Effect of whey powder and physical form of feed on humoral immune response and expression of interleukin-4 and interferon-gamma transcripts in jejunum of broiler chickens

تاثیر پودر آب پنیر و شکل فیزیکی خوراک بر پاسخ ایمنی هومورال و بیان ژن­های اینترلوکین-4 و اینترفرون گاما در ژنوم جوجه­های گوشتی

سونیا زکی زاده*¹، مریم ترابی²، علی جوادمنش³، علی زنگنه⁴، محمد حسین ناظم شیرازی⁵

¹ دانشیار بخش ژنتیک و اصلاح دام موسسه تحقیقات علوم دامی کشور، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، کرج، ایران.

² آزمایشگاه بیولوژی ملکولی اداره کل دامپزشکی خراسان رضوی،  مشهد، ایران.

³ استادیار گروه علوم دامی دانشگاه فردوسی مشهد، مشهد، ایران.

⁴ گروه علوم دامی و دامپزشکی، مرکز تحقیقات و آموزش کشاورزی و منابع طبیعی خراسان رضوی، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، مشهد، ایران.

⁵ دکترای دامپزشکی و متخصص بین المللی آزمایشگاه در پروژه بانک جهانی، پروژه فائو، ایران.

تاریخ دریافت: 27/01/1397، تاریخ پذیرش: 02/05/1397

چکیده

این طرح جهت بررسی تاثیر پودر آب­پنیر و شکل فیزیکی خوراک بر ایمنی هومورال و بیان ژن­های اینترلوکین-4 و اینترفرون گاما روی240 قطعه جوجه خروس یک­روزه گوشتی سویه راس 308 انجام شد. آزمایش در قالب طرح کاملا تصادفی در 6 تیمار به روش فاکتوریل (2×3)، آب پنیر در سه سطح (صفر، 4 و 8%) و فرم فیزیکی در دو سطح (آردی و پلت) به جیره جوجه­های گوشتی با 4 تکرار و 10 قطعه جوجه در هر تکرار انجام شد. جیره­ها بر مبنای احتیاجات جوجه گوشتی سویه راس 308 تنظیم و در سه مرحله پرورش در اختیار پرندگان قرار گرفتند. جهت تعیین تیتر ایمنی علیه نیوکاسل، برونشیت، گامبورو و آنفولانزا در روزهای 10، 31 و 42 خونگیری شد. در پایان هر مرحله یک قطعه جوجه از هر واحد آزمایشی انتخاب و کشتار شد؛ وزن اندام­های لنفاوی یادداشت و بیان ژن­های اینترلوکین-4 و اینترفرون­گاما نمونه ژژنوم پس از استخراج mRNA و ساخت cDNA، اندازه­گیری شد. مشخص گردید افزودن پودر آب­پنیر بر وزن طحال و بورس فابرسیوس اثر معنی­دار نداشت، اما پلت کردن در میان­دان بر وزن بورس تاثیر معنی­دار داشت (01/0p<). پلت کردن و افزودن آب­پنیر به جیره در میان­دان باعث افزایش بیان نسبی ژن اینترلوکین-4 گردید (05/0p<). بیان ژن اینترفرون­گاما تحت تاثیر پودر آب­پنیر قرار نگرفت اما پلت کردن، بیان این ژن را در پیش­دان (01/0p<) و میان­دان افزایش داد (01/0p<).

واژه­های کلیدی: اندام لنفاوی، ایمنی هومورال، بیان ژن، تیتراسیون واکسن.

مقدمه

بهره­گیری از فرآورده­های فرعی از جمله فرآورده­های جانبی صنایع شیر به عنوان منابع خوراکی جدید در راستای کاهش هزینه­های پرورش اهمیت فراوانی دارد. آب پنیر که مایع حاصل از فرایند پنیرسازی است، به رغم آنکه ارزش پروتئینی بالایی در زنجیره غذایی انسان دارد، به عنوان ضایعات کارخانجات لبنی محسوب می­شود، اگرچه می­تواند خشک شده آن را برای تغذیه طیور مورد استفاده قرار داد (Aghaei et al., 2010). پودر آب پنیر دارای مقدار قابل توجهی لاکتوز است، اما طیور به دلیل نداشتن آنزیم لاکتاز قادر به هضم آن نیستند؛ در نتیجه لاکتوز موجود در آب پنیر در دستگاه گوارش پرنده تخمیر شده و باعث تکثیر برخی باکتری­های مفید مانند لاکتوباسیل­ها می­شود (Aghaei et al., 2010). پودر آب پنیر به عنوان پری بیوتیک شناخته شده و اخیرا به عنوان محرک رشد، جایگزین شونده‌های آنتی بیوتیک گردیده است. پری بیوتیک­ها،کربوهیدرات­های با زنجیره کوتاه هستند که توسط آنزیم­های گوارشی طیور قابل هضم نیستند (Taherpour et al., 2009). این مواد از طریق رشد و یا فعالیت تعداد محدودی از گونه­های باکتریائی که هدف آنها بهبود سلامتی میزبان است، به طور انتخابی باعث تحریک رشد یا فعالیت شمار محدودی از باکتری­ها شده و به طور موثری بر ارتقاء سلامتی پرنده تاثیر می­گذارند (Panda et al., 2006). در تحقیقی که توسط Kheiri et al. (2015) انجام شد، افزودن آب پنیر باعث بهبود عملکرد تولیدی، کاهش کلسترول و تری گلیسرید، بهبود تیتر واکسیناسیون علیه بیماری نیوکاسل، افزایش طول و ضخامت اپیتلیال روده و بهبود میکروفلور روده جوجه­های گوشتی شد. بهبود ضریب تبدیل غذایی طیور گوشتی با مصرف پودر آب پنیر نیز گزارش شده است (Aghaei et al., 2010; Omara, 2012). با افزایش نگرانی­ها در رابطه با مقاومت آنتی بیوتیکی و ممانعت درمان با این محصولات در اروپا و ایالات متحده آمریکا، تحقیقات جهت یافتن جایگزین شونده­های آنتی‌بیوتیک­ در تولیدات طیور افزایش یافته است (Paterson and Borkhoder, 2003). مکانیسم دیگری که ممکن است وجود داشته باشد، تغییر قابلیت متابولیسمی فلور روده و تغییر میکروفلور آن به سمت میکروب‌های مفید نظیر لاکتوباسیل‌ها و کاهش اشریشیا کلی و سایر میکروارگانیسم‌های مضر، با مصرف مواد خاصی مانند پری بیوتیک‌ها (آب پنیر، مانان، بتاگلوکان، فرمکتو)، اسیدهای آلی و انواع روغن است (Ebrabimi et al., 2016).

امروزه، دو نوع فرم فیزیکی آردی و پلت جهت تغذیه طیور متداول است. مهمترین عامل تاثیرگذار در تهیه پلت، فرآیند سابیدن و شرایط آن است که باعث ریزتر شدن اندازه ذرات و افزایش نسبت سطح به حجم می­شود؛ در نتیجه باعث نفوذ بیشتر دما و رطوبت به عمق ماده غذایی می­گردد. شرایط دمایی باعث اتصال مواد مغذی می­شود که برای تشکیل باندهای قوی پلت، ضروری هستند. (Kenny & Flemming, 2006). حرارتی که روی کربوهیدرات­ها اعمال می­شود، باعث شکسته شدن گرانول­های آمیلوز و آمیلوپکتین می­شود. همچنین، تغییراتی در ساختار سه بعدی پروتئین رخ می­دهد که قابلیت هضم آن را بهبود می­دهد که می‌توان آن را به تاثیر دما، فشار و رطوبت خوراک نسبت داد، زیرا در درجه خاصی از ژلاتینه شدن، پرنده از مواد مغذی بهتر استفاده می‌کند (Maiorka et al., 2005). از طرف دیگر، تعداد ویلی­های دودنوم جوجه­ها در جیره­های پلت بیشتر و کریپت­ها، عمیق­تر از جیره آردی است (Dahlke et al., 2002). در برخی تحقیقات pH دستگاه گوارش تغییر معنی­دار نشان نداد (Dahlke et al., 2002)، در حالی که گزارش دیگر بیان نمود که در جوجه­های تغذیه شده با جیره پلت به دلیل افزایش غلظت اسیدهای چرب فرار سنگدان و سکوم که محصول تخمیر میکروبی هستند، ، اسیدیته سکوم کاهش نشان داد (Huang et al., 2006). باید توجه نمود که تغذیه جیره‌های پلت شده به تنهایی و بدون در نظرگرفتن کیفیت آن، برای دستیابی به عملکرد بالاتر پرنده کفایت نمی‌کند، به طوری که تغذیه خوراک‌های پلت شده با کیفیت ضعیف، باعث کاهش اثرات مفید استفاده از خوراک پلت در طیور گوشتی می‌شود (Khodaei et al. 2015).

ایمنی هومورال، به آن دسته از پاسخ­های ایمنی اطلاق می­شود که آنتی بادی­ها نقش مهمی در مکانیسم­های اجرایی آن دارند. پاسخ­های ایمنی به دو دسته هومورال (وابسته به آنتی بادی) و سلولی ( وابسته به سلول T) تقسیم می‌شوند. حذف آنتی ژن­های محلول و تخریب میکروارگانیسم­های خارج سلولی، وظیفه­ی اصلی ایمنی هومورال (به واسطه­ی آنتی بادی­های تولید شده توسط سلول­های B) و حذف میکروارگانیسم­های داخل سلولی (به واسطه­ی سلول­های T) می باشد. آنتی بادی دسته­ای از پروتئین­های گلوبولین می­باشند که در ایمنی بدن نقش دارند و ایمنوگلوبولین نامیده می­شوند. یکی از سیگنال­های فعال سازی پاسخ ایمنی هومورال، سیتوکین­هایی مانند اینترلوکین-4 هستند که سبب فعال شدن، تکثیر و تمایز سلول­های B می­شوند (Fietta and Delsante, 2009). ژن اینترلوکین-4 در طیور روی کروموزوم 13 قرار گرفته و طول mRNA آن 411 جفت باز می­باشد (NCBI, NM_001007079). اینترلوکین­ها، سیتوکین­هایی هستند که روابط بین لنفوسیت­ها و سایر لکوسیت­ها را تنظیم می­کنند و با مولکول‌های بسیاری به صورت واسطه­ای در مکانیسم­های ایمنی مرتبط هستند، لذا، به محرک­های انتخابی بسیاری از بیماری­های عفونی پاسخ می­دهند (Downing et al., 2010). تیموس که اندام اولیه لنفی می‌باشد در عدم حضور هر تحریک کننده­ای قادر به تولید انواع سیتوکین­ها است. در روز 14 و 18جنینی و روز اول پس از هچ، ژن های سیتوکین جوجه مانند IFN نوع 1، IL-1β، IL-2 و فاکتور رشد β4، به صورت جزئی در تیموسایت‌ها بیان شده و به نظر می‌رسد با توسعه تیموس همراه باشند (Peters et al., 2003).

 اینترفرون­ها گروه دیگری از سیتوکین­ها هستند که در تکثیر ویروس­ها تداخل ایجاد می­کنند و در ایمنی ذاتی نقش دارند. اینترفرون‌ها به سه تیپ 1 (مقابله با عفونت ویروسی)، تیپ 2 و تیپ 3 تقسیم می­شوند. تیپ 2 اینترفرون یا اینترفرون گاما، با خاصیت ضد ویروسی آن که توسط سلول‌های ایمنی فعال نظیر سلول‌های T و natural killer ها (NK) ایجاد می‌شود، شناخته می‌شود. تیپ 3 اینترفرون‌ها که پیشتر به نام اینترلوکین 28  و 29 شناخته می‌شدند، در بافت‌های محدودی توزیع شده‌اند و عمدتا در سطوح اپیتلیال فعالیت می‌کنند (Negishi et al., 2017). ژن اینترفرون گاما در طیور روی کروموزوم 1 قرار گرفته و پروتئین بالغی با تعداد 145 اسیدآمینه و وزن مولکولی 8/16 کیلودالتون تولید می­کند. این ژن همولوژی بالایی از اسیدهای آمینه و تیپ 1 اینترفرون پستانداران به خصوص در موتیف­های آن دارد و شواهد حاکی از انشقاق طیور و پستاندار در 350 میلیون سال پیش دارد (Digby and Lowenthal, 1995). شناسایی اولیه پپتیدهای مشتق از آنتی ژن به وسیله گیرنده­های سلول­های T انجام شده و سلول­های T helper (Th) نقش مهمی در القا و تنظیم پاسخ ایمنی ایفا می­کنند که به دو دسته Th1 و Th2 تقسیم می­شوند. در گذشته تصور می‌شد که اینترفرون گاما توسط سلول­های Th1 و لنفوسیت سیتوکین‌های CD8⁺ تولید می‌شود اما گزارش‌های اخیر حاکی از شواهدی است که سایر سلول‌ها مانند سلول‎های B، سلول‌های دندریت و ماکروفاژها نیز اینترفرون ترشح می‌کنند (Negishi et al., 2017).

اگر چه مطالعات زیادی در زمینه ژنتیک ملکولی و ارتباط بین ژنوتیپ و عملکرد طیور در ایران انجام شده است (Zandi et al., 2014; Mohammadifar et al., 2014; Moazeni et al., 2016a; Moazeni et al., 2016b; Shahdadnejad et al., 2016)، اما تاکنون مطالعه نوتری‌ژنومیکس در زمینه ارتباط بیان ژن­های مرتبط با پاسخ ایمنی با تغذیه آب پنیر در این حیوانات گزارش نشده است. به دلیل آنکه پری‌بیوتیک‌ها در تغییر جمعیت میکروبی روده موثر هستند؛ لذا، هدف از این تحقیق نقش و اثر پری­بیوتیک آب پنیر و نوع فرم فیزیکی جیره روی عملکرد تولیدی و افزایش کارایی و تغییرات بیان ژن­های مرتبط با سیستم ایمنی سلولی در روده باریک طیور در مقابله با بیماری بود.

مواد و روش­ها

در این طرح تعداد 240 قطعه جوجه نر یکروزه گوشتی از سویه تجاری راس 308 به صورت آزمایش فاکتوریل چند مشاهده­ای 2×3 در قالب طرح کاملا تصادفی اجرا شد که در آن دو عامل پودر آب پنیر با سه سطح صفر، 4 و 8 درصد و عامل فرم فیزیکی خوراک با دو سطح  جیره آردی و پلت (دو شکل خوراکی رایج در صنعت پرورش طیور) در نظر گرفته شد. مبنای انتخاب این سطوح، بر اساس بررسی نتایج حاصل از تحقیق سایر محققین و پیشنهادات ارائه شده بود (Mehri et al., 2004; Kermanshahi et al., 2006; Rastad et al., 2008; Aghaei et al., 2010). مدت زمان پرورش جوجه گوشتی دو ماه بود و در سن 42 روزگی با کشتار پایان یافت. جوجه­ها پس از ورود به سالن شماره گذاری و توزین شدند و به 24 گروه 10 قطعه­ای با میانگین وزنی مشابه (7/2±5/40 گرم) در پن­های مشخص اختصاص یافتند. برنامه واکسیناسیون گله بر اساس کارت بهداشتی و بیماری­های شایع در منطقه توسط دامپزشک متخصص بیماری­های طیور تجویز گردید (جدول 1).

جدول 1- برنامه واکسیناسیون گله.

Table 1- Vaccination program.

جهت بررسی تیتر ایمنی جوجه­ها، بر اساس برنامه واکسیناسیون گله و پس از تزریق واکسن­های مذکور در روزهای 24، 31 و 42 روزگی، از هرتکرار دو قطعه جوجه انتخاب و از ورید بال با سرنگ 5 میلی­لیتری خون‌گیری شده، سرم جدا شد تا سطح تیتر ایمنی گامبورو و برونشیت با روش الایزا (ELISA^[1]) و  نیوکاسل و آنفولانزا به روش ممانعت از هماگلوتیناسیونHI^[2]  مشخص گردد. جیره­های آزمایشی بر اساس احتیاجات جوجه گوشتی سویه راس 308 سال (2009) و با استفاده از نرم افزار UFFDA تنظیم شدند (Pesti et al., 1992). در تمام تیمارها، جیره‌ها بر اساس انرژی، پروتئین و مواد مغذی یکسانی برای هر یک از مراحل پرورش آغازین (10-0 روزگی)، رشد (24-11 روزگی) و پایانی (42-25 روزگی) تنظیم شدند. آب پنیر ماده خوراکی نارنجی رنگ به صورت پودر کریستاله که از پساب کارخانجات لبنی استحصال گردیده و از ضایعات زنجیره غذائی انسانی به دست می­آید، در سه سطح  صفر، 4 و 8 درصد در جیره اعمال شد و مورد استفاده جوجه­ها قرار گرفت. آنالیز پودر آب پنیر مورد استفاده در تیمارهای جیره این آزمایش در جدول 2 آورده شده است

با توجه به اینکه محل اثرگذاری پری‌بیوتیک‌ها روی فلور میکروبی روده و یکی از سایت‌های مهم جذب غذا در ژژنوم است، نمونه برداری از آن در پایان هر سه مرحله پرورش در روزهای 11 ، 25 و 42 انجام گرفت. تعداد 24 جوجه­ (1 قطعه از هر پن) پس از ذبح بلافاصله کالبدگشایی شده، بورس فابرسیوس و طحال جدا و از قسمت میانی ژژنوم، حدود 2 سانتی متر جدا و در داخل میکروتیوپ و کانتینر ازت مایع به آزمایشگاه ژنتیک ملکولی ارسال شد. به منظور بررسی میزان بیان ژن­های اینترلوکین 4 و اینترفرون گاما به همراه ژن مرجع GAPDH سه جفت آغازگر اختصاصی به شرح جدول 3 توسط شرکت متابیون آلمان سنتز شد (جدول 3) (Cox et al., 2010؛ Kitessa et al., 2014).

استخراج RNA با استفاده از کیت جداسازی High Pure شرکت Roche و برای تهیه cDNA از پرایمر هگزامر تصادفی استفاده گردید. واکنش PCR در حجم 20 میکرولیتر و طبق دستورالعمل شرکت سازنده صورت گرفت.

واکنش­ها در دستگاه Corbett Research کیاژن استرالیا مدل Rotor  gene 6000 انجام گرفت. کلیه واکنش‌ها به صورت دو تکرار و طبق استاندارد MIQE[3] انجام شدند (Bustin et al., 2009). تکثیر ژن بیان شده برای PCR کمّی با استفاده از اجزای زیر و در شرایط حرارتی مشخص در جدول 4 در حجم 20 میکرولیتر انجام شد.

. جدول 2- آنالیز پودر آب پنیر مورد استفاده در تیمارهای جیره.

Table 2- Analysis of Whey components used in treatments.

جدول3- توالی آغازگرهای استفاده شده در آزمایش.

Table 3- Primary sequences used in experiment.

مستر میکس حاوی سایبرگرین به نام 2qPCR-Mastermix with SYBR green از شرکت Primerdesign (انگلستان) استفاده شد (جدول 4).

شرایط دمایی برای تمام ژن‌ها یکسان بوده و شامل 95 درجه سانتی گراد به مدت 5 دقیقه و سپس حرارت 95 درجه و 10 ثانیه و 60 درجه 60 ثانیه بودکه 50 دور تکرار انجام گرفت . برای رسم منحنی ذوب[4]  دما از 70 تا 95 درجه سانتی گراد بود که در هر ثانیه، یک درجه دما بالاتر رفته و به مدت 10 ثانیه در همین دما باقی می‌ماند. به منظور تعیین بازده واکنش به روش منحنی استاندارد (‌Ghanipoor-Samami et al., 2018)، سری رقت­های 1 به 100، 1 به 1000، 1 به 10000، و 1 به 100000 از مخلوطی از کل cDNAها (5/0 میکرولیتر از هر cDNA) تهیه و واکنش­های جداگانه qPCR انجام شد. با استفاده از Cq[5] (محور Y) و لگاریتم رقت­ها (محور X)، منحنی استاندارد برای هر جفت پرایمر ترسیم شد و شیب نمودار و راندمان واکنش توسط نرم افزار Corbet Rotor- Gene Q series software 2.3.1 محاسبه گردید.

مدل آماری طرح در بخش فراسنجه­های عملکردی به صورت مدل زیر بود:

Y_ijk=M+A_i +B_j +AB_ij+e_ijk

Y_ijk=ارزش هر مشاهده؛ M= میانگین کل مشاهدات؛ A_i= اثر پودر آب پنیر؛ B_j= اثر فرم فیزیکی خوراک؛ AB_ij= اثر متقابل پودر آب پنیر و فرم فیزیکی خوراک؛ e_ijk= اثر خطای آزمایش.

داده ها ابتدا با برنامه اکسل((Exell مرتب شده و با استفاده از نرم افزار آماری SAS 9.1  به روش تجزیه واریانس مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفت. لازم به ذکر است که ضریب تصحیح برای داده‌ها استفاده نشد و از منحنی استاندارد برای تبدیل استفاده گردید. مقایسه میانگین تیمارها نیز با استفاده از آزمون چند دامنه­ای دانکن(05/0) انجام شد.

به منظور محاسبه کمّی تغییر بیان ژن نسبی و آنالیز آماری آن از روش منحنی استاندارد استفاده شد و مقادیر    Cq ژن مرجع و نمونه ژن­های بیان شده یا میانگین آنها، تبدیل به مقادیر مطلق و بدون واحد گردید  (Ghanipoor-Samami et al., 2018):

Cq = سیکل کمی هر نمونه، B= مقدار ثابت و اولیه منحنی استاندارد، M= شیب منحنی استاندارد.

برای نرمال کردن داده­ها میانگین هندسی تکرارها برای هر ژن محاسبه شد (Xiang et al., 2014) و در آنالیز واریانس استفاده گردیدند. برای بررسی معنی­دار بودن تغییر بیان محاسبه شده، از نرم افزار SAS استفاده شد و تفاوت بین گروه­ها برای هر یک از ژن­ها به کمک آزمون دانکن در سطح اطمینان 95% مورد بررسی قرار گرفت.

نتایج و بحث

نتایج آنالیز واریانس وزن طحال و بورس در جدول 5 نشان دهنده این مطلب است که افزودن آب پنیر روی این اوزان معنی­دار نبود. تاثیر فرم فیزیکی جیره روی وزن نسبی بورس فابرسیوس معنی­دار بود (01/0P<) اما روی وزن طحال معنی­دار نبود.

جدول 4- اجزای واکنش Realtime PCR.

Table 4-Realtime PCR reaction component.

اگرچه تاثیر آب پنیر روی وزن اندام­های لنفاوی معنی­دار نبود، ولی درصد وزن نسبی بورس و طحال در سطوح 4 و 8 درصد پودر آب پنیر کاهش یافت (جدول 5). همچنین، مشاهده گردید که افزودن آب پنیر در جیره پلت باعث تشدید کاهش وزن بورس شد، اگرچه اثرات متقابل معنی‌دار نبود.

تغییرات وزن در اندام‌های طیور در اثر مصرف خوراک پلت گزارش شده است، به طوری که وزن پیش معده (Dahlke et al., 2002)، روده کوچک (Dahlke et al., 2002) و سنگدان (Huang et al., 2006; Khodaei et al. 2015؛ Dahlke et al., 2002) کمتر و میانگین افزایش وزن (Khodaei et al. 2015) و وزن سکوم بیشتر (Huang et al., 2006) جوجه­های تغذیه شده با جیره پلت بیشتر از آردی است؛ در حالی که طول روده باریک نیز کوتاهتر (Dahlke et al., 2002) می­باشد. دلیل کمتر بودن وزن و اسیدیته سنگدان در جیره­های پلت را به تحریک مکانیکی کمتر در سنگدان و ترشح اسید کلریدریک نسبت داده‌اند. همچنین، نرخ زنده‌مانی و شیوع سالمونلا تیفیموریوم تحت تاثیر فرم فیزیکی خوراک قرار می‌گیرد (Huang et al., 2006). انتظار می­رود که با افزایش سطح پودر آب پنیر و تقویت سیستم ایمنی بدن و در نتیجه بهبود هضم و جذب مواد مغذی، وزن نسبی این اندام­ها کاهش یابد و یا به دلیل مرگ سلولی و یا آتروفی، اندام تحلیل یافته باشد. بنابراین، نیازی به تولید لنفوسیت­ها در برابر آنتی­ژن­های احتمالی نباشد و اوزان افزایش نیابند.

جدول 5- تاثیر پودر آب پنیر و فرم فیزیکی خوراک بر وزن نسبی بورس و طحال (گرم) جوجه­های گوشتی در پایان دوره پرورش.

Table 5- The effect of whey powder and physical form of diet on burse and spleen relative weight of chicks at the end of trial.

به دلیل درگیر نشدن گله با ویروس گامبورو انتظار می­رفت که وزن بورس نیز تغییر معنی­دار نشان ندهد. Khani et al. (2015) نیز تاثیری در وزن اندام‌های لنفوئیدی جوجه‌های تغذیه شده با پودر آب پنیر اسیدی و پودر آب پنیر اسیدی کم لاکتوز مشاهده نکردند. این در حالی است که Kheiri et al. (2015) کاهش وزن بورس فابرسیوس، چربی بطنی و افزایش وزن کبد و طحال بر اثر مصرف آب پنیر در جوجه­ها را گزارش کردند.

پاسخ­های ایمنی هومورال (تیتر ایمنی واکسیناسیون)

اگرچه افزودن آب پنیر تاثیر معنی­دار روی تیتر گامبورو، برونشیت و آنفولانزا در روزهای پس از واکسیناسیون نداشت (05/0P<)،  اما مقایسات میانگین نشان داد که افزودن آب پنیر به جیره روی تیتر واکسن نیوکاسل در 31 روزگی معنی­دار بود و باعث بهبود سطح ایمنی شد (05/0P<). تیترهای برونشیت، نیوکاسل و آنفولانزا تحت تاثیر نوع فرم فیزیکی جیره قرار نگرفتند اما مقایسات میانگین حاکی از تاثیر معنی­دار پلت کردن جیره روی کاهش تیتر گامبورو در روز 31 بود (05/0P<) (جدول 6 و 7).

صرف نظر از نوع فرم فیزیکی جیره، مقدار تیتر واکسن نیوکاسل در جیره­های حاوی آب پنیر در 31 روزگی بالاتر بود (05/0P<). گذشت زمان پس از واکسیناسیون نشان دهنده افزایش مقدار تیتر از روز 24ام پرورش تا زمان کشتار می­باشد. تیتر واکسن نیوکاسل و آنفولانزا در جیره­های حاوی آب پنیر نسبت به بدون آب پنیرها بالاتر بود. در حالی که میزان آنتی بادی گامبورو در جیره­های پلت شده کمتر از جیره­های آردی بود. در مورد تیتر برونشیت روند خاصی بین فرم فیزیکی جیره و میزان آب پنیر به دست نیامد.

تحقیقات زیادی روی مکانیسم تاثیر پری‌بیوتیک‌ها روی سیستم ایمنی انجام نشده است، اما گزارشات حاکی از این است که با مصرف پودر آب پنیر در جیره، pH دستگاه گوارش پایین می‌آید و در نتیجه فعالیت میکروارگانیسم‌هایی مانند اشریشیاکلی که در محدوده بالاتری از pH فعالیت دارند را محدود می‌کند.

افزودن پری‌بیوتیک‌ها باعث کمک به تغییرات میکروفلور دستگاه گوارش در جهت کلونیزه شدن باکتری‌های مفید می‌شود و در مهار پاتوژن‌هایی مانند اشریشیاکلی و کلستریدیوم‌ها موثر است (Dhama et al., 2011).

جدول 6- تاثیر سطوح پودر آب پنیر و فرم فیزیکی بر سطح تیتر ایمنی گامبورو و برونشیت درجوجه­های گوشتی.

Table 6- The effect of whey powder and physical form of diet on titration of IBD and bronchitis in chicks.

جدول 7- تاثیر سطوح پودر آب پنیر و فرم فیزیکی بر سطح تیتر ایمنی نیوکاسل و آنفولانزا درجوجه­های گوشتی.

Table 6- The effect of whey powder and physical form of diet on titration of newcastle and influenza in chicks.

^a-c values with different alphabet in columns differ significantly (p<0.05).

پری‌بیوتیک‌هایی مانند مانان-اولیگوساکارید و فروکتواولیگوساکارید اثرات ایمن سازی روی بافت‌های لنفوئیدی مرتبط با دستگاه گوارش را دارند، بدون آنکه روی عملکرد تولید تاثیر منفی بگذارند. این بهبود عملکرد می‌تواند از طریق افزایش دادن پروفایل میکروبی و فعال کردن مواد اولیه و منبع انرژی برای لاکتوباسیل‌ها و ایجاد باندهای رقابتی در جهت جلوگیری از اتصال باکتری‌های گرم منفی به دیواره روده باشد (Roberts et al., 2015). شکل 1 بیان می­کند که از زمان هچ شدن جوجه تا 24 روزگی سطح ایمنی علیه بیماری­های نیوکاسل، آنفولانزا، گامبورو و برونشیت کاهش پیدا کرده است که نتیجه افت تیتر ایمنی مادری نیوکاسل و گامبورو است. پس از اتمام آخرین واکسن در 21 روزگی (نیوکاسل)، سطح ایمنی علیه نیوکاسل و آنفولانزا افزایش یافت. اگرچه تغییرات برای برونشیت اندکی کاهشی بود، اما روند ایمنی بدن علیه گامبورو سیر نزولی نشان داد. انجام واکسیناسیون از هفته 3 و 4 به بعد باعث افزایش تیتر واکسن شد که این روند تا هنگام کشتار ادامه یافت.

شکل 1-  تغییرات تیتر واکسن در طول دوره پرورش (ND نیوکاسل، AI آنفولانزا، IBD گامبورو، IBV برونشیت).

Figure 1- Vaccine titeation changes during breeding (ND newcastle, AI influenza, IBD infectious bursa disease, IBV bronchitis).

توجه به عیار پادتن مادری در هفته اول پرورش جوجه ها بسیار حائز اهمیت است، زیرا میزان بالای ایمنی مادری جوجه‌های جوان موجب عدم تکثیر کافی واکسن‌های زنده و در نتیجه موجب کاهش ایمنی حاصل می‌شود. برای مثال جوجه‌های حاصل از مرغ‌های مادر با تیتر ایمنی بالا علیه بیماری گامبورو ممکن است برای مدت‌ها دارای ایمنی مادری علیه این بیماری بوده و در صورت انجام واکسیناسیون پاسخ مناسب ایمنی حاصل نگردد.  عفونت با ویروس گامبورو تا سن سه هفتگی از طریق تخریب بافت لنفوئیدی بورس فابریسیوس باعث تضعیف سیستم ایمنی و در نتیجه کاهش یا عدم پاسخ به واکسن‌های متداول و نیز افزایش حساسیت در برابر دیگر بیماری‌های عفونی می‌شود. در حالی که در سنین بالاتر (معمولاً سه تا شش هفتگی)، ممکن است با نشانه‌های درمانگاهی و تلفات 15-20 درصد همراه باشد  (Mayahi et al., 2017). با توجه به تیتر بالای نیوکاسل و افزایش ناگهانی آن در 31 روزگی می­توان نتیجه گرفت که تیتر بالا به دلیل برخورد گله با ویروس­های فیلدی در حدود 3 هفتگی ایجاد شده که تحریک سیستم ایمنی را به دنبال داشته است، اگرچه باعث بروز علایم مشخص بیماری نشده است. لذا به دلیل درگیر شدن گله با ویروس نیوکاسل، تیترهای واکسن، نتیجه واقعی اعمال تیمارها نمی­توانند تلقی شوند؛ اما به نظر می­رسد افزودن 4% آب پنیر نسبت به جیره شاهد، سیستم ایمنی را تقویت کرده است؛ اگرچه به دلایل فوق الذکر، قابلیت اندازه گیری این مطلب وجود ندارد. در 42 روزگی نیز بالاتر بودن تیتر جیره­های با 4% آب پنیر دیده شد. مشخص شده است که عوامل متفاوتی مانند حدت ویروس، مقاومت میزبان، عوامل محیطی و بیماری‌های همزمان می‌توانند بر بیماری‌زایی و تلفات ویروس تاثیر بگذارند. گزارش شده است که افزودن پروبیوتیک به جیره کم پروتئین سبب افزایش تیتر آنتی بادی علیه ویروس نیوکاسل شد در حالی که تاثیری بر مقدار آن در جیره با سطح پروتئین متعادل نداشت، به عبارتی باعث بهبود عملکرد تولیدی و توان ایمنی جوجه های گوشتی می­شود (Dastar et al., 2008). Khani et al. (2015) نیز تاثیری در تیتر آنتی بادی آنفولانزا و نیوکاسل جوجه‌های تغذیه شده با پودر آب پنیر اسیدی و پودر آب پنیر اسیدی کم لاکتوز مشاهده نکردند. Kheiri et al. (2015) با افزودن پودر آب پنیر و سماق به جیره جوجه­های گوشتی شاهد افزایش تیتر واکسن علیه بیماری نیوکاسل و بهبود سیستم ایمنی و مقاومت به باکتری­های بیماری­زا از طریق افزایش جمعیت میکروفلور لاکتوباسیل­ها و کاهش E.Coli بودند. آب پنیر دارای مشتقات پروتئین­های سرم از جمله لاکتوفرین است که منبع ارزشمند زیستی محسوب می­شود (Molayiparvari, 2011). گزارش شده است که خواص سودمند لاکتوفرین ممکن است به عنوان یک جایگزین ضد میکروبی برای صنعت طیور مفید باشد، به خصوص زمانی که پرندگان با یک چالش مواجه می شوند؛ اما باعث ایجاد بهبود عملکرد پرندگان سالم در شرایط پرورش مطلوب، نشد  (Geier et al., 2011).

در مورد تیتر گامبورو انتظار بر این بود که با واکسیناسیون، پس از 28 روزگی افزایش تیتر مشاهده شود، اما در تمامی تیمارها این روند کاهشی بود که می­تواند به دلیل شکست واکسیناسیون آشامیدنی و یا مصرف آنتی­بادی و درگیری با ویروس باشد. البته این امکان نیز وجود دارد که آب پنیر به عنوان بازدارنده عمل نموده و با بیماری مقابله کرده است، اگرچه تایید این فرضیه بایستی از طریق جداسازی عامل بیماری از بورس فابرسیوس انجام شود. اگر فرضیه دوم اثبات گردد، نقش سرکوب کنندگی گامبورو و تاثیر آن روی سایر واکسن­ها محرز شده در نتیجه گله کلا حساس باقی مانده است (Ezeibe et al., 2014). به دلیل موثر نبودن روند تیتر واکسیناسیون گامبورو و روند کاهشی ایمنی مادری، توجیه خاصی برای این پدیده وجود ندارد. افزایش تیتر آنفولانزا نشانه درگیر شدن با ویروس است که به طور موردی نیز تیترهای بالای 7 و 8 مشاهده شد، اما روند کاهشی تیتر برونشیت بیانگر این امر است که نه تنها درگیری از این بابت در گله وجود نداشته، بلکه یک نوبت واکسیناسیون نیز برای به دست آوردن عیار آنتی بادی محافظت کننده کافی نیست.

بیان ژن­های اینترلوکین-4 و اینترفرون گاما

منحنی استاندارد سریال رقت پرایمرها در نمودارهای جداگانه رسم شد و مقادیر شیب معادله، راندمان و ضریب تعیین­های محاسبه شده حاکی از دقت و صحت انجام کار داشت (جدول 8).

جدول 8- مقادیر شیب معادله، راندمان و ضریب تعیین پرایمرها.

Table 7- Equation slope, efficiency and reliability of primers.

بیان ژن‌های اینترلوکین-4 و اینترفرون گاما در هر مرحله پرورش

آنالیز واریانس بیان ژن­های اینترلوکین-4 و اینترفرون به تفکیک هر مرحله پرورش در جدول 9 آورده شده است. همانطور که نتایج نشان می­دهد، اینترلوکین-4 در مرحله رشد (10-24 روزگی) تحت تاثیر درصد پودر آب پنیر و فرم فیزیکی جیره قرار گرفت؛ به طوری که افزودن آب پنیر به جیره و همچنین پلت کردن آن باعث بیان بیشتر ژن اینترلوکین-4 شد. افزودن آب پنیر تاثیری در بیان ژن اینترفرون در هیچ مرحله‌ای نداشت، اما نوع فرم فیزیکی در پیش دان (0-10 روزگی) (P<0.05) و میان دان (10-24 روزگی) (P<0.01) روی بیان ژن تاثیر گذاشت. همچنین اثرات متقابل نیز در این مراحل معنی­دار شد  (P<0.01). در تحقیق حاضر، افزودن آب پنیر باعث افزایش بیان ژن اینترلوکین-4 در میان دان (10-24 روز) شد. اگرچه در دو مرحله دیگر پرورش، تاثیر افزودن آب پنیر از نظر آماری معنی­دار نبود، اما افزایش میزان بیان ژن اینترلوکین-4 حاکی از پاسخ Th2های وابسته به سلول می­باشد. اگرچه، بیان اینترفرون گاما در حضور آب پنیر تغییر نیافت اما پلت­کردن خوراک در پیش­دان و میان­دان نتایج متفاوتی را به همراه داشت. همچنین، در جیره‌های آردی، افزودن آب پنیر تا 4 درصد باعث کاهش بیان ژن اینترفرون در پیش‌دان و میان‌دان شد اما در 8% میزان بیان ژن افزایش یافت؛ در حالیکه در جیره‌های پلت شده افزودن آب پنیر در مجموع باعث افزایش بیان این ژن در این دو مرحله از رشد شد. با توجه به این که آب پنیر قبل از پلت­کردن به جیره افزوده شده بود، این احتمال وجود دارد که حرارت دادن در زمان تهیه خوراک پلت، سبب بهبود کیفیت آب پنیر و تاثیر روی فلور روده شده باشد. در پژوهشی Janardhana et al. (2009) گزارش کردند که افزودن پری بیوتیک به جیره باعث کاهش معنی­دار نسبت سلول‌های Bدر لنفوسیت بافت سکوم، افزایش تعداد کلی سلول­های سفید خون و وزن نسبی اندام­های سیستم ایمنی، وزن­های نسبی لاشه و اجزای خوراکی و بهبود مقادیر تیتر آنتی­ژن ایمنوگلوبولین M و G در سرم خون می­شود. افزایش تعداد گلبول­های سفید خون در جیره­های حاوی آب پنیر در تحقیق دیگری نیز گزارش شده است (Rastad et al., 2008). تغییرات سطح mRNA بیان شده در روزهای مختلف آزمایش در جوجه‌هایی که با جیره‌های مختلف پروبیوتیک و اسیدآلی تغذیه شده بودند گزارش شده است و احتمال بر این است که افزودن پروبیوتیک و اسیدهای آلی (اسید سوربیک و سیتریک) باعث فعال شدن گیرنده­های ملکولی سیستم ایمنی ذاتی می­شود که در نتیجه پپتیدها و پروتئین­های ضد میکروبی تولید می­شود (Rodriguez-Lecompte et al., 2011). این احتمال نیز وجود دارد که با توجه به رشد جوجه و توسعه و تکامل بافت روده و تغییرات میکروفلور که در اثر تیمارهای اعمال شده رخ می‌دهد، پاسخ‌های متفاوتی از بیان ژن مشاهده شود.

جدول 9- آنالیز واریانس و میانگین بیان ژن اینترلوکین-4 و اینترفرون گاما در سه مرحله پرورش.

Table 8- Variance analysis and expression mean of Interleukin-4 (IL-4) and Interferon-gamma (In-γ) genes in 3 periods of breeding.

^a-c values with different alphabet in columns differ significantly (p<0.05).

در همین رابطه، افزودن پروبیوتیک پریمالاک در تنظیم بیان ژن­های ایمنی در ایلئوم و سکوم تونسیل موثر بوده است (Pender et al., 2016).

در بخش دیگری از این طرح که نتایج آن قبلا به چاپ رسیده است، تاثیر جیره‌های اعمال شده روی تغییرات مورفولوژیکی ژژنوم بررسی و مشخص گردید که در جیره‌های آردی حاوی آب پنیر (4 یا 8 درصد) طول و عرض پرزهای ژژنوم در میان‌دان بیشترین مقدار بود (Vakili et al., 2015). این احتمال وجود دارد که با تغییرات ایجاد شده روی مورفولوژی، میزان هضم و جذب غذا، بیان ژن و تیتراسیون واکسن تحت تاثیر قرار گرفته باشد. با بررسی پاسخ­های ایمنی، آب پنیر پروفیل سیتوکین­ها را تعدیل و تغییر داده که منجر به بهبود پاسخ­های ایمنی ذاتی و وابسته به Thها شده است. لذا، آب پنیر با افزایش تنظیم پاسخ­های التهابی، همانند یک عامل حفاظتی برای ایمنیت عمل می­کند و منجر به حفاظت بیشتر علیه پاتوژن­های داخل سلولی می­شود.

نتیجه گیری

افزودن آب پنیر باعث افزایش بیان ژن اینترلوکین-4 فقط در روزهای 10 تا 24 روزگی شد که حاکی از پاسخ Th2ها و تولید آنتی بادی می­باشد، اما بیان ژن اینترفرون گاما تحت تاثیر افزودن آب پنیر به جیره قرار نگرفت. با توجه به امکان برخورد گله­ها با سویه­های مزرعه­ای و استرس­های مختلف مانند ورود و خروج افراد، پیشنهاد می­شود که طرح­های مربوط به پاسخ­های ایمنی در سطحی از بیوسکیوریتی و در ایزولاتور انجام شود تا تیترهایی که مشاهده می­شوند، به علت درگیری گله با عوامل بیماریزایی بجز واکسن نباشند و آلودگی­های دخالت کننده در مطالعه و نتایج آن، به حداقل ممکن برسد. همچنین در ادامه این طرح، به منظور بررسی تاثیر کاهش­دهندگی آب پنیر روی تیتر گامبورو، PCR نمونه بورس فابرسیوس گذاشته شود تا مشخص گردد آیا وجود پاتوژن و نقش بازدارندگی آب پنیر تایید می­گردد یا خیر.

سپاسگزاری

این مقاله مستخرج از طرح شماره 92103-01-01-2 سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی است و کلیه هزینه‌های آن توسط موسسه آموزش عالی علمی کاربردی جهاد کشاورزی و مرکز تحقیقات و آموزش کشاورزی خراسان رضوی تامین گردیده است. مراحل پرورش و عملیات میدانی این طرح در مزرعه پرورش طیور مرکز تحقیقات و آموزش کشاورزی و منابع طبیعی خراسان رضوی و کلیه مراحل آزمایشگاهی آن در آزمایشگاه مرجع اداره کل دامپزشکی خراسان رضوی انجام گرفت. بدین وسیله نویسندگان بر خود لازم می­دانند مراتب تقدیر و تشکر خود را از زحمات بی­دریغ مسوولین و همکاران ذیربط در اجرای این طرح بنمایند.