot mineral spring. Journal of Process Biochemistry 47: 806–815.
Bertoldo C, Antranikian G (2002).Extreme environments as a resource for microorganisms and novel biocatalysts. Chemical Biology 6: 51–60.
Bergey DH, Holt J (1994). Bergey’s manual of determinative bacteriology. Williams & Wilkins, Baltimore.
Bernfeld P (1955). Amylases, α and β methods in enzymology. Methods Enzymol 1,149-158.
Burhan A (2008). Highly thermostable, thermophilic, alkaline, SDS and chelator resistant amylase from a thermophilic Bacillus sp. isolate A3-15. Bioresource Technology 99: 3071-3076.
Creighton TE (1993). Proteins: Structures and Molecular Properties, 2nd ed., W.H. Freeman, New York, Ch 10.
Hassan SA, Ali SA, Abbasi A, Kamal M (2011). Purification and biochemical characterization of a Ca2+-independent, thermostable and acidophilic a-amylase from Bacillus sp. RM16. African Journal of Biotechnology10: 6082–6089.
Hmidet N, Bayoudh A, Berrin JG, Kanoun S, Juge N, Nasri M (2008). Process Biochemistry Journal 43: 499–510.
Janecek S, Svensson B, MacGregor EA (2014). α-Amylase – an enzyme specificity found in various families of glycoside hydrolasesCellular and Molecular Life Sciences 71: 1149–1170.
Kaneko T, Ohno T, Ohisa N (2005). Purification and characterization of a thermostable raw starch digesting amylase from a Streptomyces sp. isolated in a milling factory. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 69: 1073–1081.
Laemmli UK (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680–685.
Lim WJ, Park SR, An CL, Lee JY, Hong SY, Shin EC, Kima EJ, Kim JO, Kim H, Yun HD (2003). Cloning and characterization of thermostable intracellular a-amylase from the hyperthermophilic bacterium Thermotoga maritima MSB8. Research in Microbiology 154: 681–687.
Pandey A, Lorroche C, Soccol CR, Singh D, Mohan R (2000). Advances in microbial amylases. Biotechnology and Applied Biochemistry 31: 135-152.
Rasooli I, Astaneh SDA, Borna H, Barchini KA (2008). A thermostable α-amylase producing natural variant of Bacillus spp. isolated from soil in Iran. American Journal of Agricultural and Biological Sciences 3: 591–596.
Sivaramakrishnan S, Gangadharan D, MadhavaNampoothiri K, Ricardo Soccol C, Pandey A (2006). a-Amylases from Microbial Sources – An Overview on Recent Developments. Food Technology and Biotechnology 44: 173-184.
Suman S, Ramesh K (2010). Production of a thermostable extracellular amylase from thermophilic Bacillus species .Journal of Pharmaceutical Sciences 2: 149–154.
Vahidi, H, Shafaghi, B, Mirzabeigi, Z (2005). Culture medium optimization of α-amylase producing organism mocur spp. using the variable size-simplex algorithm. DARU Journal of Pharmaceutical Sciences 13: 20-22.
Yang AS, Honig B (1993). On the pH dependence of protein stability. Journal of Molecular Biology 231: 459-474.
Taati A. 1, Mirshamsi A.*2, Asoodeh A. 3, Malekzadeh Shafaroodi S. 4
1M. Sc. Student, Department of Biotechnology and Plant Breeding, Department of Biotechnology and Plant Breeding, Faculty of Agriculture, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran.
2Assistant professor, Department of Biotechnology and Plant Breeding, Faculty of Agriculture, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran.
3Professor, Department of Chemistry, Faculty of Science, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran.
4Associate professor, Department of Biotechnology and Plant Breeding, Faculty of Agriculture, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran.
Abstract
Considerable economic importance and wide range of applications of thermo-stable amylases in various industries has significantly increased the demand for amylase production with optimal stability properties. Natural bacterial flora of hot springs can be used as new sources for α- amylase production due to high tolerance to heat and stability in different pH ranges. In this study, Ghinarjeh hyperthermal hot spring was studied to identify the bacterial species that have amylase activity. Bacterial clones producing amylase were identified based on biochemical characteristics and molecular methods. In the next step, the growth conditions of isolated bacteria and amylase production were optimized. Finally, after extraction and purification of α- amylase enzyme from isolated clones, biochemical characteristics were evaluated. The results showed that isolated bacterial clone is a member of the genus Bacillus, and also indicated that the purified enzyme is a thermostable, and calcium-independent amylase enzyme. The purified amylase showed maximum activity at pH˷ 8, however the enzyme is active and stable in a broad range of acidic and alkaline pH (3.5- 10). The enzyme has maximum hydrolysis activity at 80°C and 80% of this activity remains at 50-70°C. According to this study, this bacterial strain can be suitable and promising source for production of high performance, thermostable amylase in order to use at industrial level.
Keywords: amylase, Calcium, hot spring, thermostable,
*نویسنده مسئول: امین میرشمسی کاخکی تلفن: 38805726- 051 Email: mirshamsi@ferdowsi.um.ac.ir
[1]Domain
[2] Luria broth
[3] 3,5-dinitrosalicylic acid
[4]SDS –Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS- PAGE)
[5]ساکینیمید یک ایمید حلقوی با فرمول C4H5NO2است.
* Corresponding Author: Mirshamsi A. Tel: 051-38805726 Email: mirshamsi@ferdowsi.um.ac.ir
)
