Identification of SNPs in exonic regions of eugenol O-methyl transferase and chavicol O-methyl transferase genes in basil

Document Type : Research Paper

Authors

1 MSc student of Agricultural Biotechnology, Department of Plant Breeding and Biotechnology, Faculty of Agriculture, Urmia University, Urmia, Iran.

2 Associate professor, Department of Plant Breeding and Biotechnology, Faculty of Agriculture, Urmia University, Urmia, Iran.

Abstract

To identify single nucleotide polymorphisms (SNPs) in eugenol O-methyl transferase (EOMT) and Chavicol O-methyl transferase (CVOMT) genes, cleaved amplified polymorphic sequence (CAPS) markers and direct sequencing were used in different basil populations. Fragments with sizes of 571 and 908 bp of coding regions of both genes were amplified and digested with restriction enzymes Pst1 and MseI. In silico digestion of the coding region of the genes by Pst1 produced fragments of 480 and 91 bp in EOMT and 621 and 287 bp in CVOMT. However, no polymorphic restricted patterns were produced in 80 basil individuals using Pst1 digestion. In silico MseI digestion of EOMT and CVOMT gene sequences produces fragments of 59, 135 and 377 bp, and 275, 302 and 331 bp, respectively. Digestion of the amplified fragments of both genes generated polymorphic banding patterns in studied basil genotypes. One out of each different restriction patters which is produced for both genes in basil genotypes, was selected for sequencing. Sequences obtained, were aligned for both genes using Clustal Omega and SNPs were identified. The results of EOMT alignment revealed transition mutations TC and AG, but no transversion was observed in this gene. Mutations AG, TC, AC and AT were found in CVOMT gene with the highest frequency of AG. In conclusion, the results of the current investigation revealed low polymorphism in coding regions of the studied genes and demonstrated the conservity of the coding regions of both genes during basil evolution.

Keywords


شناسایی SNPها در نواحی اگزونی ژن‌های اوژنول O-متیل ترنسفراز و چاویکول O-متیل ترنسفراز در گیاه ریحان

مهدیه عزیزی1، بابک عبدالهی مندولکانی2*

1دانشجوی کارشناسی ارشد بیوتکنولوژی کشاورزی، گروه اصلاح و بیوتکنولوژی گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه ارومیه، ارومیه، ایران.

2دانشیار گروه اصلاح و بیوتکنولوژی گیاهی، دانشکده کشاورزی دانشگاه ارومیه، ارومیه، ایران.

تاریخ دریافت: 14/05/1396، تاریخ پذیرش: 02/10/1396

چکیده

به منظور شناسایی تنوع‌های تک نوکلئوتیدی Single nucleotide polymorphism)) در ژن‌های اوژنول O-متیل ترنسفراز (EOMT) و چاویکول O-متیل ترنسفراز (CVOMT) در توده‌های مختلف ریحان از نشانگرهای CAPS (Cleaved amplified polymorphic sequences) و توالی‌یابی استفاده شد. قطعاتی با اندازه 571 و 908 جفت باز از نواحی کد کننده این دو ژن‌ تکثیر و با آنزیم‌‌های برشی Pst1 و MseI هضم شد. آنزیم Pst1 در ژن EOMT دو قطعه با اندازه‌های480 و 91 جفت باز و در ژن CVOMT قطعاتی با اندازه‌های 621 و 287 جفت باز تولید می­کند. برش قطعات تکثیری هر دو ژن با آنزیم Pst1 الگوهای مشابهی در 80 فرد تولید کرد. آنزیم MseI در این دو ژن به ترتیب قطعاتی با اندازه‌های 59، 135 و 377 جفت باز و 275، 302 و 331 جفت باز تولید می­کند. برش قطعات تکثیر شده هر دو ژن با این آنزیم در افراد مورد مطالعه الگوهای برشی متنوعی تولید کرد. از هر نوع الگوی برشی یک نمونه انتخاب و توالی‌یابی شد. توالی‌ها با استفاده از نرم افزار Clustal Omega هم ردیف و SNP‌ها در هر کدام از ژن­ها شناسایی شدند. نتایج همردیفی نشان داد جهش­های همجنس TC و AG در ژن EOMT مشاهده می­شود ولی جهش­های ناهمجنس در این ژن مشاهده نشد. در ژن CVOMT تبدیل بازهای AG، TC، AC و AT شناسایی گردید که بیشترین جهش مربوط به تبدیل بازهای AG بود. به‌طورکلی نتایج این تحقیق نشان داد که چندشکلی در نواحی اگزونی ژن‌های مورد مطالعه کم بوده و نواحی کد کننده این ژنها در طول تکامل ریحان محفوظ بوده است.

کلمات کلیدی: ریحان، اوژنول O-متیل ترنسفراز، چاویکول O-متیل ترنسفراز، SNP، نشانگرهای CAPS.

 

مقدمه

 

ریحان (Ocimum basilicum L.) یکی از سبزی‌های مهم برگی یکساله می‌باشد که بومی ایران، هند و سایر مناطق آسیایی، آفریقایی و آمریکای جنوبی است و به سبب اهمیت اقتصادی، تغذیه‌ای، صنعتی و دارویی که دارد به‌ طور وسیع مصرف می‌شود (Labra et al., 2004). این گیاه (48=n2) متعلق به خانواده نعناعیان از دیرباز به عنوان یک گیاه دارویی در درمان بسیاری از بیماری‌ها مورد توجه بوده است. در حالت کلی اسانس ریحان متشکل از یک درصد ترکیبات پیچیده و متغیر می‌باشد. این اسانس در رقم‌های مختلف ریحان متفاوت است و شامل اجزای مونوترپنوئیدها و فنیل پروپانوئیدها می‌باشد ((Labra et al., 2004 که از نظر مقدار و شدت عطر و بو با هم متفاوت می­باشند (Charles et al., 1990; Vieira et al., 2000)). از جمله ترکیبات فنیل پروپانوئیدی دارای خاصیت دفاعی، می­توان اوژنول را نام برد که دارای خاصیت ضد باکتریایی و ضد قارچی است و مانع رشد بسیاری از باکتری‌ها و قارچ های بیماری‌زا می‌گردد (Gang et al., 2001). برخی از ترکیبات فنیل پروپانوئیدی گیاه را در برابر تنش­های زیستی و غیر زیستی حفظ می‌کند. یکی از این ترکیبات مهم متیل چاویکول می‌باشد که فراوانترین ماده‌ی تشکیل دهنده‌ی اسانس ریحان است و مقدار آن در مراحل رویشی افزایش می‌یابد. متیل اوژنول ترکیب دیگری می‌باشد که گیاه را در برابر عوامل بیماری زا حفظ می‌کند و دارای نقش حفاظتی برای گیاه می‌باشد (Bilal et al., 2012; Zeai et al., 2014). بنابراین، استفاده از روش‌های زیست فناوری به ‌منظور تکثیر و افزایش توان ژنتیکی گیاهان دارویی و همچنین شناسایی سریع‌تر و دقیق‌تر ژنوتیپ‌هایی که فرآورده‌ی بیشتری تولید می‌کنند، می‌تواند بسیار مفید باشد.

نشانگرهای ملکولی در بهبود و اصلاح گیاهان دارای اهمیت قابل توجهی می‌باشند (Ahmadizadeh et al., 2018). SNP یا چندشکلی تک نوکلئوتیدی یک منبع ژنتیکی عمده از تغییرات فنوتیپی درون یک گونه می‌باشد که تفاوت در تک نوکلئوتیدها را مشخص می‌کند. SNPها هم بارز و دو آللی می‌باشند و تراکم آنها در سطح ژنوم بسیار زیاد بوده (Gupta et al., 2001; Jehan and Lakhanpaul, 2006; Mammadov et al., 2012.) و به علت پایداری بیش‌تر، موتاسیون کمتر و حضور آن‌ها در بیشتر نقاط ژنوم از اهمیت بالایی برخوردارند. در بررسیSNP ها بین دو گونه از گیاه ریحان (O. sanctum و O. basilicum) گزارش شد که 6/66 درصد از SNP ها مربوط به جهش­های همجنس می باشد که از این میزان 66/32 درصد مربوط به تبدیل A/G و 5/32 درصد ناشی از تبدیل C/T بوده است. میزان SNP های بدست آمده از جهش ناهمجنس در این مطالعه 84/33 درصد بود که 97/10 درصد ناشی از تبدیل A/T، 4/7 درصد به علت تبدیل G/T، 52/7 درصد از تبدیل به C/G و 95/7 درصد بخاطر تبدیل A/C بوده است (Rastogi et al., 2014). مطالعه SNP ها در بخشی از ژنوم گیاه تاج خروس وحشی (Chinopodium qiuna L.) نشان داد که می­توان از SNP های شناسایی شده برای بهبود نقشه‌ی ژنتیکی، تهیه ژرم پلاسم و مطالعات تکاملی در جمعیت­های تاج خروس وحشی استفاده کرد (Coles et al., 2005). چنانچه ذکر شد متیل چاویکول و متیل اوژنول از ترکیبات فنیل پروپانوئیدی مهم در گیاه ریحان می­باشد و دو ژن اوژنولO-متیل ترنسفراز (EOMT[1]) و چاویکولO-متیل ترنسفراز (CVOMT[2]) از ژنهای مهم در مسیر بیوسنتز این ترکیبات می­باشد (Abdollahi Mandoulakani et al., 2018; Gang et al., 2001 ). تاکنون تنوع­های تک نوکلئوتیدی در این ژن­ها در ریحان شناسایی نشده است بنابراین هدف از این تحقیق، شناسایی SNP‌ ها در این دو ژن‌ در توده‌های مختلف ریحان (O. basilicum) و همچنین استفاده از نشانگرهای مبتنی بر این SNP ها برای تمایز و تفکیک ژنوتیپ‌ها و توده‌های مورد بررسی بود.

 

مواد و روش ها

بذور توده‌های مختلف O. basilicum (80 فرد از 8 توده) از مناطق مختلف ایران جمع آوری (جدول 1) و در گلخانه کشت شد و بعد از رسیدن به مرحله 4-6 برگی نمونه برداری از افراد هر توده (10 فرد از هر توده) انجام گرفت. نمونه‌ها بعد از انجماد در نیتروژن مایع بلافاصله به دمای 80- درجه سانتی گراد انتقال داده شدند. DNA ژنومی از برگ­های جوان به روش CTAB استخراج گردید. کیفیت و کمیت DNA استخراج شده با استفاده از دستگاه اسپکترفتومتری و الکتروفورز ژل آگارز  یک درصد تعیین شد.

توالی نواحی کد کننده ژن­های اوژنول O-متیل ترنسفراز (شماره ی دسترسی AF435008) و چاویکول O-متیل ترنسفراز (شماره دسترسی AF435007) از سایت NCBI ذخیره و آغازگرهای اختصاصی (جدول 2)  با استفاده از نرم افزارهای FastPCR و Gene Runner طراحی شد. قطعاتی با اندازهای 571 (ژن EOMT) و 908 (ژن CVOMT) جفت باز از نواحی کد کننده این دو ژن با استفاده از واکنش زنجیره­ای پلیمراز تکثیر شد.

واکنش­های PCR در حجم 20 میکرولیتر شامل 50 نانوگرم DNA ژنومی، بافر PCR یک برابر (10 میلی مول Tris-HCL، 50 میلی مول KCL، pH=8.3)، 5/1 میلی مول MgCl2، 2/0 میکرومول از هر dNTP، 5/0 واحد Taq DNA  پلیمراز (شرکت سیناکلون، ایران) و 10 پیکومول از هر آغازگر در دستگاه ترموسایکلر FlexCycler (شرکت Analytikjena، آلمان ) انجام شد.

 

 

 

جدول 1- محل جمع آوری توده­های ریحان مطالعه شده در تحقیق حاضر.

Table 1- Collection sites of basil populations used in the current study.

 

کد توده

Code

محل جمع‌آوری

Collection site

ارتفاع از سطح دریا(متر)

Above sea level (m)

طول جغرافیایی(متر)

Longitude (N)

عرض جغرافیایی(متر)

Latitude (E)

رنگ برگ

Leaf color

1

کرمانشاه 1

Kermanshah1

1389

47° 3'

23° 34'

سبز

Green

2

بیرجند

Birjand

1491

32° 52'

59° 13'

سبز

Green

3

قم

Qom

928

50° 56'

34° 49'

بنفش

Green

4

یزد

Yazd

1230

54° 4'

32°

سبز

Green

5

ورامین

Varamin

1100

51° 39'°

35° 19'

سبز

Green

6

همدان

Hamadan

1824

48° 34'

36° 46'

سبز

Green

7

شهر ری 2

Shahr-e-Ray

1100

35° 7'

51° 4'

بنفش

Green

 

 

شرایط دمایی مورد استفاده شامل واسرشت سازی اولیه در دمای 95 درجه‌ سانتی گراد به مدت چهار دقیقه، 35 چرخه شامل دمای 94 درجه‌ سانتی گراد به مدت 30 ثانیه، دمای اتصال 60 درجه سانتی گراد به مدت 40 ثانیه، 72 درجه سانتی گراد به مدت دو دقیقه و بسط نهایی به مدت پنج دقیقه بود. پس از تکثیر قطعات ژنی، محصولات PCR بر روی ژل آگارز 5/1درصد الکتروفورز و باندهای مربوطه مشاهده شد. سپس هضم قطعات تکثیر شده با استفاده از آنزیمهای Pst1 و Mse1 (شرکت فرمنتاس، آلمان) انجام گرفت. یک نمونه از هر کدام از الگوهای برشی متنوع تولید شده انتخاب و برای خالص سازی و توالی‌یابی به شرکت فزاپژوه ارسال شد. با توجه به اینکه طول قطعه برای ژن چاویکول O-متیل ترنسفراز 908 جفت باز بود برای قرائت کامل، توالی‌یابی در هر دو جهت رفت و برگشت انجام گرفت. نتایج توالی یابی با استفاده از نرم افزارChromas  (نسخه2.1.3) به ‌توالی Fasta تبدیل شد. برای شناسایی SNP‌ها، هم ردیفی توالی‌ها با استفاده از نرم افزارآنلاین Clustal Omega[3] انجام گرفت و SNP‌ها شناسایی شدند.

 

نتایج و بحث

به‌ منظور بررسی الگوی برش آنزیمی و شناسایی تنوع‌‌های تک نوکلئوتیدی در دو ژن اوژنول O-متیل ترنسفراز و چاویکول O-متیل ترنسفراز، ابتدا بخشی از نواحی کد کننده این دو ژن تکثیر و فراورده‌های حاصل از تکثیر با استفاده از آنزیم PstI هضم شد. اندازه قطعات حاصل از هضم این آنزیم در افراد مورد مطالعه برای ژن EOMT، 91 و480 و برای ژن CVOMT، 621 و 287 جفت باز بود. این آنزیم منجر به تولید قطعاتی با طول یکسان در هر دو ژن شد و چندشکلی در افراد مورد مطالعه مشاهده نشد. از آنجاییکه توالی برشی این آنزیم (CTGCAG) 6 جفت بازی می­باشد بنابراین تعداد قطعات کمتری در نتیجه برش این آنزیم حاصل می­شود و احتمال تولید الگوی برشی چندشکل در افراد مطالعه شده کاهش می­یابد. قطعات تکثیری این ژن‌ها با آنزیم MseI نیز هضم شد. پیش‌بینی نواحی برشی این آنزیم در توالی ژن‌های مورد مطالعه با استفاده از نرم‌افزار FastPCR نشان داد که هضم ناحیه اگزونی تکثیرشده ژن اوژنول O-متیل ترنسفراز با این آنزیم منجر به ایجاد سه قطعه به طول 59، 135 و 377 جفت باز می‌شود. اما این آنزیم در برخی توده‌ها مانند ورامین، قم و بیرجند منجر به ایجاد الگوهای برشی متفاوت و درنتیجه قطعاتی با طول متفاوت شد که ناشی از وقوع جهش در سایت برشی آنزیم می‌باشد. ولی بین افراد داخل توده‌ها تنوعی به لحاظ الگوی برشی مشاهده نشد. همچنین بررسی نواحی برشی این آنزیم در توالی ژن چاویکول -O متیل ترنسفراز با استفاده از نرم‌افزار FastPCR نشان داد که هضم ناحیه کد کننده این ژن منجر به تولید سه قطعه به طول 275، 302 و 331 جفت باز می‌شود. ولی این آنزیم در برخی توده‌ها شامل کرمانشاه، یزد، بیرجند، ورامین و شهر ری قطعاتی با طول متفاوت ایجاد نمود. اندازه‌ی این قطعات حدود 400 و 500 جفت باز بود. برای این ژن نیز در بین افراد داخل توده‌های مورد مطالعه چندشکلی به لحاظ الگوی برشی آنزیم مشاهده نشد.


 

 

 

جدول ‏2 مشخصات آغازگرهای طراحی شده برای تکثیر دو ژن اوژنول O-متیل ترنسفراز و چاویکول O-متیل ترانسفراز در ریحان

Table 2- Characteristics of the primers designed for amplification of eugenol O-methyl transferase and chavicol O-methyl transferase genes in basil

ژن

Gene

توالی آغازگر (5´→3´)

Primer sequence

طول قطعه (جفت باز)

Amplicon length (bp)

شماره دسترسی

Accession number

چاویکولO-متیل ترنسفراز

ctgcacaaacatgaccacccaa

tcacaccaaatgctggagtaagc

908

AF435007

اوژنول O-متیل ترنسفراز

ttcaatgtccctaaagtgtgca

ccataacgaccgcatctttgc

571

AF435008

 

 

به منظور شناسایی SNPها در ژن اوژنول O-متیل ترنسفراز، همردیفی بین توالی این ژن در توده­های بیرجند، قم و همدان که الگوی برشی متفاوتی با آنزیم Mse1 نشان داده بودند انجام گرفت. در این هم ردیفی جهش­های همجنس مربوط به بازهای TC و AG  مشاهده گردید همچنین در توده‌ی قم یک حذف باز شناسایی شد (شکل 1 و جدول 3). به منظور شناسایی SNPها در ژن چاویکول O-متیل ترنسفراز، همردیفی بین توالی این ژن در توده­های کرمانشاه، شهر ری، ورامین، بیرجند و یزد که الگوی برشی متفاوتی با آنزیم Mse1 نشان داده بودند انجام گرفت. در این هم ردیفی جهش مربوط به تبدیل بازهای AG، TC، AC و AT شناسایی شد که بیشترین جهش مربوط به تبدیل بازهای AG بود. علاوه بر این حذف باز در توده‌های کرمانشاه، ورامین و بیرجند شناسایی گردید (شکل 2 و جدول 4).

 

 


 

EOMT_Bir      caagaggtgtgctactggctcaccccagcgtcatgcctcctcttgaaggaggcgccccta

EOMT_Qom      Caagaggtgtgctactggctcaccccagcgtcatgcctcctcttgaaggaggcgccccta

EOMT_Ham      caagaggtgtgctactggctcaccccagcgtcatgcctcctcttgaaggaggcgccccta

              ************************************************************

EOMT_Bir      actgtgacacccctagtccaagtcgttttggatcccaccttcacaaacccatggcaccat

EOMT_Qom      actgtgacacccctagtccaagtcgttttggatcccactttcacaaacccatggcaccat

EOMT_Ham      actgtgacacccctagcccaagtcgttttggatcccactttcacaaacccatggcaccat

              **************** ********************* *********************

EOMT_Bir      atgagtgaatggtttacacatgagaaacatgccacacagtttgaggcagcaaacggatgc

EOMT_Qom      atgagtgaatggtttacacatgagaaacatgccacacagtttgaggcagcaaacggatgc

EOMT_Ham      atgagtgaatggtttacacatgagaaacatgccacacagtttgaggcagcaaacggatgc

              ************************************************************

EOMT_Bir      acattttgggagaagttagcaaatgagccaagcaagggcagattttttgatgaagctatg

EOMT_Qom      acattttgggagaagttagcaaatgagccaagcaagggtagattctttgatgaagctatg

EOMT_Ham      acattttgggagaagttagcaaatgagccaagcaagggtagattttttgatgaagctatg

              ************************************** ***** ***************

EOMT_Bir      agttgtgactcgaggctcataacacatgtattcaccaaggactacaagcatgtgattgag

EOMT_Qom      agttgtgactcgaggctcatagcacatgtattcaccaaggactacgagcatgtgattgag

EOMT_Ham      agttgtgactcgaggctcatagcacatgtattcaccaaggactacaagcatgtgattgag

              ********************* *********************** **************

EOMT_Bir      ggaatcagaacattggttgatgttggtggtggtaatggaacgatggctaaagctatcgtt

EOMT_Qom      ggaatcagaacattggttgatgttggtggtggtaatggaacgatggctaaagctatcgtt

EOMT_Ham      ggaatcagaacattggttgatgttggtggtggtaatggaacgatggctaaagctatcgtt

              ************************************************************

EOMT_Bir      gaagcaatgcccaccattaaatgcacagttattgacctcccacatgttgtggctggcttg

EOMT_Qom      gaagcaatgcccaccattaaatgc-cagttattgacctcccacatgttgtggctggcttg

EOMT_Ham      gaagcaatgcccaccattaaatgcacagttattgacctcccacatgttgtggctggcttg

              ************************ ************************* *********

EOMT_Bir      gaaagcaccgataacttaaactatattggaggagacatgttccagtctatcccttctgca

EOMT_Qom      gaaagcaccgataacttaaactatattggaggagacatgttccagtctatcccttctgca

EOMT_Ham      gaaagcaccgataacttaaactatattggaggagacatgttccagtctatcccttctgca

              ************************************************************

EOMT_Bir      gatgcaattcttctaaagtctataatacatgattgggacgatgtggagggcctcaaaatc

EOMT_Qom      gatgcaattcttctaaagtctataatacatgattgggacgatgtggagggcctcaaaatc

EOMT_Ham      gatgcaattcttctaaagtctataatacatgattgggacgatgtggagggcctcaaaatc

              ************************************************************

EOMT_Bir      ttgaagaaatgcaaagatgcggtcgttatgg

EOMT_Qom      ttgaagaaatgcaaagatgcggtcgttatgg

EOMT_Ham      ttgaagaaatgcaaagatgcggtcgttatgg

              ********************************

 

 

شکل 1- همردیفی توالی ژن اوژنول O-متیل ترنسفراز در سه ژنوتیپ ریحان از توده­های بیرجند، قم و همدان.

Figure 1- Alignments of eugenol O-methyl transferase gene sequence in three basil genotypes from populations Birjand, Qom and Hamedan.

 

 

 

 

جدول 3- فراوانی SNP‌های شناسایی شده در ژن اوژنول O-متیل ترنسفراز در توده­های مختلف ریحان.

Table 3- Frequency of identified SNPs in eugenol O-methyl transferase gene in different basil populations.

درصد SNP

SNP percentage

SNPتعداد

Number of SNPs

SNPنوع

SNP type

33.33

2

AG

66.66

4

TC

 

 

 

CVOMT_Ker      ctgcacaaacatgaccacccaatgacactttcccaattactcaaggccatc-ccatcaac

CVOMT_Yaz      ctgcacaaacatgaccacccaatgacactttcccaattactcaaggccatccccatcaac

CVOMT_Bir      ctgcacaaacatgaccacccaatgacactttcccaattactcaaggccatctccatcaac

CVOMT_VAR      ctgcacaaacatgaccacccaatgacactttcccaattactcaaggccatccccatcaac

CVOMT_Ray      ctgcacaaacatgaccacccaatgacactttcccaattactcaaggccatccccatcaac

               *************************************************** ********

CVOMT_Ker      aaagaaaaatcccaaagttttcagcgtttgatgcgtgcactagtcaactccaatttcttc

CVOMT_Yaz      aaagaaaaatcccaaagtttccagcgtttgatgcgtgcactagtcaactccaatttcttc

CVOMT_Bir      aaagaaaaatcccaaagtttccagcgtttgatgcgtgcactagtcaactccaatttcttc

CVOMT_VAR      aaagaaaaatcccaaagtttccagcgtttgatgcgtgcactagtcaactccaatttcttc

CVOMT_Ray      aaagaaaaatcccaaagtttccagcgtttgatgcgtgcactagtcaactccaatttcttc

               ******************** ***************************************

CVOMT_Ker      atagaagaaaactctaataatcaagaggtgtgttttctggctcaccccagcctcacgcct

CVOMT_Yaz      atagaagaaaactctaataatcaggaggtgtgtttactggctcaccccagcctcacgcct

CVOMT_Bir      atagaagaaaactctaataatcaagaggtgtgt-tactggctcaccccagcctcacgcct

CVOMT_VAR      atagaagaaaactctaataatcaagaggtgtgt-tactggctcaccccagcctcacgcct

CVOMT_Ray      atagaagaaaactctaataatcaagaggtgtgt-tactgactcaccccagcctcacgcct

               *********************** ********* **************************

CVOMT_Ker      cctcttgaagggggcgcctttgactgtggcaccccttgttcaagtggttttggatcccac

CVOMT_Yaz      cctcttgaagggggcgcctttgactgtggcaccccttgttcaagtggttttggatcccac

CVOMT_Bir      cctcttgaagggggcgcctttgactgtggcaccccttgttcaagtggttttggatcccac

CVOMT_VAR      cctcttgaagggggcgcctttgactgtggcaccccttgttcaagtggttttggatcccac

CVOMT_Ray      cctcttgaagggggcgcctttgactgtggcaccccttgttcaagtggttttggatcccac

               ****** *****************************************************

CVOMT_Ker      tttcacaaacccatggcattatatgagtgaatggtttaaacatgagaaccacgccaccca

CVOMT_Yaz      tttcacaaacccatggcattatatgagtgaatggtttaaacatgagaatcacgccaccca

CVOMT_Bir      tttcacaaacccatggcattatatgagtga-tggtttaaacatgagaaccacgccaccca

CVOMT_VAR      tttcacaaacccatggcattatatgagtgaatggtttaaacatgagaaccatgccaccca

CVOMT_Ray      tttcacaaacccatggcattatatgagtgaatggtttaaacatgagaaccacgccaccca

               ****************************** ***************** ** ********

CVOMT_Ker      gtttgaggcagcaaatggatgcacgttttgggagaagttagcaaataagcccagcatggg

CVOMT_Yaz      gtttgaggcagcaaatggatgcacgttttgggagaagttagcaaataagcccagcatggg

CVOMT_Bir      gtttgaggcagcaaatggatgcacgttttgggagaagttagcaaataagcccagcatggg

CVOMT_VAR      gtttgaggcagcaaatggatgcacgtcttgggagaagttagcaaataagcccagcatggg

CVOMT_Ray      gtttgaggcagcaaatggatgcacgttttgggagaagttagcaaataagcccagcatggg

               ************************** *********************************

 

شکل 2- همردیفی توالی ژن چاویکول O-متیل ترنسفراز در پنج ژنوتیپ ریحان از توده­های کرمانشاه، یزد، بیرجند، ورامین و شهر ری.

Figure 2- Alignment of chavicole O-methyl transferase gene sequence in five basil genotypes from populations Kermanshah, Yazd, Birjand, Varamin and Shahr-e-Ray.

 

CVOMT_Ker      tagattttttgatgaagctatgagttgtgactcaaggcttgtggcacatgtactcactaa

CVOMT_Yaz      tagattttttgatgaagctatgagttgtgactcaaggcttgtggcacatgtactcactaa

CVOMT_Bir      tagattctttgatgaagctatgagttgtgactcaaggcttgtggcacatgtactcactaa

CVOMT_VAR      tagattttttgatgaagctatgagttgtgactcaaggcttgtggcacatgtactcactaa

CVOMT_Ray      tagattttttgatgaagctatgagttgtgactcaaggcttgtggcacatgtactcactaa

               ****** *****************************************************

CVOMT_Ker      ggactacaagcgtgtgattgatggaataagaacattggtcgatgttgggggtgataatgg

CVOMT_Yaz      ggaccacaagcatgtgattgatggaataagaacattggtcgatgttgggggtggtaatgg

CVOMT_Bir      ggactacaagcatgtgattgatggaataagaacattggtcgatgttgggggtggtaatgg

CVOMT_VAR      ggactacaagcatgtgattgatggaataagaacattggtcgatgttgggggtggtaatgg

CVOMT_Ray      ggactacaagcatgtgattgatggaataagaacattggtcgatgttgggggtggtaatgg

               **** ****** ***************************************** ******

CVOMT_Ker      aacgatggctaaagctatcgtcgaagcagtgcccaccatgaaatgcactgttcttgacct

CVOMT_Yaz      aacgatggctaaagctatcgtcgaagcagtgcccaccatgaaatgcactgttcttgacct

CVOMT_Bir      aacgatggctaaagctatcgtcgaagcagtgcccaccatgaaatgcactgttcttgacct

CVOMT_VAR      aacgatggctaaagctatcgtcgaagcagtgcccaccatgaaatgcactgttcttgacct

CVOMT_Ray      aacgatggctaaagctatcgtcgaagcagtgcccaccatgaaatgcactgttcttgacct

               ************************************************************

CVOMT_Ker      accacatgttgtggctgggttggaaagcaccgacaaattaagctatattgggggagacat

CVOMT_Yaz      accacatgttgtggctgggttggaaagcaccgacaaattgagctatattgggggagacat

CVOMT_Bir      accacatgttgtggctgggttggaaagcaccgacaaattgagctatattgggggagacat

CVOMT_VAR      accacatgttgtcgctgggttggaaagcaccgacaaattaagctatattgggggagacat

CVOMT_Ray      accacatgttgtggctgggttggaaagcaccgacaaattaagctatattgggggagacat

               ************ ************************** ********************

CVOMT_Ker      gttccagtctatcccttctgcagatgcaattcttctcaagtttataatacacgattggga

CVOMT_Yaz      gttccagtctatcccttctgcagatgcaattcttctcaagtttataatacacgattggga

CVOMT_Bir      gttccagtctatcccttctgcagatgcaattcttctcaagtttataatacacgattggga

CVOMT_VAR      gttccagtctatcccttctgcagatgcaattcttctcaagtttataatacacgattggga

CVOMT_Ray      gttccagtctatcccttctgcagatgcaattcttctcaagtttataatacacgattggga

               ************************************************************

CVOMT_Ker      cgatgaggagggcctcaaaatcttgaagagatgtaaagatgcagttggcattggagggaa

CVOMT_Yaz      cgatgaggagggcctcaaaatcttgaagagatgtaaagatgcagttggcattggagggaa

CVOMT_Bir      cgatgaggagggcctcaaaatcttgaagagatgtaaagatgcagttggcattggagggaa

CVOMT_VAR      cgatgaggagggcctcaaaatcttgaagagatgtaaagatgcagttggcattggagggaa

CVOMT_Ray      cgatgaggagggcctcaaaatcttgaagagatgtaaagatgcagttggcattggagggaa

               ************************************************************

CVOMT_Ker      ggtgataatcatcgatgtggttgtgggtgtcaaccatgacgttgatgaggttttagaaga

CVOMT_Yaz      ggtgataatcatcgatgtggttgtgggtgtcaaccatgacgttgatgaggttttagaaga

CVOMT_Bir      ggtgataatcatcgatgtggttgagggtgtcaaccatgacgttgatgaggttttagaaga

CVOMT_VAR      ggtgataatcatcgatgtggttgtgggtgtcaaccatgacgttgatgaggttttagaaga

CVOMT_Ray      ggtgataatcatcgatgtggttgtgggtgtcaaccatgacgttgatgaggttttagaaga

               *********************** ************************************

CVOMT_Ker      tcaactccacttcgatatggcaatgatgtcttacttcaatgcgaaagaaagaactatgaa

CVOMT_Yaz      tcaactccacttcgatatggcaatgatgtcttacttcaatgcgaaagaaagaactatgaa

CVOMT_Bir      tcaactccacttcgatatggcaatgatgtcttacttcaatgcgaaagaaagaactatgaa

CVOMT_VAR      tcaactccacttcgatatggcaatgatgtcttacttcaatgcgaaagaaagaactatgaa

CVOMT_Ray      tcaactccacttcgatatggcaatgatgtcttacttcaatgcgaaagaaagaactatgaa

               ************************************************************

CVOMT_Ker      tgaatgggaaaaattgatttctgctgctggcttcacaagctataagcttactccagcatt

CVOMT_Yaz      tgaatgggaaaaattgatttctgctgctggcttcacaagctataagcttactccagcatt

CVOMT_Bir      tgaatgggaaaaattgatttctgctgctggcttcacaagctataagcttactccagcatt

CVOMT_VAR      tgaatgggaaaaattgatttctgctgctggcttcacaagctataagcttactccagcatt

CVOMT_Ray      tgaatgggaaaaattgatttctgctgctggcttcacaagctataagcttactccagcatt

               ************************************************************

CVOMT_Ker      tggtgtgag

CVOMT_Yaz      tggtgtgag

CVOMT_Bir      tggtgtgag

CVOMT_VAR      tggtgtgag

CVOMT_Ray      tggtgtgag

               *********

ادامه شکل 2-                                                                     Figure 2- Continiued  


 

   جدول 4- فراوانی SNP‌های شناسایی شده در ژن چاویکول O-متیل ترنسفراز.

Table 4- Frequency of identified SNPs in chavicol O-methyl transferase gene in different basil populations.

نوع SNP

SNP type

فراوانی SNP

Number of SNPs

درصد SNP

SNP percentage

AG

4

33.33

TC

6

50

GC

1

8.33

AT

1

8.33

 

 

در بررسی SNPها در ناحیه‌ی اگزونی دو ژن چاویکول O-متیل ترنسفراز و اوژنول O-متیل ترنسفراز مشاهده گردید که SNPهای کمتری در این نواحی پراکنده شده است ولی از این تعداد کم، تبدیل بازهای هم جنس (A/G و T/C) دارای درصد فراوانی بالایی می‌باشد. همچنین مطالعاتی که تاکنون در افراد درون یک گونه و در ناحیه‌ی اگزونی از توالی ژن‌های مورد برسی انجام شده است نتیجه‌ی مشابهی نشان داده‌اند.  در بررسیSNP ها بین دو گونه O. sanctum و O. basilicum گزارش شد که 6/66 درصد از SNP‌ها مربوط به جهش­های هم جنس می‌باشد که از این میزان 66/32 درصد مربوط به تبدیل A/G و 5/32 درصد ناشی از تبدیل C/T بوده است.  میزان SNP‌های به ‌دست ‌آمده از جهش غیرهمجنس در این مطالعه 4/33 درصد بود که 97/10 درصد ناشی از تبدیل A/T، 4/7 درصد به علت تبدیل G/T، 52/7 درصد از تبدیل به C/G و 95/7 درصد به خاطر تبدیل A/C بوده است (Rastogi et al., 2014). در مطالعه حاضر نیز درصد جهش­های همجنس در هر دو ژن بیشتر از جهش­های ناهمجنس بود. در تحقیقی دیگر SNP های موجود در ESTهای دور قم MU16 و UPV96 گیاه کدوی تخمه کاغذی (Cucurbita pepo L.) با استفاده از تکنولوژی Roch454 شناسایی گردید. در این مطالعه حدود 19980 SNP گزارش گردید که از این تعداد 68 درصد مربوط به SNP های ناشی از جهش همجنس با فراوانی یکسان A/G و C/T و 32 درصد ناشی از جهش ناهمجنس با فراوانی یکسان ناشی از تبدیلات A/T،A/C ، G/T  وC/G   بود. همچنین در این تحقیق گزارش شد که می­توان از این SNPها برای اشباع نقشه­های ژنتیکی، مکان یابی ژنهای کنترل کننده صفات مختلف و انتخاب بر اساس نشانگر در برنامه­های اصلاحی کدوی تخمه کاغذی استفاده کرد Barbazuki et al.,) 2006). فراوانی SNPها در انتهای ´3 توالی‌های EST در سویا بررسی و گزارش شد که در نواحی اگزونی و اینترونی این ESTها به ترتیب در هر هزار جفت باز، 4/1 و 2 SNP دیده می‌شود و فراوانی SNPها در نواحی اینترونی بیشتر می‌باشد (Choi et al., 2003). در مطالعه­ای دیگر تنوع ژنتیکی بین برنج زراعی و خویشاوندان وحشی آن با استفاده از نشانگرهای SNP بررسی شد. بدین منظور قطعاتی به طول 544 تا 1057 جفت باز تکثیر و سپس توالی یابی شد. این قطعات شامل 10 جایگاه جدا از هم از 60 فرد به نمایندگی از دو زیر گونه‌ی Oriza sativa و خویشاوندان وحشی آن بود که هشت جایگاه مربوط به نواحی کد کننده و غیر کننده و 2 جایگاه مربوط به اینترون‌های Adh1 و CatA بود. بعد از توالی یابی 357 SNP با میانگین یک SNP در هر 23 جفت باز و 69 جهش از نوع حذف و اضافه مشاهده شد و اعلام گردید که تنوع نوکلئوتیدی در نواحی کد کننده کمتر از نواحی غیر کد کننده می‌باشد  Zhu et al., 2007)). در تحقیق حاضر بطور میانگین یک و 3/1 SNP در هر 100 جفت باز به ترتیب در ژن­های EOMT و CVOMT مشاهده شد که فراوانی آن بیشتر از سویا ولی کمتر از برنج و خویشاوندان وحشی آن بود. دلیل فراوانی بالای SNP ها در برنج نسبت به تحقیق حاضر احتمالا ناشی از بررسی نواحی اینترونی همراه با نواحی اگزونی و همچنین مقایسه خویشاوندان وحشی برنج در کنار گونه­های زراعی باشد. در کل نتایج تحقیق حاضر نشان داد که جهش­های همجنس در این دو ژن بیشتر از جهش­های ناهمجنس می­باشد. همچنین تنوع­های تک نوکلئوتیدی در نواحی اگزونی ژن‌های مورد مطالعه کم بود و نواحی کد کننده این ژن‌ها در طول تکامل ریحان محفوظ بوده و جهش کمی در این نواحی رخ ‌داده است. پیشنهاد می­شود ارتباط SNPهای شناسایی شده در این ژن­ها با میزان ترکیبات فنیل پروپانوئیدی مانند متیل اوژنول و متیل چاویکول بررسی شود و نشانگرهای پیوسته با میزان بالای این ترکیبات توسعه یابد. همچنین نواحی اینترونی این ژنها و سایر ژنهای کلیدی دخیل در بیوسنتز فنیل پروپانوئیدها شناسایی و SNPها در این نواحی شناسایی شود تا بتوان از آنها به عنوان نشانگرهای کارا در تحقیقات اصلاحی ریحان استفاده نمود. 

 


 

منابع

Abdollahi Mandoulakani B, Alipoor M, Darvishzadeh R, Majroomi Senji B (2018) The effect of drought stress on the expression of genes encoding phenylalanine ammonialyase (PAL), eugenol synthase 1 (EGS1) and caffeic acid O-methyltransferase (COMT) enzymes in Basil (Ocimum basilicum). Journal of Agricultural Biotechnology 4: 117-128.

Ahmadizadeh M, Babaeian-Jelodar N, Mohammadi-Nejad Gh, Bagheri N, Singh RK (2018) Identification of QTLs for rice yield and yield-related traits using high density SNPs linkage map. Journal of Agricultural Biotechnology 3: 1-24

Barbazuki WB, Emrich SJ, Chen HD, Li L, Schnble PS (2006). SNP discovery via 454 transcriptome sequencing. Plant Journal 51: 910-918.

Bilal A, Jahan N, Ahmed A, Bilal SN, Habib S, Hajra S (2012). Phytochemical and pharmacological studies on Ocimum basilicum Linn-A review. International Journal of Current Research and Review 4: 73-83.

Charles D, Simon J, Wood K (1990). Essential oil constituents of Ocimum micranthum Willd. The Journal of Agricultural and Food Chemistry 38: 120–122.

Choi I, Hyten D L, Kumar l, Cergan PB (2003). Single nucleotide polymorphism discovery in 3-EST sequence of soybean, in Proc Plant, Animal Genomes XI Conference (San Diego, California).

Coles ND, Coleman CE, Christensen SA, Jellen EN, Stevens MR, Bonifacio A, Rojas-Beltran JA, Fairbanks DJ, Maughan PJ (2005). Development and use of an expressed sequenced tag library in quinoa (Chinopodium qiuna) for the discovery of single nucleotide polymorphism. Plant Science 168: 439-447.

Gang DR, Wang J, Dudareva N, Nam KH, Simon JE, Lewinsohn E, Pichersky E (2001). An investigation of the storage and biosynthesis of phenylpropenes in sweet basil. Plant Physiology 125: 539-555.

Gupta PK, Roy JK, Prasad M (2001). Single nucleotide polymorphisms; A new paradigm for molecular marker technology and DNA polymorphism detection with emphasis on their use in plants. Current Science 80: 524-535.

Jehan T, Lakhanpaul S (2006). Single nucleotide polymorphism (SNP)–Methods and applications in plant genetics: A review. Indian Journal of Biotechnology 5: 435-459

Labra M, Miele M, Ledda BL, Grassi F, Mazei M, Sala F (2004). Morphological characterization essential oil composition and DNA genotyping of Ocimum basilicum L. Cultivars. Plant Science 167: 725-731.

Mammadov J, Aggarwal R, Buyyarapu R, Kumpatla S (2012). SNP markers and their impact on plant breeding. International Journal of Plant Genomics DOI:10.1155/2012/728398

Rastogi Sh, Meena S, Bhattacharya A, Ghosh S, Shukla RK, Songwan NS, Lal RK, Gupta MM, Lavania UC, Gupta V, Nagegowda D, Shasany AK (2014). De novo sequencing and comparative analysis of holy and sweet basil transcriptomes. BMC Genomic 15: 588

Vieira RF, Simon JE (2000). Chemical characterization of basil (Ocimum SPP) found in the markets and used in the traditional medicine in Brazil. Economic Botany 54(2): 207-216.

Zeai M, Sharifi M, Naghd bady H, Tahsili GH, Ghorbany nahoji M (2014). Review of Basil with emphasis on the major secondary compounds the major secondary compounds (Ocimum basilicum L.) and characteristics of agricultural and pharmaceutical. Journal of Medicinal Plants 52: 26-40

Zhu Q, Zheng X, Jingchu Luo J, Brandon S, Gaut B.S, Ge S (2007). Multilocus Analysis of Nucleotide Variation of Oryza sativa and Its Wild Relatives: Severe Bottleneck during Domestication of Rice. Molecular Biology and Evolution 24(3):875–888.

 

 


Identification of SNPs in exonic regions of eugenol O-methyl transferase and chavicol O-methyl transferase genes in basil

 

Azizi M.1, Abdollahi Mandoulakani B.2*

 

1MSc student of Agricultural Biotechnology, Department of Plant Breeding and Biotechnology, Faculty of Agriculture, Urmia University, Urmia, Iran.

2Associate professor, Department of Plant Breeding and Biotechnology, Faculty of Agriculture, Urmia University, Urmia, Iran.

 

Absrtact

To identify single nucleotide polymorphisms (SNPs) in eugenol O-methyl transferase (EOMT) and Chavicol O-methyl transferase (CVOMT) genes, cleaved amplified polymorphic sequence (CAPS) markers and direct sequencing were used in different basil populations. Fragments with sizes of 571 and 908 bp of coding regions of both genes were amplified and digested with restriction enzymes Pst1 and MseI. In silico digestion of the coding region of the genes by Pst1 produced fragments of 480 and 91 bp in EOMT and 621 and 287 bp in CVOMT. However, no polymorphic restricted patterns were produced in 80 basil individuals using Pst1 digestion. In silico MseI digestion of EOMT and CVOMT gene sequences produces fragments of 59, 135 and 377 bp, and 275, 302 and 331 bp, respectively. Digestion of the amplified fragments of both genes generated polymorphic banding patterns in studied basil genotypes. One out of each different restriction patters which is produced for both genes in basil genotypes, was selected for sequencing. Sequences obtained, were aligned for both genes using Clustal Omega and SNPs were identified. The results of EOMT alignment revealed transition mutations TC and AG, but no transversion was observed in this gene. Mutations AG, TC, AC and AT were found in CVOMT gene with the highest frequency of AG. In conclusion, the results of the current investigation revealed low polymorphism in coding regions of the studied genes and demonstrated the conservity of the coding regions of both genes during basil evolution.

 

Keywords: basil, eugenol O-methyl transferase, chavicole O-methyl transferase, SNP, CAPS markers.

 



* نویسنده مسئول: بابک عبدالهی مندولکانی                تلفن: 09122386990               Email: b.abdollahi@urmia.ac.ir 

[1]. Eugenol O-methyl transferase

[2]. Chavicol O-methyl transferase

[3] www.ebi.ac.uk

* Corresponding Author: Abdollahi Mandoulakani B.     Tel: 09122386990              Email: b.abdollahi@urmia.ac.ir 

Abdollahi Mandoulakani B, Alipoor M, Darvishzadeh R, Majroomi Senji B (2018) The effect of drought stress on the expression of genes encoding phenylalanine ammonialyase (PAL), eugenol synthase 1 (EGS1) and caffeic acid O-methyltransferase (COMT) enzymes in Basil (Ocimum basilicum). Journal of Agricultural Biotechnology 4: 117-128.
Ahmadizadeh M, Babaeian-Jelodar N, Mohammadi-Nejad Gh, Bagheri N, Singh RK (2018) Identification of QTLs for rice yield and yield-related traits using high density SNPs linkage map. Journal of Agricultural Biotechnology 3: 1-24
Barbazuki WB, Emrich SJ, Chen HD, Li L, Schnble PS (2006). SNP discovery via 454 transcriptome sequencing. Plant Journal 51: 910-918.
Bilal A, Jahan N, Ahmed A, Bilal SN, Habib S, Hajra S (2012). Phytochemical and pharmacological studies on Ocimum basilicum Linn-A review. International Journal of Current Research and Review 4: 73-83.
Charles D, Simon J, Wood K (1990). Essential oil constituents of Ocimum micranthum Willd. The Journal of Agricultural and Food Chemistry 38: 120–122.
Choi I, Hyten D L, Kumar l, Cergan PB (2003). Single nucleotide polymorphism discovery in 3-EST sequence of soybean, in Proc Plant, Animal Genomes XI Conference (San Diego, California).
Coles ND, Coleman CE, Christensen SA, Jellen EN, Stevens MR, Bonifacio A, Rojas-Beltran JA, Fairbanks DJ, Maughan PJ (2005). Development and use of an expressed sequenced tag library in quinoa (Chinopodium qiuna) for the discovery of single nucleotide polymorphism. Plant Science 168: 439-447.
Gang DR, Wang J, Dudareva N, Nam KH, Simon JE, Lewinsohn E, Pichersky E (2001). An investigation of the storage and biosynthesis of phenylpropenes in sweet basil. Plant Physiology 125: 539-555.
Gupta PK, Roy JK, Prasad M (2001). Single nucleotide polymorphisms; A new paradigm for molecular marker technology and DNA polymorphism detection with emphasis on their use in plants. Current Science 80: 524-535.
Jehan T, Lakhanpaul S (2006). Single nucleotide polymorphism (SNP)–Methods and applications in plant genetics: A review. Indian Journal of Biotechnology 5: 435-459
Labra M, Miele M, Ledda BL, Grassi F, Mazei M, Sala F (2004). Morphological characterization essential oil composition and DNA genotyping of Ocimum basilicum L. Cultivars. Plant Science 167: 725-731.
Mammadov J, Aggarwal R, Buyyarapu R, Kumpatla S (2012). SNP markers and their impact on plant breeding. International Journal of Plant Genomics DOI:10.1155/2012/728398
Rastogi Sh, Meena S, Bhattacharya A, Ghosh S, Shukla RK, Songwan NS, Lal RK, Gupta MM, Lavania UC, Gupta V, Nagegowda D, Shasany AK (2014). De novo sequencing and comparative analysis of holy and sweet basil transcriptomes. BMC Genomic 15: 588
Vieira RF, Simon JE (2000). Chemical characterization of basil (Ocimum SPP) found in the markets and used in the traditional medicine in Brazil. Economic Botany 54(2): 207-216.
Zeai M, Sharifi M, Naghd bady H, Tahsili GH, Ghorbany nahoji M (2014). Review of Basil with emphasis on the major secondary compounds the major secondary compounds (Ocimum basilicum L.) and characteristics of agricultural and pharmaceutical. Journal of Medicinal Plants 52: 26-40
Zhu Q, Zheng X, Jingchu Luo J, Brandon S, Gaut B.S, Ge S (2007). Multilocus Analysis of Nucleotide Variation of Oryza sativa and Its Wild Relatives: Severe Bottleneck during Domestication of Rice. Molecular Biology and Evolution 24(3):875–888.